DK146224B - Fremgangsmaade til fremstilling af sarcosinoxidase - Google Patents

Description

(!

(19) DANMARK

|j| (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT on 146224 B

DIREKTORATET FOR PATENT· OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Patentansøgning nr.: 4369/78 (51) Int.CI.3: C12N 9/06 (22) Indleveringsdag: 03 okt 1978 (41) Aim. tilgængelig: 05 apr 1979 (44) Fremlagt: 01 aug 1983 (86) International ansøgning nr.: -(30) Prioritet: 04OM1977JP119778/52 (71) Ansøger: *TOYO JOZO KABUSHIKI KAtSHA; Tagata-gun, JP.

(72) Opfinder: Shlgeru *lkuta; JP, Kazuo ‘Matsuura; JP, Yoshlfumi ‘Horlutl; JP.

(74) Fuldmægtig: Patentbureauet Magnus Jensens Ettf.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af sarcosinoxl-dase

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af sar-cosinoxidase.

Sarcosinoxidase (EC. 1.5.3-1 sarcosin: oxygen-oxidureductase (dernethylerende)) er ét kendt· enzym, som virker efter ligningen:

Sarcosin + H^O + 0? ^ glycin + HCH0 + I^Op Enzymet er blevet fremstillet ud fra lever eller nyrer fra mus eller en dyrkningsmasse af mikroorganismer af slægten Corynebacterium.

Det har nu vist sig, at et enzym, som katalyserer den oven-

JQ

for illustrerede reaktion, produceres i bakteriestammen B-0618 N hørende til slægten Bacillus, som er isoleret fra en jordprøve

M

g fra Sasaki, Fukuchiyama, Kyoto, Japan, og man har isoleret et renset enzym.

^ Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er i overensstemmelse 3 hermed ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

2 146224

Stammen B-O6I8 har følgende taxonomiske egenskaber; A. Macroskopisk iagttagelse på forskellige medier ved dyrkning ved 30°C i 18-24 timer.

(1) Bouillonagarskråflade; Vækst: god, filamenteret.

Farve af koloni; grålighvid til blegbrun, næsten intet diffusibelt pigment.

(2) Glukosebouillonagarskråfl'ade: Vækst; god, filamenteret.

Farve af koloni; grålighvid til blegbrun, mindre diffusibelt pigment.

(5) Bouillonvæske;

Dyrket væske; uklar og med sediment, ingen filmdannelse.

(4) Lakmusmælk;

Alkalisering i løbet af 1-2 uger.

(5) Bouillongelatineplade; Vækst; vækst på overfladen, svag, men tragtformet forflydning.

B. Mikroskopiske iagttagelser; (1) Form og størrelse af celler; store og retlinede stave, 1.0 - 1.5 x 2.0 - 5 μ, rund kant, enkelt eller dobbelt sammenbinding, tindertiden korte kæder.

(2) Polymorphisme; ingen.

(3) Motilitet; peritrisk bevægelse (iagttaget på bouillonagar-skråflademedium ved 26°C, 18 timers dyrkning).

(4) Spore; cylindrisk eller oosfærisk (elliptisk) ved center eller nær kant af celle. Ingen kvældning ved spore.

0.8 - 1.0 x 1.2 - 1.6 .μ.

(5) Gram-farvning: positiv.

(6) Syrefast farve: negativ.

C* Fysiologiske egenskaber:

Nitratreduktion: negativ.

Denitrifikationsreaktion: negativ.

MR-test: negativ.

VP-test: negativ.

Indoldannelse: negativ.

Hjrdrogensulfatdannelse: positiv.

Stivelseshydrolyse: negativ.

Gelatinehydrolyse: positiv.

3 ΙΑ6224

Caseinhydrolyse: negativ.

Esculinhydrolyse: negativ.

Cellulosehydrolyse: negativ.

Citratudnyttelse, Simons-medium: negativ.

Christensen-medium: positiv.

Nitratudnyttelse: positiv.

Ammoniumudnyttelse: negativ.

Dannelse af ammonium fra nitrat: positiv.

Vækst-pH: 6.4 - 9.6.

Væksttemperatur: 10 - 42°C.

Halogentolerance: NaCl 6.0%.

Opførsel i oxygen: aerob.

O-F-test (Hugh Leifson-medium): NT.

O-F-test x: 0 (oxidativ dekomposition).

. x Q-F-testmedium: modificeret medium.

Som følge af, at der ikke er nogen syredannelse fra glukose og ikke er nogen eller kun svag dannelse af syre fra andet saccharid, benyttes glycerol som sukker. NH^HgPO^ 1.0 g, KC1 0.2 g, MgSO^, THgO 0.2 g, gærekstraktpulver 1.0 g, agarpulver 3.0 g, bromthymolblåt (10^'s vandig opløsning) 10 ml, destilleret vand 1000 ml, pH-værdi 7.2 - 7.4.

Syre- og gasdannelse fra sukker: xx (ingen gasdannelse iagttages) .

L-arabinose: - cellobiose: - dulcitol: - erythritol: - fructose: + (syre). galactose: -glukose: - glycerol: + (syre) inositol: - lactose: - maltose: - mannitol: + (syre) mannose: - melezitose: - melibiose: - raffinose: - L-rhamnose: - salicin: - L-sorbose: - sorbitols - stivelse: - saccharose: - trehalose: - xylose: - xx Basismedium: NH^HpPO^ 1.0 g, KC1 0.2 g, MgSO^, 7H?0 0.2 g, gærekstraktpulver 1.0 g, agarpulver 3.0 g, bromthymolblåt (I0?o*s vandig opløsning) 10 ml, destilleret vand 1000 ml, pH-værdi 7.2 - 7.4.

Der tilsættes 10 g sukker.

Under henvisning til Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. udgave, 1974,bestemmes stammen B-0618 med de ovenfor angivne taxonomiske egenskaber - især Gram-positiv, sporedannende 4 146224 stor bacillus, peritrisk bevægelse, aerobbakterier og syredannelse fra glukose - som horende til slægten Bacillus.

Sammenligning af stammen B-0618 med andre lignende bakterier, Bacillus badius, Bacillus freudenreichii og Bacillus macroides, udfores som følger:

Bacillus badius ATCC-14574 (typekultur).

Bacillus freudenreichii ATCC-7053 (ikke-typekultur, ikke-original stamme).

Bacillus macroides ATCC-1P905 (typekultur).

- l " " ' I - I- Γ1 1 J.I ir - - -I- - I ' T

Bacillus ; Bacillus freuden- ! Bacillus

Stamme badius reichii . macroides B-0618 ATCC-14574 ATCC-7053 i ATCC-12905 Bemærkninger --i--,-------------- ., ! ingen j ingen ingen ingen O-F-test s7^e- s syre- syre- , syre- ‘ Hugh-Leifson-- _ dan- ' dan- dan- dan- medium nelse ; nelse nelse nelse ! ingen ingen O-F-test, O-F-test : 0 0 sYre- syre- beskrevet i dan- dan- ovenfor i ί nelse nelse ' ' ' ' ' " ......... ' I " " 1 1 11" ' ....... - catalase + i + + + ox idase - + + > + -r urease + ^ I + t- 1 11 ' ' 11 j I1 ‘""-'ί " r— '» ' 11 ..... 1 gelatine- forflya- t + + (+) -r ning " " .......... ..U PM·· --- stivelses-r ^ ^ hjrdrolyse ” esculin- / \ ^ ^ ^ hydrous e · indol- · jl dannelse i - ; ” ; 7 7 asnnexse * acetone- ^ ^ ^ ^ dannelse ; * KR-test --7---7- -f -t 146224 5

Tabel fortsat: nitrat- j ^ j 4. 4. 4. ; reduktion ! ' ί _I_____—-i ..... .....ί···. I ...............I. ............

i ! : i citrat- ; + + + udnyttelse ; ; i -------- j--1-1 dannelse af j i ! syre fra ! j i sukker: \ j j arabinose I -f i * ! * fructose + t ; -t * galactose + + + + glucose -r -r t -r glycerol + + x -t ** x senere alka— I linisering inositol -t t t | + : . 1 , ; lactose τ : ~ ~ ! .

maltose i 4· ; :

> , ’ : I

mannitol ( + i * + * · mannose j τ i * * * \

sorbitol τ j * * + ] S

saccharose τ ' + ^ ; . . i trehalose -t ^ ~ ~ xylose τ t * +

Egenskaberne på bouillonmedium er som følger:

Stammen B-0618: svag vækst, uldagtigt sediment.

ATCC-14574: ensartet uklar, partielt sediment.

ATCC-7053: svag vækst, uldagtigt sediment.

ATCC-12905: svag vækst, ensartet uklar, partielt sediment.

Følgelig afviger de taxonomiske egenskaber af stammen B-0618 på flere punkter fra sammenligningsstammerne, nemlig som følger: Bacillus badius ATCC-14-574: dannelse af urease, syredannel se fra glycerol (syredannelse og senere alkalinisering) og mannitol.

Bacillus freudenreichii ATCC-7053: vækst på flydende kultur og ureasedannelse (svag lighed). Esculinhydrolyse, syredannelse fra fructose, glycerol og mannose. ATCC-7055-stammen er hverken typekultur eller original stamme# Således kan st:ammen ikke tilhøre ?en ny art.

6 146224

Stammen B-0618 omtales som Bacillus sp. og betegnes som Bacillus sp. B-0618. Denne stamme er deponeret i Institute for Microbial Industry and Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, under deponeringsnr. FERM-P nr. 4049.

Stammen er også deponeret i ARS, U.3.A. som NRRL nr. B-11380 samt i Deutsche Sammlung von Mikro-Organismen, Vesttyskland, som nr.

IBM 1383.

Opfindelsen skal forklares nærmere i forbindelse med tegningen, hvor fig. 1 viser optimal pH-værdi for sarcosinoxidasen, der fås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, fig. 2 optimal temperatur for sarcosinoxidasen, fig. 3 pH-stabilitet.af sarcosinoxidasen, fig. 4 varmestabiliteten af sarcosinoxidasen, fig. 5 resultatet af kvantitativ analyse af sarcosin ved bestemmelse af formaldehyd, og fig, 6 resultatet af kvantitativ analyse af sarcosin ved bestemmelse af hydrogenperoxid,

Bacillus sp. B-0618 FERM-P nr. 4049 dyrkes i et konventionelt medium til antibioticum- eller enzymiremstilling. Luftet submers-dyrkning foretrækkes til industriel produktion.

Der benyttes fortrinsvis et konventionelt medium til mikroorganismer. Med hensyn til nitrogenkilder kan der benyttes assi-milerbare nitrogenkilder såsom majsstøbevæske, sojabønnepulver, pepton, kødekstrakter, gærekstrakter, ammoniumsulfat, ammoniumklorid eller lignende. Der benyttes assimilerbare carbonkilder såsom glucose, melasse, stivelseshydrolysater og lignende. Der kan valgfrit benyttes forskellige uorganiske salte såsom natriumklorid, kaliumklorid, magnesiumsulfat, kaliumhydrogenfosfat eller kaliumdihydrogenfosfat. Tilsætning af creatin til mediet, fortrinsvis 0,5-1$, stimulerer dannelsen af sarcosinoxidase.

Dyrkningstemperaturen kan variere inden for området for vækst af de mikrobielle celler og produktion af enzym og er fortrinsvis 26-33°C, Dyrkningstiden kan ændres afhængende af be- 7 146224 tingeiserne og er normalt 15-25 timer. Dyrkningen bør naturligvis afsluttes, når dannelsen af sarcosinoxidase i hovedsagen er fuldstændig.

Sarcosinoxidase eksisterer i mikroorganismecellerne.

• En udførelsesform for ekstraktion af sarcosinoxidase fra dyrkningsmassen er som følger; Den dyrkede masse centrifugeres,' og de våde celler suspenderes i en stødpudeopløsning såsom tris-HCl-stødpude og iturives ved behandling med lysozym, ultralydbehandling eller presning. Det således opnåede rå sarcosinoxidase renses ved gængse isolations- og rensningsmetoder for proteiner og enzymer. F.eks. kan der om fornødent efter fjernelsen af nucleinsyre ved tilsætning af protaminsulfat benyttes fraktioneret udfældning med acetone, methanol, ethanol eller iso-propanol og udsaltning med ammoniumsulfat. Yderligere rensning kan opnås ved f.eks. chromatografi, hvor den rå sarcosinoxidase opløses i tris-HCl-stødpude og chromatograferes linder anvendelse af anionbyttere såsom diethylaminoethylcellulose- eller -dextran-gel og gelfiltreringsmidler såsom dextrangel eller polyacrylamid-gel. Den rensede sarcosinoxidase kan opbevares som et lyophili-seret pulver.

Sarcosinoxidase ifølge opfindelsen har følgende fysisk-kemi-ske egenskaber; (l) Enzymvirkning;

Et mol sarcosin forbruger et mol HpO og et mol oxygen og frembringer et mol glycin, et mol formaldehyd og et mol hydrogenper oxid. Enzymet katalyserer oxidationen af sarcosin til dannelse af glycin og formaldehyd: CH^NHCHpCOOH + 0? + Hp_C » H2NCH2C00H + HCHO + HpOp

Enzymbestemmelsen udføres som følger;

Til en reaktionsblanding (0.5 ml) bestående af 0.2 mol tris-HCl-stødpude (pH-værdi 8.0, 0.05 ml), 4-aminoantipyrin (3 mg/ml, 0.05 ml), 0.2.yi phenol (0.05 ml), peroxidase (0.5 mg/ml, 0.05 ml), 1 mol sarcosin (0.1 ml) og destilleret vand (0.2 ml) sættes en-·* zymopløsningen (10 μΐ), og man inkuberer ved 37°C i 5 min.

Ethanol (2.5 ml) tilsættes til standsning af reaktionen. Dannelsen af hydrogenperoxid måles ved colorimetri igennem absorptionsevne ved 480 nm.

En enhed (l enh.) enzymaktivitet defineres som den mængde enzym, som frembringer 1 jimol hydrogenperoxid pr:, min.

146224

S

(2) Substratspecificitet:

Til en reaktionsblanding (0.5 ml) bestående af 0.2 mol tris--HCl-stødpude (pH-værdi 8.0, 0.05 ml), 4-aminoantipyrin (3 mg/ml, 0.05 ml), 0.2% phenol (0.05 ml), peroxidase (0.5 mg/ml, 0.05 ml), destilleret vand (0.2 ml) og følgende substrat (0.5 mol, 0.20 ml) sættes sarcosinoxidase (0.5 enheder), og man inkuberer ved 37°C i 5 min. Der tilsættes ethanol (2.5 ml) til standsning af reaktionen, og man bestemmer colorimetrisk ved 480 nm.

Den relative aktivitet på forskellige substrater er som følger:

Substrat Relativ aktivitet

Sarcosin 100.0

Cholin 0

Betain 0.03

Dimethylglycin 0.01

Glycin 0.06

Serin 0

Threonin 0

Alanin 0 : Valin 0

Lysin ' 0.09 N-methylethanolamin 0 N-dimethylethanolamin 0 (3) Optimal pH-værdi:

Til undgåelse af en virkning af 4-aminoantipyrin#phenol·-og peroxidase på chromogen bestemmes dannelsen af aldehyd ved acetyl-acetonemetoden. Resultatet er vist i fig. 1, hvor den optimale pH-værdi er 8.0 - 9.5·

De benyttede stødpudeopløsninger er: pH-værdi 4-7? dime- thylglutaratstødpude, pH-værdi 6-8: phosfatstødpude, pH-værdi 7.5 - 9: tris-HCl-stødpude, pH-værdi 9-10: glycin — NaOH- stødpude og pH-værdi 10 - 11: natriumcarbonat-borat-stødpude.

(4) Optimal temperatur:

Ca. 50°C som vist i fig. 2. Substrat: sarcosin.

(5) pil-stabilitet:

Bimethylglutaratstødpude for pH-værdi 5-7, phosfatstødpude for pH-værdi 6 - S, tris-HCl-stødpude for pH-værdi 7.5 - 9, gly-cin-HaOH-stødpude for pH-værdi 9-10 og natriumcarbonat-borat-stødpude for pH-værdi 10 - 11 benyttes. Til 0.1 ml af hver stød- 146224 9 pude sættes 100 μΐ enzymopløsning (protein 100 pg/ml), og man lader henstå i 60 min. ved 37°C. Efter indstilling af pH-værdien ved tilsætning af 1.0 mol tris-HCl-stødpude (pH-værdi 8.0, 0.3 ml) udtages en prøve på 20 μΐ, og enzymaktiviteten bestemmes. Sarco-sin benyttes som substrat, og som vist i fig. 3 er den stabile pH-værdi 6.0 - 10.0.

(6) Varmestabilitet:

Varmestabiliteten af enzymet bestemmes ved inkubering af 10 mmol tris-HCl-stødpude (0.5 ml, pH-værdi 8.0) indeholdende enzym (protein 20 ^g/ml) med forskellige temperaturer i 10 min. under anvendelse af sarcosin som substrat. Som det fremgår af fig.

4, er enzymet stabilt under 40°C.

(7) Molekylvægt: 40.000, målt ved gelfiltreringsmetoden.

(8) Isoelektrisk punkt: 4.7 ved elektrophorese under anvendelse af ampholyt af bærertype.

(9) Identifikation og bestemmelse af reaktionsprodukter: I) Identifikation af glycin:

Reaktionsblanding: 0.2 mol tris-HCl-stødpude (pH-værdi 8.0) 1.0 ml 1 mmol sarcosin 1.0 ml catalase 200 enh.

sarcosinoxidase 5 enh.

destilleret vand 8.0 ml total 10.0 ml

Ovenstående reaktionsblanding (10 ml) inkuberes ved 37°C i 60 min., hvorefter reaktionen standses ved opvarmning til 100°C i 5 min. De dannede udfældninger fjernes ved centrifugering, og den overliggende væske inddampes 10 gange og anbringes pletvis på filtrerpapir. Der udvikles et chromatogram med vandmættet phenol natten over, og man farver ved opvarmning efter sprøjtning med ninhydrinopløsning. Den iagttagne Rf-værdi er 0.26.

Autentiske prøver af sarcosin og glycin har Rf-værdier på henholdsvis 0.66 og 0,26, så at pletten med ovennævnte Rf-værdi identificeres som glycin.

II) Bestemmelse af formaldehyd:

Reaktionsblanding: 0.2 mol tris-HCl-stødpude (pH-værdi 8.0) 0.05 ml sarcosin med alikvot koncentration. 0.10 ml 10 146224 catalp.se 200 enh.

sarcosinoxidase 3.0 enh.

destilleret vand 0.35 ml total 0.50 ml

Reaktionsblandingen inkuberes ved 37°C i 20 min. Reaktionen standses ved opvarmning i 5 min., og efter afkøling tilsættes der acetatstødpude (pH-værdi 5.5, 1,5 ml) samt den nedenfor angivne chromogenopløsning (20 ml). Efter 50 minutters inkubation ved 37°C måles opløsningen colorimetrisk ved 412 nm. Resultatet fremgår af fig. 5, hvor dannelsen af formaldehyd svarer til koncentrationen af sarcosin.

Chromogen: ammoniumacetat 15 g eddikesyre 0,3 ml acetylacetone 0.2 ml vand ad 100 ml III) Bestemmelse af hydrogenperoxid:

Hydrogenperoxid bestemmes'kvantitativt ved kombination af 4-aminoantipyrin, phenol og peroxidase.

Reaktionsblanding: 0.2 mol tris-HCl-stødpude (pH-værdi 8.0) 0.05 ml 3 mg/ml 4-aminoantipyrin 0.05 ml 0.2'i phenol 0.05 ml 0.5 mg/ml peroxidase 0,05 ml sarcosin af alikvot koncentration 0.10 ml sarcosinoxidase 3.0 enh.

destilleret vand 0.2 ml total 0.5 ml

Reaktionsblandingen inkuberes ved 37°C I 20 min. Efter tilsætning af ethanol (2.5 ml) måles blandingen colorimetrisk ved 480 nm. Som vist i fig. 6 svarer dannelsen af hydrogenperoxid til koncentrationen af sarcosin.

Som forklaret ovenfor katalyserer enzymet sarcosinoxidase oxidationsreaktionen, hvor sarcosin omsættes med oxygen (idet der forbruges 1 Eiol vand for hvert mol sarcosin), og der dannes gly-cin, formaldehyd og hyclr ogenper oxiά. Derfor bekræftes enzymet som varende enzymet for EC.1.5.3.1 sarcosin: oxygen oxidoreduc- tase (demethylerende), 14822Λ 11

Sarcosinoxidase kan benyttes som enzymatisk diagnostisk reagens såsom til bestemmelse af creatinin i blod eller urin ved kombination med creatinase og creatininase. Endvidere kan sarcosinoxidase benyttes til bestemmelse af aktiviteten af creatininase.

Nedenstående eksempel illustrerer fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Eksempel 1

Et medium (100 ml) indeholdende creatin (0.5$), opløselig fiskeekstrakt (0.5 $), gærekstrakt (0.2$), KC1 (0.5$), K^HPO^ (0.1$) og MgS0^,71^0 (0.05$) i en 500 ml Erlenmeyerkolbe steriliseres ved 120°C i 20 min. Man poder Bacillus sp. B-0618 FERM-P nr. 4049 deri og dyrker den ved 30°C i 1 dag som en podekultur, - 4· som overføres til samme steriliserede medium (20 l) i en 30-liter forgæringsbeholder, hvor man dyrker ved 30°C i 20 timer ved 200 omdrejninger pr. min. og under luftning med 20 l/min. Ved centrifugering samlede bakterieceller (12 g) vaskes med 10 mmol phosfatstødpude (pH-værdi 7.0), og man suspenderer i samme stødpudeopløsning, og der tilsættes lysozym (slutkoncentration 0.2 mg/ml), og man omrører ved 37°C i 30 min. Den ved centrifugering ved 5000 omdrejninger pr. min. i 15 min. opnåede overliggende væske samles (sarcosinoxidaseaktivitet: 1400 enh.). Til den således opnåede overliggende væske sættes 2$ protaminsulfatopløs-ning (2.5 ml), og nucleinsyreudfældningen skilles fra.

Til den overliggende væske sættes mættet ammoniumsulfat, og man samler udfældningen af fraktionerne af 50$ - 70$ ammoniumsul-fatkonc entrati on,

Udfældningen opløses i 10 mM tris-HCl-stødpude (pH-værdi 8.0, 20 ml) og afsaltes gennem en Sephadex G-25-søjle (indregistreret varemærke) (3.5 x 50 cm). Den afsaltede opløsning anbringes på en DEAS-cellulosesøjle (2.0 x 18cm), 10 mM tris-HCl-stødpude, pH-værdi 7.0) til adsorption af enzymet, og man vasker med samme stødpudeopløsning indeholdende 0.1 mol KC1 og eluerer ved en gradient af 0.1 M - 0.5 M KCl-opløsning.

Den aktive fraktion, som elueres med 0.3β M KC1, samles og dialyseres i 10 timer mod opløsningen af 10 mM tris-HCl-stødpude (pH-værdi 8.0), hvorpå man frysetørrer til opnåelse af et pulver af sarcosinoxidase.

Total aktivitet: 540 enheder, protein: 43 mg, specifik aktivitet: 12.7 enh./mg, udbytte 38.6$.