DK153588B - Fremgangsmaade og apparat til identifikation og optaelling af celler hoerende til bestemte blodcelleunderklasser - Google Patents

Description

DK 153588B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til identifikation og optælling af blodceller hørende tilbestemte underklasser og som nærmere angivet i den indledende del af patentkrav 1.

Lymfocytbestanden i blod er opdelt i et antal underklasser, der 05 spiller særskilte roller i immunreaktionen. Eksempelvis er der sandsynlighed for, at det relative antal af lymfocytter i forskellige underklasser ændrer sig i sygelige tilstande. Følgelig giver en optælling og identifikation af celler i de forskellige underklasser en indikation, ikke blot af selve blodets sammensætning, men sædvanligvis også en 10 indikation med hensyn til organismens relative velbefindende.

Det er kendt, at i det mindste flere bestemte underklasser af funktionsmæssigt forskellige lymfocytter kan identificeres på basis af antigeniske determinanter på celleoverfladen. Specielt har T-lymfo-cytter været af betragtelig akademisk og klinisk interesse. Blandt 15 andre er T-lymfocytter karakteristiske ved specielle identificerbare antigeniske determinanter på deres overflade, som adskiller cellerne i· denne underklasse fra. andre blodcellen og fra· cellerne i. andre lymfocyt-underklasser. Det er følgelig af stor interesse at identificere og fremstille reagenser, som indeholder antistoffer, der er selektivt 20 reaktive med de af interesse værende lymfocyt-underklasser.

Dét skal bemærkes, at der er to hovedklasser af lymfocytter, som indgår i menneskers og dyrs immunsystem. Den første af disse hovedklasser (den thymus-afledte celle eller T-celle) differentieres fra hæmopoitiske stavceller i thymus kirtelen. Mens de befinder sig i 25 thymus, benævnes de under differentiering værende celler som “thymo-cytter". De fuldt udviklede T-celler forlader thymus og cirkulerer mellem vævene, lymfekarrene og blodstrømmen. Disse T-celler danner en stor andel af mængden af recirkulerende små lymfocytter. De har immunologisk specificitet og er direkte involveret som effektorceller 30 Γ de· celleformidlede immunreaktioner (såsom· transplantationsafstødninger). Selvom T-celler ikke sekrerer humorale antistoffer, er de undertiden nødvendige for sekretionen af disse antistoffer i den anden lymfocytklasse, der omtales senere. Visse typer af T-celler udfører en regulerende funktion i andre aspekter af immunsystemet. Mekanismen i 35 denne celle-samarbejdsproces forstås endnu ikke fuldstændigt.

Den anden klasse af lymfocytter (de benmarv-afledte celler eller B-celler) er de celler, som sekrerer antistof. De udvikles også ud

DK 153588B

2 fra hæmopoitiske stavceller, men deres differentiering er ikke bestemt af thymuskirtelen. I fugle differentierer cellerne i et organ, som er analogt med thymus, og som kaldes Bursa Fabricii. I pattedyr er der imidlertid ikke opdaget et ækvivalent organ, og det antages, at 05 disse B-celler differentierer i benmarven.

Det er nu konstateret, at T-celler er opdelt i i det mindste flere undertyper, der benævnes som "medhjælper"-, "undertrykker"- og ,,dræber"-T-celler, og som har til funktion at fremme en reaktion, undertrykke en reaktion eller dræbe (nedbryde) fremmede celler, 10 respektive. Disse underklasser er godt udforsket i systemer med dyr af musefamilien, men de er først fornylig blevet beskrevet for menneskesystemer. Jfr. eksempelvis R.L. Evans, et al., Journal of Experimental Medicine, Vol. 145, 221-232, 1977 og L. Chess og S.F. Schlossman - "Functional Analysis of Distinct Human T Cell Subsets 15 Bearing Unique Differentiation Antigens", i "Contemporary Topics in Immunobiology”, O. Stutman, udgiver Plenum Press, 1977, Vol. 7, 363-379.

Muligheden for at identificere eller undertrykke klasser eller underklasser af T-celler er vigtig for diagnosticering eller behand-20 ling af forskellige forstyrrelser eller tilstande i immunoreguleringen.

Eksempelvis har visse leukæmi- og lymfoma-tilfælde afvigende prognose i afhængighed af, om de er af B-celle- eller T-celleoprind-else. Evaluering af disse sygdomsprognoser afhænger således af en skelnen mellem disse to lymfocytklasser. Jfr. eksempelvis A.C. Aisen-25 berg og J.C. Long, The American Journal of Medicine, 58:300 (marts 1975); D. Belpomme, et al. i "Immunological Diagnosis of Leukemias and Lymphomas", S. Thierfelder, et al., udgiver Springer, Heidelberg, 1977, 33-45, og 'D. Belpomme, et al., British Journal of Haematology, 1978, 38, 85. Visse sygdomsstadier (f.eks. rheumatoid arthritis og 30 visse leukæmityper) har forbindelse med en ubalance i T-celle-under- klasser. Det er foreslået, at autoimmune sygdomme almindeligvis er sammenknyttet med et overskud af "hjælper"-T-celler eller et underskud af visse "undertrykker"-T-celler, mens ondartede tilfælde almindeligvis er forbundet med et overskud af "undertrykker"-T-celler. I visse 35 leukæmitilfælde produceres et overskud af T-celler i et standset udviklingsstadium. En diagnose kan således afhænge af muligheden for at konstatere denne ubalance eller dette overskud. Jfr. eksempelvis J.

3

DK 153588B

Kersey, et al., "Surface Markers Define Human Lymphoid Malignancies with Differing Prognoses" i Haematology and Blood Transfusion, Vol.

20, Springer-Verlag, 1977, 17-24, og deri indeholdte henvisninger.

Fornylig har der været anvendt monoklonal antistofteknik til at 05 fremstille store mængder af stærkt renset antistof til forskellige lymfocyt-underklasser. Ved brug af sådanne antistoffer har det vist sig at være muligt at analysere et individs lymfocytter for at bestemme de relative celleantal i forskellige underklasser. Ved brug af direkte eller indirekte metoder kan antistofferne desuden mærkes med fluor-10 escens, hvorved de under betragtning værende materialeprøver gøres egnede til at gennemgå cytometrisk analyse.

Konventionel immunofluorescensteknik indeholder for tiden en fysisk isolation af lymfocytterne fra andre leukocytter som et indledende trin. Dette trin eliminerer muligheden for, at monocytter 15 eller granulocytter, som ikke er specifikt mærkede, kan blive medtalt som specifikt mærkede lymfocytter. Dette indledende lymfocyt-isolationstrin er imidlertid langvarigt og besværligt og er faktisk meget mere langvarigt end den forholdsvis simple mærkning eller analysering af lymfocytterne. På det kliniske område, hvor der sættes stor pris på hurtige 20 og reproducerbare analyser, er nødvendigheden af at isolere lymfocytterne fra andre leukocytter tydeligvis en så at sige uovervindelig hindring. Endvidere indfører det indledende lymfocytisolationstrin, også i de undersøgelser, hvor tiden er af mindre betydning, risiko for, at lymfocytter går tabt under fjernelsen af monocytter og granulocytter, 25 og dette indfører usikkerhed og unøjagtighed i den efterfølgende analyse. På tilsvarende måde vil der blive indført en betragtelig fejlrisiko, hvis andre blodceller ikke elimineres fuldstændigt fra lymfocytterne, som skal isoleres, og sådanne andre cellers tilstedeværelse kan meget vel bevirke fejl i den efterfølgende analyse.

30 Det er følgelig et formål for den foreliggende opfindelse at tilveje bringe en fremgangsmåde til identificering og optælling af lymfocytter hørende til bestemte underklasser uden behov for en forudgående separation af lymfocytterne fra andre blodceller, som kan anvendes til andre blodcelletyper, som har lignende antigeniske karakteristika, 35 som er betragteligt hurtigere end den nuværende teknik, og som i det væsentlige undgår fejlagtig analyse som følge af fremmeddata fra andre celler eller tab af data på grund af tab af lymfocytter fra prøven.

4

DK 1S3588B

Dette opnås med de i den kendetegnende del af krav 1 angivne ejendommeligheder for fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Opfindelsen angår endvidere et apparat til udøvelse af den angivne fremgangsmåde og som nærmere angivet i patentkrav 9.

05 Opfindelsen involverer en speciel modifikation af kendt strømnings- cytofluorometrisk apparatur med hensyn til optik samt signalbehandling, hvorefter der kan benyttes selektiv immunofluorescensmærk-ning (direkte eller indirekte) af den af interesse værende underklasse, og hele blodprøven (efter ønske enten det koagulerede overfladelag 10 eller antikoaguleret fuldblod) analyseres én celle ad gangen.

I en foretrukket udførelsesform er én af retvinkel-fluorescens-kanalerne i et strømningscytofluorometrisk apparat indrettet til at tjene som en bølgelængdespecifik føler for retvinkelspredning. En prøve af fuldblod eller koaguleret overfladelag inkuberes for at tilis lade bestemte antigener pi overfladen af lymfocytterne i underklassen af interesse at forene sig med et antistof, der har en forudbestemt fluorescensreaktion pi en given illuminering (eksempelvis fokuseret kohærent lys fra en argonion laser), hvorved celler i underklassen af interesse effektivt bliver fluorescens-responderende på sådant 20 indfaldende lys. Cellerne i prøven føres derefter igennem strømningskanalen i et strømningscytometer, der er i stand til at spore fremadlys-spredning såvel som retvinkellysspredning og fluorescens. Visse fremad-spredningstilstande bliver, når de konstateres, benyttet sammen med retvinkellysspredningstilstande til at kanalisere detekteret fluorescens.

25 Ved detektering af en bestemt fluorescens af en given farve (f.eks. grøn) fremstilles et udgangssignal for at angive tilstedeværelsen af en lymfocyt i den givne underklasse. Derefter kan disse data lagres og/eller fremvises (f.eks. på en eller anden histogramform). Endvidere kan der benyttes cellesorteringsteknik, således som det er kendt, 30 til fysisk isolation af lymfocytcellerne af den givne underklasse.

I det følgende skal opfindelsen beskrives nærmere under henvisning til tegningen, hvor

Fig. 1 viser en stiliseret version af et kommercielt tilgængeligt strømn ingscytof I uorometerapparat, 35 Fig. 2 et skematisk diagram over signalbehandlingsudstyr, hvor med apparatet af den i fig. 1 viste type kan benyttes til at identificere og optælle lymfocytter i bestemte underklasser i overensstemmelse med den foreliggende opfindelses principper, og 5

DK 153588B

Figurerne 3A til 3F respektive histogrammer, som belyser anvendelse af opfindelsens principper.

Der henvises først til fig. 1, som viser en stiliseret funktionsmæssig og konstruktionsmæssig repræsentation af et apparat, der 05 kan benyttes i overensstemmelse med den foreliggende opfindelses principper. Fig. 1 viser faktisk et specielt system, som er kommercielt tilgængeligt under varebetegnelsen CYTOFLUOROGRAPH®. Apparatet i fig. 1 er indrettet efter principperne i strømningscytometri til celleanalyse, og apparatet indeholder udstyr til afføling af cellers fluorescens-10 reaktion pi bestemte typer af belysning.

Et centralt element i apparatet i fig. 1 er en strømningskanal 106, hvori celler i flydende suspension føres igennem en affølingszone i enkeltkolonne og med høj hastighed (f.eks. 2500 celler pr. sekund).

Affølingszonen er bestemt af skæringen mellem cellestrømmen og en 15 indfaldende lysstråle, som typisk kan være fokuseret kohærent lys fra en gaslaser. Nar en celle passerer igennem affølingszonen, vekselvirker den med det indfaldende lys på flere forskellige måder. En vis lysmængde bliver naturligvis absorberet af cellen, mens en anden lysmængde spredes inden for forholdsvis små vinkler i forhold til 20 aksen for det indfaldende lys, og endnu en lysmængde spredes under vinkler, som afviger ganske meget fra aksen for det indfaldende lys, eksempelvis vinkelret på det indfaldende lys. Desuden kan der også optræde fluorescensemissioner i afhængighed af selve cellens natur og af en eventuel farvning eller mærkning, som cellen på forhånd 25 kan have været udsat for.

Fotofølere, som er anbragt med forskellige orienteringer i forhold til cellestrømmen og det indfaldende laserlys, muliggør detektering af et sæt af reaktioner, som er karakteristisk for hver given celletype. Fig. 1 indeholder således en argonionlaser 101 samt en 30 heliumneonlaser 102, hvor det kohærente lys, som udsendes af hver af disse, bliver afbøjet på forskellig måde igennem spejle 103 og 104 samt en linse 105 frem til affølingszonen i strømningskanalen 106. Celleprøvestrømmen føres på kendt måde i laminar tilstand inden i en strømmende fluidumkappe for at sikre, at kun én enkelt celle vil 35 blive belyst i affølingszonen på et givet tidspunkt. Følgelig kan cellens vekselvirkning med lyset afføles, når hver celle belyses af lyset fra linsen.

DK 153588B

6

Som vist i fig. 1 detekterer en ekstinktionsføler 108 den lysmængde, som blokeres af cellen, mens fremadlysspredningen detekte-res af fotofølere 109 og 110 tilnærmelsesvis i en kegle med en halvvinkel på 20°. De elektriske signaler, som frembringes af følerne 05 108, 109 og 110, er koblet til forstærkere 120 og 121, som afgiver elektriske signaler af passende amplitude og lignende til en efterfølgende analyse og/eller fremvisning.

I apparatet i fig. 1 bliver det lys, som udsendes fra cellen på grund af en fluorescensreaktion, affølt vinkelret på både cellestrømmens 10 retning og på aksen for det indfaldende lys. Et hulspejl 125 og en samlelinse 107 samler dette lys tilnærmelsesvis inden for en kegle med en halvvinkel på 20°, og dette lys føres igennem en åbning 111 og derefter til et dikroisk spejl 112 samt et andet spejl 113. Et første farvefilter 114 (f.eks. til at lade lys med forholdsvis stor bølgelængde 15 passere) fører valgt lys fra det dikroiske spejl 112 og til en fotoføler 117 (f.eks. et fotomultiplikatorrør). Et andet filter 115 lader lys af en anden farve (f.eks. lys med forholdsvis kort bølgelængde) passere fra det andet spejl 113 og til en anden fotoføler 116. De elektriske signaler fra følerne 116 og 117, der foreligger i form af impulser 20 svarende til lyset fra de respektive celler, er koblet til forstærkere 118 og 119 for derved at frembringe signaler, som er afpasset til behandling.

Som vist i udførelsesformen i fig. 1 frembringer en følervælger 122 udgangshistogrammer under brug af signaler fra forstærkerne 25 118 til 121. Som eksempel er en velegnet udlæsningsform en opteg ning af amplituden for rød fluorescens fra føleren 117 som funktion af amplituden for grøn fluorescens fra føleren 116. Et sådant histogram er vist i repræsentationen 123, hvor hvert punkt i histogrammet repræsenterer en individuel celle. Klynger eller ansamlinger af indika-30 torer i histogrammet repræsenterer grupper af celler af ens type.

Fagfolk vil øjensynligt finde det velegnet at frembringe histogrammer af smalvinklet fremadspredning som funktion af intensiteten for grøn fluorescens, af smalvinklet fremadspredning som funktion af aksial lysekstinktion, etc.

35 I overensstemmelse med kendte anvendelser af apparatet i fig.

1 er den såkaldte første fluorescens kanal 119 fra føleren 117, der primært er blevet anvendt til måling af fluorescens af lang bølgelængde, 7

DK 153588B

også velegnet under visse omstændigheder til detektering af bredvinkel-spredning. Dette er tilfældet i overensstemmelse med den foreliggende opfindelses principper, og for at fremhæve denne faktor foretrækkes det, at den konventionelle rødfilterblok 114 erstattes af filtre, som 05 er egnede til at dirigere det blå laserlys fra laseren 101, som spredes vinkelret på aksen for det indfaldende lys fra linsen 105, til føleren 117. Tilpasninger af konstruktionsparametre i fotomultiplikatoren 117 og i forstærkeren 119 kan på tilsvarende måde være nødvendige for at frembringe signaler, der er velegnede til efterfølgende behandling.

10 Fig. 2 angiver et blokdiagram over en foretrukket version af signalbehandlingsaspekter i overensstemmelse med den foreliggende opfindelses principper, men det viste udstyr vil muligvis forstås bedre efter en detaljeret betragtning af de følgende teoretiske og metodemæssige aspekter ved opfindelsen.

15 En korrekt tilberedning af en blodprøve i overensstemmelse med opfindelsens principper indbefatter i det væsentlige en inkubation af prøven med et antistof for den af interesse værende underklasse, og som er i besiddelse af den fornødne evne til at udsende fluorescenslys efter belysning med det indfaldende laserlys. I en første metode 20 bliver fuldblod fra menneskedonorer antikoaguleret (eksempelvis med EDTA), centrifugeret, og det koagulerede overfladelag bliver isoleret. Alternativt kan der benyttes anti koaguleret fuldblod. Der udføres inkubation med passende antistof, hvorefter røde celler nedbrydes i prøven på kendt måde. Under antagelse af at det oprindelige antistof 25 er tilstrækkeligt fluorescensaktivt, er prøven derefter parat til fortynding og strømningscytofluorometrisk analyse. I tilfælde af at der benyttes indirekte immunofluorescensmærkning, udføres der en anden inkubation med et andet antistof til det første antistof, som på sin side har de fornødne fluorescensegenskaber.

30 Mens prøven føres igennem strømningskanalen og belyses, bliver de optiske parametre med hensyn til ekstinktion, fremadlysspredning, retvinkelspredning samt fluorescens detekteret samtidig, men ud fra et signalbehandlingsmæssigt synspunkt bliver de forskellige parametres betydning betragtet på en relativ prioritetsbasis. Dette vil sige, at 35 både den smal vinklede fremadspredningsimpuls (som eventuelt, men ikke nødvendigvis også indeholder ekstinktionssignalet) og retvinkel-spredningsimpulsen skal ligge inden for respektive intervaller for

DK 153588B

8 brugen af det grønne fluorescenssignal, som skal aktiveres. Efter korrektion for uægte fluorescensudsendelser fra ukombinerede antistoffer eller lignende angiver tilstedeværelse af en grøn fluorescens-impuls derefter tilstedeværelse af en lymfocytceiie i den specificerede 05 underklasse. Denne metode fungerer, fordi "vinduet" for fremadspred-ning skelner leukocytter fra blodplader, fra delvis nedbrudte røde celler og fra tilfældig debris i opløsningen, mens "vinduet" for ret-vin kelspredning skelner lymfocytter fra monocytter samt granulocytter.

En detektering af en celle, som har smalvinkelsprednings- og retvinkei-10 spredningsimpulser inden for de respektive vinduer, svarer derved effektivt til detektering af en tilstedeværende lymfocyt.

Den primære indikator for den ønskede underklasse af lymfocytter er fluorescens af den specielle farve. Hvis prøven indeholder tilfældige eller fremmedindikatorer, vil det naturligvis være nødven-15 digt at tage højde for sådanne indikatorers virkning. En sådan fremmed-indikator indeholder fluorescerende molekyler i opløsning, som kan fjernes ved at vaske prøven før den strømningscytometriske analyse.

En anden type af fremmedindikatorer frembringes af tilfældige bindinger af fluorescerende antistoffer til celler. En foranstaltning imod den 20 ene eller begge indikatortyper består i til stadighed at have et kontrol-materiale til rådighed, som er model for virkningen af fremmede eller uægte fluorescensdata. En anden foranstaltning er at opretholde data i apparatet svarende til et sådant kontrolmateriales reaktion. En sand aflæsning eller visning kan naturligvis opnås ved at kompensere de 25 aktuelt detekterede prøvesignaler ved at indføre kontrolfaktoren, eksempelvis ved at kombinere (f.eks. subtraktion eller dekonvolution) kontrollens svarsignal med det virkeligt målte fluorescenssignal. På lignende måde kan kontrolprøver eller kontroldata benyttes til at korrigere for flere forskellige andre forhold eller tilstande.

30 Der henvises nu til fig. 2, som viser et funktionsmæssigt blok diagram over procedurer, som indgår i den foreliggende opfindelses principper. I fig. 2 er et reference-"vindue" for fremadspredning vist ved 201, og et reference-"vindue" for retvinkelspredning er vist ved 204. Disse referenceværdier kan være etableret så simpelt 35 som ved hjælp af faste eller indstillelige potentiometre eller ved hjælp af så højt udviklede og esoteriske metoder som lagret programstyring, der tager hensyn til forskellige miljøbestemte faktorer, variable, som

DK 153588B

9 er knyttet til den type eller grad af behandling, som indgår i blodet, der undersøges, eller lignende. Under alle omstændigheder fastlægger "vinduerne11 ved 201 og 204 respektive amplitudeintervaller, hvori tilsvarende fremadsprednings- eller retvinkelspredningsimpulser repræ-05 senterer eventuelle leukocytter.

Fremadspredningsimpulssignalet 202, eksempelvis det signal, som kan være frembragt i forstærkeren 120 i fig. 1 ud fra smalvinkel-fotofølerne 109 og 110, er koblet til en komparator 203, der afgiver et åbnesignal til et OG-portelement 207, når den tilhørende impuls 10 ved 202 falder inden for det ved 201 dannede vindue. På lignende måde er retvinkeispredningsimpulssignalet ved 205 koblet til en anden komparator 206, hvis indgang forsynes med reference-"vinduet" 204 for retvinkelspredning. Når retvinkelspredningsimpulsen 205 falder inden for retvinkelspredningsvinduet, overføres der igen et åbne-15 signal fra komparatoren 206 og til OG-portelementet 207. Når en fremad-spredningsimpuls er til stede inden for fremadspredningsreference-vinduet, samtidig med at en retvinkelspredningsimpuls falder inden for retvinkelspredningsvinduet, udløser OG-portelementet 207 følgelig en determination i 208, der tjener til at identificere tilstedeværelsen 20 af en grøn fluorescensimpuls fra den grønne fluorescenskanal 209 (eksempelvis fra forstærkeren 118 i apparatet i fig. 1).

Endvidere er der vist en impulshøjdeanalysator 211, som på forskellig måde kompenserer data fra grøn-fluorescenskanalen og fremstiller en passende repræsentation samt udgangsdata. Som tidligere 25 omtalt kan kompensationen være så simpel som en subtraktion af en vis intensitetsmængde på grund af tilfældige, men forventede fluorescenssignaler, eller kompensationen kan være så højt udviklet som en fremstilling af data ved hjælp af en forudgående eller efterfølgende analyse af en kontrolprøve. Generelt udgør impulshøjdeanalysen 30 i 211 en passende forstærkning, filtrering og signalbehandling i overensstemmelse med konventionelle metoder, der er velkendte for fagfolk. Fremvisningen eller frembringelsen af udgangsdata ved 212 involverer frembringelse af passende histogrammer eller lignende.

Det benyttede udtryk "fluorescerende antistof" henviser til anti-35 stoffer, som selv fluorescerer, eller til antistoffer, der er mærket således, at de fluorescerer ved en bestemt stimulering.

DK 153588B

10

Eksempel

Materialer og fremgangsmåder: A. Celletilberedning 05 Fuldblod fra normale menneskedonorer blev a nti koaguleret med EDTA. Det koagulerede overfladelag blev fjernet, og koncentrationen af leukocytter i dette overfladelag blev bestemt. Procentandelen af lymfocytter blev vurderet på en modificeret CYTOFLUOROGRAPH® (Ortho Instruments, Westwood, MA) som beskrevet i det følgende.

10 Hvis lymfocytkoncentrationen var større end 10000/mm , blev det koagulerede overfladelag fortyndet med salt med phosphatstødpude 3 (f.eks. "PBS") (Dulbeco) til en koncentration på 10000 lymfocytter/mm .

B. Indirekte immunofluorescensmærkning 15 100 μΙ af koaguleret overfladelag blev inkuberet med 100 μΙ af et passende fortyndet monoklonalt antistof (muse-antilymfocyt underklasse) ved 4°C og i 30 minutter. Ved afslutningen af denne inkubation blev cellerne behandlet med 2-4 ml isotonisk ammoniumchlorid med stødpudevirkning (NH^CI 16,58 g/l, dinatrium EDTA, 0,074 g/l, kalium-20 hydrogencarbonat 2,00 g/l, pH = 7,3). Efter 5 minutters forløb var de røde celler nedbrudt, og suspensionen blev centrifugeret ved 200 x G i 5 minutter. Den tunge fase blev fjernet, og småkuglerne indeholdende leukocytterne samt resterende blodplader og rester af røde celler blev vasket én gang i PBS. Småkuglerne blev forsigtigt 25 dispergeret og inkuberet ved 4°C i 30 minutter med 100 μΙ af en 40:1 fortynding af fluorescineret gede-anti-muse 7S (Meloy Laboratories, Springfield, VA), F/p = 2,5. Efter denne inkubation og eventuelt efter yderligere skylninger med PBS blev cellerne fortyndet til et slutvolumen på 1 ml og var parat til analyse i strømningscytometeret.

30 C. Cytometrisk analyse

En CYTOFLUOGRAPH® FC200/4800A (Ortho Instruments, West-wood, MA) blev benyttet til samtidig måling af fremadspredning, ret-vinkelspredning samt den grønne fluorosceinfluorescens for hver celle 35 i prøven. Instrumentet var modificeret ved at erstatte den "røde" filterblok med filtre indrettet til at dirigere det blå laserlys, som spredes vinkelret på den indfaldende stråle, ind i den fotomultiplikator,

DK 153588B

11 som normalt benyttes til detektering af rød fluorescens. Den grønne filterblok indeholdt et FITC-filter. Retvinkelspredningssignalet og det normalt til rådighed værende fremadspredningssignal blev registreret som et cytogram på 4800A analysatoren. Ved brug af instrumen-05 tets styringer blev der fremstillet en portimpuls for celler med bestemte kombinationer af fremad- og retvinkellysspredning. De grønne fluorescensimpulser blev integreret elektrisk ved hjælp af et separat modul, som var tilføjet til 4800A apparatet, og de integrerede fluorescensimpulser blev registreret på en impulshøjdeanalysator (model 2102, 10 Ortho Instruments, Westwood, MA). Ved at anvende portimpulsen fra 4800A apparatet var det muligt at registrere fluorescensimpulser fra kun de celler, som havde bestemte lysspredningsegenskaber.

D. Resultater 15 Fremgangsmåden til leukocytidentifikation er illustreret i cyto- grammerne i figurerne 3A og 3B. Det her anvendte udtryk "cytogram" betegner en repræsentation af data, hvori hver prik repræsenterer en enkelt celle, og prikkens beliggenhed er givet ved koordinater, som er proportionale med udvalgte parametre, eksempelvis retvinkel-20 og fremadspredningsintensiteterne frembragt af cellen i CYTOFLUORO-GRAPHEN®. Prøven i fig. 3A var fuldblod fortyndet med ammonium-chloridnedbrydningsmiddel. Fire klynger af prikker eller celler kan skelnes. Klynge nr. 1 hidrører fra ansamlinger af blodplader og rester af røde celler. Klyngerne nr. 2-4 hidrører fra lymfocytter, monocytter 25 samt granulocytter, respektive. Identifikationen af leukocytklyngerne er baseret på en sammenligning af det relative optalte antal i hver klynge med manuelle differentialoptællinger af leukocytter. Lignende klynger blev observeret med en rød (HeNe) laser på en prototype-cellesorterer. Sortering af cellerne i de tilsvarende klynger, mærk-30 ning af cellerne med acridinorange samt observation af cellerne under et fluorescensmikroskop frembragte yderligere bevis for, at klyngerne var korrekt identificeret.

Fig. 3B er cytogrammet for en prøve af "mononukleare celler" fremstillet ved massefyldegradient separation af fuldblod. Blodplade-35 ansamlingen, lymfocyt- og monocytklyngerne svarer til de i fig. 3A viste, mens granulocytklyngen mangler som forventet. Det fremgår af figurerne 3A og 3B, at lymfocytterne er lette at skelne fra granulo- i 12

DK 153588B

cytterne. Der kan optræde små overlapninger mellem lymfocytterne og monocytterne i klyngerne 2 og 3, men til de aktuelle formål synes det at være tilstrækkeligt at betragte klynge nr. 2 som udelukkende indeholdende lymfocytter og klynge nr. 3 som udelukkende indeholdende 05 monocytter.

Af figurerne 3A og 3B fremgår, at fremadlysspredningen primært er anvendelig til at skelne leukocytterne fra blodpladerne og rester af røde celler. Den instrumentale tærskelværdi var typisk indstillet til at udelukke disse små celler, således at der kun tælles leukocytter.

10 Når dette er gjort, giver retvin kel lysspredningsparameteren alene en fortrinlig adskillelse af leukocyttyperne. Histogrammerne “A" og "B" i fig. 3C svarer til de i figurerne 3A, hhv. 3B viste cytogram-mer. Spidserne 1, 2 og 3 svarer til lymfocytter, monocytter og granu-locytter, respektive.

15 Når der anvendes immunofluorescensmærkning af det koagulerede overfladelag, frembringer den endelige celletilberedning lysspredningsklynger, der i det væsentlige er de samme som de i fig. 3A viste.

Da lymfocytter, monocytter og granulocytter kan skelnes på grundlag af retvin kel lysspredning, vil et cytogram af grøn fluorescens 20 som funktion af retvin kelspredning vise, hvilke af disse leukocyt-typer, der er mærket. Figurerne 3D og og 3E viser sådanne cyto-grammer for blodprøver, som er inkuberet med en kontrol, fig. 3D, eller med anti-T-celle, fig. 3E, antistof. Kontrollen var et supernat fra en ikke-antistofproducerende klon, mens anti-T-celle antistoffet 25 var et monokionalt antistof. Ved kontrollen viste kun granulocytter en fluorescens af betydning.

Blod mærket med anti-T-antistoffet viste imidlertid en tydelig lymfocytkiynge, som havde en forholdsvis intens fluorescens. Denne "T"-klynge indeholdt 77% af lymfocytterne (defineret ved lysspredning) 30 og indeholder tilsyneladende kun T-lymfocytter.

Fig. 3F viser histogrammer for grøn fluorescens fra lymfocytklyngen (klynge nr. 2 i fig. 3A). Histogrammet A i fig. 3F gælder for prøven med kontrolantistof, mens histogrammet B i fig. 3F gælder for prøven med anti-T-antistof. T-cellerne giver en tydelig spids i 35 histogrammet B i fig. 3F. T-cellerne danner en meget tydelig spids.

Et histogram af grøn fluorescens fra alle leukocytterne har en spids, som skyldes granulocytterne, og som delvis overlapper T-lymfocyt-spidsen.

13

DK 153588B

Eksperimenter med flere forskellige antistoffer i bestemte lymfocyt-underklasser og ved brug af menneskeblod fra flere donorer har givet resultater af en kvalitet i lighed med den ovenfor rapporterede.

Blod, der blev afprøvet med antistoffer, der karakteriseres som anti-T-celle, 05 indeholdt typisk 70-80% celler i lymfocytklyngen, som frembringer fluorescens af betydning. Blod, som afprøves med antistoffer, der karakteriseres som anti-B-celle, indeholdt typisk 20% celler i lymfocytklyngen, som frembringer fluorescens af betydning. Disse resultater ligger i det normale interval for T-celle og B-celleprocenter.

10 15 20 25 30 35

Claims (12)

1. Fremgangsmåde til identifikation og optælling af celler hørende til en udvalgt underklasse af lymfocytter i blod, eller andre typer blodceller, som udviser lignende antigenegenskaber, KENDETEGNET 05 ved a) en tilvejebringelse af en delmængde fra det blod, som skal undersøges, b) en selektiv mærkning af celler i nævnte underklasse ved at inkubere nævnte delmængde med et antistof, som reagerer med 10 celler i nævnte underklasse, hvilket antistof har en forudbestemt fluorescensreaktion pi lys med en forudbestemt spektral karakteristik, c) en nedbrydning af røde celler i nævnte delmængde, d) en transport af nævnte delmængde, i det væsentlige én celle ad gangen, igennem et område med fokuseret lys med nævnte 15 forudbestemte spektrale karakteristik og under detektering af lys, som spredes af og udsendes ved fluorescens fra hver celle i nævnte delmængde, og e) udnyttelse af det spredte lys til at opdage om en celle er en lymfocyt eller nævnte anden type celle, og 20 f) identificering af en celle som værende af nævnte underklasse ved detektering af tilstedeværelsen af nævnte forudbestemte fluorescens-reaktion i det detekterede lys fra en detekteret lymfocyt eller anden celletype.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, AT nævnte delmængde er tilvejebragt fra antikoaguleret, men i øvrigt i det væsentlige ubehandlet fuldblod.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, AT nævnte 30 delmængde er tilvejebragt fra overfladelaget, der er isoleret fra en prøve af fuldblod, som er centrifugeret i en forudbestemt tidsperiode. 1 Fremgangsmåde ifølge krav 1, indrettet til identifikation og 35 optælling af specielle underklasser af T-type lymfocytter, KENDETEGNET ved, AT nævnte mærkningstrin indeholder en inkubation af nævnte delmængde med anti-nævnte underklasseantistof, som fluorescerer DK 153588B Inden for kendte intensitets- og frekvensintervaller ved bestråling med lys af givne bølgelængder.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, KENDETEGNET ved, AT nævnte 05 transporttrin indeholder en fokusering af. en arganlaser i nævnte. område.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1-5 hvor det spredte lys er anvendt til at detektere om en celle er en lymfocyt, KENDETEGNET ved, AT 10 nævnte transporttrin endvidere indeholder: en tilvejebringelse af respektive referenceintervaller for frem-adlysspredning samt retvinkelspredning, en detektering af fremad- og retvinkelspredningsimpulser for en given celle, 15 en sammenligning af respektive detekterede impulser med til svarende referenceintervaller, og en udløsning af detektering af retvin kelfluorescens i nævnte forudbestemte reaktion, når begge detekterede impulser ligger inden for deres tilsvarende intervaller. 20

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1-6, KENDETEGNET ved, AT nævnte mærkningstrin indeholder en inkubation af nævnte delmængde med en mængde af nævnte antistof, som på forhånd er associeret med et fluorescerende farvemiddel. 25

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1-6, KENDETEGNET ved, AT nævnte mærkningstrin indeholder først en inkubation af nævnte delmængde med et ikke-fluorescerende antistof, derefter en yderligere inkubation af nævnte delmængde med et antistof, som har nævnte forudbestemte 50 fluorescensreaktion, og som reagerer med nævnte ikke-fluorescerende antistof.

9. Apparat til identifikation og optælling af specificerede T-Iymfocytter eller andre typer blodceller, som udviser lignende antigenegenskaber, 35. en prøve, som er blevet inkuberet med et fluorescens-reagerende antistof som reagerer med antigenisk determinant på overfladen af nævnte specificerede T-lymfocytter eller nævnte andre typer blodceller, KENDETEGNET ved . J DK 153588B a) en cytometrigennemstrømningscelle (106) indrettet til at føre celler i nævnte prøve hurtigt og i det væsentlige én ad gangen igennem et givet område, b) en lyskilde (101,102), som fremkalder fluorescens i nævnte 05 antistof, c) midler (103,104,105) til kobling og fokusering af lys fra nævnte kilde til cellestrømmen i nævnte givne område, d) en første fotofølerindretning (109,110) til detektering af fremadlysspredning som spredes fra nævnte område af en celle, som 10 passerer igennem området, e) en anden fotofølerindretning (114,117) anbragt på en akse i det væsentlige vinkelret på aksen for cellestrømmen til detektering af lys, som er spredt af nævnte celle på en akse, der i det væsentlige er vinkelret på aksen for cellestrømmen, 15 f) en tredie fotofølerindretning (115,116) til afføling af fluor escenslysimpulser, g) midler (201,204) til frembringelse af respektive referenceintervaller for fremadlysspredning samt retvinkellysspredning, h) midler (203,206) til sammenligning af lysimpulser, som er 20 detekteret af nævnte første og anden fotofølerindretning, med tilhøren de referenceintervaller fra midlerne (201,204) til frembringelse af intervallerne, i) midler (207,208) indrettet til, som reaktion på nævnte midler til frembringelse af referenceintervallerne, selektivt at aktivere nævnte 25 tredie fotofølerindretning, når nævnte detekterede lysimpulser optræder inden for tilhørende referenceintervaller, og j) midler (212) til fremvisning af optegnelser af fluorescenslysimpulser som indicier for tilstedeværelse af nævnte specificerede T-lym-focytcelier eller nævnte andre typer blodceller i nævnte område. 30

10. Apparat ifølge krav 9, KENDETEGNET ved, AT det yderligere omfatter midler (210,211) indrettet til, som reaktion på nævnte midler (207,208) til selektiv aktivering af den tredie fotofølerindretning at kompenser® signaler detekteret af nævnte tredie fotofølerindretning 35 for at tage hensyn til pi forhånd udvalgte fremmedfluorescenseffekter, og AT nævnte fremvisningsmidler (212) er indrettet til at reagere på nævnte kompenseringsmidler (210,211). DK 1535888

11. Apparat ifølge krav 9, KENDETEGNET ved, AT nævnte midler (103,104,105) til kobling og fokusering af lys er indrettet til at levere lys fra nævnte kilde (101,102) i det væsentlige vinkelret på aksen for cellestrømmen i nævnte givne område. 05

12. Apparat ifølge krav 9, KENDETEGNET ved, AT nævnte lyskilde indeholder en argonionlaser (101), og AT nævnte tredie fotoføler-indretning (115,116) indeholder midler til afføling af grønne fluorescenslysimpulser. 10

13. Apparat ifølge krav 12, KENDETEGNET ved, AT nævnte tredie fotofølerindretning (115,116) er indrettet til at afføle nævnte grønne lysimpulser langs nævnte normalakse, der er i det væsentlige vinkelret på aksen for cellestrømmen. 15 20 25 30 35