NO790375L - Substrater for bestemmelse av proteaser - Google Patents

Substrater for bestemmelse av proteaser

Info

Publication number
NO790375L
NO790375L NO790375A NO790375A NO790375L NO 790375 L NO790375 L NO 790375L NO 790375 A NO790375 A NO 790375A NO 790375 A NO790375 A NO 790375A NO 790375 L NO790375 L NO 790375L
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
group
proteases
protecting group
gly
arg
Prior art date
Application number
NO790375A
Other languages
English (en)
Inventor
Karl Goeran Claeson
Leif Erik Aurell
Leif Roger Simonsson
Salo Arielly
Original Assignee
Kabi Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kabi Ab filed Critical Kabi Ab
Publication of NO790375L publication Critical patent/NO790375L/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0821—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp
    • C07K5/0825—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp and Glp-amino acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
    • C12Q2337/20—Coumarin derivatives
    • C12Q2337/22—7-Amino-4-methylcoumarin, i.e. AMC, MCA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
    • C12Q2337/30—Naphthyl amides, e.g. beta-NA, 2-NA, 4-methoxy-beta-naphthylamine, i.e. 4MNA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
    • G01N2333/96444—Factor X (3.4.21.6)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/968—Plasmin, i.e. fibrinolysin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/972—Plasminogen activators
    • G01N2333/9723—Urokinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/972—Plasminogen activators
    • G01N2333/9726—Tissue plasminogen activator
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/802—Chromogenic or luminescent peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse angår nye lett spaltbare substrater beregnet på anvendelse som reagens for kvantitativ bestemmelse av serinproteaser og SH-proteaser, og for studium av reaksjoner i hvilke serinproteaser dannes, inhiberes eller forbrukes, eller for bestemmelse av faktorer som' påvirker eller deltar i slike reaksjoner.
I de senere år er en rekke syntetiske peptidsubstrater be-skrevet. De fleste av disse oppviser en tripeptidkjede i hvilken enten den N-endeavsluttende aminosyres aminogruppe er blokkert med en acylgruppe eller har vært fri, men da foreliggende i D-konfigurasjon. Den C-endeavsluttende aminosyre har vært blokkert med en kromogen eller fluorogen gruppe som avspaltes under enzymets reaksjon med substratet. Den derved dannede, frigjorte kromofore eller fluorescerende gruppe kan bestemmes kvantitativt ved fotometriske eller fluorescensfot omet riske metoder. Ved å
måle den pr. tidsenhet frigjorte mengde spaltningsprodukt kan den enzymatiske aktivitet beregnes.
Den korte peptidkjede er viktig for substratets affinitet til enzymet. Herunder synes det å være viktig at den N-terminale aminosyre enten foreligger i L-form med aminogruppen acylert eller også i D-form med fri aminogruppe. Det har nu vist seg at substrater med en N-terminale pyro-glutaminsyre spaltes meget lett av en rekke serinproteaser.Pyro-glutaminsyre, hvis a-aminogruppe ikke er fri, men acylert ved ringslutning, lactam av glutaminsyre,
har tidligere ikke vært anvendt i peptider beregnet som substrat for bestemmelse av enzymer.
De nye kromogene substrater ifølge oppfinnelsen karak-teriseres av følgende generelle formel:
eller salter derav, hvor
kan være hydrogen eller en beskyttelsesgruppe, fortrinnsvis t-butyloxycarbonyl eller benzyloxycarbonyl,
A1 kan være valgt blant aminosyrene Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Pro, Pip, Phe eller Tyr,
A2kan være Arg eller Lys,
R2 kan være en aromatisk, eventuelt substituert, hydrocarbongruppe hvor -NH-R2 er en fysikalsk-kjemisk bestembar gruppe, fortrinnsvis en kromogen eller fluorogen gruppe, som spaltes av det nevnte enzym og da danner et spaltningsprodukt med formelen H2N-R2, hvis mengde kan bestemmes kvantitativt.
Ved syntese av de nye substrater ifølge oppfinnelsen anvendes konvensjonelle, i peptidkjemien vel kjente beskytteises-grupper og koblingsmetoder.
Prinsippet for syntesen kan være trinnvis oppbygning av aminosyrene på den C-terminale arginyl- eller lysylgruppe, enten fra begynnelsen av forsynt med påkoblet bestembar gruppe (-HN-R2
i formelen), som derved tjenestegjør som carboxylbeskyttelsesgruppe eller forsynt med avspaltbar carboxylbeskyttelsesgruppe,
og den bestembare gruppe kobles da til det beskyttede tripeptid-derivat, eller man kan velge å syntetisere det N-terminale, beskyttede dipeptidfragment for seg, som derefter kobles til arginyl- eller lysylresten med eller uten bestembar gruppe ifølge foregående resonnement. Uavhengig av den valgte syntesevei ut-føres rensning av mellom- og sluttprodukter ved hjelp av omkrys-tallisasjon og/eller gelfiltreringskromatografi.
Oppfinnelsen eksemplifiseres av følgende utførelseseksempel.
Ved dan tynnskiktskromatografiske analyse av eluat og produkt anvendes glassplater med silicagel^254(Merck) som absorpsjonsmiddel. Som oppløsningsmiddelsystem ble anvendt:
A : n-butanol:HOAc:vann, 3:2:1 (volum)
P1: kloroform:MeOH, 9:1 (volum)
Efter tynnskiktskromatograferingen studeres platene først i UV-lys (254 nm), og derpå spyles de med ninhydrin og behandles derefter med dicarboxidin/klor ifølge vanlig fremgangsmåte. Angitte Rf-verdier er resultatet fra enkelte kromatograferinger.
De nedenfor anvendte forkortelser har følgende betydninger:
Aminosyrer :
Forkortelsene betegner aminosyrerester. Den frie aminosyre eller peptidet angies av H- ved aminogruppen og -0H ved carboxyl-gruppen. Aminogruppen angies alltid til venstre og carboxyl-gruppen til høyre. Alle aminosyrer med unntagelse av Gly har L-konfigurasjon hvor annet ikke er angitt.
Ala = Alanin Pha = Fenylalanin
Arg = Arginin Pip = Pipekolinsyre
Gly = Glycin Pro = Prolin
Ile = Isoleucin Ser = Serin
Leu = Leucin Thr = Treonin
Lys = Lysin Tyr = Tyrosin
p-Glu = pyro-glutaminsyre Val = Valin
Øvrige forkortelser:
HOAc = eddiksyre
Bz = benzoyl
Cbo = carbobenzoxy
DCCI = dicyclohexylcarbodiimid
PClg = fosfortriklorid
DMF = dimethylf ormamid
Et^N = triethylamin
HOBT = hydroxybenzotriazol
DCHA = dicyclohexylamin
DCU = dicyclohexylurea
EtOH = ethylalkohol
MeOH = methylalkohol
EtOAc = ethylacetat
OpNP = p-nitrofenoxy
pNA = p-nitroanilid
TFA = trifluoreddiksyre
(3-NA = (3-nafthylamid
4-MeO-|3-NA = 4-raethoxy-(3-nafthylamid
7-A-4-M-C = 7-amino-4-methyl-coumarin
Eksempel I
p-Glu-Gly-Arg-pNA-HCl Molvekt = 498,9
Ia Cbo-Gly-Arg(N02)pNA Molvekt = 530,5
Til 35 g (0,074 mol) Cbo-Arg(N02)-pNA settes 175 ml konsen-te rt HOAc og 105 ml 5,6 M HBr i HOAc. Reaksjonen får forløpe under omrøring i 30 minutter efter at reaksjonsoppløsningen er klarnet. Derefter helles reaksjonsblandingen i ca. 2 liter tørr ether under kraftig omrøring. Den dannede feining frafiltreres og vaskes med tørr ether og tørres derefter i vakuum over NaOH. Det erholdte HBr-salt av H-arg(N02)-pNA oppløses i 150 ml tørr, destillert DMF og nøytraliseres koldt (-10°C) med Et^N inntil man får svakt basisk reaksjon med fuktet pH-papir overfor reaksjonsblandingen. (Bruker vanligvis å være ca. 1,5 ekvivalenter HBr å nøytralisere.) Det dannede Et^NHBr frafiltreres. Til reaksjonsblandingen settes koldt 1,1 ekvivalent = 0,81 mol = 26,8 g Cbo-Gly-OpNP, og efter 30 minutter tilsettes ytterligere 0,5 ekvivalent = 5,2 ml Et^N. Reaksjonen får forløpe ved værelsetemperatur over natten, hvorefter reaksjonsblandingen inndampes i vakuum til en olje. Oljen tritureres i en vannoppløsning av 2% NaHCO^, hvorefter den oppløses i varm MeOH og krystalliserer under omrør-ing og avkjøling. Den dannede krystallmasse frafiltreres og vaskes med kold MeOH. TLC viser bare svake forurensninger, hvor-for produktet omkrystalliseres fra det samme oppløsningsmiddel. Der fåes rent hvite krystaller som er rene ved TLC. Utbytte: 34 g (86%) av Ia.
Rf0,20(P1) [a]^<3>- 35,4° (c0,3 MeOH)
Ib' Cbo - p-Glu-OH Molvekt = 263,3
56,3 g (0,20 mol) Cbo-Glu-OH oppløses i 400 ml EtOAc og 49,4 g (0,24 mol) DCCI oppløst i 60 ml EtOAc tilsettes under om-røring i isbad. Efter 2 timer frafiltreres den dannede DCU, og produktet inndampes til tørrhet. Produktet (anhydridet av Cbo-Glu) krystalliseres fra EtOAc + petrolether, frafiltreres og vaskes med petrolether. Anhydridet oppløses i 120 ml dioxan + 26o ml ether, hvorefter 48 ml DCHA oppløst i ether til 100 ml tilsettes. Efter en stund faller Cbo-p-Glu•DCHA ut. Omrøringen fortsettes i en times tid, hvorefter det dannede DCHA-salt frafiltreres og
vaskes med ether og EtOAc. DCHA-saltet oppslemmes i EtOAc og rystes med 25 g (0,18 mol) KHSO^oppløst i vann, hvorved den dannede Cbo-p-Glu-OH går over i EtOAc-fasen. EtOAc-fasen vaskes med 10%-ig NaCl i H20 og tørres over Na2S0^(risiko for at produktet faller ut). EtOAc-fasen inndampes til lite volum og felles med petrolether, hvorved man får tunge krystaller av Ib'
som er rene ifølge TLC. Utbytte: 36,9 g (70%) av Ib'
Rf=0,45 (A) [a]p<4>- 30,3° (c 1,0 MeOH)
Ib Cbo - p-Glu-Gly-Arg(N02)pNA Molvekt = 64l,6
10,25 g (18,3 mmol) av H-Gly-Arg(N02)pNA-HBr erholdt ved fjernelse av beskyttelsen fra Cbo-Gly-Arg(N02)pNA med HBr på
samme måte som i eksempel Ia oppløses i 35 ml tørr DMF og nøy-traliseres koldt v (-10°C) med Et 3N til man får basisk reaksjon med fuktet pH-papir. Dannet Et^NHBr frafiltreres. Reaksjonsblandingen tilsettes 2,47 g (18,3 mmol) HOBT, 5,26 g (20 mmol) Cbo-p-Glu-OH (Ib'), og koldt tilsettes 4,539(22 mmol) DCCI opp-løst i litt DMF. Hensettes over natten ved værelsetemperatur, hvorefter reaksjonsoppløsningen inndampes i vakuum til en olje. Oljen tritureres med 2%-ig NaHCO^i vann og rent vann. Den erholdte hårde masse oppløses i litt aceton, hvorefter varm MeOH og litt vann tilsettes. Produktet krystalliserer, ved avkjøling og under omrøring til en krystallmasse som frafiltreres. Den erholdte Ib er ren ifølge TLC. Man får efter nøyaktig tørring i vakuum 8,90 g (76%) Ib
Rf = 0,06 (P1) [a]^<1>- 21,5° (c 0,8 DMF)
I
0,8 g (1,25 mmol) av Ib befries for beskyttelse med 30 ml
HF ved 0°C i 1 time i nærvær av 0,6 ml anisol. Efter inndampning
i vakuum oppløses produktet i ca. 30 ml 2%-ig HOAc og vaskes med litt ether. Vannfasen kromatograferes på en kolonne med "Sephadex G-15"(Pharmacia Fine Chemicals) i 2%-ig HOAc med samme middel som elueringsmidlet.Fraksjoner med det rene acetat av I frysetørres og ionebyttes på en kolonne med QAE-25 (Pharmacia Fine Chemicals) i kloridform med EtOH-H20(1:1) med samme middel som elueringsmidlet. Fraksjonen med det rene hydroklorid av I frysetørres. Man får 485 mg (78%) av I. TLC (Rf = 0,29 (A))
viser en eneste flekk.
[a]^ - 54,1° (c 1,0, 50% H0Ac/H20)
De i tabell I angitte eksempler II - XIII er fremstilt på prinsipielt samme måte som i ovenstående eksempel, og derfor er bare fysikalske data, utbytte, metode for kobling og rensning med-tatt i tabellform.
Eksempel XIV
p-Glu-Gly-Arg-4-Meo-(3-NA«HCl Molvekt = 534,0
XIV a p-Glu-Gly-Arg-OH-HCl Molvekt = 378,8
Til en oppløsning av 250 mg (0,50 mmol) p-Glu-Gly-Arg-pNA«HCl (S-2444) i 100 ml 0,1 M NaHCO^i H20 settes trypsin (Novo, 400 (il av en oppløsning av 0,2 mg trypsin pr. ml 1 mM HC1). pNA-avspaltningen følges på et spektrofotomet er ved 405 nm. Avspaltningen er ferdig efter ca. 45 minutter, og oppløsningen surgjøres da med HOAc til pH ca. 4, hvorefter den inndampes til tørrhet, oppløses i methanol og kromatograferes på en kolonne med LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals) i methanol med samme middel som elueringsmidlet. Fraksjonen med den rene syre XIV a inndampes, oppløses i H,_,0 og frysetørres. Utbytte: 167 mg (88%) av XIV a, som er rent ifølge TLC. Rf = 0,08 (A).
XIV:
Til en oppløsning av 105 mg (0,50 mmol) 4-MeO-(3-NA«HCl i 2,25 ml tørr pyridin tilsettes under vannfrie betingelser og under avkjøling i isbad en oppløsning av 27 M-l (0,25 mmol) PCl^i 450 |il tørr pyridin. Efter ca. 45 minutter ved værelsetemperatur tilsettes alt XIV a erholdt ifølge ovenstående. Når reaksjonen stanser (efter omtrent en time), inndampes reaksjonsblandingen til en mørkerød olje (redusert trykk). Oljen oppløses i litt EtOH-H20 (1:1) og påføres på en kolonne med QAE-25 (Pharmacia Fine Chemicals) i kloridform i EtOH-H20 (1:1) med samme middel som eluerings-middel. Fraksjonen med det nesten rene hydroklorid av XIV inndampes, løses på nytt i litt EtOH-H20 (1:1), og fremgangsmåten gjentaes. Det således erholdte hydroklorid av XIV er rent og frysetørres efter fordampning av all alkohol.
Utbytte: 85 mg (36%) av XIV
TLC (Rf = 0,24 (A)) viser bare én flekk.
[a]D " 45,7° (c0,6, 50%hoac/h2o)
Eksempel XV
Utførelse analogt med eksempel XIV, men med 88 mg (0,50 mmol) 7-<A.>j^4-M<->C som amin istedenfor 4-MeO-|3-NA'HC<l>.
Utbytte: 84 mg (32%) av XV
TLC (Rf = 0,25 (A)) viser bare én flekk.
[a]D- 51,5° (c 1, 50% H0Ac/H20)
Bestemmelse av proteaser ved hjelp av substrater med avspaltbar
og fysikalsk- kjemisk bestembar gruppe
De ifølge eksemplene fremstilte substrater anvendes for å bestemme forskjellige enzymer ifølge det efterfølgende.
Prinsippet for bestemmelse er bestemt på at det ved enzym-atisk hydrolyse dannede spaltningsprodukt oppviser et fra substratet i hovedsaken forskjellig UV-spektrum. Således har f.eks. alle p-nitroanilidsubstrater ifølge oppfinnelsen absorpsjonsmak-sima omkring 310 nm med den molare ekstinksjonskoeffisient på ca. 12.000. Ved 405 nm har disse substraters absorpsjon nesten helt opphørt. p-nitroanilin som avspaltes fra substrater under den enzymatiske hydrolyse, har et absorpsjonsmaksimum ved 380 nm med en molar ekstinksjonskoeffisient på 13.200, som ved 405 nm bare har avtatt til 9.620. Ved spektrofotometrisk å måle ved 405 nm kan man derfor lett følge mengden av dannet p-nitroanilin, som er proporsjonal med graden av den enzymatiske hydrolyse, som i sin tur bestemmes av den aktive mengde enzym.
For beregning av dannet mengde fluorescerende amin bestråles prøven i et fluorescensfotometer med lys med en eksiterende bølgelengde (omkring 350 nm for (3-nafthylamin og 4-methoxy-(3-nafthylamin, og 380 nm for 7-amino-4-methyl-coumarin), og mengden av(spaltningsprodukt fåes derefter ved måling av det emitterte lys (omkring 420 nm for (3-nafthylamin og 4-methoxy-(3-nafthylamin, og 440 nm for 7-amino-4-methyl-coumarin).
Tabell II viser de syntetiserte substraters reaksjonshastig-heter med forskjellige enzymer. Reaksjonshastigheten er satt i forhold til et referansesubstrat (reaksjonshastighet = 100) for hvert enzym. En del av referansesubstratene er tidligere kjent og også kommersielt tilgjengelige. Av tabellen fremgår tydelig an-vendbarheten av de nye substrater ifølge oppfinnelsen samt at disse av flere enzymer hydrolyseres hurtigere enn hittil tilgjengelige substrater.
Referansesubstratenes følsomhet overfor respektive enzymer:

Claims (6)

1. Lett spaltbare enzymsubstrater for kvantitativ bestemmelse av proteaser, karakterisert ved at de har den generelle formel: R1 - p-Glu - A1 - A2 - NH - R2 , hvor er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe, fortrinnsvis t-butyloxycarbonyl eller benzyloxycarbonyl; A-j^ er Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Pro, Pip, Phe eller Tyr; A2 er Arg eller Lys; R2 er en aromatisk, eventuelt substituert, hydrocarbongruppe, hvor -NH-R2 utgjør en fysikalsk-kjemisk bestembar gruppe, fortrinnsvis en kromogen eller fluorogen gruppe som spaltes av nærværende enzym og da danner et spaltningsprodukt med formelen H„N-R„, hvis mengde er bestembar.
2. Lett spaltbare enzymsubstrater ifølge krav 1, karakterisert ved at R2 er pNA, p-NA, 4-MeO-f3-NA, 7-A-4-M-C.
3. Fremgangsmåte ved fremstilling av lett spaltbare enzymsubstrater for proteaser med den generelle formel: R1 - p-Glu - Ax - A2 - NH - R2 , hvor R± er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe, fortrinnsvis t-butyloxycarbonyl eller benzyloxycarbonyl; A± er Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Pro, Pip, Phe eller Tyr; A2 er Arg eller Lys; R2 er en aromatisk, eventuelt substituert, hydrocarbongruppe, hvor -NH-R2 utgjør en fysikalsk-kjemisk bestembar gruppe, fortrinnsvis en kromogen eller fluorogen gruppe, som avspaltes av nærværende enzym og da danner et spaltningsprodukt med formelen H2N-R , hvis mengde kan bestemmes kvantitativt, karakterisert ved at syntesen utføres enten ved trinnvis oppbygning på A_, som bærer R2 , eller en avspaltbar carboxyl-beskyttelsesgruppe, som derefter erstattes med R2 , eller fra R1 - p-Glu - A, hvor R1 er en beskyttelsesgruppe, fortrinnsvis t-butyloxycarbonyl eller benzyloxycarbonyl ved kobling til A2 - NH - R2 , idet R2 kan innføres separat i utbytning mot en avspaltbar carboxyl-beskyttelsesgruppe.
4. Fremgangsmåte ved fremstilling av lett spaltbare enzymsubstrater for proteaser ifølge krav 3, karakterisert ved at R2 er pNA, (3-NA, 4-MeO-p-NA, 7-A-4-M-C.
5. Fremgangsmåte ved laboratoriediagnostikk av proteaser, karakterisert ved at der som substrat anvendes en forbindelse med den generelle formel:
hvor R1 er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe, fortrinnsvis t-butyloxycarbonyl eller benzyloxycarbonyl; Ax er Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Pro, Pip, Phe eller Tyr; A2 er Arg eller Lys; R2 er en aromatisk, eventuelt substituert, hydrocarbongruppe hvor -NH-R2 er en fysikalsk-kjemisk bestembar gruppe, fortrinnsvis en kromogen eller fluorogen gruppe, som spaltes av nærværende enzym og da danner et spaltningsprodukt med formelen H2 N - R2 , hvis mengde er bestembar.
6. Fremgangsmåte ved laboratoriediagnostikk av proteaser ifølge krav 5, karakterisert ved at der som substrat anvendes en forbindelse med den generelle formel:
hvor R.^ er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe, fortrinnsvis t-butyloxycarbonyl eller benzyloxycarbonyl; Ax er Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Pro, Pip, Phe eller Tyr; A2 er Arg eller Lys; R2 er pNA, (3-NA, 4-MeO-(3-NA, 7-A-4-M-C.
NO790375A 1978-02-07 1979-02-06 Substrater for bestemmelse av proteaser NO790375L (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE7801373A SE7801373L (sv) 1978-02-07 1978-02-07 Lett spjelkbara substrat for kvantifiering av proteaser

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NO790375L true NO790375L (no) 1979-08-08

Family

ID=20333883

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO790375A NO790375L (no) 1978-02-07 1979-02-06 Substrater for bestemmelse av proteaser

Country Status (18)

Country Link
US (2) US4279810A (no)
EP (1) EP0004256B1 (no)
JP (2) JPS6345397B2 (no)
AT (1) AT368773B (no)
AU (1) AU4394579A (no)
CA (1) CA1136124A (no)
DD (1) DD142550A5 (no)
DE (1) DE2963358D1 (no)
DK (1) DK147495C (no)
ES (1) ES477501A1 (no)
FI (1) FI790376A7 (no)
IL (1) IL56520A0 (no)
NO (1) NO790375L (no)
PL (1) PL116682B1 (no)
SE (1) SE7801373L (no)
SU (1) SU1277904A3 (no)
WO (1) WO1979000602A1 (no)
ZA (1) ZA79424B (no)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4275153A (en) * 1978-08-03 1981-06-23 American Hospital Supply Corporation Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes
US4336186A (en) * 1978-08-03 1982-06-22 Gargiulo Robert J Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes
US4409140A (en) * 1979-04-23 1983-10-11 Smith Robert E Substrates and method for determining enzymes
EP0018002B1 (de) * 1979-04-24 1983-02-09 Marcel Jozefonvicz Neues Bestimmungsverfahren für Proteasen und Antiproteasen
DE2936543A1 (de) * 1979-09-10 1981-04-09 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Chromogene verbindungen
CA1161432A (en) * 1980-02-12 1984-01-31 Lars G. Svendsen Tripeptide derivatives and their application in assaying enzymes
DE3164437D1 (en) * 1980-08-25 1984-08-02 Kabivitrum Ab Peptide substrates for determination of protease activity
FR2497798A1 (fr) * 1981-01-09 1982-07-16 Pharmindustrie Nouveaux peptides portant un fluorophore, procede pour leur preparation et leur application au dosage fluorimetrique des endotoxines
US4388233A (en) * 1981-05-15 1983-06-14 The Regents Of The University Of California Synthetic substrates for enzyme analysis
US4510241A (en) * 1981-09-03 1985-04-09 Mallinckrodt, Inc. Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin
JPS5863399A (ja) * 1981-10-14 1983-04-15 Nitto Boseki Co Ltd 新規なプラスミン測定用基質
US4448715A (en) * 1981-11-02 1984-05-15 University Of Miami Tagged pyroglu-L-Phe-L-Arg derivatives, substrates and assays for kallikrein
DE3211254A1 (de) * 1982-03-26 1983-09-29 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zum nachweis des vorliegens einer allergie und zum spezifischen nachweis des fuer die allergie verantwortlichen allergens
US4491541A (en) * 1982-11-10 1985-01-01 Farmitalia Carlo Erba Peptides
DE3244030A1 (de) * 1982-11-27 1984-05-30 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Chromogene verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
DE3484912D1 (de) * 1983-06-03 1991-09-19 Pentapharm Ag Peptidderivate und deren verwendung als substrate zur quantitativen bestimmung von enzymen.
JPS6117956A (ja) * 1984-07-04 1986-01-25 Nitto Boseki Co Ltd 新規な尿中カリクレイン測定用基質
CA1293591C (en) * 1985-01-11 1991-12-24 Charles A. Kettner Peptide substrates for detecting virus-specified protease activity
US4801534A (en) * 1985-05-28 1989-01-31 Coulter Electronics, Inc. Water soluble zanthylium derivative substrates
US4694070A (en) * 1985-05-28 1987-09-15 Coulter Electronics, Inc. Water soluble xanthylium derivatives substrates
US5231006A (en) * 1986-10-16 1993-07-27 Behringwerke Aktiengesellschaft Method for the determination of plasminogen
DE3635191A1 (de) * 1986-10-16 1988-04-21 Behringwerke Ag Verfahren zur bestimmung von plasminogen
SE8701801L (sv) * 1987-04-30 1988-10-31 Kabivitrum Ab Foerfarande foer identifiering av mikroorganismer
US5115099A (en) * 1988-06-14 1992-05-19 Nitto Boseki Co., Ltd. Substrates for determination of enzyme activity and intermediates for synthesis of the substrates as well as process for producing the intermediates
JPH06104079B2 (ja) * 1988-07-14 1994-12-21 日東紡績株式会社 新規な酵素活性測定用基質
US5191065A (en) * 1988-11-22 1993-03-02 Hoechst Aktiengesellschaft Process for the preparation of tripeptides
DE3839379A1 (de) * 1988-11-22 1990-05-23 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung von tripeptiden
SE8904188D0 (sv) * 1989-12-12 1989-12-12 Kabivitrum Ab Chromogenic substrate
JP2769243B2 (ja) * 1990-02-19 1998-06-25 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 溶液、特に発酵溶液から精製ｅｐｉ蛋白質の回収方法
US5733719A (en) * 1995-05-18 1998-03-31 Coulter Corporation Method of making an assay compound
US5698411A (en) * 1995-05-18 1997-12-16 Coulter Corporation Method for determining activity of enzymes in metabolically active whole cells
US5776720A (en) * 1995-05-18 1998-07-07 Coulter Corporation Assay reagent
US5871946A (en) * 1995-05-18 1999-02-16 Coulter Corporation Method for determining activity of enzymes in metabolically active whole cells
AU2001265092A1 (en) * 2000-06-02 2001-12-17 Regents Of The University Of California Profiling of protease specificity using combinatorial fluorogenic substrate libraries
GB0208989D0 (en) * 2002-04-19 2002-05-29 Amersham Biosciences Uk Ltd Methods for measuring enzyme activity
CN115974752A (zh) * 2023-01-04 2023-04-18 郑州安图生物工程股份有限公司 一类对硝基苯胺类化合物的制备方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL42124A (en) * 1972-05-02 1977-02-28 Kabi Ab Substrate for the determination of proteolytic enzymes
SE380257B (sv) * 1972-05-02 1975-11-03 Bofors Ab Nya diagnostiskt verksamma substrat med hog specificitet till trombin och andra proteolytiska enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser
DE2527932C2 (de) * 1974-07-02 1983-04-21 Pentapharm AG, 4052 Basel Säureadditionssalze von Tripeptidderivaten und deren Verwendung als Substrate zur Bestimmung von Plasmakallikrein
SE407058B (sv) * 1974-12-05 1979-03-12 Kabi Ab Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser
CH622286A5 (no) * 1975-06-23 1981-03-31 Pentapharm Ag
SE407571B (sv) * 1975-07-11 1979-04-02 Kabi Ab Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser
SE437153B (sv) * 1976-12-01 1985-02-11 Kabi Ab Specifika kromogena enzymsubstrat for serinproteaser
US4215047A (en) * 1977-06-06 1980-07-29 Ajinomoto Company Incorporated 7-(Arginylamino)-4-methylcoumarins

Also Published As

Publication number Publication date
EP0004256A1 (en) 1979-09-19
EP0004256B1 (en) 1982-07-21
CA1136124A (en) 1982-11-23
DK147495B (da) 1984-09-03
JPS63173600A (ja) 1988-07-18
US4279810A (en) 1981-07-21
ATA78279A (de) 1982-03-15
SE7801373L (sv) 1979-08-08
AT368773B (de) 1982-11-10
JPS55500076A (no) 1980-02-14
JPS6345397B2 (no) 1988-09-09
DK420879A (da) 1979-10-05
PL116682B1 (en) 1981-06-30
ES477501A1 (es) 1979-11-16
AU4394579A (en) 1979-08-16
DD142550A5 (de) 1980-07-02
DK147495C (da) 1985-07-15
US4335204A (en) 1982-06-15
IL56520A0 (en) 1979-03-12
WO1979000602A1 (en) 1979-08-23
SU1277904A3 (ru) 1986-12-15
ZA79424B (en) 1980-01-30
FI790376A7 (fi) 1979-08-08
DE2963358D1 (en) 1982-09-09
PL213217A1 (no) 1980-02-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO790375L (no) Substrater for bestemmelse av proteaser
NO142812B (no) Nye diagnostisk aktive kromogene enzymsubstrater
NO142074B (no) Nye kromogene enzymsubstrater for serinproteaser
US4061625A (en) Novel chromogenic thrombin substrates
US4070245A (en) Substrate for the quantitative determination of proteolytic enzymes
US4440678A (en) Tripeptide derivatives and their application in assaying enzymes
US4016042A (en) Substrate for the quantitative determination of enzymes
NO135245B (no)
NO135362B (no)
WO1982000641A1 (en) Peptide substrates for determination of protease activity
US4563305A (en) Radiolabelled substrates for assaying mammalian enzymes
DK149215B (da) Tri- eller tetrapeptider eller salte deraf til anvendelse som substrat til kvantitativ bestemmelse af plasminogenaktivatorer, inhibitorer for disse og plasminogen-praeaktivatorer samt trypsin, trypsin-inhibitorer og trypsinogen i legemsvaesker hos mennesker og pattedyr og i vaevsekstraktersamt en fremgangsmaade til kvantitativ bestemmelse af plasminogenaktivato
US4247454A (en) Novel chromogenic thrombin substrates
NO142576B (no) Nye diagnostisk aktive kromogene substrater med hoey spesifisitet for thrombin og thrombinlignende ensymer
US4169015A (en) Novel chromogenic thrombin substrates
US4162941A (en) Method for determining a proteolytic enzyme
US5334506A (en) Chromogenic method of detecting endoproteases
US5723307A (en) Fluorogenic substrates for assay of angiotensin converting enzyme
US4474691A (en) Chromophoric peptides, a process for their preparation, agents containing them and their use for determining DD-carboxypeptidases
DK171845B1 (da) Tripeptidderivater og fremgangsmåde til fremstilling af samme samt fremgangsmåde til bestemmelse af serinproteaser eller komponenter, der kan samvirke med serinproteaser
García-Echeverría et al. Kinetic studies of papain: effect of P3′ substituents and donor/acceptor pairs of intramolecularly quenched fluorogenic substrates
JPH0244518B2 (ja) Tanpakubunkaikosooteiryobunsekisuruhoho