DK153570B - Fremgangsmaade til frembringelse af glucoseisomerase - Google Patents

Description

i

DK 153570B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af glucose-isomerase ved dyrkning af en stamme af slægten Streptomyces ved en temperatur på 24-36°C i et næringsmedium med en begyndelses-pH-værdi mellem 6,5 og 9,0 og indeholdende xylose.

Det er kendt, at D-glucose ved hjælp af enzymet glucoseisomerase omdannes til D-fructose, som anvendes i stigende grad inden for fødevareindustrien og ved fremstilling af diætfødevarer i et antal udviklede lande. Glucoseisomerase giver i kombination med et kompleks jq af amylolytiske enzymer (a-amylase og glucoamylase) mulighed for at opnå glucose-fructose-sirupper og fructose direkte fra stivelse under anvendelse af enzymer.

Nogle metoder til frembringelse af glucoseisomerase har været kendt siden 1957, da R.O.Marshall og E.R.Kooi (28) for første gang 15 påviste, at det var muligt at omdanne D-glucose direkte til D-fructose ved hjælp af celler, der tilhører bakteriestammen Pseudomonas hydrophila N.491 og 492. Til frembringelse af glucoseisomerase anvendes for det meste mikroorganismer af

Streptomyces-slægten og frem for alt arterne Streptomyces 2Q phaeochromogenes (32,36), S. Venezuela (1,23), S. griseus (22), S.

wedmorensis (2), S. albus (33), S. flavovirens, S. acromogenes, S. echinatus (34), S. olivocinereus (19,23,25), S. acromogenes, S.

olivaceus (16,17), samt andre. Foruden Streptomyces-slægten findes der andre aktive producenter af ordenen Actinomycetales, som tilhører 25 slægterne: Nocardia, Micromonospora (20,21), Actinoplanes (29,30),

Thermoactinomyces, Thermopolyspora (35) samt også nogle andre bakteriestammer, der tilhører slægterne: Aerobacter (19), Acetobacter (27), Lactobacillus (24), Bacillus (31), Arthrobacter (26), Flavobacterium (3), samt andre.

Ved de allerede kendte metoder til tilvejebringelse af glucoseisomerase kombinerer producentstammen sjældent høj glucoseisomerase-aktivitet med et gunstigt temperatur- og pH-optimum for enzymet. En lavere isomeri seringstemperatur end 60-65°C medfører fare for mikrobiel forurening af den reaktor, hvori isomeriseringen udføres.

3,- En forøgelse af temperaturen til 90°C nedsætter enzymets stabilitet, forårsager farvning af siruppen samt nogen ændring af viskositeten.

Hvad angår industriel anvendelse er det mest gunstige pH-område fra 6,5 til 7,0, fordi dersved en pH-værdi på over 7,0 sker en alkalisk isomerisering af glucose under dannelse af D-psicose og farvning af 2

DK 153570B

siruppen, og en lavere pH-værdi (under 5,5) bevirker en irreversibel denaturering af enzymet.

Det har nu vist sig, at en hidtil ukendt mikroorganismestamme ^ Streptomyces sp. N. 1339 producerer glucoseisomerase i højt udbytte, samtidig med at den fundne glucoseisomerase har et højt temperaturoptimum og et gunstigt pH-optimum.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved at der som mikroorganisme anvendes stammen Strep-tomyces sp. N. 1339 deponeret ved den bulgarske stats Institut for Lægemiddel kontrol (Institute for Drugs Control), under nummeret 144.

Streptomyces-stamme sp. N.1339 er blevet isoleret fra bulgarsk jord. 874 Streptomyces-stammer er blevet undersøgt for produktion af glucoseisomerase. Undersøgelsen er blevet udført på det modificerede jg syntetiske kulturmedium N.l efter Krasilnikov, idet selektionen er blevet gennemført på to substratniveauer under anvendelse af xylose og xylan. Under disse betingelser er der fundet 18 Streptomyces-stammer, som kan udvikle og producere enzymet glucoseisomerase. Af disse Streptomyces-stammer viser sp. N.1339 sig at have de største perspektiver med hensyn til industriel anvendelse. Stammen har været i kollektionen ved The State Institute for Drugs Control, bul. Vladimir Zaimov N.26 siden 29. sept. 1979 under nummeret 144 og har følgende morfologiske og biokemiske egenskaber. På kulturmedium 1 med nitrogenmi neral kil de (ifølge G.F.Gause et al.) har kolonierne 25 sædvanligvis en oval form, med uformede rande, flade med konvekse kuppellignende centre og er let foldede i nogle tilfælde radialt segmenterede. Sporangierne er spiralformede med ikke over 1-3 vindinger. På nogle kulturmedier dannes coremier. Væksten er god. Sporerne har en længde på 0,4-0,9 micron og en bredde på 0,3-0,6 30 micron. Enderne har vel afgrænsede hjørner. I nogle tilfælde har sporerne en svagt konkav midte. De dannes ved fragmentering.

Farven af luft- og substratmyceliet bestemmes ifølge A.S.Bondartsev's farveskala og Tresner-Backus-skalaen.

Med forskelligt kulturmedium skifter farven af luftmyceliet fra 4 2 3g let grå til mørk grå (a -a ) afhængigt af carbon- og nitrogenkilderne. På kulturmedium 1 med en uorganisk nitrogenkilde (ifølge G.F.Gause et al.) er farven musegrå (aj til mørkegrå (a ), og på kulturmedium 2 med en organisk nitrogenkilde (ifølge G.F.Gause) er farven mørkegrå (a ). På kulturmedier med forskellige carbon- og 3

DK 153570B

nitrogenkil der er luftmyceliet gråt til mørkegråt.

På kulturmedium 1 med en mineralsk nitrogenkilde (ifølge G.F. Gause et al.) har substratmyceliet en lys citrongul farve til ^ gul-orange (d -d ). På kulturmedium 2 med en organisk nitrogenkilde (ifølge G.F.Gause et al.) er substratmyceliet gyldent-gult og bliver efter en forlænget dyrkningsperiode næsten kastaniebrunt (n/-o^).

På kulturmedier med forskellige carbon- og nitrogenkilder er substratmyceliet fra gult til gulgråt-grønt.

1Q På kulturmedium kød-pepton-agar. Lav vækst. Luftmycelium hvidt, meget sparsomt. Substratmycelium: farveløst.

På kulturmedium kartoffel-glucose-agar. Vækst meget god. Luftmycelium gråt til mørkegråt. Substratmycelium lysebrunt til mørkebrunt, på randen af kolonien: gult. Pigment i centrum gult.

På kulturmedium Tchapek med sucrose. Middel vækst. Luftmycelium lysegråt. Substratmycelium beige.

På kulturmedium Tchapek med glucose. Middel vækst. Luftmycelium gråligt. Substratmycelium cremefarvet.

På kulturmedium med sucrose. God vækst. Luftmycelium gråt.

2Q Substratmycelium gult.

På kulturmedium amylum-agar. Middel vækst. Luftmycelium lysegråt, med bleg askegrå farve. Substratmycelium gult, citrongult.

På amylium-ammoniak kulturmedium ifølge Mishustin. God vækst. Luftmycelium gråt til mørkegråt. Substratmycelium gult, lysegult.

25 På syntetisk medium ifølge Krassilnikov. Vækst lav til middel.

Luftmycelium beige-gråt. Substratmycelium gult.

På CPI ifølge N.A.Krassilnikov. God vækst. Luftmycelium mælke-gråt, blågråt. Substratmycelium gul-gråligt-grønt.

På CPU ifølge N.A.Krassilnikov. God vækst. Luftmycelium gråt, 30 hvidt ekssudat udskilles. Substratmycelium creme-gråt.

På CPIII ifølge Krassilnikov. God vækst. Luftmycelium gråt. Substratmycelium gult, citronfarvet.

På CPIV ifølge N.A.Krassilnikov. Middel vækst. Luftmycelium lysegråt, gråligt. Substratmycelium cremefarvet.

35 På CPV ifølge N.A.Krassilnikov. Lav vækst. Luftmycelium hvidt.

Substratmycelium beige, mørk cremefarvet.

På syntetisk medium ifølge Vaxman. Middel vækst. Luftmycelium hvidt, på separate dele gråt. Substratmycelium gult til orange.

På kød-amylum-agar. Middel vækst. Luftmycelium gråt.

4

DK 153570B

Substratmycelium gult.

På pepton-agar. God vækst. Luftmycelium gråt til mørkegråt. Substratmycelium farveløst med en skygge af luftmycelium.

^ På glucose-asparagin-agar. Middel vækst. Luftmycelium lysegråt.

Substratmyceli um gult-cremefarvet.

På glycerin-asparagin-agar. God vækst. Luftmycelium lysegråt, idet det bliver gråt ved ældning. Substratmycelium mørkegult.

På tyrosin-agar. Middel vækst. Luftmycelium gråt, i nogle 1Q kolonier gråliggult. Substratmycelium mørkegult til orange.

På tyrosin-casein-nitrat agar. Middel vækst. Luftmycelium askegråt. Substratmycelium gult.

På glucose-tyrosin-agar. God vækst. Luftmycelium creme-gråt til gråt. Substratmycelium gul brunt.

1C På saccharose-nitrat-agar. Middel vækst. Luftmycelium gråt. Sub- io stratmycelium creme-gult.

På glycerol-calcium-malat-agar. God vækst. Luftmycelium lysegråt til gråt. Substratmycelium gulorange.

På pepton-oksekød-agar. God vækst. Luftmycelium gråt. Substrat-20 mycelium farveløst til beige.

På havre-agar. Vækst meget god. Luftmycelium gråt. Substratmycelium lysegult.

På tomat-agar. God vækst. Luftmycelium mørkegråt. Substratmycelium terracottafarvet.

25 På blyacetat-agar. Lav vækst. Luftmycelium gråligt. Substratmy celium gul-brunt.

På jern-pepton-agar. Middel vækst. Luftmycelium lysegråt. Substratmycelium farveløst med en grå skygge af luftmycelium.

På gær-malt-agar. God vækst. Luftmycelium gråt. Substratmycelium 30 orange.

Over for NaCl i mediet er stammens tolerance lav. Maximumkoncen-trationen er 4%. Ved denne koncentration er væksten af stammen lav. Luftmycelium er hvidt. Substratmycelium gult. En koncentration på over 1% har en negativ indflydelse på sporuleringsgraden.

2g Stammen peptoniserer fedtfattig mælk. I begyndelsen af pep- toniseringen er reaktionen sur, men efter nogen tid bliver den al kali sk.

Den smelter gelatine. Den vokser meget godt på et sucrosemedium, men inverterer ikke sucrose. Den vokser meget godt på en amylaseagar, 5

DK 153570 B

og den hydrolyserer stivelse godt.

Den dekomponerer ikke cellulose og reducerer ikke nitrater til nitriter. Den frigør hydrogensulfid. Den vokser på kartofler.

5 Hæmolyse positiv. Tyrosinase negativ.

Det er blevet konstateret, at på Pridham og Gottlieb's basale kulturmedium er væksten god i nærværelse af følgende carbonkilder: glucose, fructose, lævulose, xylose, maltose, cellobiose, galactose, mannitol, arabinose, dextrose, ribose og glycerol.

IQ Stammen absorberer salicin i mindre målestok.

Den absorberer ikke carbonkilderne lactose, sorbit, inosit, sucrose og raffinose.

Der forekommer nogle forskelle i pigmenteringen af luft- og substratmyceliet afhængigt af carbonkilden.

15 Det er blevet konstateret, at på Pridham og Gottlieb's modificerede basale kulturmedium er stammens vækst god i nærværelse af følgende nitrogenkilder: NH^Cl, (NH4)2S04, (NH4)2HP04, NH4H2P04, NH4N0g, Na2HP04 og carbamid.

Væksten er moderat på et vækstmedium med NaNQg. Stammen vokser 2q ikke på et vækstmedium med NaN02.

Meget god vækst af stammen er iagttaget på vækstmedier med følgende aminosyrer: asparaginsyre, asparagin, prolin, cystin, tyrosin. Væksten er moderat på et vækstmedium med val in, hydroxyprolin, phenyl alanin, leucin og alanin. Stammen vokser ikke på 25 et vækstmedium med giutaminsyre.

Afhængigt af nitrogenkilden observeres nogle forskelle i pigmenteringen af luft- og substratmyceliet.

Ifølge nogle egenskaber ligner Streptomyces-stammen N. 1339 Streptomyces griseoflavus, der tilhører Gray-serierne ifølge Bergey's 2Q (1974), og Actinomyces griseoflavus af Flavus-gruppen ifølge N.A.Krassilnikov (1970). Sidstnævnte skelnes fra førstnævnte ved hjælp af et antal morfologiske, dyrkningsmæssige og fysiologisk, biokemiske egenskaber, der er beskrevet i art-karakteriseringen af Bergey's (1974) og N.A.Krassilnikov (1970). Streptomyces griseoflavus 25 har f.eks. aflange stavlignende og ovale sporer med glat overflade; den viser tolerance over for NaCl fra 7 til 10%. Den hydrolyserer stivelse svagt. Den absorberer sucrose og sorbit og absorberer ikke galactose. Derfor er Streptomyces-stammen N.1339 ikke identisk med den lignende Streptomyces griseoflavus (Actinomyces griseoflavus).

6

DK 153570B

Det er derfor, den betegnes Streptomyces sp. N.1339. Den tilhører Gray-serierne ifølge Bergey's (1974) og Flavus-gruppen ifølge N.A.Krassilnikov (1970).

g Producentstammen kan dyrkes i 500 ml Erlenmeyer-kolber inde holdende 50 ml fermenteringsmedium i fra 36 til 96 timer ved en temperatur på fra 24 til 36°C, en begynde!ses-pH-værdi på fra 6,5 til 9.0, på et rysteapparat med fra 180 til 320 omdr./min.

Isomerisering af glucose til fructose ved hjælp af 10 glucoseisomerase fra stammen Streptomyces sp. N.1339 kan udføres ved en direkte behandling med frisk mycelium (adskilt ved centrifugering ved 12.000 omdr./min. og vasket tre gange med 0,05M phosphatpuffer med pH 7,0) eller med tørret mycelium (lufttørrede eller acetonetørrede celler), med enzymopløsning (opnået efter en ultralyd-disintegration eller autolyse af cellemateriale og separation af supernatant ved centrifugering ved 15.000 omdr./min.), med kulturcentrifugat indeholdende extracellulær isomerase eller med celler, der er gjort immobile på en hård bærer.

Den fructose, der dannes i reaktionsblandingen, måles ifølge 2Q cystein-carbazol-metoden (18), og stammens aktivitet udtrykkes i mg fructose pr. ml kulturvæske eller i internationale glucoseisomerase-enheder (GIU). Én GIU er lig med den mængde enzym, der ved 70°C og pH

7.0, 1M glucose-opløsning i 0,05M phosphatbuffer, 1x10"4M CoCl2* 6H20 og 1x10_2H MgS04«7H20 på 1 minut omdanner 1 piol glucose til 1 /tmol 2 g fructose.

Fordelene ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er følgende:

Til frembringelse af glucoseisomerase anvendes stammen Streptomyces sp. N.1339, der er i stand til at syntetisere en stor mængde af 3ø enzymet (12.000-20.000 GIU), hvilket er fra 4 til 20 gange mere end aktiviteten af de fra litteraturen kendte producentstammer (4-15).

Det enzym, der opnås, er kendetegnet ved et højt temperaturoptimum (70°C) ved lave optimale Co++-koncentrationer (lxl0”Sl) og 4-4- -7

Mg -koncentrationer (1x10 M) i isomeriseringsblandingen. Det har et 35 gunstigt pH-optimum (7,0) og betragtelig termostabilitet mellem 40 og 65°C.

Opfindelsen illustreres ved følgende eksempel:

EKSEMPEL

7

DK 153570B

Streptomyces N.1339 holdes i reagensglas med skråagar på vækstmedier med følgende sammensætning: 5 1. Xvlose-vækstmedium xylose 20 g agar 20 g KN03 1,0 g K2HP04 0,5 g 10 MgS04-7H20 0,5 g

NaCl 0,5 g

CaC03 1,0 g

FeS04 0,001 g vand til 1 liter.

15 2. Kartoffel-qlucoseaqar kartoffelekstrakt fra 300 g kogte kartofler glucose 10 g agar 20 g 2Q vand til 2 liter.

Det anbefales, at der til opretholdelse af stammen skiftevis anvendes begge vækstmedier.

Til et velspiret materiale fra en 10-15 dage gammel kultur på vækstmedium 1 eller 2 (1 anbefales) tilsættes 6 ml inokuleringsvækst-medium, der har følgende sammensætning: xylose 1,0% tryptone 2,0% 3Q MgS04’7H20 0,1% K2HP04 0,25%

Vand op til 100%

Cellemassen udvaskes, og reagensglasset anbringes på et ryste- „ apparat i 24 timer ved 30°C og 240 omdr./min. Fra den således adap-3b terede kultur podes inokuleringsmedium med følgende sammensætning: xylose 1,0% majsekstrakt 3,0% (tørvægt) 8

DK 153570B

MgSQ4'7H2Q 0,1% K2HPG4 0,25% agar 0,1%

Vand op til 100%

Efter 60 timers dyrkning under de ovennævnte betingelser overføres 5% af inokulum til et fermenteringsvækstmedium med følgende sammensætning: 10 xylose 1% af fermenteringsmediets vægt majsekstrakt 3,0% (tørvægt) af fermenteringsmediets vægt

MgS04'7H20 0,1% af fermentering s mediets vægt KC1 0,0075% af fermenteringsmediets vægt j,. CoC12®6H20 0,024% af fermenteringsmediets vægt

Vand op til 100%

Dyrkningen udføres i 500 ml Erlenmeyer-kolber indeholdende 50 ml fermenteringsmedium. Dyrkningen udføres i 60 timer ved 30°C på et 2Q rysteapparat ved 240 omdr./min. Begyndelses-pH-værdien er 8,5.

Efter 60 timers dyrkning af Streptomyces sp. N.1339 opnås fra 140 til 220 g fugtig biomasse pr. 1 liter dyrkningsvæske.

Isomeriseringen af glucose til fructose ved hjælp af glucoseisomerase fra stammen Streptomyces sp. N.1339 udføres ved en temperatur på oc 70°C, en pH-værdi på 7,0 i nærværelse af C o Cl« * 5 H«0 i en CO Λ L L o koncentration på 1x10 M, MgS04*7H20 i en koncentration på 1x10 M og en substratkoncentration på 1M.

Aktiviteten af stammen Streptomyces sp. N.1339 er 130-215 mg fructose pr. 1 ml dyrkningsvæske eller 12.000-20.000 GIU pr. 1 liter 30 kulturvæske.

REFERENCER

1. Gratcheva, I.M., Mositchev, M.S., Gavristov, A.B., Filippov, S.A., 1977. Aut.cert.SSSR, No.542763. Bull.'Otkritie, izobre- 33 tenia" N.2.

2. Patent No. 1.361.846, England.

3. Patent No. 3.956.066, USA

4. Patent No. 3.616.221, USA

5. Patent No. 3.834.988, USA

9

DK 153570B

6. Patent No. 1.451.273, England 7. Patent No. 1.376.787, England 8. Patent No. 1.284.218, England

5 9. Patent No. 534.490, SSSR

10. Patent No. 534.491, SSSR

11. Patent No. 542.763, SSSR

12. Patent No. 2.219.713, BRD

13. Patent No. 2.247.922, BRD 1Q 14. Patent No. 2.018.518, BRD

15. Patent No. 1.934.461, BRD

16. Patent No. 2.223.340, BRD

17. Patent No. 2.131.984, Frankrig 18. Dische, Z., Borenfreund, E., 1951, J.Biol.Chem., 192, 583.

. 15 19. Heady, R.E., Jacaway, W.A., Patent No.2225864, BRD

20. Horwath, R.O., Cole, G.W., 1973. Patent No.2156622, Frankrig

21. Horwath, R.O., Cole, G.W., 1973. Patent No.2247922, BRD

22. Hsu, T.Y., Shon, S.C., 1964. Sheng Wu Hua Usuen Yu Sheng Wu Li Hsuen Pao, 4, 342.

20 23. Iizuka, H., Ayukawa, Y., Suekane, M., Kanno, M., 1971. Patent

No.3622463, USA

24. Kent, C.A., Emery, A.N., 1973, J.Appl.Chem. and Biotechnol., 23, 689.

25. Kooi, E.R., Smyth, R.J., 1972, Food Technol., 26, 9, 57.

25 26. Lee, C.K., Lawrence, E.N., Long, M.E., 1972. Patent No.

3645848, USA

27. Liyd, N.E., Lewis, L.T., Logan, R.M., Patel, D.N., 1972. Patent No.3694314, USA

28. Marschall, R.O., Kooi, E.R., 1957. Science, 125, No.3249,648 3q 29. Scallet, B.L., Shieh, K., Ehrenthan, I., 1974, Stårke, 26, 12, 405 30. Shieh, K.K., Lee, H.A., Donnelly, B.J., 1974. Patent No.

3834988, USA

31. Skot, G., Outtrup, H. In "5th Int.Ferment.Symp., 4th Int.Spec. Syrn.Yeast, Berlin, 1976, Abstr.Pap." - Berlin, 1976, 256.

35 32. Strandberg, J.W., Smily, K.L., 1971. Appi.Microbiol., 21, 4, 588.

33. Takasaki, Y. Patent No.49981, Japan

34. Takasaki, Y., 1971. Patent No. 3616221, USA

35. Takasaki, Y., 1975. Patent No.50-17560, Japan 36. Tsumura, M., Sato, T. 1965, Agr.B1o1.Chem., 29, 1129.

Claims (2)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af glucoseisomerase ved 5 dyrkning af en stamme af slægten Streptomyces ved en temperatur på 24-36°C i et næringsmedium med en begyndelses-pH-værdi mellem 6,5 og 9,0 og indeholdende xylose, kendetegnet ved, at der som mikroorganisme anvendes stammen Streptomyces sp. N. 1339 deponeret ved den bulgarske stats Institut for Lægemiddel kontrol (Institute for 10 Drugs Control), under nummeret 144,

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det anvendte vækstmedium har følgende sammensætning: xylose 1,0-2,0% af vækstmediets vægt 15 majsekstrakt 1,5-4,0% (tørvægt) af vækstmediets vægt MgSO^-Tl^O 0,05-0,2% af vækstmediets vægt KC1 0,005-0,01% af vækstmediets vægt CoClg'^HgO 0,008-0,036% af vækstmediets vægt Vand op til 100% 20 25 30 35