DK153406B - Poroest, uorganisk stoettemateriale, der er belagt med en organisk, stationaer fase, til anvendelse i kromatografi og fremgangsmaade til dets fremstilling - Google Patents

Description

Opfindelsen angår et støttemateriale, der er velegnet som sådant i kromatografi eller som et udgangsmateriale, der ved binding hertil af forbindelser, der indeholder ioniske grupper, ligander eller biomakromolekyler, kan anvendes som ionbytter, som et medium i affinitetskromatografi eller i enzymatiske reaktioner, hvilket støttemateriale består af porøse, uorganiske silaniserede partikler, hvorpå der kovalent er bundet en organisk stationær fase opbygget af (co)polymer i serede vinylmonornerer, der indeholder amidgrupper.

Støttemateriale af den ovenfor anførte type er beskrevet blandt andet i US patentskrift nr. 3.983.299. Den så anvendte organiske stationære fase er et tyndt lag af et carbohydronat, såsom dextran eller saccharider med en molekylvægt mindre end 6000. En stor ulempe ved støttematerialer af denne type er, at carbohydrat er et naturligt materiale, som ikke blot undergår oxidativ nedbrydning, men også er genstand for biologisk angreb. En yderligere ulempe er, at antallet af funktionelle grupper, der skal bindes dertil til sidst, forbliver temmeligt begrænset.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en hidtil ukendt type støttemateriale, som ikke udviser den ovennævnte ulempe.

Det skal bemærkes, at støttematerialer til anvendelse i kromatografienmere specielt affinitetskromatografi og baseret på et porøst uorganisk materiale og en organisk, stationær fase af en syntetisk polyme^ kendes fra DE patentskrift nr. 2.750.595. I dette tilfælde gøres der imidlertid ikke brug af silaniseret materiale, og der opnås en mindre kraftig binding mellem den organiske, stationære fase og det uorganiske materiale.

I det nævnte DE patentskrift nævnes desuden ikke anvendelsen af en tværbundet polymer. Delvis på grund af anvendelsen af et ikke-si1aniseret materiale og specielt vinylmonomerer kan det under visse omstændigheder ske, at hverken den hydrolytiske stabilitet eller adsorptionsegenskaberne af dette støttemateriale er tilfredsstillende.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer et hydrolytisk meget stabilt støttemateriale, som er fremragende velegnet til anvendelse til det ovennævnte formål, hvor støttematerialet skal anvendes mange gange efter hinanden.

Det hidtil ukendte støttemateriale ifølge opfindelsen består af porøse, uorganiske silaniserede partikler, hvorpå der covalent er bundet en organisk, stationær fase, der er opbygget af (co)polymeriserede vinylmonomerer og indeholder amidgrupper og er ejendommeligt ved, at

(A) det uorganiske materiale er blevet silaniseret med en organisk silan med formlen I

(I) hvori n = 1-5, fortrinsvis 3, R^ er halogen eller alkoxy (1-10 C); R2 og R3 hver er halogen, alkoxy (1-10 C), alkyl (1-3 C) eller aryl (6-10 C), idet halogenet og alkoxygruppen i Rj, R? og R3 er i stand til at danne en -Q-Si-binding mellem silanet og det uorganiske materiale via dets overfladehvdroxylgrupper; og R4 er amino, substitueret amino, såsom ω -amino-alkyl (1-3 C)-amino, mercapto, en estergruppe eller glycidoxy og fortrinsvis er glyc i doxy, og (B) den organiske, stationære fase er en tværbundet (co)poly- mer, der er opnået ved additionspolymerisation og opbygget af 0,1 -140 pmol , fortrinsvis 5-25 umol vi ny 1 monomerer pr. m2 uorganisk overflade af støttematerialet, idet nævnte (co)poly-mer indeholder mindst 0,1 pmol amidgrupper pr. m2 uorganisk overflade af støttematerialet, idet nævnte vinylmonomerer består helt eller delvis af bi funktionelle vi ny1 monomerer indeholdende amidgrupper og med formlen (II)

(II) hvori R5 og F*6 hver er hydrogen, en alkyl- eller cykloalkyl-gruppe med indtil 6 carbonatomer eller en arylgruppe med indtil 10 carbonatomer; R7 er hydrogen eller en organisk gruppe med indtil 20 carbonatomer; og m er et helt tal fra 1-10, hvor amidgrupperne er blevet opnået delvis ved at omsætte (a) et afstandsmolekyle, en ligand, et bio-makromolekyle eller en forbindelse, der indeholder en ionisk gruppe, idet hver har en reaktiv gruppe og en eller flere amidgrupper, med en reaktiv gruppe af en vinyimonomer eller den tværbundne (co)polymer, eller (b) et afstandsmolekyle, en ligand, et bio-makromolekyle eller en forbindelse, der indeholder en ionisk gruppe, hver med en eller flere amino- og/eller carboxylgrupper, med en eller flere carboxyl- og/eller aminogrupper i den tværbundne (co)polymer.

Det hidtil ukendte støttemateriale kan med fordel anvendes i industriel målestok. Det har meget hensigtsmæssige hydrofile egenskaber, har høj mekanisk stabilitet og er i stand til at tåle store strømningshastigheder. Det går ikke i opløsning i vandige opløsninger og giver ikke anledning til uspecifikke reaktioner med biomakromolekyler. Materialet kan let regenereres og er modstandsdygtigt over for nedbrydning på grund af mikrober og enzymer.

Udtrykket "bifunktionel vinylmonomer" anvendes i den foreliggende tekst til at beskrive en monomer, som foruden den vinyliske funktion har mindst én hydrofil funktionel gruppe, der er i stand til at danne covalente bindinger, dvs. i formlen II gruppen -OR^. "Delvis" er fortrinsvis > 5 mol%.

Silaniseret, uorganisk materiale omfattende glycidoxygrupper hydrolyseres til opnåelse af glycerylgrupper før (co)poly= merisation.

Britisk patentskrift nr. 1.456.865 omhandler et kiselhol-digt, partikelformet støttemateriale til anvendelse i kromatografi, specielt i ionbytterkromatografi, med en stationær, organisk fase, som er en copolymer, der er bundet til støttematerialets overflade. Det kiselholdige materiale er silaniseret med en vinylsilan, og det silaniserede materiale er copolymeriseret med en vinylmonomer indeholdende en eller flere olefiniske grupper. Vinylmonomeren kan indeholde funktionelle grupper, såsom halogen, hydroxyl, methoxy, amid, trichlorsilinyl, carboxylsyre og en estergruppe, men disse funktionelle grupper synes ikke at være af afgørende betydning, når henses til eksemplerne, som angår vinyImonomerér, såsom propylen, isobutylen, styren og butadien, idet undtagelsen er eksempel 4, hvori vinylmonomeren er maleinsyreanhydrid.

Den bundne podecopolymer, som afhængigt af valget af vinylmonomeren ikke er tværbundet eller svagt tværbundet, kan yderligere tværbindes under anvendelse af tværbindende midler, såsom divinylbenzen eller dichlorpropan.

Det dannede produkt med overvejende hydrofobe egenskaber omdannes så fortrinsvis til en syre- eller en base-ionbytterpodecopolymer ved sulfonering, phosphonering, carboxylering, hydroxylering eller aminering.

Den bundne copolymer kan alternativt blive funktionali-seret ved omsætning med et chelateringsmiddel til indføring af et chelateringsmiddel i den bundne podecopolymer, eller nitrilgrupper kan indføres ved omsætning af et alkyl= nitril med halogenatomer, der er indeholdt i den bundne copolymer.

Dette kendte vinyl-silaniserede støttemateriale med copoly= mer covalent bundet derpå har ikke de særlige hydrofile egenskaber og ikke den store alsidighed i kromatografiske anvendelser som materialet ifølge opfindelsen. Det kendte materiale er ikke velegnet til affinitetskromatografi og har ringe egenskaber i størrelsesudelukkelseskromatografi.

US patentskrift nr. 3.984.349 omhandler et porøst, findelt eller kolloidt, uorganisk støttemateriale til anvendelse i kromatografi indeholdende overfladehydroxylgrupper, som er modificeret ved, at der til overfladen er podet en organisk gruppe for at etablere en -O-Si-binding, hvori den organiske gruppe har en gennemsnitlig molekylvægt på over 150 og indeholder mindst én hydrofil funktionel gruppe.

Den organiske gruppe er en silan, der er dannet ved tilføjelsen af en forbindelse, som omfatter en vinyl- eller allylafslutning og mindst ét hydrofilt radikal og en simpel silanfeller ved copolymerisation af en vinylmonomer, som indeholder mindst ét hydrofilt radikal og en umættet silan, dvs. en organisk silan, hvori den organiske gruppe indeholder ethylenisk umætning. Det således dannede silan omsættes med det uorganiske støttemateriale, f.eks. silica. På denne måde forsynes støttematerialets overflade med lange kæder ("haler") af (co)polymer uden nogen tværbinding,og i tilfældet af en copolymer indeholdende adskillige silangrupper pr. molekyle vil ikke alle disse silangrupper reagere med det uorganiske støttemateriales overfladehydroxylgrupper, således at for dette kendte materiale vil de forstyrrende, ikke-specifikke adsorptionsegenskaber af støttematerialet selv eller af silaner-nes silanolgrupper stadigt eksistere i en vis udstrækning. Til forskellige kromatografiske anvendelser (f.eks. stør-relseseksklusionskromatografi, affinitetskromatografi) er dette adsorptionsfænomen meget forstyrrende. Belægning af det uorganiske støttemateriale ifølge den foreliggende opfindelse fører til kromatografisk støttemateriale med fuldstændig eller næsten fuldstændig deaktiveret uorganisk overflade og med fremragende hydrofile egenskaber. For skellige porøse, uorganiske materialer er velegnede til anvendelse i støttematerialet ifølge den foreliggende opfindelse. Eksempler herpå omfatter oxider af aluminium, titan, nikkel, zirkonium og jern, forskellige silikater, såsom ler, diatomejord, kaolin, bentonit, magnesiumsilikat (talkum), asbest og glas. Porøst silica (Si02) foretrækkes. Særligt fordelagtige resultater opnås med silicaperler. Egnede perler markedsføres af Rhone-Poulenc under handelsnavnet Spherosil. I forhold til kontrolleret poreglas har dette materiale den fordel, at det er i alt væsentligt kugleformet. Prisen er desuden væsentligt lavere.

De uorganiske materialers porediameter vil sædvanligvis ligge fra 50-10.000 Å. Den valgte diameter afhænger af den påtænkte anvendelse. I affinitetskromatografi vil der f.eks. sædvanligvis blive anvendt perler med en porediameter af størrelsesordenen fra 250-3000 Å.

Perlernes porevolumen vil sædvanligvis ligge i intervallet fra 0,01-3 ml/g, idet et volumen på ca. 1 ml/g foretrækkes.

Perlernes specifikke overfladeareal vil sædvanligvis ligge 2 i intervallet fra 0,5-1000 m /g, idet den bedste værdi er fra 5-500 m^/g.

Ved fremstillingen af støttematerialet til affinitetskromatografi foretrækkes det at anvende perler med et specifikt 2 overfladeareal i intervallet fra 25-100 m /g, hvilket svarer til perler med en porediameter i intervallet fra henholdsvis 1000-250 Å. Afhængig af den påtænkte anvendelse af støttematerialet vil gennemsnitsdiameteren af det uorganiske materiale, der skal anvendes til fremstilling deraf, sædvanligvis ligge fra 2-3000 y.

Ved fremstillingen af støttematerialet til affinitetskromatografi kan der gøres brug af perler med en gennemsnits-diameter i intervallet fra 50 μ til 3000 μ, idet perler med en gennemsnitsdiameter i intervallet fra 10Q-800 μ foretrækkes. Ved fremstillingen af støttemateriale til højtryksvæskekromatografi (HPLC). foretrækkes anvendelsen af perler med en gennemsnitspartikelstørrelse i intervallet fra 2-50 y.

Før en organisk, stationær fase covalent bindes derpå, skal det porøse, uorganiske materiale silaniseres. Dette kan ske på en måde, der er i og for sig kendt i den kemiske teknologi. Formålet med silaniseringen er at give det uorganiske materiale reaktive grupper for at tillade, at den tværbundne polymer får en covalent binding. Eksempler på silanerings-reaktioner, som er velegnede til brug ved fremstillingen af de foreliggende støttematerialer, er beskrevet i det førnævnte US patentskrift nr. 3.983.299 og i en artikel af Pryde i Journal of Chromatographic Science, bind 12 (1974), side 486-498. Som tidligere anført silaniseres det uorganiske materiale med et organosilan af formlen I.

I forbindelse med den foreliggende opfindelse foretrækkes et støttemateriale, hvor det uorganiske materiale er underkastet silanisering med y-aminopropylsiloxygrupper, γ-mercaptopropylsiloxygrupper eller hydrolyserede y-glycid= oxypropylsiloxygrupper, idet sidstnævnte grupper særligt foretrækkes.

Det har vist sig, at der til størstedelen af de fornævnte anvendelser opnås de gunstigste resultater med et støttemate-riale, hvori den tværbundne polymer er opbygget af 5-25 ymol vi ny 1 monomerer pr. m2 af det siTaniserede materiales uorganiske overfladeareal. Specielt i det tilfælde, hvor de foreliggende støttematerialer anvendes til affinitetskromatografi, er det ønskeligt, at de har optimale hydrofile egenskaber. Dette krav tilfredsstilles ved hjælp af den foreliggende opfindelse, der giver et støttemateriale, der indeholder mindst 0,1 pmol amidgrupper pr. m2 uorganisk overfladeareal af det si-laniserede materiale. Amidgrupper er ikke blot modstandsdygtige over for hydrolytisk dekomponering i vandige opløsninger under kraftigt varierende betingelser, men de er også stabile over for mikrobielt og/eller enzymatisk angreb. I praksis vil støttematerialet indeholde 5-25 ymol amidgrupper pr. m2 uorganisk overfladeareal af det silaniserede materiale.

Som tidligere angivet påvirkes indføringen af amidgrupper i den organiske, stationære fase ved, at der i (co)poly= merisationen anvendes en bifunktionel vinylmonomer af formlen II. Nævnte bifunktionelle vinylmonomer kan være den eneste kilde for amidgrupperne. Det er imidlertid også muligt inden for den foreliggende opfindelses omfang fordelagtigt at opnå amidgrupperne delvis ved at bringe en forbindelse, der indeholder et afstandsmolekyle, en ligand, et bio-makromolekyle eller en ionisk gruppe med en reaktiv gruppe og en eller flere amidgrupper,til reaktion med en reaktiv gruppe af vinylmonomeren eller den tværbundne polymer.

Støttematerialets egenskaber kan også påvirkes i gunstig retning, hvis amidgrupperne opnås delvis ved at bringe en eller flere amino og/eller carboxyl grupper i den tværbundne polymer til reaktion med en forbindelse, der indeholder et afstandsmolekyle, en ligand, et bio-makromolekyle eller en ionisk gruppe med carboxyIgrupper og/eller am inogrupper .

Inden for den foreliggende opfindelses omfang har det vist sig, at belagte materialer, hvori de amidgruppeholdige vinyl= monomerer af formlen II er inkorporeret, er særdeles velegnede til anvendelse i væskefaseeksklusionskromatografi, gelfiltrering eller størrelseseksklusionskromatografi (SEC).

Det porøse, uorganiske materiale består fordelagtigt af silicaperler, der fortrinsvis har en diameter i intervallet fra 100-200 μ og markedsføres af Rhone-Polenc under handelsnavnet Spherosil. Det er en stor fordel ved de belagte perler, at der i de sædvanlige vandige opløsninger ikke sker nogen adsorption eller biospecifik reaktion mellem perlenes overflade og bio-makromolekylerne.

Amidgrupper, der indeholder vinyImonorærer., som er særligt velegnede til anvendelse ved fremstillingen af en polymer belægning, er N-(hydroxyethyl)acrylamid og N-methyloi ime-cru -acrylamid, fortrinsvis sidstnævnte.

Ved anvendelsen af den biofunktionelle vinylmonomer af formlen II sker tværbinding under additionspolymerisation. I det tilfælde, hvor der findes y-aminopropylsiloxygrupper på det si-laniserede materiale, vil den covalente binding almindeligvis være en amidbinding, der er opnået ved omsætning af en am i no-gruppe af silanet med en carboxyl gruppe af additionspolymeren. Γ det tilfælde, hvor der indgår N-methy1 o 1 am idgrupper i en eller flere af additionspolymerens vinylmonomerer, foretrækkes det at tilføre y-glycerylpropylsiloxygrupper til det uorganiske materiale. N-methylolamidgrupperne er med opvarmning og eventuelt i nærværelse af et syrespor i stand til at reagere med sig selv og med en y-glycerylpropylsiloxyforbindelses gly-cerylgruppe, hvilket resulterer i, at additionspolymeren tværbindes samt bindes covalent til det silaniserede materiale.

Ikke blot valget af silanen til opnåelse af det silaniserede, uorganiske materiale og den bifunktionelle vi ny1 monomer, som anvendes ved (co)polymerisationen, men også fremgangsmåden til fremstilling af støttematerialet ifølge opfindelsen bidrager til opnåelse af optimale produkter. Det silaniserede, uorganiske materiale opnås ifølge i teknikken kendte metoder som tidligere angivet heri. Den tværbundne po 1 ymerbel ægn ing opnås ved hjælp af følgende fremgangsmåde. Først opløses monomererne og, alt efter det foreliggende tilfælde, di- og/eller oligo-merer i et flygtigt, organisk opløsningsmiddel eller organiske opløsningsmidler og/eller vand og sættes til det silaniserede, uorganiske materiale. Det flygtige opløsningsmiddel fjernes derpå fortrinsvis i et roterende vakuumfordampningsapparat under omrøring og reduceret tryk og lav temperatur (under 40°C). Efter tilsætning af et opløsningsmiddel til rad ika1 initi atoren, i hvilket opløsningsmiddel monomererne slet ikke eller kun i ringe omfang opløses, opvarmes blandingen i en oxygenfri atmosfære, hvilket resulterer i, at monomererne polymeriseres, og der sker en covalent binding til det silaniserede materiale. Radikalinitiatoren kan eventuelt allerede være sat til opløsningen af monomererne.

Foruden den bifunktionelle vinylmonomer af formlen II kan der anvendes andre .vinylmonaterer i copolymerisationen til opnåelse af den tværbundne polymer. Afhængig af det påtænkte anvendelsesområde kan de yderligere vinylmono-iterer have højst varierende struktur.

Anvendelige eksempler derpå omfatter epoxyforbindelserne med en ethylenisk, umættet gruppe som nævnt i ovennævnte DE patentskrift nr. 2.750.595. Der kan ogå anvendes vinylmonomerer uden nogen reaktiv gruppe, såsom ethylen, propylen, vinylchlo-rid, vinylfluorid og/eller vinylacetat, selvom deres anvendelse er begrænset inden for den foreliggende opfindelses omfang. En forudsætning er imidlertid, at monomererne let kan polymeriseres til en additionspolymer med de krævede egenskaber til den påtænkte anvendelse. Hvis materialet f.eks. skal anvendes som ionbytter, kan der overvejes copolymerisation, hvor der gøres brug af en vinylmonomer med en kationisk eller anioni sk gruppe. Eksempler på forbindelser, der indeholder en anionisk gruppe, er vi ny 1 monomerer med en carboxyl gruppe, en su1fonsyregruppe, såsom ethylensulfonsyre, allylsulfonsyre, styrensu1 fonsyre, 2-su1foethy1methacry1 at, 2-acry1amid-2-me-thyl propyl sul fonsyre, 2-methacry1oxy-2-hydroxypropy1su1 fonsyre, (meth)acryloylesteren af ω-hydroxyalkylensulfonsyre med 1-20 carbonatomer i alky1engruppen, N-acryloyltaurin, vinyl-oxybenzensulfonsyre og acryl- eller methacry1 syre. Eksempler på vi ny1 monomerer med en kationisk gruppe er:

Alkenylpyridiner af formlen:

eller hvori q = 0 eller et helt tal fra 1-20, og R , R, og R kan a. o c være ens eller forskellige og betegner et hydrogenatom eller en alkylgruppe med 1-20 carbonatomer; aminoalkylacrylater og methacrylater såsom t-butylaminoethylmethacrylat, diethyl= aminoethylacrylat, dimethylaminopropylmethacrylamid og methacrylamidpropyltrimethylammoniumchlorid.

Til anvendelse som udgangsmateriale til affinitetskromatografi foretrækkes vinylmonomerer med reaktive grupper, som let kan kobles til forbindelser, som på den ene side har en reaktiv gruppe og på den anden side en ligand, som er velegnet til anvendelse i et specielt område af affinitetskromatografi. Affinitetskromatografi har samme mening her som defineret af Tur-kovå i "Affinity Chromatography", Elsevier, 1978, side 1 og 2. Således dækkes ikke blot affinitetsmetoder i betydningen biospecifik adsorption heraf, men også hydrofob kromatografi, covalent kromatografi, affinitetseluering såvel som undersøgelsen af reaktioner på støttematerialer, hvortil oligonucleo-tider er bundet. Ved affinitetskromatografi skal også forstås isoleringen af bio-makromolekyler ved simpel sorption på en specifik sorbent. Det er naturligvis også muligt at anvende vinylmonomerer, hvori den funktionelle gruppe er bundet uden mellemleddet af to reaktive grupper.

Foruden de førnævnte vinylmonomerer med en anionisk eller kat-ionisk gruppe omfatter eksempler på vi ny 1 monomerer med reaktive grupper; Halogenerede monomerer, såsom halogenerede alkyl-acrylater og methacrylater. Som eksempler herpå kan nævnes: 2-chlorethylacrylat og 2-chlorethylmethacrylat; halogeneret alkylacrylsyre og deraf afledte forbindelser med formlen

hvori Rj og Rg kan være ens eller for- skellige og betegner et hydrogenatom, en methylgruppe eller en ethylgruppe, og Rf betegner et hydrogenatom, en lavere alkyl-gruppe eller en arylgruppe, X betegner et hydrogenatom, halogen, CN, en arylgruppe, OH, COOH eller O-aryl, og Y betegner et chlor- eller bromatom; og halogenmethyleret styren såsom p-chlormethylstyren.

Yderligere eksempler omfatter: Reaktive heterocykli ske vinylmonomerer såsom 2-(1-aziridinyl)ethylmethacrylat, allylglyci- dylether, glycidylmethacrylat, thioglycidylacrylat, N-vinyl-2-pyrrolidon og maleinsyreanhydrid; vinylmonomerer med en aldehydendegruppe såsom acrolein og crotona1dehyd; vinylmonomerer med en aminogruppe såsom allylamin, vinylamin og p-aminosty-ren; syremonomerer såsom maleinsyre, fumarsyre, itakonsyre og syrer af formlen:

hvori t = O eller et helt tal fra 1-20; acrylsyre og deraf afledte forbindelser såsom C^CK^H COOH; vinylalkylencarboxylsyre med 2-20 carbonatomer i alkylen= gruppen; p-vinylbenzoesyre, alkylvinylether med 1-18 carbon= atomer i alkylgruppen; vinylphenylether; hydroxyalkylen= vinylether med 2-20 carbonatomer i alkylengruppen; vinyl= etheren af en polyalkylenoxidglycol med 2-20 alkylenoxid-enheder og 2-5 carbonatomer pr, alkylenoxidenhed; forbindelser af formlen:

hvori Rg betegner et hydrogenatom eller en alkylgruppe med 1-18 carbonatomer, og A betegner et hydrogenatom eller en alkylgruppe med 1-20 carbonatomer, og v betegner et helt fra 1-20.

Særligt egnede er forbindelser med formlen

hvori Rq betegner et hydrogenatom eller methyl,

Rg er -CH2NH2,

eller CH2OR1Q; X er halogen, fortrinsvis Br; og R-^q er alkyl med indtil 10 carbonatomer, fortrinsvis methyl eller glycidoxy.

Som udgangsmaterialer, der er gjort velegnede til anvendelse i affinitetskromatografi ved, at der dertil er bundet ligander anvendes der imidlertid fortrinsvis en tværbundet (co)-polymer af en eller flere 'vinylironarerer roed en funktionel gruppe af formlen;

hvori Rg = H eller CHg/Og R^ betegner en funktionel gruppe, der kan være bundet eller ej via en afstandsgruppe, og hvori R^^ betegner en hydroxylgruppe eller en eller flere af følgende grupper:

hvori R-^2 kan have samme betydning som , og p betegner et helt talt fra 2-10.

Ifølge den foreliggende opfindelse er det en fordel, hvis molekylvægten af vinylmonomeren med en funktionel gruppe og eventuelt også en afstandsgruppe højst er 1000 og fortrinsvis fra 70-400. Eksempler på ligander, der er velegnede til anvendelse i affinitetskromatografi, omfatter aminosyrer, mononu-cleotider, oligonucleotider og polynucleoti der, forskellige organiske farvende stoffer, enzyminhibitorer, polyaminosyrer, lectiner, polysaccharider, lipider, antigener, enzymer.

Opfindelsen vil blive beskrevet yderligere i de efterfølgende eksempler. Det er klart, at disse eksempler blot tjener til at belyse den foreliggende opfindelse og på ingen måde udgør en begrænsning af opfindelsens omfang.

Eksempel I

Fremstilling af y-g1ycery1propy1 si 1oxysi 1 ica-per1 er. 110 g si-licaperler (gennemsnitlig porediameter: 600 Å, specifikt overfladeareal 50 m2/g, diameter interval: 100-200 μ) blev behandlet i 2 timer med 4oo ml destilleret vand i et ultrasonisk bad ved 80°C . Efter vask af perlerne med vand indtil opnåelse af en klar opløsning blev de aktiveret ved behandling af suspensionen med 40 ml 4H HNO3. Efter vask med vand og tørring blev der tilsat 460 ml toluen til 100 g silicaperler anbragt i en kolbe. Derpå blev der til kolben sat 40 ml γ-glycidoxypropyl-trimethoxysilan. Efter at kolben var blevet forbundet til et roterende vakuuminddamponingsapparat, blev den opvarmet i 5 timer på et oliebad af 90°C .

Efter afkøling blev suspensionen filtreret fra og vasket med 500 ml toluen og 1 liter acetone. Efter fjernelse af acetonen under reduceret tryk blev perlerne tørret i 2 timer ved 50°C og under reduceret tryk. Efter tørring natten over ved 120°C og under reduceret tryk af ca. 200 mg perler blev carbonindholdet bestemt ved hjælp af elementar-analyse. Det viste sig at være ca. 2%, hvilket svarer til ca. 280 ymol γ-glycidoxypropylsiloxygrupper pr. g perler.

I en roterende vakuuminddampningsapparat indeholdende 300 ml vand syrnet til pH-værdi 2 med 10% HC1, blev 105 g af disse perler afgasset ved tryk på 12 ml Hg.

, et

Derpå blev materialet omrørt i 1 time ved'tryk på 1 atmosfære på et oliebad af 90°C. Efter afkøling af materialet blev perlerne filtreret fra og vasket med vand indtil neutral reaktion. Derpå blev perlerne tørret i 3 timer ved 70°C og henstillet natten over under reduceret tryk ved 120°C. Ved elementaranalyse viste det sig, at mængden af .Y’-glycerylpropylsiloxygrupper var ca, 280 ymol pr, g perler.

Eksempel II

Under anvendelse af samme fremgangsmåde som beskrevet i eksempel I blev silicaperler (porediameter: 260 Å, partikelstørrelse: 100-20Q p, specifiktoverfladeareal: o 102 m /g) behandlet med γ-glycidoxypropyltrimethoxysilan indeholdende indtil 500 ymol Y-glycidoxypropylsiloxy= grupper pr. g silica. Efter hydrolyse med dannelse af y-glycerylpropylsiloxysilica blev 25 g af disse perler suspenderet i 100 ml dioxan. Til denne suspension blev der sat 7,5 ml af en 60 vægt% vandig opløsning af N-methylolacrylamid. I et roterende vakuuminddampnings-apparat blev dioxanen afdampet,indtil perlerne trillede i kolben. Der blev derpå tilsat en opløsning af 150 mg dibenzoylperoxid (20% vand) i 100 ml n-hexan. Efter at suspensionen var blevet udsat for en nitrogenatmosfære, blev blandingen polymeriseret i 1,5 time ved 70°C. Suspensionen blev overført til et glasfilter og vasket med acetone og methanol, hvorefter perlerne blev tørret under reduceret tryk ved 120°C. Ved elementaranalyse viste det sig, at carbonindholdet var 8,73% og nitrogenindholdet 1,78%. Pr. g støttemateriale indgik der 1270 ymol N-methylolacryl= amid i en grundmasse i form af colymeren Dette svarer ' " 2 til 14,8 ymol N-methylolacrylamider pr. m .

Eksempel III

Idet der anyendes samme fremgangsmåde som beskrevet i eksempel I, blev silicaperler forsynet med 300 ymol y-glyceryl= propylsiloxygrupper pr. g perler (porediameter: 500 Å, perlediameter; 100-200 y, specifikt overfladeareal: 2 63 m /g). 10Q g af disse perler blev blandet med 7,5 ml af en vandig opløsning indeholdende 60 vægt% N-methylol= acrylamid. I 400 ml vandfri ethylacetat blev der lidt efter lidt indført: 2,882 g (40 mmol) acrylsyre: 5,524 g N-hydroxysuccinimid (48 mmol) og 9,078 g (44 mmol) N,N-dicyklohexylcarbodiimid efterfulgt af filtrering af opløsningen efter en nats omrøring. Filtratet blev sat til suspensionen af silicaperler, hvorefter ethylacetatet blev fjernet under reduceret tryk ved 40°C i et roterende' vakuuminddampningsapparat. Til perlerne blev der derpå tilsat en opløsning af 400 mg dibenzoylperoxid i 400 ml isooctan. Suspensionen blev opvarmet i en nitrogenatmosfære i 1,5 time ved 70°C, hvilket forårsagede, at filmen på perlerne polymeriserede. Efter filtrering blev perler^· ne vasket med acetone og methanol og derpå tørret i vakuum ved 12Q°C. Ved elementaranalyse viste det sig, at der var opnået følgende resultater; C 6,54% N 0,99%

Ved mikrotitrering (tilsætning af overskud af ethanolamin og tilbagetitrering med HC1) bestemtes mængden af med N-hydroxysuccinimid aktiverede carboxylgrupper til 241 ymol pr. g eller 4,4 μηιοί pr. m . N-methylolacrylamidmængden viste sig at være 460 pmol pr. g.

Eksempel IV

Under anvendelse af samme fremgangsmåde som beskrevet i eksempel III blev silicaperler forsynet med 257 pmol γ-glycerylpropylsiloxygrupper pr. g perler (porediameter: 500 Å, perlediameter: 100-200 μ, specifikt overfladeareal; 63 m2/g).

100 g af disse perler blev blandet med 6,0 ml af en vandig opløsning indeholdende 6Q vægt% N-methylolacrylamid (40 mmol).

Til 400 ml vandfri dioxan blev der successivt sat 7,4 g 6-racrylamidpentancarboxylsyre (4Q mmol fremstillet ifølge en artikel af E. Brown et al., i J. of Chromatography 150 (1978), side 101-110, 5,524 g N-hydroxysuccinimid (48 mmol) og 9,078 g (44 mmol). N,N1 -dicyklohexylcarbodiimid efterfulgt af filtrering af opløsningen efter en nats omrøring. Ethylacetatet blev fjernet fuldstændigt ved inddampning under omrøring under reduceret tryk ved 40°C, Til perlerne blev derpå sat en opløsning af 400 mg dibenzoylperoxid i 400 ml n-hexan. Suspensionen blev opvarmet i en nitrogen= atmosfære i 1,5 time ved 70°C,hvilket bevirkede polymeri- sation af filmen på perlerne. Efter filtrering blev perlerne vasket med acetone og methanol og derpå tørret i vakuum ved 12Q°C, Elementaranalyse af støttematerialet viste følgende resultater; C 6,49% N 1,05%

Ved mikrotitrering viste det sig, at den med N-hydroxy= succinimidaktiverede mængde carboxylgrupper var 200 ymol 2 pr. g eller 3,7 ymol pr. m . Den indbyggede mængde af N-methylolacrylamid viste sig at være 360 ymol pr. g.

Eksempel V

Under anvendelse af den samme fremgangsmåde som beskrevet i eksempel 1 blev aluminiumoxidperler (Alumina Woelm N^g, kraftigt spaltning, høj hastighed, fin mesh aluminiumoxid, W200 neutral, specifikt overfladeareal: 200 m /g, partikelstørrelse: 18-30 y) forsynet med 422 ymol y-glycerylpropyl= siloxygrupper pr. g perler.

10 g af de silaniserede perler blev suspenderet i 50 ml ethylacetat. Til denne suspension blev der sat 3,80 ml af en vandig opløsning indeholdende 60 vægt% N-methylol= acrylamid. Efter fordampning af ethylacetat blev der tilsat en opløsning af 100 mg dibenzoylperoxid (20% vand) i 60 ml isoocten. Efter at suspensionen var blevet udsat for en nitrogenatmosfære, blev blandingen polymeriseret i 1,5 time ved 70°C.

Efter vaskning og tørring viste elementaranalyse af produktet et carbonindhold på 7,89% og et nitrogenindhold på 1,58%. Pr. g af støttematerialet forefandtes der 1130 ymol N-methylolacrylamid i form af den polymere. Dette svarer 2 til 6,78 ymol N-methylolacrylamid pr. m .

Eksempel VI

Under anvendelse af den samme fremgangsmåde som beskrevet i eksemplerne I og II blev sillcaperler (porediameter: 700 Å, perlediameter; 10Q-2QQ μ, specifikt overfladeareal: 42 m2/g). silaniseret og belagt med y^glycerylpropylsiloxy og polymeriseret N-methylolacrylamid. Elementaranalyse viste, at produktets carbonindhold var 3,15% og nitrogen- 2

indholdet 0,57%. Mængden af amidgrupper var 10,3 μιηοΐ/m . Eksempel VII

Under anvendelse af den samme fremgangsmåde som beskrevet i eksempel I blev sillcaperler forsynet med 250 ymol γ-glycerylpropylsiloxygrupper pr. g perler (porediameter: 700 Å, perlediameter: 100-200 μ, specifikt overfladeareal: 42 m2/g).

5 g af disse perler blev blandet med 20 ml dioxan, hvorefter der til den resulterende suspension blev sat 0,375 ml (2,5 mmol) af en 60 vægt% vandig opløsning af N-methylolacrylamid, 0,360 g (2,53 mmol) glycidylmethacrylat og 10 mg azobisiso= butyronitril (AIBNJ. Dioxanet blev fjernet under reduceret tryk ved 40°C i et roterende vakuuminddampningsapparat.

Derpå blev perlerne opvarmet i 4 timer i en kolbe på et oliebad af 80°C, hvorefter perlerne blev tørret i vakuum i 2 timer ved 100°C, Efter at perlerne havde fået lov til at afkøle, blev de omhyggeligt vasket med acetone og tørret igen. Ved elementaranalyse viste det sig, at. carbon= indholdet var 5,91% og nitrogenindholdet 0,51%. Ved mikro- titrering blev det påvist, at mængden af epoxygrupper 2 var 105 jjmol pr. g eller 2,9 μιαοί pr. m . Ud fra det fundne N-indhold kan det beregnes, at der i polymerbelægningen var inkorporeret ca, 310 μιηοΐ N-methylolacrylamid pr. g.

Eksempel VIII

Under anvendelse af den samme fremgangsmåde,som blev anvendt i eksempel 1, blev silicaperler forsynet med 390 ymol y-glycerylpropylsiloxygrupper pr. g perler (porediameter: 650 Å, perlediameter: 100-200 31, specifikt overfladeareal: 50 m2/g)· 10 g af disse perler blev suspenderet i 30 ml dioxan, hvorefter der til den resulterende suspension blev· sat 0,75 ml (5,00 mmol) af en 60 vægt% vandig opløsning af N-methylol^ acrylamid. Efter afdampning af opløsningsmidlet blev der tilsat 50 ml N-hexan, hvori der var blevet opløst 25 mg dibenzoylperoxid (20% vand). Efter polymerisation blev perlerne vasket med acetone og methanol og derpå tørret.

Ved elementaranalyse fandtes et carbonindhold på 4,45% og et nitrogenindhold på 0,54%. Dette støttemateriale blev derpå overtrukket med et andet lag af polymer.

Hertil blev 0,370 g 6-acrylamidpentancarboxylsyre, 0,276 g N-hydroxysuccinimid og 0,454 g N^’-dicyklohexylcarbodiimid omsat med hinanden i 20 ml dioxan. Efter filtrering af reaktionsblandingen blev opløsningen blandet med 20 ml di= oxan, 0,150 ml af en 60 vægt% vandig opløsning af N-methylol= acrylamid og 10. g af silicamaterialet forsynet med et første overtræk af polymer.

Efter afdampning af dioxanet blev der tilsat 60 ml n-hexan indeholdende 30 mg opløst dibenzoylperoxid. Ved elementar-=- analyse viste carbonindholdet sig at være 6,48% og nitro= genindholdet 0,96%. Ved mikrotitrering viste det sig, at mængden af carboxylgrupper, der blev aktiveret med N-hydroxy= 2 succinimid var 100 3imol pr, g eller 2,33 ymol pr. m .

Eksempel' IX

10 g af perlerne, der var oyertrukket i oyerensstemmelse med fremgangsmåden ifølge eksempel XV,blev behandlet med en opløsning af 4,5 g heparin (175 USP enheder/mg). i 60 ml af en 0,1 molær boratpuffer af pH-værdi 7,7.

Efter afgasning af suspensionen blev den holdt ved pH-værdi 8 ved tilsætning af 1 M natriumhydroxidopløsning og omrørt i 22 timer. Derpå blev suspensionen filtreret og successiyt vasket med 400 ml vand, 600 ml 3 M NaCl og 400 ml vand. Efter at oyerskuddet af carboxylgrupper, der var aktiveret med N-hydroxysuccinimid, var blevet blokeret ved titrering med 1 M ethanolamin, blev perlerne vasket med 400 ml vand, 300 ml 3 M NaCl og 500 ml 0,01 M trispuffer (pH-værdi 7,4).

Af de 112,5 umol aminogrupper af heparinet var 86,5 ymol efter reaktion tilbage i opløsningen og vaskevæskerne bestemt ved fluorescensspektroskopi. Det således med heparin forsynede støttemateriale blev pakket i en 50 x 16 mm søjle med et lejevolumen på 10 ml. Søjlen blev først behandlet med 0,01 M tris-puffer (pH-værdi 7,4). Derpå blev 60 ml bovinplasma ledt gennem søjlen med en strømningshastighed på 22 ml pr. time. Plasmaet viste en anti-thrombin-III-'-aktivitet på 0,92 E/ml. Efter vask me(j 0,01 M tris-puffer blev den adsorberede aktivitet elu-eret med 0,01 M tris-puffer og 3 M NaCl, Det samlede udvundne udbytte var 75%. Renheden var 2,2 E pr. mg protein, hvilket betyder en renhedsfaktor på 167.

Eksempel X

5 g af de i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge eksempel VIII belagte perler blev behandlet med en afkølet opløsning af bovin-antithrombin-TII og 140 mg heparin (med en minimal mængde af frie aminogrupper) i 20 ml af en 0,1 phosphatopløsning (pH-værdi 7,4).. Opløsningen indeholdt 11 mg ariti-5-thrombin-III/ml med en aktivitet på 5,7 E/mg.

Efter afgasning af perlerne blev opløsningen omrørt i 24 timer ved 4°C på et roterende vakuuminddampningsapparat. Derpå blev perlerne vasket på et glasfilter med 200 ml 0,1 M phosphatpuffer (pH-værdi 7). De resterende aktiverede carboxylgrupper blev blokeret ved titrering med 1 M ethanolamin, hvorefter perlerne successivt bley vasket med en 3 M NaCl-holdig 0,1 M phosphatpuffer (pH-værdi 7,4) og en 0,15 M NaCl-holdig 0,1 M phosphatpuffer (pH-værdi 7,4). Mængden af adsorberet anti-thrombin-III/g støttemateriale blev bestemt ved hjælp af Folin-testmetoden og viste sig at være 8 mg pr. g støttemateriale. Dette materiale blev pakket i en søjle,hvorefter heparinadsorptions-kapaciteten blev bestemt. Hertil blev efter ligevægt med en 0,15 M NaCl-holdig 0,02 M phosphatpuffer (pH-værdi 7,4) et stort overskud af heparin ledt gennem søjlen.

Derpå blev det adsorberede heparin elueret med en 3 M NaCl-holdig 0,02 M phosphatpuffer (pH-værdi 7,4). Det viste sig, at søjlen havde adsorberet 140 yg heparin pr. ml af lejevolumen.

Eksempel XI

Under anvendelse af samme fremgangsmåde som anført i eksempel 3 blev silicaperler forsynet med 300 ymol y-glyceryl= propylsiloxygrupper pr, g perler (porediameter: 500 Å, 2 perlediameter:100-200 y, specifikt overfladeareal; 63 m /g)-

Overfladen blev overtrukket på den i eksempel 3 beskrevne måde med 407 ymol N-methylolacrylamid og 104 ymol carboxyl= grupper/g aktiveret med N-hydroxysuccinimid. Af det således aktiverede materiale blev 100 g· portioner omsat med hver af de følgende primære aminer: 1) p-aminobenzamidinhydrochlorid 2\ ethanolamin 3) N,N-diethylethylendiamin 4} taurin 5) hexylamin 6) ethylenamin og derpå succinsyreanhydrid, 1. 10 g af støttematerialet bley suspenderet i en opløsning af 2,4 g (11,5 mmoll p-aminobenzamidindihydrochlorid i 40 ml 0,1 M phosphatpuffer (pH-værdi 8}, Efter afgasning af suspensionen blev pH-værdien indstillet på 8 med 2 N natriumhydroxidopløsning og omrørt i 16 tinier.

Suspensionen blev derpå filtreret og vekslende vasket med 0,1 M acetatpuffer indeholdende 1 M NaCl (pH-værdi 4) og 0,1 M phosphat indeholdende 1 M NaCl (pH-værdi 8) og til slut med vand.

Ved mikrotitrering (tilsætning af overskud af ethanolamin og tilbagetitrering med HC1). blev det konstateret, at støttematerialet ikke længere indeholdt aktiverede carboxyl= grupper. Slutproduktets nitrogenindhold var 0,76%, hvoraf det kan beregnes, at der var inkorporeret 45 μπιοΐ/g støttemateriale. Dette støttemateriale er meget velegnet til anvendelse ved isolering af proteaser,såsom trypsin, i overensstemmelse med en fremgangsmåde, der er beskrevet af Hixson et al. i Arch. Biochem. Biophys. 154 (1973) 501 og Methods Enzymol. 34 (1974).. 440.

2. 10 g af støttematerialet blev suspenderet i 30 ml af en 0,01 M ethanolaminopløsning. Suspensionen blev i rækkefølge afgasset, omrørt i 30 min., filtreret, vasket med vand, 1 M NaCl og igen med vand. Det målte nitrogenindhold var 0,71%, hvilket svarer til i alt væsentligt kvantitativ omdannelse af de aktiverede carboxylgrupper.

3. 10 g af støttematerialet blev suspenderet i en opløsning af 0,32 ml (2,2 mmoll Ν,Ν-diethylendiamin i 25 ml dimethyl= foramid. Efter afgasning af opløsningen blev den omrørt i 16 timer. Suspensionen blev derpå filtreret og successivt vasket med 20Q ml dimethylformamid, 200 ml vand, 300 ml 1 M NaCl og 300 ml vand. Ved elementaranalyse viste nitrogenindholdet sig at være 0,85%. Antallet af tertiære aminogrup-per/g produkt blev bestemt ved titrering i eddikesyre med perchlorsyre og viste sig at være 1QQ ymol/g, 4. 10 g af støttematerialet blev suspenderet i en opløsning af 2,5 g (20 mmol). taurin i 25 ml vand og 3,1 ml (21 mmol) triethylamin. Efter afgasning blev suspensionen omrørt i 24 timer. Efter filtrering blev suspensionen vasket successivt med vand, 2 M NaCl, 5% saltsyre og vand. Ved ele-mentaranalyse viste svovlindholdet sig at være 0,30 vægt% hvilket svarer til en inkorporering af 93 ]jmol sulfoethyl= grupper pr. g. Støttematerialet var velegnet til anvendelse som en kraftig, sur ionbytter.

5. 10 g af støttematerialet blev suspenderet i en opløsning af 0,222 g (2,2 mmol) hexylamin i 25 ml dimethyl= formamid. Efter afgasning af opløsningen blev den omrørt i 16 timer. Efter filtrering blev støttematerialet vasket successivt med 2Q0 ml dimethylformamid, 200 ml vand, 300 ml 1 M NaCl og 300 ml vand. Ved elementaranalyse viste nitrogenindholdet sig at være 0,70%,hvilket svarer til en i alt væsentligt kvantitativ ombyttelse. Det på denne måde fremstillede støttemateriale var velegnet til anvendelse i hydrofob (affinitet), kromatografi som vist ved hjælp af det følgende forsøg.

En opløsning af 5 mg mikrobiel lipase (stammer fra Chromo-bacterium Viscosum). i 10 ml 0,05 M tris, 0,05 M malein= syreanhydrid-puffer indeholdende 1 M NaCl (pH-værdi 7,0) bley bragt i kontakt med 0,5 g af støttematerialet. Affi- niteten, bestemt ifølge en .metode, der er beskrevet af A. Louwers og R. Ruyssen i Pharmeceutical Enzymes (1978), Story Scientia, Gent (Belgien)., var 20.0 enheder (U). pr. mg lipase. Efter afgasning blev suspensionen inkuberet natten over. Efter inkuberingen fandtes der 1Q5 U (10,5%) lipaseaktivitet i den oyerliggende væske. Adsorptionen udgjorde 90%. Efter fraseparering af den oyerliggende væske på et glassugningsfilter blev perlerne bragt i kontakt to gange med 5 ml vand i 45 min. Vandet viste Sig at indeholde 23 U lipaseaktiyitet. Efter fjernelse af vandet ved sugning blev perlerne inkuberet i 10 ml 50% ethanol i 2 timer. Den overliggende væske viste sig at indeholde 867 U lipaseaktivitet, dvs. 87% af den oprindelige lipaseaktivitet fandtes i eluatet, 6. 10 g af støttematerialet blev sat til en opløsning af 0,132 g (2,2 mmol) ethylendiamin i 25 ml dimethylformamid.

Efter afgasning blev opløsningen udsat for en· nats omrøring. Suspensionen blev filtreret og vasket successivt med 200 ml dimethylformamid, 200 ml vand, 300 ml 1 M NaCl og 300 ml vand. Ved analyse af en prøve af dette støttemateriale efterfulgt af tørring og titrering i iseddikesyre med perchlorsyre viste det sig, at den indeholdt 100 ymol primære aminogrup-per pr. g.

5 g af det således med primære aminogrupper forsynede støttemateriale blev suspenderet i 15 ml 0,1 M NaCl og afgasset.

Til denne suspension blev der under omrøring og i løbet af 30 min. tilsat små mængder af pulverformet ravsyreanhydrid. Der blev ialt tilsat 2 g (20 mmol).. Under denne periode blev suspensions pH-værdi holdt på 6 ved tilsætning af 20% natriumhydroxidopløsning. Efter filtrering blev perlerne vasket successivt med vand, 0,1 M NaCl og vand.

Ved pietpladeundersøgelse blev det påvist, hvorvidt alle aminogrupper var blevet omdannet. Ved denne undersøgelse blev en perle af ninhydrid bragt i kontakt med 10 mg af prøven i 0,1 ml vand. Når perlerne blev blå, blev reak- tionen med ravsyreanhydrid gentaget, indtil perlerne i ninhydrintesten ikke længere blev blå« På denne måde blev der opnået en svagt sur ionbytter. Dette støttemateriale viste sig også at være velegnet til anvendelse som et forstadium for en affinitetssøjle.

Eksempel XII

I dette eksempel påvises det, at den hydrolytiske stabilitet af støttematerialerne ifølge opfindelsen er langt bedre end af det udelukkende silaniserede støttemateriale eller af usilaniseret støttemateriale, der er overtrukket med en tværbundet polymer opnået ved additionspolymerisation og 2 med 0,1-140 ymol vinylmoncxiErer /m uorganisk materiale.

**· I alle tilfælde blev der gjort brug af silicaperler (pore- diameter: 650 Å, perlediameter: 100-200 y, specifikt over- 2 fladeareal: 50 m /g).

Der blev fremstillet tre typer af støttemateriale.

Type Å blev fremstillet i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge eksempel 1 ved at behandle silicaperlerne med γ-glycidoxypropyltrimethoxysilan. Ved elementaranalyse viste carbonindholdet sig at være 1,91%. Efter hydrolyse af y-glycidoxygrupperne blev støttematerialet dannet ved covalent binding af en belægning af en tværbundet polymer af 308 ymol N-methylolacrylamid og 196 ymol N-hydroxysuccin-imid-aktiveret 6-acrylamidpentancarboxylsyre pr. g til y-glycerylpropylsiloxysilicaets overflade. De med N-hydroxy= succinimid-aktiverede carboxylgrupper blev omdannet ved titrering med en 1 molær ethanolaminopløsning. Ved'elementaranalyse viste det sig, at det resulterende materiale indeholdt 5,68% carbon og 0,93 vægt% nitrogen.

Type B blev fremstillet ved at oyertrække usilaniseret silicaperler direkte med en tværbundet copolymer af 360 ymol N-methylolacrylamid og 210 ymol 6-acrylamidpentan= carboxylsyre/g aktiveret med N-succinimid. De med N- hydroxysuccinimid-aktiverede carbpxylgrupper blev omdannet ved titrering med en ethanolaminopløsning. Ved ele-mentaranalyse viste det sig, at det opnåede materiales carbonindhold og nitrogenindhold var henholdsvis 4,38 og 1,05 vægt%«

Type C blev fremstillet i overensstemmelse med fremgangsmåden, der blev anvendt i eksempel I, men ved oyertræk-ning af silicaperlerne med Y-glycidoxypropyltrimethoxy= silan. Ved elementaranalyse blev carbonindholdet bestemt til at være 3,28 vægt%. Dette svarer til 455 ymol y-glyceryl= propylsiloxygrupper pr. g.

De således fremstillede støttemateriaLer (typerne A, B og C) blev underkastet følgende hydrolyseundersøgelser: 2 g støttemateriale blev i en uge eller en dag omrørt ved en temperatur på 70°C i tre forskellige puffere med en pH-værdi på henholdsvis 8,8, 9,5 og 4,0. Resultaterne er sammenfattet i den efterfølgende tabel.

TABEL·

* Efter forsøgets afslutning blev suspensionen mælkehvid/ hvilket viser nærværelsen af silicapartikler som et resultat af hydrolytisk dekomponering af type C,

Af de i den ovennævnte tabel nævnte resultater fremgår det, at støttematerialet af type A (ifølge opfindelsen) er meget stabilt over for hydrolyse. Støttematerialet af type B var mere modstandsdygtigt over for en puffer med en høj pH-værdi end over for en med en lav pH-værdi. Støttematerialet af type C er mindre velegnet til de fleste anvendelser på grund af reaktion med bio-makromolekyler.

Eksempel XIII

På tilsvarende måde som beskrevet i eksempel I blev silica-perler (porediameter: 500 Å, specifikt areal: 63 m /g, perlediameter: 100-200 y) forsynet med 210 ymol y-glyceryl= propylsiloxygrupper pr. g perler.

Til 10 g af det silaniserede silica blev der sat en vandig opløsning af 1,045 g (5,06 mmol) 3-dimethylaminopropylmeth= acrylamidhydrochlorid, 0,91 ml (6,0 mmol) af en vandig opløsning (60 vægt%). af N-methylolacrylamid og 30 ml methanol. Efter afdampning af methanol blev der tilsat 45,5 mg azo= bisisobutyronitril (AIBN). i 35 ml isooctan, og der skete polymerisation.

Elementaranalyse af det polymeriserede produkt gav et carbon- indhold på 7,65% og et nitrogenindhold på 1,75%. Ved mikro- titrering blev mængden af svagt basiske dimethylaminogrupper af det ionbyttende produkt bestemt til at være 335 ymol 2 pr. g eller 6,1 ymol pr. m .

Eksempel XIV

På tilsvarende måde som beskrevet i eksempel I blev silica- perler (porediameter; 500 Å, specifikt overfladeareal: 2 63 m /g, perlediaraeter: 100-200 y) forsynet med 172 ymol y-glycerylpropylsiloxygrupper pr. g perler.

Til 40 g af de silaniserede perler blev der sat 7,6 ml af en vandig opløsning (40 vægt%) af methacrylamidpropyl= trimethylammoniumchlorid (18,1 mmol).,3,64 ml af en vandig opløsning (60 vægt%) af N-methylolacrylamid (24 mmol). og 14Q ml methanol. Efter afdampning af methanol blev der tilsat 150 mg AIBN, der er opløst i 140 ml isooctan.

Efter polymerisation blev perlerne vasket successivt med acetone, methanol, vand og en 3 M NaCl-opløsning. Elementaranalyse af det tørrede produkt gav et carbon= indhold på 7,32% og et nitrogenindhold på 1,59%. Ved mikrotitrering blev mængden af kraftigt basiske trimethyl= ammoniumgrupper af ionbytteren bestemt til at være 255 2 ymol pr. g eller 4,7 pnol pr. m .

Eksempel XV

a) På tilsvarende måde som beskrevet i eksempel I blev si- licaperler .(porediameter: 700 Å, specifikt overfladeareal: 2 42 m /g, perlediamter: 100-200 p) forsynet med 143 μιαοί γ-glycerylparopylsiloxygrupper pr, g perler.

Til 50 g af de silaniserede perler blev der sat en blanding af 5,18 g (25,0 mmol) 2-acrylamid-2-methylpropansulfonsyre, 3,5 ml (25,0 mmol) triethylamin, 4,55 ml (6,0 mmol) af en vandig opløsning (60 vægt%) af N-methylolacrylamid og 150 ml methanol. Efter afdampning af methanol blev der tilsat 250 mg AIBN, 50 mg p-toluensulfonsyre og 200 ml isooctan.

Det efter polymerisation opnåede produkt blev successiyt vasket med acetone, methanol, vand og 5% saltsyre.

Elementaranalyse: Carbon 5,99%, nitrogen 1,16%, svovl 1,25%.

Produktet indeholdt 438 ymol N-methylolacrylamid og 390 jimol 2-acrylamid-2-methylpropansulfonsyre pr. g. Ved mikrotitrering blev mængden af sulfonsyregrupper bestemt til at være 285 pmol pr. g.

b) 10 ml af det således fremstillede støttemateriale blev bragt i ligevægt i en søjle med 0,05 M Sørensen-puffer ved pH-værdi 5,5. 30 ml af en opløsning af hæmoglobin (indeholdende 20 mg hæmoglobin pr. ml) blev perkoleret gennem søjlen. Efter vask af søjlen med ligevægtspuffer blev hæmoglobinet elueret med 0,05 M Sørensen-puffer (pH-værdi 7,5) indeholdende henholdsvis intet, 0,5 M og 2 M NaCl. Der kunne ialt elueres 104 mg hæmoglobin, hvilket indicerer en søjlekapacitet på 10 mg hæmoglobin pr. ml støttemateriale i søjlen.

Eksempel XVI

På tilsvarende måde som beskrevet ± eksempel I blev silica- perler (porediameter: 500 Å, specifikt overfladeareal: 2 63 m /g, perlediameter: 100-200 y) forsynet med 210 ymol γ-glycerylpropylsiloxygrupper pr. g perler.

Til 10 g af de silaniserede perler blev der sat en blanding af 0,476 g (6,50 mmol) acrylsyre, 0,66 g (6,50 mmol) triethylamin, 0,91 ml (6,0 mmol) af en vandig opløsning..

(60 vægt%) af N-methylolacrylamid og 30 ml methanol. Efter afdampning af methanol blev der tilsat 60 mg AIBN og 20 mg p-toluensulfonsyre i 30 ml isooctan. Efter polymerisation blev produktet vasket successivt med acetone, methanol, 5% saltsyre og vand.

Elementaranalyse: Carbon 5,03%, nitrogen 0,67%.

Produktet indeholdt 480 ymol N-methylolacrylamid og ca. 170 ymol acrylsyregrupper pr. g.

Kapaciteten for hæmoglobin bestemt som i eksempel XVb) var 11,6 mg/ml.

Eksempel XVII

10 g af de i eksempel II fremstillede perler blev pyrolyseret ved 650°C i 2 timer. Efter afkøling blev der opnået hvide silicaperler med et carbon- og nitrogenindhold på under 0,05%. Perlerne blev behandlet igen og overtrukket igen på den i eksemplerne 1 og 2 beskrevne måde. Det opnåede produkt havde et carbonindhold på 8,63% og et nitrogen-indhold på 1,73%.

Sammenligning af gelpermeationskalibreringskurverne opnået ved eluering af polystyrenstandarder ± tetrahydrofuran viste, at porediameterområdet af materialet efter overtrækning igen var det samme som for det oprindeligt overtrukne produkt.

Eksempel XVIII

De i eksempel VI fremstillede perler blev undersøgt med hensyn til deres gelpermeationsegenskaber (størrelseseksklusion) for forskellige proteiner ved pH-værdi 7 og 9 i 0,02 M phosphatpuffer indeholdende 0,15 M NaCl.

En søjle (diameter 1 cm, højde 34,1 cm) blev fyldt med perlerne. Injektionsvolumen: 0,1 ml indeholdende 1 ml 2 protein pr. ml. Strømningen var 2,5 ml pr. min. pr. cm . Resultater:

* eluering umulig.

Fordelingskoefficient V = retentionsvolumen af proteinet.

V = retentionsvolumen af en fuldstændigt ekskluderet ........

komponent

Vt = retentionsvolumen af en fuldstændig permeabel komponent.

Eksempel XIX

Støttematerialet fra eksempel VI 1. indeholdende p-amino= benzamidingrupper blev anvendt til trypsin- og chymotryp-sinisolering. En søjle blev fyldt med perlerne. Den anvendte ligevægtspuffer var 0,1 I natriumacetat (pH-værdi 5,5) indeholdende 0,1 M NaCl og 0,001 M CaCl2. Strømningshastigheden var 15,6 ml/time. Søjlen blev elueret med 0,1 M glycin-HCl-puffer (pH-værdi 2,0) indeholdende 0,1 M NaCl og 0,001 M CaCl2·

Aktiveret pancreas-pulver (30 g) blev ekstraheret med ligevægtspuffer (100 ml) ved 5°C. 60 ml af den filtrerede ekstrakt blev overført til søjlen. Søjlen blev vasket med ligevægtspuffer og derpå elueret med glycin-HCl-puffer.

Det viste sig, at det således i eluatet opnåede trypsin blev renset syv gange og chymotrypsinet ca. tre gange (trypsinaktiv!teten blev målt under anvendelse af det chromogeniske substrat S-2160, chymotrypsinaktiviteten blev målt potentiometrisk under anvendelse af ATEE som substrat).

Begge enzymer viste sig at være ca. 30% rene efter et enkelt kromatografitrin.

Eksempel XX

På tilsvarende måde som beskrevet i eksempel III blev sili-caperler (porediameter; 320Q Å, perlediameter; 100-200 ]i, specifikt overfladeareal; 12 m /g) silaniseret med 28,8 ymol γ-glycerylpropylsiloxygrupper pr« g og overtrukket med en copolymer af N-methylolacrylamid (150 Timol) og N-hydroxysuccinimidylacrylsyreester (91 pmol/g). Perlerne (10 g) blev derpå behandlet med en opløsning af 1790 jimol γ-glutamylcysteinylglycin (glutathio). i 30 ml bicarbonate puffer 0,1 M, pH-værdi 8,5 i 22 timer.

Perlerne blev vasket successivt med 200 ml 0,1 M NaHCO^-puffer (pH-værdi 8,0), 100 ml 0,1 M NaHCO^-puffer (pH-værdi 9,5) indholdende 1 M NaCl og 0,001 M EDTA, 100 ml 0,1 M NaHCO^-puffer (pH-værdi 4,3) indeholdende 1 M NaCl og 0,001 M EDTA og endelig med 100 ml 0,001 M EDTA.

Sulfhydrylgrupperne bley aktiveret med 2,21-dipyridyldi= sulfid i Tris-HCl-puffer, 0,1 M, pH-vaerdi 8, indeholdende 0,3 M NaCl og 0,001 M EDTA.

Det resulterende materiale indeholdt 10 jimol aktiverede sulfidgrupper pr. g (bestemt spektofotometrisk ved 343 nm efter reaktion med β^-mercaptoethanol I.

Det således fremstillede materiale var velegnet til isolering af proteiner indeholdende thiolgrupper, f.eks. enzymer, såsom urease.

Hed dette materiale kan også enzymer, såsom urease, immo-biliseres uden aktivitetstab. Søjlen forsynet med urease kan fordelagtigt anvendes til bestemmelse af ureumindhold af vandige opløsninger, f.eks« urin, ved perkolering af ureumopløsningen gennem søjlen og bestemmelse af NH^ i eluatet med en NH^-elektrode,

Claims (6)

1. Støttemateriale, der er anvendeligt som sådant i kromatografi eller som udgangsmateriale, der efter binding hertil af forbindelser, der indeholder ioniske grupper, ligander eller bio-makromolekyler, kan anvendes som ionbytter, som et medium 1 affinitetskromatografi eller i enzymatiske reaktioner, hvilket støttemateriale består af porøse, uorganiske, silani-serede partikler, hvorpå der covalent er bundet en organisk, stationær fase opbygget af (co)polymeriserede vinylmonomerer og indeholdende amidgrupper, kendetegnet ved, at (A) det uorganiske materiale er hlevet silaniseret med en organosilan med formlen I

(I) hvori n er 1-5, fortrinsvis 3; er halogen eller alkoxy (1-10 C); 1*2 °9 R3 hver er halogen, alkoxy (1-10 C) , alkyl (1-3 C) eller aryl (6-10 C), idet halogenet og alkoxygrup-pen i R^, R2 og R^ er i stand til at danne en -O-Si-binding mellem silanet og det uorganiske materiale via dets overil adehydroxylgrupper; og R4 er amino, substitueret amino, såsom ω-aminoalkyl (1-3 C) amino, mercapto, en estergruppe eller glycidoxy og fortrinsvis er glycidoxy; og (B) den organiske,stationære fase er en tværbundet (co).poly= mer, der er opnået ved additionspolymerisation og opbygget af 0,1-140 ymol, fortrinsvis 5-25 ymol vinylmonomerer pr. 2 m uorganisk overflade af støttematerialet, idet nævnte 2 (co).polymer indeholder mindst 0,1 ymol amidgrupper pr. m uorganisk overflade af støttematerialet, idet nævnte vinyl= monomerer består helt eller delvis af bifunktionelle vinyl= monomerer indeholdende amidgrupper og med formlen 'II

(II) hvori r5 og Rø hver er hydrogen, en alkyl- eller cykloalkyl-gruppe med. indtil 6 carbonatomer eller en arylgruppe med indtil 10 carbonatomer; Ry er hydrogen eller en organisk gruppe med indtil 20 carbonatomer; og m er et helt tal fra 1-10, hvor amidgrupperne er blevet opnået delvis ved at omsætte (a) et afstandsmolekyle, en ligand, et bio-makromolekyle eller en forbindelse, der indeholder en ionisk gruppe, idet hver har en reaktiv gruppe og en eller flere amidgrupper, med en reaktiv gruppe af en vinylmonomer eller den tværbundne (co)polymer, eller (b) et afstandsmolekyle, en ligand, et bio-makromolekyle eller en forbindelse, der indeholder en ionisk gruppe, hver med en eller flere amino- og/eller carboxyl grupper, med en eller flere carboxyl- og/eller aminogrupper i den tværbundne (co)polymer.

2. Støttemateriale ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R5 er hydrogen; Rg er hydrogen eller methyl; R7 er hydrogen; og m er lig 1.

3. Støttemateriale ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at vinylmonomererne består af mindst 5 mol% bifunktionelle vinylmonomerer med formlen II.

4. Støttemateriale ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at (co)polymeren indeholder 5-25 pmol amidgrupper pr. m^ uorganisk overflade af støttematerialet.

5. Støttemateriale ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at comonomeren til opnåelse af den tværbundne copolymer er valgt blandt en eller flere vinylmonomerer med en funktionel gruppe og med formlen III

(Ill) hvori Rfi er H eller CH3; Rg er -CH2NH2,

-CH2OR^q eller

og fortrinsvis er

; X er halogen, fortrinsvis Br; R^g er alkyl med indtil 10 carbonatomer, fortrinsvis methyl, eller glycidoxy; R^ betegner en funktionel gruppe, der kan være bundet eller ikke bundet til carbonylgruppen via en afstandsgruppe og betegner en hydroxylgruppe eller en af følgende grupper

vori R12 kan have samme betydning som Ru; og p betegner et elt tal fra 1-10, og molekylvægten af vinylcomonomeren med en funktionel gruppe og eventuelt også en afstandsgruppe ikke er over 1000 og fortrinsvis er i intervallet fra 70 til 400.

6. Fremgangsmåde til fremstilling af støttematerialet ifølge ethvert af kravene 1-5, kendetegnet ved, at (A) det uorganiske materiale silaniseres ifølge i teknikken kendte fremgangsmåder med en organosilan med formlen I som angivet i krav 1, (B) det silaniserede, uorganiske materiale bringes i kontakt med en opløsning af vinylmonomererne i et flygtigt, organisk opløsningsmiddel eller organiske opløsningsmidler og/eller vand, idet det flygtige opløsningsmiddel derpå fjernes under omrøring under reduceret tryk ved en temperatur under 40°C i et afdampningsapparat for at dække det uorganiske materiale med en tynd film af monomerblanding, hvorpå polymerisation af filmovertrækket og samtidigt en covalent binding af den resulterende {co)polymer til det silaniserede materiale frembringes ved opvarmning i en oxygenfri atmosfære, og (C) om nødvendigt kobles det opnåede materiale yderligere med forbindelser med reaktive grupper ifølge i teknikken kendte fremgangsmåder.