DK149616B - Fremgangsmaade til fremstilling af insuliner - Google Patents

Description

i 149616

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde af den i krav l's indledning angivne art til fremstilling af insuliner. De som udgangsmaterialer anvendte insulinderivater kan være fremstillet ved fremgangsmåden ifølge 5 stamansøgningen DK fremlæggelsesskrift nr. 148.714 eller ved andre fremgangsmåder som nærmere forklaret nedenfor.

Opfindelsen forklares i det følgende i forbindelse med den specifikke spaltning af derivater af human insulin, 10 men det ses let, at den beskrevne metode lige så vel kan anvendes på derivater af andre typer insulin, såsom okseinsulin og svineinsulin.

Der kendes, jfr. Morihara et al. (Ref. 1), en syntese 15 af human insulin ud fra des-alanin(B-30)-insulin (DAI) opnået ved nedbrydning af svineinsulin med carboxypep-tidase A i 8 timer. 10 mM DAI inkuberedes med et stort overskud (0,5 M) threonin-OBu1' ester ved 37°C i 20 timer i nærvær af trypsin og høje koncentrationer af organiske 20 co-solventer. Det dannede [Thr - 0Bu*" -Β-3θ] insulin deblokeredes med trifluoreddikesyre, idet det for at undgå racemisering er nødvendigt at arbejde i nærvær af anisol.

25 I et lignende eksperiment har Morihara et al. (Ref.

2) anvendt Achromobacter Protease I som enzymatisk katalysator for kobling af DAI med stort overskud af Thr -0Bu*· under dannelse af [Thr - OBu^ - B-30j insulin, der isoleredes og deblokeredes som ovenfor.

30

Et lignende eksperiment med okseinsulin fører til [Thr -OBu^ - B—30[] okseinsulin.

Fremgangsmåderne beskrevet i Ref. 1 og 2 er også omtalt 55 i EP offentliggørelsesskrift nr. 17938 og DK-ans. 2556/80, jfr. fremlæggelsesskrift nr. 146.482. I begge tilfælde 2 149616 gennemførtes en kemisk deblokering som omtalt ovenfor med trifluoreddikesyre i nærvær af anisol for at undgå racemisering.

5 Formålet med den foreliggende opfindelse er at angive en fremgangsmåde til deblokering af insulinderivater, der er B-30 carboxylgruppebeskyttede med amid- eller estergrupper, under skånsomme betingelser, hvorved det er muligt under korte reaktionstider at opnå rene insu-10 liner i godt udbytte, og uden at der skal træffes særlige forholdsregler for at undgå racemisering.

Dette opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, der er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del 15 anførte.

De som udgangsmaterialer anvendelige insulinderivater er naturligvis ikke kun insulinderivater fremstillet ved det første transpeptideringstrin ved fremgangsmåden 20 ifølge stamansøgningen, men fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes på et hvilket som helst sådant derivat uden hensyn til oprindelsen, især derivater fremstillet ifølge EP offentliggørelsesskrift nr. 17938 som vist nedenfor i eksempel 2.

25

Det er fornylig blevet påvist, at enzymet carboxypepti-dase-Y er en effektiv katalysator for peptidsynteser (Widmer og Johansen (Ref. 3)). Det er endvidere blevet vist, at enzymet under visse betingelser katalyserer 30 udskiftningen af C-terminale aminosyrer i et peptid med en anden aminosyre eller aminosyrederivat i en trans-peptideringsreaktion (jfr. international ansøgning nr.

W0 80/02151, videreført som dansk patentansøgning nr.

5202/80).

Opfindelsen ifølge stamansøgningen hviler på den over- 35 3 149616 raskende erkendelse, at det ovennævnte enzym carboxy-peptidase-Y kan omdanne svineinsulin til human insulin ved udskiftning af B-30 alanin med threonin i et enkelt trin eventuelt uden isolering af et mellemprodukt og 5 efterfølgende deblokeringsbehandling.

Som yderligere belyst nedenfor er det mest velegnede derivat for denne omdannelse threoninamid. Imidlertid vil omdannelsen, såfremt et mellemprodukt ikke isoleres, 10 resultere i en blanding af human insulin og en vis mængde uomsat svineinsulin, som det er vanskeligt at adskille, hvorfor de dannede human insulin-amidmellemprodukter fortrinsvis separeres fra reaktionsblandingen, der bl.a. indeholder uomsat svineinsulin, og derpå deamideres.

15 ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, med fordel ved hjælp af det samme enzym carboxypeptidase-Y, som ligeledes forklaret nedenfor. .

I DK-ans. 5202/80 er de ønskede enzymatiske karakteristika 20 med hensyn til en almen peptidsyntese beskrevet i detaljer, og det er anført, at en række carboxypeptidaser udviser forskellige enzymatiske aktiviteter, som er meget pH afhængige, således at de f.eks. i basisk miljø ved pH 8 - 10,5 udviser overvejende esterase- eller 25 amidaseaktivitet og ved pH 9 - 10,5 ingen eller kun ubetydelig carboxypeptidaseaktivitet, der imidlertid bliver mere og mere udtalt ved pH-værdier faldende under 9. Disse egenskaber kan også med fordel udnyttes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, eftersom de bidrager 30 til gennemførelsen af en skånsom deblokeringsproces med gode udbytter.

De anvendelige carboxypeptidaser ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er L-specifikke serin- eller thiol-35 carboxypeptidaser, sådanne enzymer kan produceres af gærsvampe, eller de kan være af animalsk, vegetabilsk U9616 4 gærsvampe, eller de kan være af animalsk, vegetabilsk eller anden mikrobiel oprindelse.

Et særligt velegnet enzym er som nævnt carboxypeptidase-Y 5 fra gærsvampe (CPD-Y). Dette enzym er bl.a. beskrevet i DK-ans. nr. 5202/80, bl.a. under henvisning til Johansen et al. (Ref. 4), der udviklede en særligt hensigtsmæssig rensningsmetode ved affinitetskromatografi på en affinitetsresin omfattende et polymert resinskelet med til-10 koblede benzylsuccinylgrupper. CPD-Y, der er et serin-enzym, udmærker sig ved at have de ovennævnte relationer mellem de forskellige enzymatiske aktiviteter ved pH 9 og ved ikke at udvise endopeptidaseaktivitet. En anden fordel ved CPD-Y er, at det er tilgængeligt i store 15 mængder og udviser en relativt høj stabilitet. Yderligere detaljer er angivet i Ref. 3 og 6.

foruden CPD-Y, der er det foretrukne enzym for nærværende, kan fremgangmåden ifølge opfindelsen gennemføres med 20 andre carboxypeptidaser, f.eks. de nedenstående:

Enzyiji Oprindelse

Svampe

Penicillocarboxypeptidase S-l Penicillium janthinellum 25 " S-2 " "

Carboxypeptidase(r) fra Aspergillus saitoi " Aspergillus oryzae

Planter

Carboxypeptidase(r) C Orangeblade 30 Orangeskaller

Carboxypeptidase C^ Citrus natsudaidai Hayata

Phaseolain Bønneblade

Carboxypeptidase(r) fra Spirende byg

Spirende bomuldsplanter 35 Tomater

Vandmeloner

Bromelain (ananas) pulver 5 149616

Det nære slægtskab mellem en række af de ovennævnte carboxypeptidaser er diskuteret at Kubota et al. (Ref.

7).

5 Det skal nævnes, at ioniserbare grupper, der er til stede i de enkelte aminosyrer, der indgår i insulin-udgangsmaterialet, om ønsket kan blokeres på i og for sig kendt måde afhængig af gruppens art. Dette er imidlertid absolut ikke nødvendigt, hvilket netop er en 10 af fordelene ved den omhandlede fremgangsmåde. Hvis af en eller anden årsag det skulle være ønskeligt at beskytte de funktionelle grupper, kan egnede beskyttelsesgrupper vælges som anført i den ovennævnte DK-ans.

5202/80.

15

Aminosyren B, der indgår i insulinderivatet, der er udgangsmaterialet for fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan være en hvilken som helst af de kendte L-aminosyrer, f.eks. Leu, Ile, Ala, Gly, Ser, Val, Thr, Lys, Arg, 20 Asn, Glu, Gin, Met, Phe, Tyr, Trp eller His, men er dog fortrinsvis Thr.

For gruppen betegner "alkyl" ligekædet eller forgrenet alkyl, fortrinsvis med 1-6 carbonatomer, såsom methyl, 25 ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tert.butyl, amyl eller hexyl.

Som anført i krav l's kendetegnende del gennemføres fremgangsmåden ifølge opfindelsen ved pH 7,0 - 10,5, 30 fortrinsvis ved pH 9 - 10,5. Den foretrukne pH-værdi, der ofte ligger inden for et meget snævert interval, afhænger af henholdsvis pH-maxima og pH-minima for det anvendte enzyms forskellige enzymatiske aktiviteter, idet det er underforstået, at pH-værdien skal vælges 35 således, at aktiviteterne er indbyrdes afstemt som forklaret ovenfor.

U9616 6

Hvis CPD-Y anvendes som enzym, er pH-værdien fortrinsvis 7,5 - 10,5, især 9,0 - 10,5 på grund af den mere udtalte amidase- og esteraseaktivitet og den negligerbare carboxy-peptidaseaktivitet.

5 pH-kontrol kan f.eks. opnås ved inkorporering af en passende puffer for det ønskede pH-område i reaktions-mediet, såsom en bicarbonatpuffer.

10 pH-værdien kan også opretholdes ved tilsætning af en syre, såsom HC1, eller en base, såsom NaOH, under reaktionen. Dette kan bekvemt gøres ved anvendelse af en pH-stat.

15 På basis af informationen givet ovenfor og i Ref. 3 og 6, vil fagmanden være i stand til at udvælge de mest velegnede reaktionsbetingelser, især med hensyn til den pH-værdi, ved hvilken amidase-, esterase eller pep-tidyl-aminosyre-amid hydrolaseaktiviteten bedst kan 20 udnyttes i afhængighed af insulinudgangsmaterialet.

Imidlertid kan disse betingelser også påvirkes ved variation af enzymkoncentrationen, reaktionstiden, etc.

25 Reaktionen gennemføres i et vandigt reaktionsmedium, der om ønsket kan indeholde op til 50?ά af et organisk opløsningsmiddel. Foretrukne organiske opløsningsmidler er alkanoler, f.eks. methanol og ethanol, glycoler, f.eks. ethylenglycol eller polyethylenglycoler, dimethyl- 30 formamid, dimethylsulfoxid, tetrahydrofuran, dioxan og dimethoxyethan.

Valget af reaktionsmediets sammensætning afhænger især af opløseligheden, temperaturen og pH for reaktions- 35 komponenterne og de involverede insulinprodukter, samt af enzymets stabilitet.

7 149616

Reaktionsmediet kan også indeholde en komponent, som gør enzymet uopløseligt, men bibeholder en væsentlig del af enzymaktiviteten, såsom en ionbytterharpiks.

Alternativt kan enzymet immobiliseres på i og for sig 5 kendt måde, jfr. Methods of Enzymology, Vol. 44, 1976, f.eks. ved binding til en matrix, såsom en tværbunden dextran eller agarose, eller til en silica, et polyamid eller cellulose, eller ved indkapsling i polyacrylamid, alginater eller fibre. Endvidere kan enzymet modificeres 10 ad kemisk vej til forbedring af dets stabilitet eller enzymatiske egenskaber.

Reaktionsmediet kan også indeholde urinstof eller guanidin-hydrochlorid i koncentrationer på op til 3 molær. Dette 15 kan også være fordelagtigt ved pH-værdier og i medier, hvor insulin-udgangsmaterialet har begrænset opløselighed.

Enzymaktiviteten kan variere, men er fortrinsvis 10 ** - 10 ^ molær, især 10~^ molær.

20

Reaktionstemperaturen ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er fortrinsvis 20-40°C. Den mest hensigtsmæssige reaktionstemperatur kan fastlægges ved forsøg, men afhænger især af enzymkoncentrationen. En passende temperatur 25 er sædvanligvis ca. 20 - 30°C, fortrinsvis ca. 25°C.

Ved temperaturer under 20°C vil reaktionstiden sædvanligvis være uhensigtsmæssig lang, mens temperaturer over 40°C ofte forårsager problemer med stabiliteten af enzymet og/eller reaktanterne eller reaktionsprodukterne.

30

Standardreaktionstiden ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er yderst kort, nemlig helt ned til 15-20 min., som det fremgår af eksemplerne omhandlende deamidering.

35 Før fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nærmere ved eksempler, vil udgangsmaterialerne, målemetoderne, 8 149616 etc. blive omtalt.

UDGANGSMATERIALER

5 Svineinsulin blev leveret af Nordisk Insulinlaboratorium, København. Carboxypeptidase-Y fra bagerigær, et kommercielt produkt fra Carlsberg Bryggerierne, blev isoleret ved en modificering af affinitetschromatografifremgangsmåden ifølge Johansen et al. (Ref. 4) og opnået som 10 et lyofiliseret pulver (10¾ enzym i natriumcitrat).

(1?)

Inden brugen blev enzymet afsaltet på en "Sephadex ^ G-25" kolonne (1,5 x 25 cm) ækvilibreret og elueret med vand. Enzymkoncentrationen bestemtes spektrofoto-1¾ metrisk ved E^gg nm = Det anvendte enzympræparat 15 var fri for Protease A bestemt ifølge Lee og Riordan (Ref. 5). L-threoninamid blev indkøbt hos Vega-Fox,

Arizona, USA. L-threoninmethylester fra Fluka, Schweiz og L-threonin, Dansyl chlorid, carboxypeptidase A og trypsin fik man fra Sigma, USA. Chromatografiske materia-20 ler var fra Pharmacia, Sverige. Alle andre reagenter og opløsningsmidler var af analytisk renhedsgrad fra Merck, BRD.

AMINOSYREÅNALVSER

25

Prøver til aminosyreanalyse blev hydrolyseret i 6M HC1 ved 110°C i vakuum i 24 timer og analyseret på en Durrum D-500 aminosyreanalysator. Aminosyresammensætningen var baseret på det kendte indhold af asparaginsyre og 30 glycin. Thr, Lys og Ala er de eneste aminosyrer, der påvirkes af reaktionerne. Værdierne af disse aminosyrer for svine-(human) insulin er: Thr = 1,93 (2,87), Lys = 0,97 (0,98) og Ala = 2,00 (1,05). Mængden af uomdannet svineinsulin i reaktionsblandingerne blev bestemt ud 35 fra alaninanalyse af "insulinpoolen" efter chromatografi på "Sephadex G-50". Koblingsudbyttet angives som mængden U9616 9 af et givet produkt divideret med mængden af det totale insulinforbrug i reaktionen.

ENZYMATISK NEDBRYDNING AF INSULINDERIVATER (eksempel 2) 5

Nedbrydning af forskellige insulinderivater med carboxy-peptidase A og Y udførtes i en 0,05 M Tris puffer, pH

7,5 ved stuetemperatur under anvendelse af ca. 0,5 mM insulin og 5^uM carboxypeptidase. Reaktionstiden var 10 3 timer med CPD-A og 1,5 time med CPD-Y. Under disse betingelser opnåedes den maksimale frigivelse af C-termi-nal aminosyre. Efter at reaktionsblandingen var blevet gjort sur med HC1, anvendtes de udtagne mængder direkte i aminosyreanalysatoren.

15

Aminosyresekvensen i den C-terminale del af de forskellige insulinderivater bestemtes efter trypsinnedbrydning og reaktion af det nedbrudte materiale med Dansylchlorid, efterfulgt af identificering af Oansylpeptider. Nedbryd-20 ning af insulinderivater med trypsin udførtes i 0,1M

NaHCOj ved pH-værdi 8,2 under anvendelse af 1 mM insulin, 40yuM DPCC-trypsin og en inkubationstid på 1 time. Forudgående forsøg på svineinsulin havde vist, at disse betingelser var tilstrækkelige til fuldstændig frigørelse 25 af den C-terminale alanylrest fra B-kæden. De frigjorte aminosyrer eller dipeptider blev dansyleret som følger:

Til en lOO^ul prøve af trypsin-nedbrydningsblandingen sattes 100yul 0,5M HC1, hvorved nedbrydningen standsede.

Prøven blev inddampet til tørhed og genopløstes i 100^ul 30 0,1M NaHCOj, pH-værdi 8,2. lOO^ul Dansylchlorid (5 mg/ml) i acetone tilsattes, og reaktionsblandingen inkuberedes i 2 timer ved 37°C. Reaktionsblandingen blev analyseret ved HPLC ved hjælp af et Waters væskechromatografi-system, der bestod af en Model U6K injector, 2 Model 6000 A 35 pumper, en Model 660 Solvent Programmer, en Model 450 UV detector, et Waters Data Modul og et Waters Radial Com- 149616 ίο pression Module (RCM 100) kammer forsynet med en Waters Radial Pak A (C-18 reverse phase) kolonne.

Følgende standardforbindelser blev syntetiseret: 5

Dns-Ala-OH, Dns-Thr-OH, Dns-Ala-Thr-OH, Dns-Thr-Thr-OH, Dns-Thr-NH^, Dns-Thr-Thr-NH2 og Dns-Ala-Thr-NH^. Ved at anvende den ovenfor beskrevne fremgangsmåde for dansy-lering af insulinnedbrydningsproduktet, kunne tre af 10 disse derivater syntetiseres fra H-Ala-OH, H-Thr-OH

og H-Thr-NI^. De dansylerede dipeptider blev syntetiseret via Dns-Ala-OMe og Dns-Thr-OMe: 1 mmol H-Ala-OMe,HC1 opløstes i 0,1M NaHCO^, 5 mmol Dansylchlorid tilsattes, og reaktionsblandingen inkuberedes i 2 timer. Dns-Ala-OMe 15 ekstraheredes fra reaktionsblandingen med ethylacetat og inddampedes til tørhed. Det påvistes ved HPLC, at det isolerede produkt var rent. Samme fremgangsmåde anvendtes ved syntetisering af Dns-Thr-OMe. Ved anvendelse af fremgangsmåderne til enzymatisk peptidsyntese svarende 20 til de tidligere beskrevne (Ref. 3 og 6) kobledes disse to forbindelser dernæst til H-Thr-0H, der gav Dns-Ala-Thr-OH og Dns-Thr-Thr-OH, og H-Thr-NH2, der gav Dns-Ala-Thr-NH2 og Dns-Thr-Thr-NH2. Betingelserne var følgende: 5 mM substrat, 0,5M nucleophil, 0,1M KC1, 2 mM EDTA, 25 l^uM CPD-Y, pH 9,0, 10¾ ethanol. Alle syv Dansylderivater kunne nemt adskilles ved HPLC ved brug af to forskellige programmer.

Opfindelsen illustreres nærmere på tegningen, hvor 30

Fig. 1 viser en elueringsprofil fra en ionbytningschroma-tografi af reaktionsproduktet mellem svineinsulin og threoninamid.

35 EKSEMPEL 1 (Baggrundsundersøgelser)

Svineinsulin inkuberedes med carboxypeptidase-Y ved 11 149616 25°C og pH 5 - 7, der er et pH-område, hvor enzymet udviser maksimal peptidaseaktivitet. Derved frigjordes følgende aminosyrer fra C-terminalen af B-kæden: 1,0 Alanin, 1,0 Lysin, 1,0 Prolin, 1,0 Threonin, 1,0 Tyrosin 5 og 2,0 Phenylalanin. Ved stilling B-23 (glycin) standser carboxypeptidase-Y, og man kan således opnå en fuldstændig frigivelse af de første 7 aminosyrer i B-kæden i insulin. Overraskende nok frigives C-terminal asparagin (A-21) i A-kæden overhovedet ikke. Ved pH 9,5 frigives C-terminal 10 alanin fra B-kæden meget hurtigere end de efterfølgende aminosyrer. Da det rensede CPD-Y præparat var fri for protease A (endopeptidase) i modsætning til mange kommercielt tilgængelige præparater fra andre kilder, hydrolyseredes (B-15-16) Leu-Tyr bindingen ikke, hvilket er 15 af stor vigtighed.

EKSEMPEL 2 (Omdannelse af svineinsulin til human insulin under anvendelse af threoninamid som aminkom-ponent og med isolering af insulinamidmellem-20 produkterne og efterfølgende deamidering ifølge opfindelsen)

Til en opløsning af zinkfri svineinsulin (2 mM) i 2 mM EDTA, 0,1M KC1 og 1,5M guanidin hydrochlorid og indehol-25 dende 0,5M threoninamid (L-Thr-NH2) ved pH 7,5 og 25°C sattes CPD-Y (15^,uM). pH-værdien holdtes konstant under reaktionen ved tilsætning af 0,5M NaOH ved brug af en pH-stat. For at følge reaktionsforløbet blev lige store prøver udtaget på forskellige tidspunkter, og reaktionen 30 blev standset efter 2 timer ved at indstille pH-værdien til 1,5 - 2,0 med 1M HC1. Insulinfraktionen skiltes fra enzymet og lavmolekylære forbindelser ved chromatogra-fering på "Sephadex ® G-50 fine" (1 x 30 cm) ækvilibre-ret med 1M eddikesyre og blev lyofiliceret. Aminosyre-35 analyse på den lyofilicerede "insulin pool" som beskrevet ovenfor viste, at 78°ό af svineinsulinet var blevet for- 12 149616 brugt under reaktionen.

For yderligere at analysere reaktanterne i "insulin poolen" gennemførtes ionbytningschromatografi på "DEAE-5 Sephadex ® A-25" i det væsentlige som beskrevet af

Morihara et al. (Ref. 1). Den lyofilicerede insulinprøve (75 mg) opløstes i 0,01M Tris, 2,5M urinstof, 0,05M NaCl, pH 7,5 og påførtes en "DEAE Sephadex® A-25" kolonne (2,5 x 25 cm) ækvilibreret med den samme puffer. Insulinet 10 blev elueret med en NaCl gradient fra 0,05 til 0,30M i den samme puffer og 8 ml fraktioner opsamledes på en "Sephadex ®G-25" kolonne og blev lyofiliseret.

Elueringsprofilen er vist i fig. 1, hvor tre toppe kan 15 observeres. Desuden er aminosyresammensætningerne for de enkelte toppe og topsammensætningerne som resultat af nedbrydningsforsøg udført med CPD-Y og CPD-A som beskrevet ovenfor. Da kun C-terminalen af B-kæden i insulin er involveret i disse reaktioner anvendes -Pro-20 Lys-Ala-OH som forkortelse for svineinsulin. Andre insulinderivater forkortes også tilsvarende: -Pro-Lys-Thr-OH = human insulin, -Pro-Lys-Thr-NH^ = human insulinamid, etc. Det ses, at ved pH-værdien 7,5, der blev brugt i reaktionen, og hvor amidaseaktiviteten for CPD-Y almin-25 deligvis er lavere end peptidaseaktiviteten, er det dannede peptidamid tilstrækkeligt stabilt, da toppen I omfattede ca. 208! af den totale "insulin pool". Ca.

75¾ af svineinsulinudgangsmaterialet blev omdannet i reaktionen. Da imidlertid threoninindholdet i toppen 30 I (3,65) er større end de 3,0 i human insulin, er det tydeligt, at det oprindelige transpeptideringsprodukt (-Pro-Lys-Thr-NH2) ikke er tilstrækkelig stabilt til at undgå en oligomerisering under dannelse af (-Pro-Lys-Thr-Thr-NH2)·

Denne dannelse af en blanding af amid-mellemprodukter 35 13 149616 kunne umiddelbart indicere, at homogent human insulin •s ikke ville blive dannet ved deamidering ved hjælp af CPD-Y, da det kunne forventes, at deamideringen ville resultere i en blanding af -Pro-Lys-Thr-OH og -Pro-Lys-5 Thr-Thr-OH. Når imidlertid top I blandingen underkastedes en deamideringsbehandling ifølge opfindelsen med lO^uM CPD-Y ved pH 10,0 i 0,1M KC1, 2mM EDTA i 20 minutter opnåedes overraskende næsten ren human insulin. Forsøget forløb som følger: 10

Efter at det omsatte insulin var skilt fra enzymet og (ft det lavmolekylære materiale ved chromatografi på "Sephadex G-50", chromatograferes materialet på "DEAE Sephadex® A-25" ved at anvende fremgangsmåder, der er identiske 15 med de ved fig. 1 angivne. Reaktionsproduktet elueredes som top II som forventet, mens uomsat materiale (<10%) elueredes som top I. Der var ingen top III, d.v.s. der dannedes ingen insulinderivater uden lysin. Som vist i resultaterne i Tabel I nedenfor opnået med CPD-A, 20 CPD-Y og trypsinnedbrydning, var kun threoninindholdet væsentligt påvirket af disse reaktioner. Dette er i overensstemmelse med den forventede mangel på peptidase-aktivitet for CPD-Y ved denne pH-værdi.

25 Aminosyresammensætningen af top II fra deamiderings-reaktionen ligger tæt på analysen for human insulin:

Thr = 2,87, Ala = 1,05, Lys = 0,98. Nedbrydningen af deamideret produkt med CPD-Y, CPD-A og trypsin viser, at prøven indeholdt 90-95% rent human insulin. Dette 30 indicerer, at insulinderivatet -Pro-Lys-Thr-Thr-NH2 reagerer næsten udelukkende via peptidyl-aminosyre-amid-hydrolaseaktiviteten, mens -Pro-Lys-Thr-NH2 reagerer overvejende via amidaseaktiviteten. Det totale udbytte ved omdannelsen af svineinsulin til human insulin er 35 ca. 30% beregnet på mængden af omdannet insulin.

TABEL I

14 149616

Aminosyresammensætning af toppene I, II og III i fig.

1 og top II opnået efter deamideringsbehandling af top I fraktionen

Top II opnået efter deamidering _ Top I Top II Top III af Top I_

Asparaginsyre 2,99 2,99 3,01 3,01

Threonin 3,62 2,52 2,50 2,79

Serin 2,93 2,92 2,92 2,93

Glutaminsyre 6,88 7,16 7,18 7,01

Prolin 1,00 0,98 0,71 0,87

Glycin 4,00 4,00 4,00 4,00

Alanin 1,16 1,52 1,03 1,09

Valin 2,42 2,82 2,81 2,50

Ileucin 0,94 1,04 1,09 1,19

Leucin 5,80 . 6,21 6,18 6,10

Tyrosin 3,8C 3,86 3,67 4,02

Phenylalanin 2,74 2,82 2,65 2,64

Histidin 1,96 1,90 1,93 1,89

Lysin 0,99 0,74 0,06 1,01

Arginin 0,96 1,00 0,98 0,89 15 149616 EKSEMPEL 3 (Deamidering af human insulinamid opnået ved trypsinkatalyseret kondensering af Des-alanin (B30) svineinsulin (DAI) med threonin-amid).

5

For at påvise, at den fordelagtige CPD-Y katalyserede deamidering af insulinamider ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen ikke er begrænset til insulinamider opnået ved transpeptideringsfremgangsmåden ifølge stamansøgningen 10 blev human insulinamid fremstillet i overensstemmelse med kendt teknik ifølge Morihara et al. (EP 17938 og Ref. 1 og 2). Det bemærkes imidlertid, at mens amiderne er omtalt i EP 17938 som én blandt andre beskyttende grupper for carboxylgruppen i threonin, er dens anvende-15 lighed ikke blevet vist ved eksempler, idet det eneste eksempel omhandler threonin-tert.butyl ester.

Omsætningen kan illustreres med det følgende skema: 7 n

Trypsin/ThrNH? CPD-Y

DAI -4 DAI-Thr-NhL -* DAIThr

pH 6,5 L

Denne fremgangsmåde har den betydelige fordel i forhold til fremgangsmåden, der er eksemplificeret i EP 17938, 25 at den enzymatiske deamidering er meget mildere end syre-katalyseret deesterificering ifølge Morihara et al.

Fremstilling af DAI-ThrNHp 30

Threoninamid,hydrochlorid (400 mg) suspenderedes i 60?ό dimethylformamid (DMF) (2 ml). pH-værdien indstilledes til 6,5 med pyridin (20 ^ul) og 6M NaOH (50 yul). Trypsin (100 mg) og DAI (100 mg) tilsattes. Efter 1/2 time stand-35 sedes reaktionen ved tilsætning af myresyre (1 ml).

o (R)

Reaktionsblandingen fraktioneredes på "Sephadex w G-50" 16 149616 med 1M eddikesyre. Følgende fraktioner blev opsamlet:

Trypsinfraktion: 60 mg

Insulinfraktion: 102 mg 5 Rest: 371 mg

Insulinfraktionen (102 mg) rensedes ued ionbytnings-chromatografi på "DEAE Sephadex ® A-25", ækuilibreredes med 7M urinstof og elueredes med en NaCl gradient i 10 overensstemmelse med EP 17938.

Rent human insulinamid (DAI-Thr-NH^) i en mængde på 59,2 mg (bestemt ued aminosyreanalyse) blev opnået.

15 Fremstilling af DAI-Thr (human insulin) DAI-Thr-Nl^ (11 mg) opløstes i ImM EDTA og 2mM KC1 (2 ml). pH-uærdien indstilledes til 9,0 ued hjælp af 0,5M NaOH (51^ul) og CPD-Y (50yul, 13,6 mg/ml) tilsattes.

20 Efter 15 minutters forløb standsedes reaktionen med 6M HC1 (25yul), og pH-uærdien faldt til 1,2. Reaktions-blandingen fraskiltes på "Sephadex G-50" og elueredes med IH eddikesyre. 8 mg human insulin bleu opnået. Amino-syreanalysen er vist i Tabel II nedenfor:

TABEL II

17 148616

Aminosyreanalyse

Human insulin Human _( formel)_DAI_Amid_insulin

Asp 3 2,97 3,05 3,04

Thr 3 1,91 2,94 2,90

Ser 3 2,86 2,86 2,95

Glu 7 7,27 7,23 . 7,04

Pro 1 0,94 0,95 0,85

Gly 4 4,000 4,000 4,000

Ala 1 1,00 1,00 1,04

Cys 6 5,31 5,19 5,02

Val 4 3,37 3,11 3,24

Ile 2 1,36 1,22 1,40

Leu 6 6,28 6,20 6,13

Tyr 4 3,64 3,97 3,77

Phe 3 2,82 2,92 2,83

His 2 1,96 1,96 1,87

Lys 1 0,94 1,00 0,95 NH3 6 8,12 6,46 6,98

Arg 1 0,98 0,99 0,87

Thr/Ser 1,00 1,003 (x3/2) 1,027 0,984 143616 18 EKSEMPEL 4 (Omdannelse af human insulin-methylester til human insulin)

Human insulin-methylester fremstilledes ved kobling 5 af des-Ala(B30)insulin med threonin-methylester i nærvær af trypsin som beskrevet af Gattner et al. (Ref. 8).

5 mg Ins-Thr(B30)-0Me opløstes i 1 ml 0,1M KC1 med ImM EDTA ved at hæve pH fra 4,5 til 8,5 med 1M NaOH. Denne 10 pH holdtes i en pH-stat med 0,05M NaOH som titrant ved stuetemperatur. Reaktionen startedes ved tilsætning af l^ug CPD-Y opløst i lO^ul vand. Reaktionen fulgtes med HPLC; efter 1 time og 10 minutter var hydrolysen færdig. Reaktionsblandingen gelfiltreredes i 30% HAC 15 over "Sephadex ® G-50". Udbytte bestemt ved A2qq var 4,8 mg human insulin.

Aminosyreanalyse gav følgende sammensætning:

TABEL III

19 149616

FORMEL ANALYSE

Asp 3 3,00

Thr 3 2,83

Ser 3 3,00

Glu 7 7,09

Pro 1 0,76

Gly · 4 4,00

Ala 1 1,07

Cys 6 4,67

Mal 4 2,88

Ile 2 1,97

Leu 6 6,18

Tyr 4 3,89

Phe 3 2,89

His 2 1,86

Arg 1 0,97

Lys 1 0,98 20 149616

REFERENCER

1. Morihara, V.: Semi-synthesis of human insulin by trypsin-catalysed replacement of Ala-B30 by Thr in porcine insulin, Nature, Vol. 280, No. 5721, 1979, 412-13 2. Morihara, K,, Oka, T., Tsuzuki, H., Tochino, Y.,

Kanaya, T.: Achromobacter protease I-catalyzed conversion of porcine insulin into human insulin, Biochemical and Biophysical Research Comm. Vol. 92, No. 2, 1980, 396-402.

3. Widmer, F., Johansen, J.T.: Enzymatic peptide synthesis carboxypeptidase Y catalyzed formation of peptide bonds, Carlsberg Res. Commun., Vol. 44, 23. april 1979, 37-46.

4. Johansen, J.T., Breddam, K., Ottesen, M.: Isolation of Carboxypeptidase Y by affinity chromatography,

Carlsberg Res. Commun., Vol. 41, No. 1, 1976, 1-13.

5. Lee, H.-M., Riordan, J.F.: Does carboxypeptidase Y have intrinsic endopeptidase activity?, Biochemical and Biophysical Research Comm., Vol. 85, No. 3, 1978, 1135-1142.

6. Breddam, K., Widmer, F., Johansen, J.T.: Carboxypeptidase Y catalyzed transpeptidations and enzymatic peptide synthesis, Carlsberg Res. Comm. Vol. 45, 4. november 1980, p. 237-247.

7. Kubota et al., Carboxypeptidase C^, J. Biochem.,

Vol. 74, No. 4 (1973), p. 757-770.

8. Gattner et al., Trypsin catalyzed pepti.de synthesis: Modification of the B-chain C-terminal region of insulin; European Peptide Symposium 1980.