DK149314B - Fremgangsmaade til fremstilling af humaninsulin eller threonin-b30-derivater af humaninsulin eller et salt eller kompleks deraf - Google Patents

Description

i 149314

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde B3 0 til fremstilling af humaninsulin eller threonin -derivater af humaninsulin eller et salt eller kompleks deraf ved reaktion B30

mellem svine-des(Ala )-insulin eller et salt eller kompleks 5 deraf og et L-threoninderivat med den almene formel I

Thr (R2) -OR^ I

1 2 hvor R repræsenterer en carboxylbeskyttelsesgruppe, og R repræsenterer hydrogen eller en hydroxylbeskyttelsesgruppe, eller et salt deraf i en blanding af vand, et vandblandbart, organisk 10 opløsningsmiddel og trypsin, hvorefter det resulterende derivat om ønsket afblokeres for at danne humaninsulin.

Man kender allerede forskellige processer til fremstilling af humaninsulin. Eksempler på sådanne processer er bl.a. ekstraktion fra humanpankreaskirtler, syntese ud fra de 15 til grund liggende aminosyrer, gensplejsning og omdannelse af svineinsulin til humaninsulin. Nogle af processerne for omdannelse af svineinsulin til humaninsulin foregår via svine-des- non octapeptid-(B23-B30)-insulin og nogle foregår via des(Ala )-insulin.

20 Til behandlingen af diabetes mellitus er der sædvan ligvis anvendt insulinpræparater indeholdende svine- eller okseinsulin. Okse-, svine- og humaninsulin udviser mindre forskelle med hensyn til aminosyresammensætning, idet forskellen mellem human- og svineinsulin er begrænset til en enkelt amino-25 syre, idet B30-aminosyren i humaninsulin er threonin, hvorimod den i svineinsulin er alanin.

En fremgangsmåde til fremstilling af humaninsulin fra B30 des(Ala )-insulin er beskrevet i europæisk patentansøgning nr. 80.101.966 og den tilsvarende danske patentansøgning, nr.

30 1556/80, se også Nature 280 (1979), 412. Ifølge den omtalte pa tentansøgning udføres amideringen fortrinsvis i et medium indeholdende 0 til 65%, fortrinsvis 40 til 60%, af et organisk opløsningsmiddel. Desuden er den foretrukne reaktionstemperatur 149314 2 mellem 20 og 40°C, idet temperaturen 37°C bliver brugt i alle eksempler. Udbyttet af koblingen var ifølge de tre eksempler ved HPLC (high pressure liquid chromatography) bestemt til at være 75, 80 og ca. 50%-. Ifølge Nature-tidsskriftet var udbyttet 5 omkring 73%.

En yderligere fremgangsmåde til fremstilling af hu-B30 maninsulin fra des(Ala )-insulin er beskrevet i Proceedings of the 2nd International Insulin Symposium, Aachen, Federal Republic of Germany, 1979. Ifølge det omtalte tidsskrift blev 10 amideringen udført i en blanding, der indeholdt omkring 60% organisk opløsningsmiddel, og reaktionen blev foretaget ved 38°C. Udbyttet af kobling blev ved HPLC fastlagt til at være 67%.

Endnu en fremgangsmåde til fremstilling af humaninsu-lin fra des(Ala )-insulin er beskrevet i Proceedings of the 15 16th European Peptide Symposium, Helsingør, Denmark, 1980.

Ifølge omtalte udgivelse blev processen foretaget i en blanding, der indeholdt omkring.60% organisk opløsningsmiddel. Reaktionstemperaturen var efter al sandsynlighed 37°C. Efter en reaktionstid på 30 minutter var udbyttet 85%, dog var udbyttet 20 formindsket til 70% efter 22 timer.

En af grundene til det lavere udbytte ved de kendte fremgangsmåder er tabet af insulin som følge af uønskede bi- 2 1 reaktioner, f.eks. dannelsen af DOI-Thr(R )-OR , hvori DOI re- 1 2 præsenterer svine-des-octapeptid-(B23-B30)-insulin, og R og R 25 er som beskrevet ovenfor.

Formålet med den foreliggende opfindelse var at finde en fremgangsmåde, ved hvilken udbyttet af reaktionsproduktet er særlig stort, fortrinsvis større end 90%.

Det har overraskende vist sig, at et sådant udbytte 30 kan opnås ved brug af en meget lavere koncentration af vand i reaktionsblandingen end ved de allerede kendte fremgangsmåder, og ydermere at det foretrækkes at foretage processen ved en betydeligt lavere reaktionstemperatur end ved de allerede kendte fremgangsmåder.

3 tmu

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er ejendommelig ved, at vandindholdet i reaktionsblandingen er mellem 30 og 10% (rumfang/rumfang), at reaktionstemperaturen er højst 37°C, og at der eventuelt er en syre til stede. Den fore-5 trukne reaktionstemperatur er mellem ca. 0°C og stuetemperatur, d.v.s. ca. 25°C.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan B30 udføres ved at opløse des(Ala )-insulin, et L-threoninderivat med formel I og trypsin i en blanding af vand og mindst et 10 vandblandbart, organisk opløsningsmiddel, eventuelt i nærværelse af en syre.

De organiske opløsningsmidler, der er egnede til brug ved denne opfindelse, er polære opløsningsmidler, som er blandbare med vand, og fortrinsvis sådanne, som kan indeholde høje 15 koncentrationer af insulinforbindelser og threoninestere.

Eksempler på sådanne egnede organiske opløsningsmidler er apro-tiske opløsningsmidler som f.eks. Ν,Ν-dimethylformamid, N,N-dimethylacetamid, N-methylpyrrolidon, hexamethylphosphortri-amid, dimethylsulfoxid, dioxan, acetone, tetrahydrofuran, for-20 mamid og acetonitril og protiske opløsningsmidler som f.eks. ethanol, methanol, 2-propanol og 1,2-ethandiol. Opløsningsmidlet påvirker hele systemet som sådant, og de betingelser, der passer til et opløsningsmiddelsystem med et højt amideringsudbytte, passer ikke nødvendigvis til et andet opløsningsmiddel.

25 De bedste resultater m.h.t. udbytte er blevet opnået med apro-tiske opløsningsmidler, og aprotiske opløsningsmidler er de mest foretrukne ved udførelsen af denne opfindelse.

Afhængigt af hvilket vandblandbart, organisk opløsningsmiddel, der bruges, af den valgte reaktionstemperatur og 30 af tilstedeværelsen af en syre i reaktionsblandingen må indholdet af vand i reaktionsblandingen være mindre end ca. 30% (rumfang/rumfang), fortrinsvis mindre end ca. 25% (rumfang/rum-fang), og mere end ca. 10% (rumfang/rumfang), fortrinsvis mere end ca. 15% (rumfang/rumfang).

14931A

4

En fordel ved at formindske mængden af vand i reaktionsblandingen er, at dannelsen af biprodukter derved bliver formindsket. I lighed dermed er det ved at forøge mængden af syre i reaktionsblandingen muligt at formindske dannelsen af 5 biprodukter. Forøgelsen i udbytte er positivt korreleret med et lavt vandindhold i reaktionsblandingen. For at forebygge denaturering af enzymet i reaktionsblandinger med et lavt vandindhold bør reaktionstemperaturen fortrinsvis være væsentligt lavere end de reaktionstemperaturer, der traditionelt benyttes i 10 peptidsynteser med trypsin.

For udøvelsen af denne opfindelse er det ikke væsentligt, hvilken art trypsin der anvendes. Trypsin er et godt karakteriseret enzym, der kommercielt er tilgængeligt i høj renhed, især fra okse- og svinekilder. Der kan endvidere anven-15 des trypsin af mikrobiel oprindelse. Til udøvelse af denne opfindelse er trypsinformen, f.eks. krystallinsk trypsin (opløselig form), immobiliséret trypsin eller endog trypsinderivater (så længe trypsinaktiviteten bibeholdes), endvidere ikke væsentlig. Den heri anvendte betegnelse trypsin skal omfatte 20 trypsiner af enhver oprindelse og alle trypsinformer, som har bibeholdt amiderende aktivitet, herunder proteaser med trypsin-lignende specificitet, f.eks. Achromobacter lyticus-protease, jfr. Agric.Biol.Chem. 42, 1443.

Som eksempler på aktive trypsinderivater kan angives 25 acetyleret trypsin, succinyleret trypsin, glutaraldehydbehandlet trypsin og immobiliserede trypsinderivater.

Såfremt der anvendes et immobiliseret trypsin, suspenderes det i mediet.

Til opnåelse af et egnet puffersystem kan der tilsæt-30 tes organiske eller uorganiske syrer såsom saltsyre, myresyre, eddikesyre, propionsyre og smørsyre og/eller baser såsom pyri-din, TRIS, N-methylmorpholin og N-ethylmorpholin. Organiske syrer foretrækkes. Omsætningen kan imidlertid udføres uden sådanne tilsætninger. Den tilsatte mængde syre er sædvanligvis 3.5 mindre end ca. 10 ækvivalenter pr. ækvivalent L-threoninderivat 149314 5 med formel I. Mængden af syre er fortrinsvis mellem 0,5 og 5 ækvivalenter pr. ækvivalent L-threoninderivat med formel I. Der kan tilsættes ioner, som stabiliserer trypsin, såsom kalciumioner.

5 Fremgangsmåden må udføres ved en temperatur på højst 37°C og fortrinsvis over reaktionsblandingens frysepunkt. Til opnåelse af tilstrækkelig reaktionshastighed udføres enzymatiske reaktioner med trypsin sædvanligvis ved 37°C. For at undgå inaktivering af trypsin er det imidlertid fordelagtigt at ud-10 føre fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse ved en temperatur under stuetemperatur. I praksis foretrækkes reaktionstemperaturer på over ca. 0°C.

Afhængigt af reaktionstemperaturen, den tilsatte mængde trypsin og af andre reaktionsbetingelser er reaktions-15 tiden sædvanligvis mellem nogle få timer og nogle få dage.

Trypsinets virkning reguleres i høj grad af forholdet mellem vand og opløsningsmiddel, af forholdet mellem syre og base og af reaktionstemperaturen, således at dets amiderende virkning fremmes, og for at hindre uønskede trypsinkatalyseren-20 de bireaktioner. Ved at formindske koncentrationen af vand i reaktionsblandingen opnår man begge dele, men man øger derved også den hastighed, med hvilken irreversibel trypsindenature-ring forekommer. Trypsindenatureringen kan - i hvert fald delvist - imødegås ved at sænke reaktionstemperaturen. En sænkning 25 af reaktionstemperaturen nedsætter også amideringshastigheden, men der kan kompenseres for en sådan nedsættelse ved at øge reaktionstiden.

Vægtforholdet mellem trypsin og des(Ala )-insulin i reaktionsblandingen er normalt over ca. 1:200, fortrinsvis over 30 ca. 1:50, og under ca. 1:1.

B30

De threonin -derivater af humaninsulin, der er et resultat af amideringen, kan angives ved den almene formel II

1493 U

6

(Thr(R2)-OR1)B30-h-In II

hvori h-In repræsenterer human-des(ThrB3<^) -insulindelen, og R^ 2 og R er som defineret ovenfor.

Anvendelige L-threoninderivater med formel I er så- 5 danne, hvori R^ er en carboxylbeskyttelsesgruppe, som kan fjer- B30 nes fra threonin -esteren af humaninsulin (formel II) under betingelser, som ikke forårsager væsentlig, irreversibel ændring i insulinmolekylet. Som eksempler på sådanne carboxyl-beskyttelsesgrupper kan nævnes lavere alkyl, f.eks. methyl, 10 ethyl o,g tert.butyl, substitueret benzyl såsom p-methoxybenzyl og 2,4 ,,6-trimethylbenzyl og diphenylmethyl, og grupper med den 3 3 almene formel -CH2CH2S02R , hvori R repræsenterer lavere alkyl såsom methyl, ethyl, propyl og n-butyl. Egnede hydroxylbeskyt-telsesgrupper R2 er sådanne, der kan fjernes fra threoninB3^-15 derivater af humaninsulin (formel II) under omstændigheder, som ikke forårsager væsentlig, irreversibel ændring i insulinmole-kylet. Som eksempel på en sådan gruppe (R ) kan tert.butyl angives . ’

Lavere alkylgrupper indeholder mindre end 7 carbon-20 atomer, fortrinsvis mindre end 5 carbonatomer.

Yderligere, sædvanligt anvendte beskyttelsesgrupper er beskrevet af Wunsch: Methoden der Organischen Chemie (Houbén-Weyl), Vol. XV/1, editor: Eugen Muller, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974.

25 En fremgangsmåde til fremstilling af des(Ala )-in sulin er beskrevet i Hoppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem. 359 (1978), 799 ff.

Nogle L-threoninderivater med formel I er kendte forbindelser, og de resterende L-threoninderivater kan fremstilles 30 analogt med fremstillingen af kendte forbindelser.

L-threoninderivater med formel I kan være de frie baser eller egnede organiske eller uorganiske salte deraf, fortrinsvis acetater, propionater, butyrater og hydrogenhalogeni-der såsom hydrogenchlorider.

14931Λ 7

Det er ønskeligt at anvende reaktanterne, d.v.s. des-

B3 O

(Ala )-insulin og L-threoninderivater med formel I, i høje koncentrationer. Det molære forhold mellem L-threoninderivater B30 med formel I og des(Ala )-insulin er fortrinsvis over ca.

5 5:1.

Det er ønskeligt, at koncentrationen af L-threoninderivater med formel I i reaktionsblandingen overstiger 0,1 molær.

Humaninsulin kan fas ud fra threonin -derivater af 10 humaninsulin (formel II) ved fjernelse af beskyttelsesgruppen 1 2 R og en eventuel beskyttelsesgruppe R ved allerede kendte metoder eller analogt til allerede kendte metoder. I tilfælde 1 3 af at R er methyl, ethyl eller en gruppe -C^C^SC^R , hvori R^ er som defineret ovenfor, kan nævnte beskyttelsesgruppe 15 fjernes under milde, basiske betingelser i et vandigt medium, fortrinsvis ved en pH-værdi på mellem ca. 8 og ca. 12, f.eks.

ca. 9,5. Som base kan anvendes ammoniak, triethylamin, bicar- bonat/carbonatpuffere eller hydroxider af alkalimetaller såsom natriumhydroxid. I tilfælde af at R^ er tert.butyl, substitue- 20 ret benzyl såsom p-methoxybenzyl eller 2,4,6-trimethylbenzyl eller diphenylmethyl, kan omtalte gruppe fjernes ved acidolyse, fortrinsvis med trifluoreddikesyre. Trifluoreddikesyren kan være ikke-vandig eller kan indeholde noget vand, eller den kan være fortyndet med et organisk opløsningsmiddel såsom dichlor- 2 25 methan. I tilfælde af at R er tert.butyl, kan omtalte gruppe fjernes ved acidolyse, jfr. ovenfor.

B30

Foretrukne threonin -derivater af humaninsulin med . 2 formel II er forbindelser, hvori R er hydrogen, og disse kan fremstilles fra L-threoninderivater med formel I, hvori R er 30 hydrogen.

Som eksempler på et kompleks eller et salt af des- B30 (Ala )-insulin kan nævnes et zinkkompleks eller zinksalt.

1493U

8

Hvis man udvælger reaktionsbetingelserne ifølge ovennævnte forklaring, og hvis man tager reaktionsbetingelserne i de følgende eksempler i betragtning, er det muligt at opnå et B3 0 udbytte af threonin -derivater af humaninsulin (formel II), 5 som er højere end 90% eller endog højere end 95%.

En foretrukken fremgangsmåde til fremstilling af hu-B30 maninsulin fra threonin -derivater af humaninsulin er som følger: 1) Hvis der er nogen trypsinaktivitet tilbage efter 10 amideringen,'foretrækkes det at fjerne det, f.eks. under betingelser, hvor trypsinet er inaktivt, f.eks. i surt medium ved en pH-værdi på under 3. Trypsin kan. fjernes ved adskillelse ifølge molekylvægt, f.eks. ved gelfiltrering på en "Sephadex® G-50"-gel (Pharmacia) eller på en "Bio-gel P-30"-gel (Bio-gel er et 15 varemærke fra Bio-rad Laboratories) i eddikesyre, jfr. ovennævnte Nature 28 0.‘ • - pon 2) Urenheder såsom ureageret des(Ala )-insulin kan fjernes ved brug af anion- og/eller kationbytterchromatografe-ring.

B30 20 3) Derefter spaltes threonin -derivatet af human insulin (formel II), og humaninsulin isoleres, f.eks. krystalliseres på i og for sig kendt måde.

På denne måde kan der fås humaninsulin med en acceptabel farmaceutisk renhed, og humaninsulinet kan om ønsket ren-25 ses yderligere.

Anvendte forkortelser er·i overensstemmelse med de regler, der blev godkendt (1974) af IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, jfr. Collected Tentative Rules & Recommendations of the Commission on Biochemical Nomenclature 30 IUPAC-IUB, 2nd ed., Maryland 1975.

Fremgangsmåden til fremstilling af humaninsulinderi-vater og humaninsulin illustreres yderligere ved de følgende eksempler.

149314 9

Eksempel 1

B3 O

10 mg svine-des(Ala )-insulin blev opløst i 100 μΐ 10 M eddikesyre. Til 50 μΐ af denne opløsning blev der tilført: 100 μΐ 2 M Thr-OMe (Me betyder methyl) i N,N-dimethylacetamid, 5 60 μΐ N,N-dimethylacetamid, 15 μΐ vand og 10 μΐ af en opløsning af trypsin (8% vægt/rumfang) i 0,05 M calciumchlorid. Efter inkubation ved 4°C i 24 timer blev produktet udfældet med 8 ml acetone, isoleret ved centrifugering, vasket med 8 ml acetone, isoleret ved centrifugering og tørret i vakuum. Udbyttet af 10 (Thr-OMe)B3®-h-In blev bestemt af HPLC.

Produktet blev opløst i 2 ml 1 M eddikesyre, og 100 μΐ af opløsningen blev sat på en 4 x 200 mm "Nucleosil 5 C18 kolonne" (Nucleosil er et varemærke fra Mackerey & Nagel) til modstrøms-HPLC, idet der blev benyttet en 0,2 M ammoniumsulfat-15 puffer, der var indstillet til en pH-værdi på 3,5, og som indeholdt 26,8% (rumfang/rumfang) acetonitril som eluent. Ved en flowhastighed på 1 ml/min eluerede des-(Ala )-insulin efter B30 18 minutter og (Thr-OMe) -h-In efter 24 minutter. Biproduktet .

B2 3 af reaktionen, nemlig (Thr-OMe) -des-heptapeptid-(B24-B30)- 20 insulin, eluerede efter 7 minutter. Påvisningen og mængdebestemmelsen af proteinerne blev bestemt ved ekstinktion ved 280 nm. Analysen gav følgende fordeling af forbindelser: (Thr-OMe)B30-h-In: 97,1%

Tson des(Ala )-insulin: 2,5%

OO O

25 (Thr-OMe) -des-heptapeptid(B24-B30)-insulin: 0,4%

Eksempler 2 til 16

De følgende eksempler 2 til 16 i tabel 1 blev udført på analog måde som eksempel 1, idet man ændrede reaktionsparametrene som vist i tabellen. Der blev imidlertid i alle eksem-30 pier tilført 10 μΐ 8% trypsin i en 0,05 M calciumchloridopløs-ning, 100 μΐ organisk opløsningsmiddel indeholdende et threo- ίο 1493 ΙΑ ninderivat med formel I samt 50 μΐ eddikesyre indeholdende 20% B30 des(Ala )-insulin. Molariteten af threoninderivatet med formel I i omtalte organiske opløsningsmiddel og af omtalte eddikesyre fremgår af tabel 1. Reaktionstiden var 24 timer. I tabel 5 1 er der benyttet følgende forkortelser: HOAc er eddikesyre, DMAA er Ν,Ν-dimethylacetamid, DMF er Ν,Ν-dimethylformamid, DMSO er dimethylsulfoxid, NMP er N-methylpyrrolidon og THF er tetrahydrofuran.

Ved syntetiseringen af (Thr-OBu^^^-h-In, jfr.

10 eksempel 15, blev elueringen udført ved at anvende en gradient i acetonitril fra 26,8% til 40% (rumfang/rumfang).

11 M93U

-P i) -CnH β β Η Ο Ο Φ •Ρ Η Λ ·Η CP φ -Ρ Ό -Ρ C

C C ΟΟΠΟΟΟΟΟΟΟΓ'ΗΙ^ΟΟ

CnflJ-HlCOdP NNHNNNNNNNNMNNN

φ Ρ T3 φ β p +J β M Id Φ g (d H

pa o >·η ,α . - (M 3

X WWWWMWWWWWWWMtCCQ

-P +J

H <1)ΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦ33 pi aaaaaaaasssssw« φ

•P

+1 ["[''ΓΟΓ-'Γ'-Γ^Γ-^νΟΓ^ΟΟ'ί'ΟΓ''!-) >idp σισΐ£Γισισισισισισ^σιοοε^«ησ>σι $ Γ3 •

fX Nin'i^Nin'sfNTfNNNNNN

EU H(M HCN H Η Η Η (N Η H

φ o I

_H__ OH LninoLnLninininLninmoLnLnin

CN— i—li—i i—li—|i—i'—li—li—Ir—{i—1 i—I i—! i—I

ffi y, Φ BUD I p β -H cn Φ Η β β Cn β td *H *» •η -P tji c p h oomooooooooinooo

h ftj p ω Φ =l p ID 08Ό φ Η Η T3 Ό H IH Dj-H

>H -P Φ 0 g -p' Φ -P ω *h

- P

0 Φ a oooooooooo^^^oo <JrH rHrHi—JrHi-HrHrHrHiHr-H ri r| o o X & w -

I -P -P β φ Φ •Η -P -P β Id H

0 > P a NOlOIMNNNMMWINNNPfM

Φ H Id P P H X! Φ 0 tH-d E

ω cn β ω ·η η β η < <ί dj ΟΟ λ3 βίΟΦ ιΰ®5 aaaaaaaaaaaaaaa

CPH -d QOQQQaQQaSQQQQQ

p an o o e

H

Η Φ

Dj η E fMm'd’iri'xn'OoaioHiNM'^Ln'x

φ φ HHHHrHHH

A ω .

ιΰ λ: p g! _HJh_ 149314 12

Eksempler 17 til 34

Disse eksempler blev udført på analog måde som eksemplerne 1 til 16 med det forbehold, at reaktionstiden var 4 timer. I hvert af disse eksempler var udbyttet det samme som det, 5 der blev opnået i eksemplerne 1 til 16.

Det fremgår af en sammenligning af eksemplerne 1 til 16 med eksemplerne 17 til 34, at det samme udbytte blev opnået, og det er bl.a. dette, der adskiller den nye fremgangsmåde fra den allerede kendte fremgangsmåde, der er beskrevet i Pro-10 ceedings of the 16th European Peptide Symposium, jfr. ovenfor.

Som følge deraf er tidsafhængigheden blevet elimineret.

Eksempel 35 B30 250 mg krystallinsk (Thr-OMe) -h-In, som var fremstillet ifølge eksempel 1, blev suspenderet i 25 ml vand og op-15 løst ved tilsætning af 1 N natriumhydroxidopløsning til en pH-værdi på 10,0. pH-værdien blev holdt konstant ved 10,0 i 24 timer ved 25°C. Det humaninsulin, der dannedes, blev krystalliseret ved tilsætning af 2 g natriumchlorid, 350 mg natrium-acetattrihydrat og 2,5 mg zinkacetatdihydrat efterfulgt af til-20 sætning af 1 N saltsyre for at opnå en pH-værdi på 5,52. Efter henstand i 24 timer ved 4°C blev de romboedriske krystaller isoleret ved centrifugering, vasket med 3 ml vand, isoleret ved centrifugering og tørret i vakuum. Udbytte: 220 mg humaninsulin.

25 Eksempel 36 B30 20 mg svine-des(Ala )-insulin blev opløst i en blanding af 200 μΐ 2 M Thr-OMe i N,N-dimethylacetamid, 130 μΐ Ν,Ν-dimethylacetamid og 45 μΐ vand. Derefter tilsattes yderligere 25 μΐ af en 0,05 M vandig calciumacetatopløsning inde-30 holdende 1,25 mg trypsin. Efter inkubering ved 12°C i 2 timer 149314 13 blev der udtaget en prøve på 50 μΐ, som blev fældet med 2 ml B30 acetone. Udbyttet af (Thr-OMe) -h-In blev ved HPLC-analyse bestemt til 96%.

Eksempel 37 B3 0 5 20 mg svine-des(Ala )-insulin blev opløst i 100 μΐ 10 M eddikesyre. Derefter tilsattes 200 μΐ 2 M Thr-OMe i N,N-dimethylacetamid samt yderligere 60 μΐ Ν,Ν-dimethylacetamid og 15 μΐ vand. Til blandingen sattes 25 μΐ 0,05 vandig calcium-acetatopløsning indeholdende 1,25 mg trypsin. Efter inkubering 10 ved 37°C i 2 timer blev der udtaget en prøve på 50 μΐ, som blev fældet med 2 ml acetone. Udbyttet af (Thr-OMe)®^®-h-In blev ved HPLC-analyse bestemt til 86%.

Eksempel 38 B30 20 mg svine-des(Ala )-insulin blev opløst i 100 μΐ 15 10 M eddikesyre. Derefter tilsattes 200 μΐ 2 M Thr-OMe i Ν,Ν- dimethylacetamid og 25 μΐ vand indeholdende 1,25 mg trypsin.

Efter inkubering ved 25°C i 1/2 time blev der udtaget en prøve på 50 μΐ, som blev fældet med 4 ml acetone. Udbyttet af (Thr-B30 OMe) -h-In blev ved HPLC-analyse bestemt til 88%. (Beregnet 20 vandindhold = 21%).

Eksempel 39

33Q

20 mg svine-des(Ala )-insulin blev opløst i 83 μΐ 12 M eddikesyre. Derefter tilsattes 200 μΐ 2 M Thr-OMe opløst i absolut ethanol og 25 μΐ vand indeholdende 1,25 mg trypsin.

25 Efter inkubering ved 12°C i 4 timer udtoges en prøve på 50 μΐ, Β3Ω som blev fældet med 4 ml acetone. Udbytte af (Thr-OMe) -h-In blev ved HPLC-analyse bestemt til 86%.

Claims (2)

1493 Η Eksempel 40 Eksemplet udføres på analog måde som beskrevet i eksempel 39 bortset fra, at trypsinet er opløst i 0,05 M vandig Din calciumacetat i stedet for i vand. Udbyttet af (Thr-OMe) -h-5 In efter 1 time ved 12°C blev ved HPLC-analyse bestemt til 89%. Eksempel 41 Eksemplet udføres på analog måde som beskrevet i eksempel 40 bortset fra, at der inkuberes ved 25°C. Udbyttet af (Thr-OMe)B^-h-In efter 1 time ved 25°C blev ved HPLC-analyse 10 bestemt til 89%.

1. Fremgangsmåde til fremstilling af humaninsulin el-B30 ler threonin -derivater af humaninsulin eller et salt eller B30 kompleks deraf ved reaktion mellem svine-des(Ala )-insulin 15 eller et salt eller kompleks deraf og et L-threoninderivat med den almene formel I Thr(R2) -OR·1· I 1. hvor R repræsenterer en carboxylbeskyttelsesgruppe, og R repræsenterer hydrogen eller en hydroxylbeskyttelsesgruppe, eller 20 et salt deraf i en blanding af vand, et vandblandbart, organisk opløsningsmiddel og trypsin, hvorefter det resulterende derivat om ønsket afblokeres for at danne humaninsulin, kendetegnet ved, at vandindholdet i reaktionsblandingen er mellem 30 og 10% (rumfang/rumfang), at reaktionstemperaturen er højst 37°C, og 25 at der eventuelt er en syre til stede.