DK146482B - Fremgangsmaade til fremstilling af et b30-threonin-insulin - Google Patents
Fremgangsmaade til fremstilling af et b30-threonin-insulin Download PDFInfo
- Publication number
- DK146482B DK146482B DK155680AA DK155680A DK146482B DK 146482 B DK146482 B DK 146482B DK 155680A A DK155680A A DK 155680AA DK 155680 A DK155680 A DK 155680A DK 146482 B DK146482 B DK 146482B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- insulin
- threonine
- trypsin
- enzyme
- amino acid
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 73
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 title claims description 38
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 title claims description 38
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 title claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 27
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 title claims description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 25
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 25
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 23
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 22
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 21
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 16
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 14
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 13
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 13
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 11
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 8
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 7
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 7
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 6
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 claims description 6
- 101710127332 Protease I Proteins 0.000 claims description 5
- 101710137710 Thioesterase 1/protease 1/lysophospholipase L1 Proteins 0.000 claims description 5
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- 150000008551 L-threonines Chemical class 0.000 claims description 3
- 125000000769 L-threonyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](O[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 claims description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 2
- 150000003587 threonine derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 22
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 20
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 20
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 11
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(4-chlorophenyl)-2-(4-methylphenyl)sulfonylbutane-1,4-dione Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)C(C(=O)C=1C=CC(Cl)=CC=1)CC(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 6
- 102000000496 Carboxypeptidases A Human genes 0.000 description 6
- 108010080937 Carboxypeptidases A Proteins 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 6
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 5
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 5
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N Aspartic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N N-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N[C@H](C(=O)CCl)CC1=CC=CC=C1 MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000003918 fraction a Anatomy 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- -1 t-butyl esters Chemical class 0.000 description 4
- 241000590035 Achromobacter lyticus Species 0.000 description 3
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 3
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000993800 Sus scrofa Insulin Proteins 0.000 description 3
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 3
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 3
- 210000002196 fr. b Anatomy 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N cysteic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CS(O)(=O)=O XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- MCJGNVYPOGVAJF-UHFFFAOYSA-N quinolin-8-ol Chemical compound C1=CN=C2C(O)=CC=CC2=C1 MCJGNVYPOGVAJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 2-methylphenol;3-methylphenol;4-methylphenol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1.CC1=CC=CC(O)=C1.CC1=CC=CC=C1O QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940090248 4-hydroxybenzoic acid Drugs 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N L-lysyl-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003931 anilides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 229940064004 antiseptic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 1
- 229930003836 cresol Natural products 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical compound CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 229960005051 fluostigmine Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- DCKVNWZUADLDEH-UHFFFAOYSA-N sec-butyl acetate Chemical compound CCC(C)OC(C)=O DCKVNWZUADLDEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010021648 semen liquefaction factor Proteins 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
146482
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et B30-threonin-insulin, herunder human insulin.
Insulin er et uundværligt lægemiddel til behandling af diabetes.
Okse-og svineinsulin kan i øjeblikket fis i handelen. Disse insuliner 05 afviger imidlertid fra human insulin ved nogle få aminosyrekomponen-ter, som bevirker dannelse af antistof i patienter. Antistoffet vides at formindske effektiviteten af videre insulinbehandling. Human insulin er derfor mere gunstigt, og der har været et stærkt ønske om at kunne få det i handelen. Human insulin afviger fra andre animal-M0 ske insuliner ved aminosyrekomponenterne i stillingerne 8, 9 og 10 i A-kæden og i B-kædens 30-stilling. Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en fremgangsmåde til erstatning af aminosyren i 30-stil-lingen i et animalsk insulins B-kæde med L-threonin. Human insulin kan følgelig let fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen 15 ved som udgangsmateriale at anvende svineinsulin. Svineinsulin afviger fra human insulin ved aminosyren i B30-stillingen. Human insulin opnået på denne måde kan med fordel anvendes til behandling af diabetes patienter. Opfindelsen tilvejebringer desuden andre B30--threonin-insuliner ved anvendelse af andre animalske insuliner som 20 udgangspunkt. De resulterende insuliner afviger fra human insulin ved aminosyrer i A-kædens 8-, 9- og 10-stilling, og de kan anvendes som reagenser til prøver for antigenicitet og som diabetes lægemidler.
Human insulin er blevet fremstillet kemisk af M.A. Ruttenberg 25 som vist i U.S.A. patentskrift nr. 3.903.068 og af R. Obermeier et al. som beskrevet i Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 357, 759-767 (1976). Disse fremgangsmåder omfatter kondensation af et desocta-peptid-(B23-30)-svineinsulin med et syntetisk octapeptid, der svarer til stillingerne B23-30 i human insulin. Den første fremgangsmåde 30 omfatter imidlertid alkalisk hydrolyse, som ledsages af uheldige bireaktioner. Sidstnævnte fremgangsmåde er også en ikke-specifik omsætning, som bevirker mange bireaktioner og kræver komplicerede rensningsprocedurer. Disse fremgangsmåder kan derfor ikke anvendes i industriel målestok.
35 M. Bodanszky et al. tilvejebringer i U.S.A. patentskrift nr.
3.276.961 en fremgangsmåde til fremstilling af human insulin, ved hvilken human insulin fremstilles ud fra andre animalske insuliner 146482 2 ved indvirkning af et enzym, såsom carboxypeptidase A eller trypsin, i nærværelse af threonin. Det er ikke sandsynligt, at denne fremgangsmåde vil frembringe human insulin, fordi trypsin og carboxypeptidase A ikke kun hydrolyserer lysyl-alaninpeptidbindingen 05 (B29-B30), men også andre positioner i insulin under de i patent skriftet beskrevne betingelser. Trypsin hydrolyserer fortrinsvis ar-ginyi-glycinpeptidbindingen (B22-B23) frem for lysyl-alaninbindingen (B29-B30). Carboxypeptidase A kan ikke frigøre afaninen ved B-kæ-dens C-terminal alene uden at frigøre asparagin ved A-kædens C-ter-10 minal. En speciel betingelse, dvs. omsætning i en ammon iumhyd rogen -carbonatpufferopløsning, er nødvendig for at forhindre asparaginfri-gørelsen. Denne betingelse blev opdaget i 1978 (Hoppe-Seyler's Z.
Physiol. Chem., 359, 799-802 (1978)). Desuden kan peptidsyntese næppe finde sted, fordi hydrolysen sker hurtigere end syntesen i 15 denne tilstand.
Det konkluderes derfor, at der indtil nu ikke har været nogen industriel tilgængelig fremgangsmåde tii fremstilfing af human insulin.
Den foreliggende opfindelse kan imidlertid tilvejebringe human insulin i kommerciel målestok. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til 20 fremstilling af et B30-threonin-insulin er ejendommelig ved, at man omsætter et des-B30-insulin (herefter betegnet forbindelse II) med et overskud af et L-threoninderivat (herefter betegnet forbindelse I) med den almene formel: 25 Thr(R1)(R2) i hvori Thr stir for en L-threoninrest, R er hydrogen eller en hydro- 2 xybeskyttende gruppe, og R er en carboxylbeskyttende gruppe, i nærværelse af trypsin eller et trypsinlignende enzym og i en reak-30 tionsblanding med en pH-værdi på ca. 5-9 og en temperatur på ca.
0-50°C og indeholdende et vandblandbart organisk opløsningsmiddel, hvorpå den eller de beskyttende grupper fjernes. Denne fremgangsmåde frembyder mange fordele. Det er en specifik omsætning, som ikke ledsages af nogen ugunstig bireaktion, såsom racemisering.
35 Desuden kan uomsatte udgangsmaterialer let genvindes uden at være ødelagt, og de kan genanvendes. Fremgangsmåden benytter et overskud af et L-threoninderivat. Overskudet af threoninderivatet hin- 3 146482 drer brydning af arginincarbonylbindingen i B-kædens 22-stilling, selv om denne binding sædvanligvis spaltes med trypsin. Den beskyttelse af argininresten, som er ufravigelig ved sædvanlig enzymatisk omsætning, er følgelig ikke nødvendig ved denne fremgangs-05 måde.
Forbindelse II kan fremstilles ved omsætning af forskellige animalske insuliner (f.eks. svine-, kvæg-, hval-, fire-, kanin-, fiske-, abeinsulin, og lignende) med carboxypeptidase A som beskrevet af E.W. Shimitt et al. i Hoppe-Seyler's Z. Physiol.Chem., 359 , 799 10 (1978). Det kan også fremstilles ved anvendelse af en protease frem stillet af Achromobacter lyticus. Proteasen har en specificitet over for lysin og spalter specifikt lysincarbonylbindingen i peptidbindinger. Isolering og karakteristika er beskrevet af Masaki et al. i Agric.Biol.
Chem., 42, 1443 (1978). Enzymet kaldes Protease I. Fremstillingen 15 af des-B30-svineinsulin er beskrevet i Biochem.Biophys.Res.Commun.
92, 396-402 (1980) og japansk offentliggørelsesskrift 54-135789. Des--B30-insuliner af andre dyreinsuliner kan fremstilles på samme måde.
Forbindelse I's hydroxygruppe kan være beskyttet eller ej. Begge forbindelser kan benyttes ved omsætningen. Den beskyttende 20 gruppe, som anvendes, udvælges blandt vilkårlige af de hydroxybe-skyttende grupper, der i almindelighed anvendes ved peptidsyntese, såsom t-butyl, benzyl, acetyl og lignende. Forbindelse l's carboxyl-gruppe skal være beskyttet, og der kan anvendes en hvilken som helst af de ved peptidsyntese anvendte carboxylbeskyttende grupper, 25 f.eks. i form af alkylestere (f.eks. t-butylestere), aralkylestere (f.eks. benzylester), amid, substituerede amider (f.eks. anilid), salte (f.eks. natrium), osv.
En beskyttende gruppe bør udvælges under hensyntagen til indførings- og fjernelsesomsætningernes indvirkning på insulin, da 30 omsætningerne kan resultere i denaturering eller inaktivering af insulinet. Hvis en hydroxy beskyttende gruppe og en carboxylbeskyttende gruppe for threon in resten udvælges hensigtsmæssigt, er én fjernelsesprocedure tilstrækkelig til at fjerne begge de beskyttende grupper. Beskyttende grupper, der anvendes ved peptidsyntese, er 35 beskrevet nærmere af M. Bodanszky et al. i Peptide Synthesis, 2. udgave (1976) udgivet af John Wiley & Sons.
146482 4
Det ved fremgangsmåden anvendte enzym indbefatter enzymer, der kan fis fra forskellige planter og dyr. Som tidligere nævnt udføres omsætningen i nærværelse af trypsin eller et trypsinlignende enzym. Til illustration af trypsinlignende enzymer kan nævnes sådan-05 ne enzymer, som den af Morihara et al. isolerede protease, Arch.
Biochem. Biophys., 126, 971 (1968), og den af Yoshida et al. i FEBS Lett., 15, 129 (1971) beskrevne protease. Enzymet, som skal anvendes, kan behandles med tosyl-L-phenylalaninchlormethylketon (herefter forkortet TPCK) til fjernelse af blandede enzymer, såsom chymo-10 trypsin og chymotrypsinlignende enzym.
Desuden er Protease I, der produceres af Achromobacter lyti-cus M497-1, et trypsinlignende enzym og medregnet blandt enzymerne, der kan anvendes. Protease I virker specifikt på lysincarbonyi i peptidbindinger, og dets isolering og karakteristika er beskrevet i 15 Agric. Biol. Chem., 42, 1443 (1978).
Kondensationen af forbindelse I med forbindelse II gennemføres under betingelser, der er egnede til peptidsyntese med ovenstående enzymer. Omsætningen gennemføres således ved et pH på ca. 5 til 9, fortrinsvis pH ca. 6 til 7. Omsætningstemperaturen er ca. 0-50°C, 20 fortrinsvis ca. 20-40°C. Det ønskes, at koncentrationen af såvel forbindelse I som forbindelse II er si høj som mulig. Det foretrukne molforhold mellem forbindelse I og forbindelse II er ca. 5:1 til 1000:1, især ca. 25:1 til 200:1. Reaktionsblandingen indeholder som nævnt et vandblandbart organisk opløsningsmiddel. Tilsætningen af organisk 25 opløsningsmiddel sænker reaktionsblandingens vand koncentration, hvilket resulterer i, at den omvendte reaktion, dvs. hydrolyse af produktet hindres, og forøger også bemærkelsesværdigt opløseligheden af forbindelserne I og II. De organiske opløsningsmidler til brug herfor er f.eks. methanol, ethanol, dimethylformamid, dimethylsul-30 foxid, glycerol, og lignende. De kan anvendes enkeltvis eller som en blanding. Den foretrukne koncentration af det organiske opløsningsmiddel er ca. 0-65%, især ca. 40-60% af reaktionsblandingen.
Den relative mængde af det organiske opløsningsmiddel bør bestemmes af udgangsmaterialernes opløselighed, enzymets tilbøjelighed til 35 denaturering og dets hydrolyseaktivitet.
Reaktionsmediet kan udvælges blandt trishydroxymethylamino-methan (herefter forkortet til tris), carbonat, boratpufferopløsnin- 146482 5 ger, og lignende. Enzymkoncentrationen bestemmes i afhængighed af koncentrationen af substrater og enzymaktiviteten. F.eks. anvendes krystallinsk trypsinhandelsvare fortrinsvis i en koncentration fra ca. 1 mg/ml til 10 mg/rnl. Enzymet kan anvendes, som det er, eller 05 i fixeret form, såsom i kombination med eller som inklusion i en uopløselig bærer, såsom cellulose, dextran (f.eks. "Sephadex"), agarose (f.eks. "Sepharose"), polyacrylamidgel ("Bio-gel")/ porøst glas, og lignende.
Reaktionstiden er variabel og påvirkes af andre reaktionsbetin-10 gelser. Omsætningen kan fortsættes, indtil substratet og produktet kommer i ligevægt. Det tager i almindelighed ca. 3 til 72 timer, og i de fleste tilfælde ca. 6 til 24 timer.
Insulinproduktet kan isoleres ved kombination af de sædvanlige inden for peptidkemi anvendte metoder. Til illustration kan nævnes 15 følgende isoleringsfremgangsmåde: Reaktionsblandingen underkastes gelfiltrering til isolering og opsamling af uomsat forbindelse I og enzym. Udvundet forbindelse I og enzym kan genanvendes. Den tilbageværende del underkastes passende kromatografi til isolering af opnået beskyttet insulin og uomsat des-B30-insulin. Sidstnævnte kan gen-20 anvendes som forbindelse II. Førstnævnte underkastes en omsætning til fjernelse af den eller de beskyttende grupper.
Fjernelsen af den eller de beskyttende grupper gennemføres på sædvanlig måde, idet metoden dog skal udvælges i afhængighed af den beskyttende gruppes egenskaber. En t-butylgruppe er et eksem-25 pel på en beskyttende gruppe for såvel threoninens hydroxygruppe som dens carboxylgruppe. Den kan fjernes ved behandling med tri-fluoreddikesyre i nærværelse af et kation-opfangningsmiddel, f.eks. anisol. Som nævnt ovenfor bliver processen simpel, hvis en enkelt behandling kan fjerne den hydroxybeskyttende og den carboxylbeskyt-30 tende gruppe på én gang, og den resulterer i godt udbytte. Når C-terminalen i det opnåede insulin beskyttes med en anden ester, et amid, substitueret amid eller salt, kan den beskyttende gruppe fjernes ved passende hydrolyse- eller afsaltningsteknik.
Det ifølge opfindelsen fremstillede insulin er nyttigt til behand-35 |jng af diabetes og også som reagens.
Det ifølge opfindelsen opnåede insulin viser samme aktivitet til sænkning af blodsukkerniveau som okseinsulin i mus på følgende mide: 6 146682
Testmetode: Testforbindelsen opløses i 0,01M saltsyre, og opløsningen fortyndes til en passende koncentration (2,5 - 20 pg/ml) med 20 til 60 gange fysiologisk saltopløsning. Den resulterende opløsning administreres intravenøst i en mængde pi 0,1 ml/10 g legems-05 vægt til DS mus, der har fastet i 5 timer. Blod udtages fra orbital blodkar 45 minutter efter administreringen, og blodsukker måles ved hjælp af giucose-oxidasemetoden under anvendelse af et i handelen værende udstyr fremstillet af Boehringer Mannheim Corporation.
10 Tabel I
Insulinaktivitet
Test- Dosis Blodglucoseniveau forbindelse (pg/10 g legemsvægt) (mg/dl) 15 _
Fysiologisk saltopløsning - 112,2 ± 7,3 (1)
Semisyntetisk 0,25 80,2 ± 2,6 (2) human insulin 1 41,0 ± 6,0 (3) 20 _
Okseinsulin 0,25 73,2 ±1,5 (4) 1 41,0 ± 2,3 (5)
Note: (2)-(4), (3)-(5) ingen signifikant forskel.
25
Human insulin fremstillet ifølge opfindelsen kan administreres til mennesker pi samme mide som de på markedet værende svine-eller okseinsulinpræparater. Det kan anvendes til farmaceutiske præparater på sædvanlig måde. F.eks. kan det udformes som en injicer-30 bar opløsning ved hjælp af passende fremgangsmåder, såsom fremgangsmåder til fremstilling af zinkkompleks med zinkchlorid, en pufret opløsning med en passende puffer, såsom natriumhydrogenphosphat, natriumacetat, og lignende, og en isotonisk opløsning med natrium-chlorid. Desuden kan der tilsættes passende antiseptiske midler. Så-35 danne er f.eks. cresol, phenol, para-hydroxybenzoesyrealkylestere (f.eks. methyl-, ethyl-, propyl-, butylestere, og lignende). Dose- 7 146482 ringen af den humane insulin er som for insulinpræparaterne på markedet. Der kan således administreres ca. 1 til 100 enheder til voksne mennesker pr. dag, om end dosis afhænger af, hvor alvorlig diabetes lidelsen er.
05 De efterfølgende eksempler tjener til yderligere illustration og beskrivelse af den foreliggende opfindelse. Forkortelserne har følgende betydning: Ala: alanin, Arg: arginin, Asp: asparaginsyre,
CysOgH: cysteinsyre, Glu: glutaminsyre, Gly: glycin, His: histidin,
Ile: isoleucin, Leu: leucin, Lys: lysin, Phe: phenylalanin, Pro: pro-10 lin, Ser: serin, Thr: threonin, Tyr: tyrosin, Val: valin, Obu*: t--butylesterrest.
Eksempel 1 (1) Desalanin-(B30)-svineinsulin 15 Til en opløsning af svineinsuiin (500 mg) i 0,1M ammoniumhy- drogencarbonat (100 ml, pH 8,3) sættes krystallinsk carboxypepti-dase A (5 mg, Worthington Co., forbehandlet med diisopropylfluor-phosphat, 49 u/mg). Blandingen inkuberes ved stuetemperatur i 8 timer. Inkubationen afbrydes, når alanin frigøres i forhold på 20 0,77M/1M insulin. Reaktionsblandingen lyofiliseres. Produktet oplø ses i 0,5M eddikesyre og adsorberes på en søjle af "Sephadex G 50" (3,5 x 95 cm) af yderst fine partikler. Søjlen elueres med 0,5M eddikesyre med en portion på 11,5 ml pr. fraktion. Fraktion nr. 40-60 opsamles og lyofiliseres til frembringelse af den i overskriften anførte 25 forbindelse (460 mg). Udbyttet er 92%.
Produktet hydrolyseres til aminosyreanalyse med 6M saltsyre ved 110°C i 24 timer, hvorved følgende resultat fås. De i parentes viste tal er i hele beskrivelsen de teoretiske værdier.
Aminosyreanalyse: Lys 1,00 (1), His 1,91 (2), Arg 0,95 (1), 30 Asp 3,2I (3), Thr 2,09 (2), Ser 2,97 (3), Glu 7,35 (7), Gly 4,29 (4), Ala 1,26 (1), CysOgH 5,94 (6), Val 3,86 (4), Ile 1,55 (2), Leu 6,53 (6), Tyr 4,08 (4), Phe 3,22 (3), Pro 1,2 (1).
(2) |'B30-Thr-OBut1-svineinsuiin 35 Ovenstående produkt (100 mg, 10 mM) og L-threonin-t-butyl- ester (205 mg, 500 mM) opløses i en blanding (1,05 ml) af ethanol og dimethylformamid (1:1, vol./vol.) Til opløsningen sættes en op- 8 146482 løsning af krystallinsk trypsin (4 mg, Worthington Co., omkrystalliseret tre gange) i 0,5M boratpufferopløsning (0,75 ml, pH 6,5) og TPCK til en s lutkoncentration på 0,01 mM. Blandingen holdes natten over ved 37°C. Produktet bekræftes med hp væskekromatografi, og 05 det beregnede udbytte er 75%. Blandingen gøres sur med iseddikesyre og underkastes gelfiltrering med en søjle af "Sephadex G 50" (4,2 x 130 cm) af yderst fine partikler, hvorved der fis tre fraktioner svarende til trypsin, det i overskriften anførte insulinderivat og L-threonin-t-butylester. Målinger af enzymaktivitet og ninhydrin-10 reaktion viser, at henholdsvis trypsin og L-threonin-t-butylester genvindes 50%.
Den fraktion, der indeholder insulinderivatet, lyofiliseres til frembringelse af et råt pulver (89 mg) af den i overskriften anførte forbindelse. Produktet fyldes ved 4°C på en søjle af "DEAE-Sepha-15 dex A 25" (1,9 x 24,5 cm), som på forhånd er ligevægtsindstillet med 0,01M trispufferopløsning (pH 7,6) og 7M urinstof. Søjlen elu-eres med ovenstående pufferopløsning (800 ml), og der frembringes så en lineær Na+ gradient (til 0,3M NaCI), og der fås en fraktion A nær ved 0,08 til 0,09M koncentration og en fraktion B nær ved 0,13 20 til 0,14M. Hver fraktion dialyseres øjeblikkeligt mod 0,01M ammoniumacetat i 3 til 4 dage på et køligt sted og lyofiliseres, hvorved der fås et pulver (35 mg) fra fraktion A og et pulver (27 mg) fra fraktion B. Førstnævnte identificeres som den i overskriften anførte forbindelse, og sidstnævnte som en blanding af des-alanin-(B30)-svine-25 insulin og intakt svineinsulin ved hp væskekromatografi og polyacryl-amidgelelektroforese.
(3) Human insulin
Trifluoreddikesyre (2 ml) med anisol (0,2 ml) sættes til det ovenfor 30 opnåede produkt (30 mg), og blandingen holdes ved stuetemperatur i 30 minutter. Trifluoreddikesyren fjernes under nitrogenatmosfære, og blandingen ekstraheres med ether (15 ml) efter tilsætning af 1N eddikesyre (2 ml) til fjernelse af anisolen. Eddikesyrelaget lyofiliseres, hvorved den i overskriften anførte forbindelse fås (28 mg). Udbyt-35 tet er 43% beregnet ud fra udgangsforbindelsen i 77% renhed.
Produktet identificeres som den i overskriften anførte forbindelse ved aminosyreanalyse, "Slab" gelelektroforese og hp væske 9 146482 kromatografi. Aminosyreanalysen gennemføres under samme betingelser som i afsnit (1), og resultatet er som følger:
Aminosyreanalyse: Lys 1,00 (1), His 1,89 (2), Arg 0,87 (1),
Asp 3,32 (3), Thr 3,16 (3), Ser 2,99 (3), Glu 7,35 (7), Pro 1,29 05 CD, Gly 4,39 (4), Ala 1,26 (1), CysC>3H 4,6 (6), Val 3,93 (4), Ile 1,61 (2), Leu 6,51 (6), Tyr 3,68 (4), Phe 3,19 (3).
Eksempel 2 (1) Desalanin-(B30)-o kseinsulin 10 Til en opløsning af okseinsulin (200 mg) i 0,1M ammoniumhy- drogencarbonat (40 ml) sættes krystallinsk carboxypeptidase A (1,8 mg, 49 u/mg). Blandingen holdes natten over ved stuetemperatur og lyofiliseres, hvorved der fås et råt pulver (180 mg) af den i overskriften anførte forbindelse. Man forvisser sig om, at produktet be-15 står af 78% af den i overskriften anførte forbindelse og 22% desaspa-ragm-(A21)-desalanin-(B30)-insulin.
(2) [BSO-Thr-OBu*'] -okseinsulin
Det under afsnit (1) ovenfor opnåede produkt (116 mg, 5 mM) 20 og L-threonin-t-butylester (448 mg, 500 mM) opløses i en blanding (2,4 ml) af ethanol og dimethylformamid (1:1). Opløsningen blandes med 0,5M boratpufferopløsning (1,6 ml, pH 7,0) indeholdende krystallinsk trypsin (87,5 mg, 0,94 mM) og TPCK (0,27 mg, 0,2 mM) og inkuberes natten over ved 37°C. Fremstillingen af den i overskrif-25 ten anførte forbindelse bekræftes ved hp væske kromatografi, og udbyttet beregnes til 80%.
Reaktionsblandingen behandles på samme måde som i eksempel 1 (2) . Den resulterende fraktion A rekromatograferes for at fjerne desasparagin-(A21)-desalanin-(B30)-insulin og behandles pi samme 30 måde som i eksempel 1 (2), hvorved der fås et råt pulver (63 mg).
Produktet identificeres som den i overskriften anførte forbindelse ved hp væske kromatografi og "Slab" gelelektroforese.
(3) [B30-Thr1-okseinsulin 35 Til produktet (63 mg) fra afsnit (2) ovenfor sættes trifluoreddi- kesyre (2 ml) med anisol (0,2 ml). Blandingen holdes ved stuetemperatur i 30 minutter, behandles så på samme måde som i eksempel 1 146482 10 (3) og lyofiliseres, hvorved der fis den i overskriften anførte forbindelse (60 mg). Udbyttet er 66% beregnet ud fra udgangsforbindelsen i 78% renhed.
Produktet identificeres ved hjælp af [B30-Thr]-okseinsulin frem-05 stillet på en anden måde, ved aminosyreanalyse, "Slab" gelelektroforese og hp væske kromatografi. Aminosyreanalysen gennemføres under samme betingelser som i eksempel 1 (1), og resultatet er som følger:
Aminosyreanalyse: Lys 1,00 (1), His 1,95 (2), Arg 0,98 (1),
Asp 3,00 (3), Thr 2,00 (2), Ser 2,83 (3), Glu (6,69 (7), Gly 4,06 10 (4), Ala 2,06 (2), Cys03H 5,38 (6), Val 4,45 (5), Ile 0,76 (1), Leu 6,14 (6), Tyr 3,92 (4), Phe 2,97 (3), Pro 1,20 (1).
Eksempel 3 (1) [B30-Thr-OBu*j-svineinsulin 15 Desalanin-(B30)-svineinsulin (100 mg, 10 mM) fremstillet ved fremgangsmåden i eksempel 1 (1) og L-threonin-t-butylester (205 mg, 500 mM) opløses i en blanding af (1,05 ml) af ethanol og dime-thylformamid (1:1, vol./vol.). Opløsningen blandes med en 0,5M borat-pufferopløsning (0,7 ml) og Protease I (0,35 mg) fremstillet med 20 Achromobacter lyticus M497-1 og inkuberes ved ved 37°C i 2 dage.
Reaktionsblandingen gøres sur med iseddikesyre og underkastes gelfiltrering med en søjle (4,2 x 130 cm) af "Sephadex G 50" med yderst fine partikler til adskillelse i en enzymfraktion, en insulinfraktion og en threoninfraktion. Enzymet og L-threonin-t-butyleste-25 ren genvindes mere end 50%. Insulinfraktionen lyofiliseres, hvorved der fås et rit pulver (83 mg). Pulveret underkastes søjlekromatogra-f? på samme måde som i eksempel 1 (2), hvorved der fis et pulver (48 mg) fra fraktion A og et andet pulver (20 mg) fra fraktion B. Førstnævnte identificeres som den i overskriften anførte forbindelse, 30 og sidstnævnte som en blanding af desalanin-(B30)-svineinsulin og et kontamineret svineinsulin.
(2) Human insulin
Det ovenfor opnåede produkt (40 mg) behandles med trifluor-35 eddikesyre (2 ml) og anisol (0,2 ml). Blandingen holdes ved stuetemperatur i 30 minutter og behandles så på samme mide som i eksempel 1 (3), hvorved der fås den i overskriften anførte forbindelse
Claims (5)
1. Fremgangsmåde til fremstilling af et B30-threonin-insulin, KENDETEGNET ved, at man omsætter et des-B30-insulin med et 15 overskud af et threoninderivat med den almene formel: Thr(R1)(R2) o 1 hvori Thr står for en L-threoninrest, R er hydrogen eller en hy- 2 20 droxybeskyttende gruppe, og R er en carboxylbeskyttende gruppe, i nærværelse af trypsin eller et trypsinlignende enzym og i en reaktionsblanding med en pH-værdi pi ca. 5-9 og en temperatur pi ca. 0-50°C og indeholdende et vandblandbart organisk opløsningsmiddel, hvorpå den eller de beskyttende grupper fjernes. 25
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at enzymet er trypsin.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at det 30 trypsinlignende enzym er Protease I.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at molforholdet mellem L-threoninderivatet og des-B30-insulinet er 5:1 til 1000:1. 35
5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, KENDETEGNET ved, at molforholdet er 25:1 til 200:1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK545181A DK155887C (da) | 1979-04-13 | 1981-12-09 | Fremgangsmaade til fremstilling af oeb30-thr(r1)(r2)aa - insulin |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4571179 | 1979-04-13 | ||
| JP4571079 | 1979-04-13 | ||
| JP4571079A JPS55138393A (en) | 1979-04-13 | 1979-04-13 | Semisynthesis of insulin |
| JP4571179A JPS55138391A (en) | 1979-04-13 | 1979-04-13 | New synthetic method of peptide derivative |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK155680A DK155680A (da) | 1980-10-14 |
| DK146482B true DK146482B (da) | 1983-10-17 |
| DK146482C DK146482C (da) | 1986-10-06 |
Family
ID=26385768
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK155680A DK146482C (da) | 1979-04-13 | 1980-04-11 | Fremgangsmaade til fremstilling af et b30-threonin-insulin |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0017938B1 (da) |
| DE (1) | DE3064479D1 (da) |
| DK (1) | DK146482C (da) |
| NO (1) | NO153061C (da) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1986005496A1 (en) * | 1985-03-15 | 1986-09-25 | Nordisk Gentofte A/S | Novel insulin derivatives and pharmaceutical preparations containing these derivatives |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK147437A (en) * | 1980-02-11 | 1900-01-01 | Process for preparing human insulin or threonine B30 esters of human insulin, or a salt or complex thereof | |
| DK319780A (da) * | 1980-07-24 | 1982-01-25 | Forenede Bryggerier As | Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyren i insuliner |
| DE3101382A1 (de) * | 1981-01-17 | 1982-09-02 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | "verfahren zur herstellung von humanisulin oder dessen derivaten aus schweineinsulin oder dessen derivaten" |
| DK353781A (da) * | 1981-08-10 | 1983-02-11 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til fremstilling af insulinderivater |
| AU550062B2 (en) * | 1981-08-10 | 1986-02-27 | Nordisk Insulinlaboratorium | A process for the preparation of an insulin derivative |
| AU551174B2 (en) * | 1981-09-15 | 1986-04-17 | Nordisk Insulinlaboratorium | Enzymatic preparation of human insulin or b-30 esters thereof |
| DK149824C (da) * | 1982-01-22 | 1987-03-16 | Carlsberg Biotechnology Ltd | Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyrer i insuliner |
| WO1983002772A1 (en) * | 1982-02-08 | 1983-08-18 | Robin Ewart Offord | An improved method for preparing human insulin from non-human insulin |
| DE3209184A1 (de) * | 1982-03-13 | 1983-09-15 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur umwandlung von praeproinsulinanaloga zu insulinen |
| NL8201650A (nl) * | 1982-04-21 | 1983-11-16 | Akzo Nv | Semisynthetische bereiding van humane insuline. |
| DK182483A (da) * | 1982-04-23 | 1983-10-24 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Fremgangsmaade til semi-syntese af humant insulin og alkalisk protease til anvendelse derved |
| DK55183D0 (da) * | 1983-02-09 | 1983-02-09 | Nordisk Insulinlab | Fremgangsmade til fremstilling af human insulin |
| DE3326472A1 (de) * | 1983-07-22 | 1985-02-14 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue insulin-derivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung sowie pharmazeutische mittel zur behandlung des diabetes mellitus |
| DE3333640A1 (de) * | 1983-09-17 | 1985-04-25 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von insulin-derivaten, deren b-kette c-terminal verlaengert ist, neue basisch modifizierte insulin-derivate diese enthaltende mittel und ihre verwendung |
| EP0294851A3 (de) * | 1987-06-12 | 1990-05-09 | Berlin-Chemie Ag | Verfahren zur Herstellung von Humaninsulin und seinen Derivaten |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3276961A (en) * | 1963-04-08 | 1966-10-04 | Squibb & Sons Inc | Process for preparing human insulin |
| NL7110277A (da) * | 1970-07-31 | 1972-02-02 | ||
| GB1426061A (en) * | 1972-12-28 | 1976-02-25 | Ici Ltd | Polypeptides |
| CH602599A5 (en) * | 1974-03-27 | 1978-07-31 | Ciba Geigy Ag | Insulin prodn. using different cysteine protecting groups |
| GB1465235A (en) * | 1975-04-29 | 1977-02-23 | Sagami Chem Res | Process for preparing peptides |
| US4116768A (en) * | 1975-04-29 | 1978-09-26 | (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center | Process for producing a peptide |
-
1980
- 1980-04-11 NO NO801048A patent/NO153061C/no unknown
- 1980-04-11 DE DE8080101966T patent/DE3064479D1/de not_active Expired
- 1980-04-11 EP EP80101966A patent/EP0017938B1/en not_active Expired
- 1980-04-11 DK DK155680A patent/DK146482C/da not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1986005496A1 (en) * | 1985-03-15 | 1986-09-25 | Nordisk Gentofte A/S | Novel insulin derivatives and pharmaceutical preparations containing these derivatives |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO801048L (no) | 1980-10-14 |
| DK155680A (da) | 1980-10-14 |
| DK146482C (da) | 1986-10-06 |
| EP0017938B1 (en) | 1983-08-03 |
| NO153061C (no) | 1986-01-08 |
| DE3064479D1 (en) | 1983-09-08 |
| NO153061B (no) | 1985-09-30 |
| EP0017938A1 (en) | 1980-10-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4320196A (en) | Semi-synthesis of human insulin | |
| JP4519324B2 (ja) | 共有結合で架橋されたインスリンダイマー | |
| US4701440A (en) | Insulin derivatives, processes for their preparation and their use, and pharmaceutical agents for the treatment of diabetes mellitus | |
| DK146482B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af et b30-threonin-insulin | |
| US5015728A (en) | Process for the preparation of insulin derivatives, the B chain of which is lengthened c-terminally | |
| HU201096B (en) | Crystal suspensions of insulin derivatives, process for their preparation and their use | |
| PL191901B1 (pl) | Sposób wytwarzania prekursorów insuliny i pochodnych insuliny | |
| CA2083360A1 (en) | Tri-arginine insulins | |
| US4320197A (en) | Semi-synthesis of human insulin | |
| US5149716A (en) | Insulin derivatives, process for their preparation, their use and a pharmaceutical preparation containing them | |
| JPS642360B2 (da) | ||
| FI79853B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av insulinderivat. | |
| MOLLAY et al. | Isolation of a dipeptidyl aminopeptidase, a putative processing enzyme, from skin secretion of Xenopus laevis | |
| FI78119C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av maenskligt insulin eller b-30-estrar daerav. | |
| FI79117B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av bovine-, svin- eller humaninsulin. | |
| JPH06128287A (ja) | ペプチドおよびその製造方法 | |
| US5049545A (en) | Insulin derivatives, a process for their preparation, and their use | |
| DK155887B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af oeb30-thr(r1)(r2)aa - insulin | |
| FI73239B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av ett insulinderivat. | |
| EP0087238A1 (en) | Am improved method for preparing human insulin from non-human insulin | |
| EP0348399B1 (fr) | Sorbine et peptides derives, elevant l'absorption par les muqueuses | |
| NO163531B (no) | Beskyttet b30-thr(r1)(r2)-insulin egnet for fremstilling av et b30-threonininsulin. | |
| JPH0150719B2 (da) | ||
| JPS6312480B2 (da) | ||
| JPH0150718B2 (da) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |