JPH0593724A - 特異性化血液細胞の亜綱の自動化された同定および計数装置 - Google Patents
特異性化血液細胞の亜綱の自動化された同定および計数装置Info
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- JPH0593724A JPH0593724A JP3202279A JP20227991A JPH0593724A JP H0593724 A JPH0593724 A JP H0593724A JP 3202279 A JP3202279 A JP 3202279A JP 20227991 A JP20227991 A JP 20227991A JP H0593724 A JPH0593724 A JP H0593724A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 特異性化Ｔリンパ球の表面上の選択した抗原
決定基に対する蛍光応答性抗体と共にインキュベートし
た試料中の特異性化Ｔリンパ球の同定および計数装置 【効果】 本発明により、リンパ球の特異性亜綱を、分
離することなく、速く比較的簡単に同定および計数でき
る装置が提供される。
決定基に対する蛍光応答性抗体と共にインキュベートし
た試料中の特異性化Ｔリンパ球の同定および計数装置 【効果】 本発明により、リンパ球の特異性亜綱を、分
離することなく、速く比較的簡単に同定および計数でき
る装置が提供される。
Description
【０００１】本発明は、自動化された血液学的計器に関
し、さらに詳しくは、血球の特異性化亜綱、たとえば、
ある型のリンパ球の同定および計数に関する。
し、さらに詳しくは、血球の特異性化亜綱、たとえば、
ある型のリンパ球の同定および計数に関する。
【０００２】血液中のリンパ球の集団個体数（ｐｏｐｕ
ｌａｔｉｏｎ）は、免疫応答において明確な役割を演ず
るある数の亜綱（ｓｕｂｃｌａｓｓ）で定められる。た
とえば、種々の亜綱中のリンパ球の相対的数は、病気の
状態を変えるようである。従って、種々の亜綱の計数お
よび同定は特に血液のコンステイチュエンシー（ｃｏｎ
ｓｔｉｔｕｅｎｃｙ）ばかりでなく、一般に有機体の相
対的な良好な存在について指示を与える。
ｌａｔｉｏｎ）は、免疫応答において明確な役割を演ず
るある数の亜綱（ｓｕｂｃｌａｓｓ）で定められる。た
とえば、種々の亜綱中のリンパ球の相対的数は、病気の
状態を変えるようである。従って、種々の亜綱の計数お
よび同定は特に血液のコンステイチュエンシー（ｃｏｎ
ｓｔｉｔｕｅｎｃｙ）ばかりでなく、一般に有機体の相
対的な良好な存在について指示を与える。
【０００３】機能的に異なるリンパ球の少なくともいく
つかの特定の亜綱は、細胞表面上の抗原性決定基（ａｎ
ｔｉｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）に基づいて
同定できることは知られている。特に、かなり学究的且
つ臨床的な興味がＴリンパ球について起こってきた。な
かでも、Ｔリンパ球はそれらの表面上の特定の同定可能
な抗原性決定基により特徴づけられ、それらの決定基は
亜綱の細胞を他の血球と、また他のリンパ球の亜綱の細
胞と区別する。しかして、興味あるリンパ球亜綱と選択
的に反応性の抗体を含む試薬を同定し且つ生成すること
において高い興味が持たれている。
つかの特定の亜綱は、細胞表面上の抗原性決定基（ａｎ
ｔｉｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）に基づいて
同定できることは知られている。特に、かなり学究的且
つ臨床的な興味がＴリンパ球について起こってきた。な
かでも、Ｔリンパ球はそれらの表面上の特定の同定可能
な抗原性決定基により特徴づけられ、それらの決定基は
亜綱の細胞を他の血球と、また他のリンパ球の亜綱の細
胞と区別する。しかして、興味あるリンパ球亜綱と選択
的に反応性の抗体を含む試薬を同定し且つ生成すること
において高い興味が持たれている。
【０００４】人間および動物の免疫系統に含まれるリン
パ球の２つの主要な群が存在することを理解すべきであ
る。これらの第１群（胸腺誘導細胞、すなわちＴ細胞）
はヘモポイエチン細胞からの胸腺中で分化する。胸腺内
に存在する間、分化する細胞は、「胸腺細胞」と名付け
られる。成熟したＴ細胞は胸腺から出て、組織、リンパ
管および血流の間を循環する。これらの細胞は再循環す
る小さいリンパ球のプールの大きい比率を形成する。そ
れらは免疫学的特異性を有し、細胞媒介免疫応答（たと
えば、移植拒絶）において奏効体・細胞として直接関与
する。Ｔ細胞は液性抗体を分泌しないが、それらは後述
するリンパ球の第２群によるこれらの抗体の分泌に時々
要求される。Ｔ細胞のいくつかの型は、免疫系統の他の
面において調整機能をはたす。細胞共同（ｃｅｌｌ ｃ
ｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ）のこの過程の機構は、また完全
には理解されていない。
パ球の２つの主要な群が存在することを理解すべきであ
る。これらの第１群（胸腺誘導細胞、すなわちＴ細胞）
はヘモポイエチン細胞からの胸腺中で分化する。胸腺内
に存在する間、分化する細胞は、「胸腺細胞」と名付け
られる。成熟したＴ細胞は胸腺から出て、組織、リンパ
管および血流の間を循環する。これらの細胞は再循環す
る小さいリンパ球のプールの大きい比率を形成する。そ
れらは免疫学的特異性を有し、細胞媒介免疫応答（たと
えば、移植拒絶）において奏効体・細胞として直接関与
する。Ｔ細胞は液性抗体を分泌しないが、それらは後述
するリンパ球の第２群によるこれらの抗体の分泌に時々
要求される。Ｔ細胞のいくつかの型は、免疫系統の他の
面において調整機能をはたす。細胞共同（ｃｅｌｌ ｃ
ｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ）のこの過程の機構は、また完全
には理解されていない。
【０００５】リンパ球の第２群（骨髄誘導細胞、すなわ
ちＢ細胞）は、抗体を分泌するものである。それらはま
たヘモポイエチン幹細胞から発生するが、それらの分化
は胸腺によって決定されない。鳥において、それらはフ
アブリキウス嚢（ｂｕｒｓａｏｆ Ｆａｂｒｉｃｉｕ
ｓ）と呼ばれる胸腺に類似する器官中で分化される。し
かしながら、哺乳動物において、同等の器官は発見され
ておらず、これらのＢ細胞は骨髄内で分化すると考えら
れている。
ちＢ細胞）は、抗体を分泌するものである。それらはま
たヘモポイエチン幹細胞から発生するが、それらの分化
は胸腺によって決定されない。鳥において、それらはフ
アブリキウス嚢（ｂｕｒｓａｏｆ Ｆａｂｒｉｃｉｕ
ｓ）と呼ばれる胸腺に類似する器官中で分化される。し
かしながら、哺乳動物において、同等の器官は発見され
ておらず、これらのＢ細胞は骨髄内で分化すると考えら
れている。
【０００６】現在、Ｔ細胞は「ヘルパー（ｈｅｌｐｅ
ｒ）」「サプレッサー（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）」およ
び「キラー（ｋｉｌｌｅｒ）」Ｔ細胞と呼ばれる、少な
くともいくつかの亜類型に分割されることが認められて
おり、これらのＴ細胞は（それぞれ）反応を促進し、反
応を抑制し、或いは異質細胞を殺す［分離する（ｌｙｓ
ｉｎｇ）］機能を有する。これらの亜綱はネズミの系統
についてよく理解されているが、それらは人間の系統に
ついて記載されたのはほんの最近になってからである。
たとえば、Ｒ．Ｌ．Ｅｖａｎｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅ
ｄｉｅｉｎｅ、Ｖｏｌ．１４５、２２１〜２３２、１９
７７；およびＬ．ＣｈｅｓｓおよびＳ．Ｆ．Ｓｃｈｌｏ
ｓｓｍａｎ−“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉ
ｓ ｏｆ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌ
ｌ Ｓｕｂｓｅｔｓ Ｂｅａｒｉｎｇ Ｕｎｉｑｕｅ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｇｅｕ
ｓ”、“ＣｏｎｔｅｍｐｏｒｙＴｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｉ
ｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｏ．Ｓｔｕｔｍａｎ編、
Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９７７、Ｖｏｌ．７、３
６３〜３７９参照。
ｒ）」「サプレッサー（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）」およ
び「キラー（ｋｉｌｌｅｒ）」Ｔ細胞と呼ばれる、少な
くともいくつかの亜類型に分割されることが認められて
おり、これらのＴ細胞は（それぞれ）反応を促進し、反
応を抑制し、或いは異質細胞を殺す［分離する（ｌｙｓ
ｉｎｇ）］機能を有する。これらの亜綱はネズミの系統
についてよく理解されているが、それらは人間の系統に
ついて記載されたのはほんの最近になってからである。
たとえば、Ｒ．Ｌ．Ｅｖａｎｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅ
ｄｉｅｉｎｅ、Ｖｏｌ．１４５、２２１〜２３２、１９
７７；およびＬ．ＣｈｅｓｓおよびＳ．Ｆ．Ｓｃｈｌｏ
ｓｓｍａｎ−“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉ
ｓ ｏｆ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌ
ｌ Ｓｕｂｓｅｔｓ Ｂｅａｒｉｎｇ Ｕｎｉｑｕｅ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｇｅｕ
ｓ”、“ＣｏｎｔｅｍｐｏｒｙＴｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｉ
ｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｏ．Ｓｔｕｔｍａｎ編、
Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９７７、Ｖｏｌ．７、３
６３〜３７９参照。
【０００７】Ｔ細胞の綱または亜綱を同定または抑制す
る能力は、種々の免疫調整障害または状態診断または処
置に重要である。
る能力は、種々の免疫調整障害または状態診断または処
置に重要である。
【０００８】たとえば、ある種の白血病およびリンパ腫
は、それらがＢ細胞またはＴ細胞に由来するかどうかに
依存して、異なる予後を有する。こうして、病気の予後
の評価は、これらのリンパ球の２つの群を区別すること
に依存する。たとえば、Ａ．Ｃ．Ａｉｓｅｎｂｅｒｙお
よびＪ．Ｃ．Ｌｏｎｇ、Ｔｈｅ ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、５８：３００
（１９７５年３月）；Ｄ．Ｂｅｌｐｏｍｍｅ， ｅｔ
ａｌ．，“Ｉｍｍｕｎｏｌｇｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓ
ｉｓ ｏｆ Ｌｅｕｋｅｍｉａｓ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈ
ｏｍａｓ”、Ｓ．Ｔｈｉｅｒｆｅｌｄｅｒ， ｅｔ ａ
ｌ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｈｅｉｅｌｂｅｒｇ、１
９７７、３３〜４５；およびＤ．Ｂｅｌｐｏｍｍｅ ｅ
ｔ ａｌ．， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、１９７８、３８、８５参
照。ある種の病気の状態（たとえば、幼年リウマチ様関
節炎およびある種の白血病）は、Ｔ細胞の亜綱の不釣合
いに関連する。自己免疫病は一般に「ヘルパー」Ｔ細胞
の過剰またはある種の「サプレッサー」Ｔ細胞の欠乏に
関係するが、亜性腫瘍は一般に「サプレッサー」Ｔ細胞
と関連することが示唆されている。ある種の白血病にお
いて、過剰のＴ細胞は発育の抑圧段階において生成され
る。こうして診断はこの不釣合い、すなわち過剰を検知
する能力に依存する。たとえば、Ｊ．Ｋｅｒｓｅｙ，ｅ
ｔ ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍａｒｋｅｒｓ Ｄｅ
ｆｉｎｅ Ｈｕｍａｎ ＬｙｍｐｈｏｉｄＭａｌｉｇｎ
ａｃｉｅｓ ｗｉｔｈ Ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｇ
ｎｏｓｅｓ”、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｌ
ｏｏｄ Ｔｒａｎｆｕｓｉｏｎ、Ｖｏｌ．２０、Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９７７、１７〜２４およ
びその中に含まれる引用文献参照。
は、それらがＢ細胞またはＴ細胞に由来するかどうかに
依存して、異なる予後を有する。こうして、病気の予後
の評価は、これらのリンパ球の２つの群を区別すること
に依存する。たとえば、Ａ．Ｃ．Ａｉｓｅｎｂｅｒｙお
よびＪ．Ｃ．Ｌｏｎｇ、Ｔｈｅ ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、５８：３００
（１９７５年３月）；Ｄ．Ｂｅｌｐｏｍｍｅ， ｅｔ
ａｌ．，“Ｉｍｍｕｎｏｌｇｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓ
ｉｓ ｏｆ Ｌｅｕｋｅｍｉａｓ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈ
ｏｍａｓ”、Ｓ．Ｔｈｉｅｒｆｅｌｄｅｒ， ｅｔ ａ
ｌ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｈｅｉｅｌｂｅｒｇ、１
９７７、３３〜４５；およびＤ．Ｂｅｌｐｏｍｍｅ ｅ
ｔ ａｌ．， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、１９７８、３８、８５参
照。ある種の病気の状態（たとえば、幼年リウマチ様関
節炎およびある種の白血病）は、Ｔ細胞の亜綱の不釣合
いに関連する。自己免疫病は一般に「ヘルパー」Ｔ細胞
の過剰またはある種の「サプレッサー」Ｔ細胞の欠乏に
関係するが、亜性腫瘍は一般に「サプレッサー」Ｔ細胞
と関連することが示唆されている。ある種の白血病にお
いて、過剰のＴ細胞は発育の抑圧段階において生成され
る。こうして診断はこの不釣合い、すなわち過剰を検知
する能力に依存する。たとえば、Ｊ．Ｋｅｒｓｅｙ，ｅ
ｔ ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍａｒｋｅｒｓ Ｄｅ
ｆｉｎｅ Ｈｕｍａｎ ＬｙｍｐｈｏｉｄＭａｌｉｇｎ
ａｃｉｅｓ ｗｉｔｈ Ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｇ
ｎｏｓｅｓ”、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｌ
ｏｏｄ Ｔｒａｎｆｕｓｉｏｎ、Ｖｏｌ．２０、Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９７７、１７〜２４およ
びその中に含まれる引用文献参照。
【０００９】最近、単クローン性（ｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌ）抗体技術が、種々のリンパ球亜綱に対する高度に精
製された抗体を大量に生成させるために使用されてい
る。このような抗体を使用することにより、個々のリン
パ球を検定して、種々の亜綱中の細胞の相対的数を決定
することが可能であることが明らかにされた。さらに、
直接的技術または間接的技術を用いることにより、抗体
を蛍光的に標識付けし（ｔａｇ）、これによって考慮す
る試料を流れ血液計算分析に従わせることができる。
ｌ）抗体技術が、種々のリンパ球亜綱に対する高度に精
製された抗体を大量に生成させるために使用されてい
る。このような抗体を使用することにより、個々のリン
パ球を検定して、種々の亜綱中の細胞の相対的数を決定
することが可能であることが明らかにされた。さらに、
直接的技術または間接的技術を用いることにより、抗体
を蛍光的に標識付けし（ｔａｇ）、これによって考慮す
る試料を流れ血液計算分析に従わせることができる。
【００１０】普通の免疫蛍光技術は、現在、リンパ球を
他のリンパ球から物理的に単離することを予備工程とし
て含む。この工程は、非特異性的に着色された単球細胞
または顆粒球細胞として計数されうるという可能性を排
除する。しかしながら、この初期のリンパ球単離工程
は、長く、困難であり、事実、リンパ球を着色または分
析する比較的簡単な工程よりも非常に長い。明らかなよ
うに、臨床の舞台において、気速な反復的分析について
かなりのプレミアムが存在し、リンパ球を他のリンパ球
から単離することの必要性は実際上克服し難しい障害で
ある。さらに、時間がそれほどプレミアムではない研究
の応用に対してさえ、初期のリンパ球の単離工程は、単
球細胞および顆粒球細胞の除去の間、多少のリンパ球の
損失の危険を含み、これは引き続く分析に不確実性と不
精確性をもたらす。相応して単離しようとするリンパ球
から他の血球を完全に除去しないと、誤差を生ずる危険
がかなり生じ、そしてこのような他の細胞が存在する
と、引き続く分析において誤差が生ずることがよくあ
る。
他のリンパ球から物理的に単離することを予備工程とし
て含む。この工程は、非特異性的に着色された単球細胞
または顆粒球細胞として計数されうるという可能性を排
除する。しかしながら、この初期のリンパ球単離工程
は、長く、困難であり、事実、リンパ球を着色または分
析する比較的簡単な工程よりも非常に長い。明らかなよ
うに、臨床の舞台において、気速な反復的分析について
かなりのプレミアムが存在し、リンパ球を他のリンパ球
から単離することの必要性は実際上克服し難しい障害で
ある。さらに、時間がそれほどプレミアムではない研究
の応用に対してさえ、初期のリンパ球の単離工程は、単
球細胞および顆粒球細胞の除去の間、多少のリンパ球の
損失の危険を含み、これは引き続く分析に不確実性と不
精確性をもたらす。相応して単離しようとするリンパ球
から他の血球を完全に除去しないと、誤差を生ずる危険
がかなり生じ、そしてこのような他の細胞が存在する
と、引き続く分析において誤差が生ずることがよくあ
る。
【００１１】したがって、本発明の目的は、リンパ球の
特異性亜綱を同定および計数し、同時にリンパ球の他の
血球からの前もっての分離の必要性を回避する装置を提
供することである。関連する目的は、同様な抗原特性を
含む他の型の血球のためのこのような装置を提供するこ
とである。
特異性亜綱を同定および計数し、同時にリンパ球の他の
血球からの前もっての分離の必要性を回避する装置を提
供することである。関連する目的は、同様な抗原特性を
含む他の型の血球のためのこのような装置を提供するこ
とである。
【００１２】相応して、本発明の目的は、現在の技術よ
りもかなり速く、そして他の細胞からの異物データ（ａ
ｒｔｉｆａｃｔ ｄａｔａ）の伴う欠陥のある分析、或
いは試料からのリンパ球の損失によるデータの損失を実
質的に排除する装置を提供することである。さらに本発
明の目的は、速度がはやく且つ比較的簡単であるため、
リンパ球の亜綱の同定および計数を有効な臨床的道具と
するこのような装置を提供することである。
りもかなり速く、そして他の細胞からの異物データ（ａ
ｒｔｉｆａｃｔ ｄａｔａ）の伴う欠陥のある分析、或
いは試料からのリンパ球の損失によるデータの損失を実
質的に排除する装置を提供することである。さらに本発
明の目的は、速度がはやく且つ比較的簡単であるため、
リンパ球の亜綱の同定および計数を有効な臨床的道具と
するこのような装置を提供することである。
【００１３】本発明は、光学および信号の処理により従
来の流れ細胞蛍光測定装置を選択的に変更することを包
含し、この装置で興味ある亜綱の選択的免疫蛍光着色
（直接または間接）を利用することができ、そして全血
液試料［必要に応じて、淡黄膜（ｂｕｆｌｙ ｃｏａ
ｔ）層または抗凝固処理した全血液］を一度に１つの細
胞について分析する。
来の流れ細胞蛍光測定装置を選択的に変更することを包
含し、この装置で興味ある亜綱の選択的免疫蛍光着色
（直接または間接）を利用することができ、そして全血
液試料［必要に応じて、淡黄膜（ｂｕｆｌｙ ｃｏａ
ｔ）層または抗凝固処理した全血液］を一度に１つの細
胞について分析する。
【００１４】好ましい態様において、流れ細胞蛍光測定
装置の直角蛍光チャンネルの１つは直角散乱のための波
長特異性センサとして働らくように適合されている。全
血液または淡黄膜層の試料インキュベート（ｉｎｃｕｂ
ａｔｅ）して興味ある亜綱のリンパ群の表面上の特異性
抗原を一定の照明（たとえば、アルゴンイオンのレーザ
ーから集束された干渉性の光）に前もって決定した蛍光
応答性を有する抗体と結合させ、これによって興味ある
亜綱の細胞自体を効果的にこのような入射光に対して蛍
光応答性とする。次いで、試料の細胞を流れ細胞メータ
ーの流れチャンネルに通過させる。この流れ細胞メータ
ーは、前方光散乱器、ならびに直角光散乱器および蛍光
を監視する能力を有する。ある前方散乱条件を、それが
認められるとき、直角光散乱条件と組み合わせて使用し
て、検知された蛍光をゲート（ｇａｔｅ）する。一定の
色（たとえば、緑色）の特異性蛍光を検出したとき、出
力信号が生成されて一定の亜綱のリンパ球の存在を示
す。それから、このデータは正しく記憶および／または
表面（たとえば、あるヒストグラムの形に）できる。さ
らに、この分野で知られているように、細胞の分類技術
を使用して一定の亜綱のリンパ球を物理的に単離でき
る。
装置の直角蛍光チャンネルの１つは直角散乱のための波
長特異性センサとして働らくように適合されている。全
血液または淡黄膜層の試料インキュベート（ｉｎｃｕｂ
ａｔｅ）して興味ある亜綱のリンパ群の表面上の特異性
抗原を一定の照明（たとえば、アルゴンイオンのレーザ
ーから集束された干渉性の光）に前もって決定した蛍光
応答性を有する抗体と結合させ、これによって興味ある
亜綱の細胞自体を効果的にこのような入射光に対して蛍
光応答性とする。次いで、試料の細胞を流れ細胞メータ
ーの流れチャンネルに通過させる。この流れ細胞メータ
ーは、前方光散乱器、ならびに直角光散乱器および蛍光
を監視する能力を有する。ある前方散乱条件を、それが
認められるとき、直角光散乱条件と組み合わせて使用し
て、検知された蛍光をゲート（ｇａｔｅ）する。一定の
色（たとえば、緑色）の特異性蛍光を検出したとき、出
力信号が生成されて一定の亜綱のリンパ球の存在を示
す。それから、このデータは正しく記憶および／または
表面（たとえば、あるヒストグラムの形に）できる。さ
らに、この分野で知られているように、細胞の分類技術
を使用して一定の亜綱のリンパ球を物理的に単離でき
る。
【００１５】以下、本発明を添付図面を参照しながらさ
らに詳しく説明する。
らに詳しく説明する。
【００１６】まず図１を参照すると、本発明の原理に従
って使用できる装置が様式化されて機能的および構造的
に表示されている。事実、図１の装置は、商品名ＣＹＴ
ＯＦＬＵＯＲＯＧＲＡＰＨRで商業的に入手できる特定
のシステム（Ｏｒｔｈｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，
４１０ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＡｖｅｎｕｅ， Ｗｅｓ
ｔｗｏｏｄ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０２０９
０製）である。図１の装置は、細胞分析のための流れ血
球計算の原理を組み入れ、そして特定の型の照明に対す
る細胞蛍光応答を感知する能力を含む。
って使用できる装置が様式化されて機能的および構造的
に表示されている。事実、図１の装置は、商品名ＣＹＴ
ＯＦＬＵＯＲＯＧＲＡＰＨRで商業的に入手できる特定
のシステム（Ｏｒｔｈｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，
４１０ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＡｖｅｎｕｅ， Ｗｅｓ
ｔｗｏｏｄ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０２０９
０製）である。図１の装置は、細胞分析のための流れ血
球計算の原理を組み入れ、そして特定の型の照明に対す
る細胞蛍光応答を感知する能力を含む。
【００１７】図１の装置の焦点に流れチャンネル１０６
が存在し、ここにおいて懸濁液中の細胞は単一の列で急
速に（たとえば、２５００細胞／秒で）感知帯域を通
る。感知帯域は、細胞流と入射光ビーム、典型的は気体
レーザーからの集束された干渉性の光との交差によって
定められる。細胞が感知帯域を通過するとき、それは入
射光と色々な方法で相互作用する。ある光は、もちろ
ん、細胞により吸収され、他の光は入射光の軸に対して
比較的に狭い角度で散乱し、そしてなお他の光は入射光
の軸からの非常に発散した角度、たとえば、入射光に対
して直角に散乱される。さらに、細胞自体の性質、およ
び細胞があらかじめ受けることができる染色または着色
に依存して、蛍光放射も起こりうる。
が存在し、ここにおいて懸濁液中の細胞は単一の列で急
速に（たとえば、２５００細胞／秒で）感知帯域を通
る。感知帯域は、細胞流と入射光ビーム、典型的は気体
レーザーからの集束された干渉性の光との交差によって
定められる。細胞が感知帯域を通過するとき、それは入
射光と色々な方法で相互作用する。ある光は、もちろ
ん、細胞により吸収され、他の光は入射光の軸に対して
比較的に狭い角度で散乱し、そしてなお他の光は入射光
の軸からの非常に発散した角度、たとえば、入射光に対
して直角に散乱される。さらに、細胞自体の性質、およ
び細胞があらかじめ受けることができる染色または着色
に依存して、蛍光放射も起こりうる。
【００１８】したがって、細胞流および入射レーザー光
に関して種々の方向で位置する光センサは、各一定の型
の細胞に対して独特の組の応答の検知を可能とする。こ
うして、図１は、イオン・レーザー１０１およびヘリウ
ム・ネオン・レーザー１０２を含み、各レーザーから放
射された干渉性の光は鏡１０３および１０４とレンズ１
０５により流れチャンネル１０６の感知帯域へ種々に反
射される。この分野において知られているように、細胞
の試料流を流れる流体の鞘内で層流で運んで、単一細胞
が感知帯域において一定時間において照明されることを
確保する。すれゆえ、各細胞がレンズからの光により照
明されたとき、細胞と光との相互作用が感知される。
に関して種々の方向で位置する光センサは、各一定の型
の細胞に対して独特の組の応答の検知を可能とする。こ
うして、図１は、イオン・レーザー１０１およびヘリウ
ム・ネオン・レーザー１０２を含み、各レーザーから放
射された干渉性の光は鏡１０３および１０４とレンズ１
０５により流れチャンネル１０６の感知帯域へ種々に反
射される。この分野において知られているように、細胞
の試料流を流れる流体の鞘内で層流で運んで、単一細胞
が感知帯域において一定時間において照明されることを
確保する。すれゆえ、各細胞がレンズからの光により照
明されたとき、細胞と光との相互作用が感知される。
【００１９】図１に示すように、吸光センサ１０８は細
胞が遮断した光の量を検知し、そして前方光散乱は光セ
ンサ１０９および１１０によりほぼ半角２０°の円錐に
おいて検知される。センサ１０８、１０９および１１０
によって発生された電気信号は、増幅器１２０および１
２１に接続される。これらの増幅器１２０および１２１
は適当な振幅の電気信号になどを引き続く分析および／
または表示のため提供する。
胞が遮断した光の量を検知し、そして前方光散乱は光セ
ンサ１０９および１１０によりほぼ半角２０°の円錐に
おいて検知される。センサ１０８、１０９および１１０
によって発生された電気信号は、増幅器１２０および１
２１に接続される。これらの増幅器１２０および１２１
は適当な振幅の電気信号になどを引き続く分析および／
または表示のため提供する。
【００２０】図１の装置において、蛍光応答により細胞
から放射した光は、細胞の流れの方向および入射光の軸
の両方に対して、ほぼ直角で感知される。球面鏡１２５
および集光レンズ１０７はこの光をほぼ半角２０°の円
錐で集め、この光を開口１１１を通して、連続的に二色
鏡１１２および第２鏡１１３へ伝える。第１色フイルタ
１１４（たとえば、比較的長い波長の光を通すため）
は、選択した光を二色鏡１１２から光センサ１１７（た
とえば、光電子増倍管）へ運ぶ。第２フイルタ１１５は
異なる色の光（たとえば、比較的短かい波長の光）を第
２鏡１１３から第２センサへ選択的に通す。それぞれの
細胞からの光に相当するパルスの形のセンサ１１６およ
び１１７からの電気信号は、増幅器１１８および１１９
へ結合され、これによってまた適当な処理に適合する信
号を生成する。
から放射した光は、細胞の流れの方向および入射光の軸
の両方に対して、ほぼ直角で感知される。球面鏡１２５
および集光レンズ１０７はこの光をほぼ半角２０°の円
錐で集め、この光を開口１１１を通して、連続的に二色
鏡１１２および第２鏡１１３へ伝える。第１色フイルタ
１１４（たとえば、比較的長い波長の光を通すため）
は、選択した光を二色鏡１１２から光センサ１１７（た
とえば、光電子増倍管）へ運ぶ。第２フイルタ１１５は
異なる色の光（たとえば、比較的短かい波長の光）を第
２鏡１１３から第２センサへ選択的に通す。それぞれの
細胞からの光に相当するパルスの形のセンサ１１６およ
び１１７からの電気信号は、増幅器１１８および１１９
へ結合され、これによってまた適当な処理に適合する信
号を生成する。
【００２１】図１の態様に示すように、センサ・セレク
タ１２２は増幅器１１８〜１２１からの信号を利用する
出力ヒストグラムを発生する。たとえば、出力の１つの
有用な形は、センサ１１６からの、緑の蛍光の振幅に対
する、プロツトである。このようなヒストグラムは表示
１２３に示されており、ヒストグラム上の各点は個々の
細胞を表わす。ヒストグラム上のインジケータの集団ま
たは集合は、同様な型の細胞の群を表わす。非常に明ら
かなように、当業者は緑の蛍光の強さに対する狭い前方
角の散乱のヒストグラム、軸方向の光の吸光に対する狭
い角度の散乱のヒストグラムなどをつくることに有用性
を見い出すであろう。
タ１２２は増幅器１１８〜１２１からの信号を利用する
出力ヒストグラムを発生する。たとえば、出力の１つの
有用な形は、センサ１１６からの、緑の蛍光の振幅に対
する、プロツトである。このようなヒストグラムは表示
１２３に示されており、ヒストグラム上の各点は個々の
細胞を表わす。ヒストグラム上のインジケータの集団ま
たは集合は、同様な型の細胞の群を表わす。非常に明ら
かなように、当業者は緑の蛍光の強さに対する狭い前方
角の散乱のヒストグラム、軸方向の光の吸光に対する狭
い角度の散乱のヒストグラムなどをつくることに有用性
を見い出すであろう。
【００２２】図１の装置の既知の応用に従えば、センサ
１１７からの、いわゆる第１蛍光チャンネル１１９は、
主として長い波長の蛍光を測定するために使用される
が、また、広い角度の散乱を検知するために、ある場合
において有用である。このような場合は、本発明の原理
に従い、そしてこの因子を強調するために、普通の赤フ
イルタ・ブロック１１４の代わりに、レンズ１０５から
の入射光の軸に対して直角に散乱するレーザー１０１か
らの青のレーザー光をセンサ１１７に向けるのに適する
フイルタを使用することが好ましい場合である。光電子
増幅倍管１１７および増幅器１１９の設計パラメーター
の適用は、当業者の能力に従い、継続処理のための適当
な特性の信号を生成するために、要求される。
１１７からの、いわゆる第１蛍光チャンネル１１９は、
主として長い波長の蛍光を測定するために使用される
が、また、広い角度の散乱を検知するために、ある場合
において有用である。このような場合は、本発明の原理
に従い、そしてこの因子を強調するために、普通の赤フ
イルタ・ブロック１１４の代わりに、レンズ１０５から
の入射光の軸に対して直角に散乱するレーザー１０１か
らの青のレーザー光をセンサ１１７に向けるのに適する
フイルタを使用することが好ましい場合である。光電子
増幅倍管１１７および増幅器１１９の設計パラメーター
の適用は、当業者の能力に従い、継続処理のための適当
な特性の信号を生成するために、要求される。
【００２３】図２は、本発明の原理に従う好ましい信号
処理面のブロック線図の相を記載するが、その装置は本
発明の次の理論的および方法的面を詳細に考察すると、
多分一層よく理解できるであろう。
処理面のブロック線図の相を記載するが、その装置は本
発明の次の理論的および方法的面を詳細に考察すると、
多分一層よく理解できるであろう。
【００２４】本発明の原理に従う血液試料の適切な調整
は、試料を興味ある亜綱に対する抗体で刺激し且つ試料
を含み、この抗体は入射レーザー光で照明したとき蛍光
を放射するという要求される特性を有する。１つのアプ
ローチにおいて、正常のヒトの提供者からの全血液を抗
凝固処理し（たとえば、ＥＤＴＡで）、遠心分離し、淡
黄膜を単離する。別法として、抗凝固処理した全血液を
利用する。適当な抗体を用いる刺激を達成し、次いで赤
血球を試料から普通の方法で溶解する。次いで、初期の
抗体が適切に蛍光に対して活性であると仮定すると、試
料は希釈し、流れ細胞測定分析に使用できる状態にあ
る。間接的免疫蛍光着色を含む場合、第２刺激を第１抗
体に対する第２抗体を用いて実施し、そしてこの第２抗
体は要求される蛍光特性を有する。
は、試料を興味ある亜綱に対する抗体で刺激し且つ試料
を含み、この抗体は入射レーザー光で照明したとき蛍光
を放射するという要求される特性を有する。１つのアプ
ローチにおいて、正常のヒトの提供者からの全血液を抗
凝固処理し（たとえば、ＥＤＴＡで）、遠心分離し、淡
黄膜を単離する。別法として、抗凝固処理した全血液を
利用する。適当な抗体を用いる刺激を達成し、次いで赤
血球を試料から普通の方法で溶解する。次いで、初期の
抗体が適切に蛍光に対して活性であると仮定すると、試
料は希釈し、流れ細胞測定分析に使用できる状態にあ
る。間接的免疫蛍光着色を含む場合、第２刺激を第１抗
体に対する第２抗体を用いて実施し、そしてこの第２抗
体は要求される蛍光特性を有する。
【００２５】試料が流れチャンネルを通過し、照明され
るとき、吸光、前方光散乱、直角光散乱および蛍光の光
学的パラメーターを同時に検知するが、信号処理の観点
から、種々のパラメーターの意味を相対的優先を基準に
して考慮する。すなわち、前方の狭い角度のパルス（任
意であるが、かならずしも吸光信号を含まない）および
直角散乱パルスの両方は、動作すべき緑の蛍光信号を使
用するためのそれぞれの範囲内に存在しなくてはならな
い。次いで、結合した抗体などからの偽の蛍光計数につ
いて補正した後、緑の蛍光パルスの存在は特異性化亜綱
のリンパ球の存在を示す。このアプローチが働く理由
は、次の通りである。すなわち、前方散乱のための
「窓」は白血球を血小板、部分的に溶解した赤血球、お
よび溶液中の残屑と判別する効果をもち、そして直角に
関する「窓」はリンパ球を単球および顆粒球と判別する
からである。狭い角度の散乱および直角散乱を有する細
胞の検知はそれぞれの案内でパルスし、これによって効
果的にリンパ球の存在の検知に対応する。
るとき、吸光、前方光散乱、直角光散乱および蛍光の光
学的パラメーターを同時に検知するが、信号処理の観点
から、種々のパラメーターの意味を相対的優先を基準に
して考慮する。すなわち、前方の狭い角度のパルス（任
意であるが、かならずしも吸光信号を含まない）および
直角散乱パルスの両方は、動作すべき緑の蛍光信号を使
用するためのそれぞれの範囲内に存在しなくてはならな
い。次いで、結合した抗体などからの偽の蛍光計数につ
いて補正した後、緑の蛍光パルスの存在は特異性化亜綱
のリンパ球の存在を示す。このアプローチが働く理由
は、次の通りである。すなわち、前方散乱のための
「窓」は白血球を血小板、部分的に溶解した赤血球、お
よび溶液中の残屑と判別する効果をもち、そして直角に
関する「窓」はリンパ球を単球および顆粒球と判別する
からである。狭い角度の散乱および直角散乱を有する細
胞の検知はそれぞれの案内でパルスし、これによって効
果的にリンパ球の存在の検知に対応する。
【００２６】リンパ球の所望の亜綱の主インジケーター
は、特定の色の蛍光である。もちろん、試料が偽のイン
ジケーターを含む場合、このようなインジケーターの効
果を計数することが必要であろう。１つのこのようなイ
ンジケーターは溶液中の蛍光分子を含み、これらの蛍光
分子は試料を流れ細胞分析前に洗浄することによって排
除できる。偽のインジケーターの他のクラスは、蛍光抗
体の細胞への非特異性結合によって生ずる。いずれかの
型のインジケーター（または両方）についての１つのア
プローチは、手に１つの対照材料を維持することであ
り、これは偽のまたは実際の蛍光データの効果のモデル
である。他のアプローチはこのような対照の応答に相当
する計器のデータを維持することである。明らかなよう
に、真の読みは実際の検知された試料の信号を対照フア
クターの導入により、典型的には対照の応答を実際のゲ
ートした（ｇａｔｅｄ）蛍光信号と組み合わせること
［たとえば、引き算またはデイコンボリューション（ｄ
ｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）］により得ることができ
る。同様な方法で、対照試料または対照データを使用し
て、当業者によって検知できる種々の条件について補正
できる。
は、特定の色の蛍光である。もちろん、試料が偽のイン
ジケーターを含む場合、このようなインジケーターの効
果を計数することが必要であろう。１つのこのようなイ
ンジケーターは溶液中の蛍光分子を含み、これらの蛍光
分子は試料を流れ細胞分析前に洗浄することによって排
除できる。偽のインジケーターの他のクラスは、蛍光抗
体の細胞への非特異性結合によって生ずる。いずれかの
型のインジケーター（または両方）についての１つのア
プローチは、手に１つの対照材料を維持することであ
り、これは偽のまたは実際の蛍光データの効果のモデル
である。他のアプローチはこのような対照の応答に相当
する計器のデータを維持することである。明らかなよう
に、真の読みは実際の検知された試料の信号を対照フア
クターの導入により、典型的には対照の応答を実際のゲ
ートした（ｇａｔｅｄ）蛍光信号と組み合わせること
［たとえば、引き算またはデイコンボリューション（ｄ
ｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）］により得ることができ
る。同様な方法で、対照試料または対照データを使用し
て、当業者によって検知できる種々の条件について補正
できる。
【００２７】図２を参照すると、本発明の原理を用いる
機能的ブロック線図が示されている。図２において、前
方散乱の参照「窓」は２０１で示し、そして直角散乱参
照「窓」は２０４で示されている。これらの参照値は、
同定されたまたは調整可能な電位計により、簡単に、或
いは種々の環境因子、試料採取した血液中に含まれる処
理の型または量と関連する変数などを考慮する記憶され
たプログラム制御のような複雑かつ難解なアプローチに
より、維持できる。いずれの場合においても、２０１お
よび２０４における「窓」は、それぞれ、対応する前方
散乱または直角散乱のパルスが可能な白血球を定めると
ころの振幅の範囲を定める。前方散乱パルス信号２０
２、たとえば、狭い角度の光センサ１０９および１１０
から図１の増幅器１２０において生成するようなもの、
はコンパレータ２０３に接続される。コンパレータ２０
３は、２０２における関連するパルスが２０１に定める
窓内に落下するとき、アンド・ゲート２０７へ動作信号
を与える。同様に、２０５における直角散乱のパルス信
号はなお他のコンパレータ２０６に結合され、その他方
の入力へは２０４からの直角散乱のための参照「窓」か
ら供給を受ける。再び、２０５における直角の散乱パル
スが直角散乱窓内にあるとき、作動信号はコンパレータ
２０６からアンド・ゲート２０７へ運ばれる。それゆ
え、前方散乱参照窓内に前方散乱パルス、そして直角散
乱窓内に直角パルスが同時に生ずると、アンド・ゲート
２０７は２０８における測定を動作し、緑の蛍光チャン
ネル２０９からの緑の蛍光パルス（たとえば、図１の装
置の増幅器１１８から）の発生を確認する。
機能的ブロック線図が示されている。図２において、前
方散乱の参照「窓」は２０１で示し、そして直角散乱参
照「窓」は２０４で示されている。これらの参照値は、
同定されたまたは調整可能な電位計により、簡単に、或
いは種々の環境因子、試料採取した血液中に含まれる処
理の型または量と関連する変数などを考慮する記憶され
たプログラム制御のような複雑かつ難解なアプローチに
より、維持できる。いずれの場合においても、２０１お
よび２０４における「窓」は、それぞれ、対応する前方
散乱または直角散乱のパルスが可能な白血球を定めると
ころの振幅の範囲を定める。前方散乱パルス信号２０
２、たとえば、狭い角度の光センサ１０９および１１０
から図１の増幅器１２０において生成するようなもの、
はコンパレータ２０３に接続される。コンパレータ２０
３は、２０２における関連するパルスが２０１に定める
窓内に落下するとき、アンド・ゲート２０７へ動作信号
を与える。同様に、２０５における直角散乱のパルス信
号はなお他のコンパレータ２０６に結合され、その他方
の入力へは２０４からの直角散乱のための参照「窓」か
ら供給を受ける。再び、２０５における直角の散乱パル
スが直角散乱窓内にあるとき、作動信号はコンパレータ
２０６からアンド・ゲート２０７へ運ばれる。それゆ
え、前方散乱参照窓内に前方散乱パルス、そして直角散
乱窓内に直角パルスが同時に生ずると、アンド・ゲート
２０７は２０８における測定を動作し、緑の蛍光チャン
ネル２０９からの緑の蛍光パルス（たとえば、図１の装
置の増幅器１１８から）の発生を確認する。
【００２８】次に、パルス高さ分析器２１１が示されて
おり、この分析器は緑の蛍光チャンネルからのデータを
色々に補正し、そして適当な表示および出力のデータを
生成する。前述のように、補正は偽であるが予測された
蛍光信号による強度のある量を引き算するように簡単で
あることができ、或いは対照試料の先の分析または引き
続く分析によるデータの生成のように複雑であることが
できる。一般に、２１１におけるパルスの高さの分析
は、当業者により容易に可能であるように、普通のアプ
ローチに従い適当な増幅、フイルタ、および信号の処理
を構成する。２１２における出力データの表示は、同様
に当業者の能力の範囲内である適当なヒストグラムなど
の作製を含む。
おり、この分析器は緑の蛍光チャンネルからのデータを
色々に補正し、そして適当な表示および出力のデータを
生成する。前述のように、補正は偽であるが予測された
蛍光信号による強度のある量を引き算するように簡単で
あることができ、或いは対照試料の先の分析または引き
続く分析によるデータの生成のように複雑であることが
できる。一般に、２１１におけるパルスの高さの分析
は、当業者により容易に可能であるように、普通のアプ
ローチに従い適当な増幅、フイルタ、および信号の処理
を構成する。２１２における出力データの表示は、同様
に当業者の能力の範囲内である適当なヒストグラムなど
の作製を含む。
【００２９】ここで使用するように、「蛍光応答性抗
体」は、それら自体蛍光を発生する抗体、あるいは特異
性化刺激のもとに蛍光に対して標識付けされる抗体を意
味する。
体」は、それら自体蛍光を発生する抗体、あるいは特異
性化刺激のもとに蛍光に対して標識付けされる抗体を意
味する。
【００３０】図２の略図は、本発明の原理の機能的面を
単に表わし、そして当業者の能力の範囲の多数の変法を
包含することを理解すべきである。同様に、ここに記載
する方法および装置は、本発明の原理の好ましい且つ例
示的態様を構成するが、多数の変法は本発明の精神また
は範囲を逸脱することなく当業者に容易に考えられうる
ことを理解すべきである。
単に表わし、そして当業者の能力の範囲の多数の変法を
包含することを理解すべきである。同様に、ここに記載
する方法および装置は、本発明の原理の好ましい且つ例
示的態様を構成するが、多数の変法は本発明の精神また
は範囲を逸脱することなく当業者に容易に考えられうる
ことを理解すべきである。
【００３１】
材料および方法： Ａ．細胞の調製 正常人の提供者からの全血液をＥＤＴＡで抗凝固処理し
た。淡黄膜層を取り出し、そして淡黄膜層中の白血球の
濃度を測定した。リンパ球の百分率を、下に説明するよ
うに、変形したサイトフルオログラフ（Ｃｙｔｏｆｌｕ
ｏｒｏｇｒａｐｈ）（Ｏｒｔｈｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎ
ｔｓ， Ｗｅｓｔｗｏｏｄ， ＭＡ）で推定した。リン
パ球濃度が１０，０００／ｍｍ3より大である場合、淡
黄膜層をリン酸塩緩衝溶液（すなわち、“ＰＢＳ”）
（Ｄｕｌｂｅｃｏ）で希釈して１０，０００リンパ球／
ｍｍ3の濃度にした。
た。淡黄膜層を取り出し、そして淡黄膜層中の白血球の
濃度を測定した。リンパ球の百分率を、下に説明するよ
うに、変形したサイトフルオログラフ（Ｃｙｔｏｆｌｕ
ｏｒｏｇｒａｐｈ）（Ｏｒｔｈｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎ
ｔｓ， Ｗｅｓｔｗｏｏｄ， ＭＡ）で推定した。リン
パ球濃度が１０，０００／ｍｍ3より大である場合、淡
黄膜層をリン酸塩緩衝溶液（すなわち、“ＰＢＳ”）
（Ｄｕｌｂｅｃｏ）で希釈して１０，０００リンパ球／
ｍｍ3の濃度にした。
【００３２】Ｂ．間接的免疫蛍光着色 １００μｌの淡黄膜層を１００μｌの適当に希釈した単
球抗体（マウス−抗リンパ球亜綱）と共に４０℃におい
て３０分間インキュベートした。このインキュベーショ
ンの終りにおいて、細胞を２〜４ｍｌの緩衝した等張塩
化アンモニウム（ＮＨ4Ｃｌ、１６．５８ｇ／ｌ、ＥＤ
ＴＡ二ナトリウム０．０７４ｇ／ｌ、重炭酸カリウム、
２．００ｇ／ｌ、ｐＨ＝７．３）で処理した。５分後、
赤血球は溶解してしまい、そしてこの懸濁液を２００×
Ｇで５分間遠心分離した。上層を取り出し、白血球と残
留する血小板および幻影赤血球を含有するペレットをＰ
ＢＳ中で１回洗った。このペレットをおだやかに分散
し、４℃において３０分間１００μｌの蛍光処理したヤ
ギ−抗−マウス７Ｓ（Ｍｅｌｏｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ， Ｓｐｉｎｇｆｉｅｌｄ， ＶＡ）、Ｐ／Ｐ＝
２.５、の４０：１希釈液でインキュベートした。この
インキュベーションの後、必要に応じてＰＢＳでさらに
洗った後、細胞を１ｍｌの最終体積に希釈し、これによ
りこれは流れ血球計の分析に使用できる状態となった。
球抗体（マウス−抗リンパ球亜綱）と共に４０℃におい
て３０分間インキュベートした。このインキュベーショ
ンの終りにおいて、細胞を２〜４ｍｌの緩衝した等張塩
化アンモニウム（ＮＨ4Ｃｌ、１６．５８ｇ／ｌ、ＥＤ
ＴＡ二ナトリウム０．０７４ｇ／ｌ、重炭酸カリウム、
２．００ｇ／ｌ、ｐＨ＝７．３）で処理した。５分後、
赤血球は溶解してしまい、そしてこの懸濁液を２００×
Ｇで５分間遠心分離した。上層を取り出し、白血球と残
留する血小板および幻影赤血球を含有するペレットをＰ
ＢＳ中で１回洗った。このペレットをおだやかに分散
し、４℃において３０分間１００μｌの蛍光処理したヤ
ギ−抗−マウス７Ｓ（Ｍｅｌｏｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ， Ｓｐｉｎｇｆｉｅｌｄ， ＶＡ）、Ｐ／Ｐ＝
２.５、の４０：１希釈液でインキュベートした。この
インキュベーションの後、必要に応じてＰＢＳでさらに
洗った後、細胞を１ｍｌの最終体積に希釈し、これによ
りこれは流れ血球計の分析に使用できる状態となった。
【００３３】Ｃ．流れ細胞分析 サイトフルオログラフ（Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｇｒａｐ
ｈ）ＦＣ２００／４８００Ａ（Ｏｒｔｈｏ Ｉｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔｓ， Ｗｅｓｔｗｏｏｄ， ＭＡ）を使用し
て、試料中の各細胞の前方および直角の光散乱および緑
の蛍光を同時に測定した。この計器を変形して、赤の蛍
光を検出するのに通常使用される光電子増倍管中への入
射ビームに対して直角で散乱する青のレーザー光を検出
するのに適当なフイルターを、「赤」フイルタ・ブロッ
クの代りに、使用した。緑のフイルタ・ブロックはＦＩ
ＴＣフイルタを含有した。通常存在する前方散乱の信号
と一緒に直角散乱信号を、４８００Ａ分析器上にサイト
グラムとして表示した。この器具に対照を用いることに
より、前方および直角の光散乱の特定の組み合わせを有
する細胞についてゲート・パルスを生成させた。４８０
０Ａへ付加した別のモジュールにより緑の蛍光を電気的
に積分し、そして積分した蛍光パルスをパルス高さ分析
器（２１０２型、Ｏｒｔｈｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
ｓ， Ｗｅｓｔｗｏｏｄ， ＭＡ）に記録した。４８０
０Ａからのゲート・パルスを用いることにより、特定の
光散乱特性を有する細胞のみからの蛍光を記録すること
ができた。
ｈ）ＦＣ２００／４８００Ａ（Ｏｒｔｈｏ Ｉｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔｓ， Ｗｅｓｔｗｏｏｄ， ＭＡ）を使用し
て、試料中の各細胞の前方および直角の光散乱および緑
の蛍光を同時に測定した。この計器を変形して、赤の蛍
光を検出するのに通常使用される光電子増倍管中への入
射ビームに対して直角で散乱する青のレーザー光を検出
するのに適当なフイルターを、「赤」フイルタ・ブロッ
クの代りに、使用した。緑のフイルタ・ブロックはＦＩ
ＴＣフイルタを含有した。通常存在する前方散乱の信号
と一緒に直角散乱信号を、４８００Ａ分析器上にサイト
グラムとして表示した。この器具に対照を用いることに
より、前方および直角の光散乱の特定の組み合わせを有
する細胞についてゲート・パルスを生成させた。４８０
０Ａへ付加した別のモジュールにより緑の蛍光を電気的
に積分し、そして積分した蛍光パルスをパルス高さ分析
器（２１０２型、Ｏｒｔｈｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
ｓ， Ｗｅｓｔｗｏｏｄ， ＭＡ）に記録した。４８０
０Ａからのゲート・パルスを用いることにより、特定の
光散乱特性を有する細胞のみからの蛍光を記録すること
ができた。
【００３４】Ｄ．結果 白血球の同定法を、図３および図４に図解する。ここに
使用するように、「サイトグラム（ｃｙｔｏｇｒａ
ｍ）」はデータの表示であり、ここで各点は単一の細胞
を表わし、そして点の位置は座標で与えられ、これらの
座標は選択したパラメーター、たとえばサイトグラム中
の細胞により生ずる直角および前方の光散乱の強さに比
例する。図３中の試料は、塩化アンモニウム溶解試薬で
希釈した全血液であった。点すなわち細胞の４つの集団
を区別できる。集団１は血小板と幻影赤血球の群集また
は多重線による。集団２〜４はそれぞれリンパ球、単球
および顆粒球による。白血球の集団の同定は、各集団中
の相対的計数値と手による微分白血球計数値との比較に
基づく。同様な集団を赤（ＨｅＮｅ）のレーザーを用い
て原型細胞分類器で観測した。対応する集団中の細胞の
分類、細胞のアクリジンオレンジを用いる細胞の着色及
び蛍光顕微鏡による細胞の観察は、集団が正しく同定さ
れたことをさらに証明した。図４は、全血の密度こう配
分離によって調製した「単核細胞」の試料のサイトグラ
ムである。血小板の集合、リンパ球および単球の集団は
図３のそれらに類似するが、顆粒球の集団は、期待され
るように存在しない。図３および図４から明らかなよう
に、リンパ球は顆粒球と容易に区別される。それらは集
団２および３においてリンパ球と単球との少量の重複が
存在しうるが、現在の目的に対して、集団２がリンパ球
のみを含み、そして集団３が単球だけを含有すると十分
にみなされた。
使用するように、「サイトグラム（ｃｙｔｏｇｒａ
ｍ）」はデータの表示であり、ここで各点は単一の細胞
を表わし、そして点の位置は座標で与えられ、これらの
座標は選択したパラメーター、たとえばサイトグラム中
の細胞により生ずる直角および前方の光散乱の強さに比
例する。図３中の試料は、塩化アンモニウム溶解試薬で
希釈した全血液であった。点すなわち細胞の４つの集団
を区別できる。集団１は血小板と幻影赤血球の群集また
は多重線による。集団２〜４はそれぞれリンパ球、単球
および顆粒球による。白血球の集団の同定は、各集団中
の相対的計数値と手による微分白血球計数値との比較に
基づく。同様な集団を赤（ＨｅＮｅ）のレーザーを用い
て原型細胞分類器で観測した。対応する集団中の細胞の
分類、細胞のアクリジンオレンジを用いる細胞の着色及
び蛍光顕微鏡による細胞の観察は、集団が正しく同定さ
れたことをさらに証明した。図４は、全血の密度こう配
分離によって調製した「単核細胞」の試料のサイトグラ
ムである。血小板の集合、リンパ球および単球の集団は
図３のそれらに類似するが、顆粒球の集団は、期待され
るように存在しない。図３および図４から明らかなよう
に、リンパ球は顆粒球と容易に区別される。それらは集
団２および３においてリンパ球と単球との少量の重複が
存在しうるが、現在の目的に対して、集団２がリンパ球
のみを含み、そして集団３が単球だけを含有すると十分
にみなされた。
【００３５】前方光散乱は、図３及び図４から、リンパ
球を血小板および幻影赤血球と判別するのに主として有
用であることがわかる。計器の限界値を、典型的にはこ
れらのより小さい細胞を排除するようにセットして、白
血球だけが計数されるようにした。これをなしたとき、
直角の光散乱パラメーター単独は白血球の型をきわめて
良好に判別する。図５中のヒストグラム“Ａ”および
“Ｂ”は、それぞれ図３および図４中に示すサイトグラ
ムに相当する。ピーク１〜３は、それぞれリンパ球、単
球および顆粒球に相当する。
球を血小板および幻影赤血球と判別するのに主として有
用であることがわかる。計器の限界値を、典型的にはこ
れらのより小さい細胞を排除するようにセットして、白
血球だけが計数されるようにした。これをなしたとき、
直角の光散乱パラメーター単独は白血球の型をきわめて
良好に判別する。図５中のヒストグラム“Ａ”および
“Ｂ”は、それぞれ図３および図４中に示すサイトグラ
ムに相当する。ピーク１〜３は、それぞれリンパ球、単
球および顆粒球に相当する。
【００３６】免疫蛍光着色法は淡黄膜層に応用すると、
最終の細胞の調製は図３に示すものと本質的に同一の光
散乱集団を生成する。リンパ球、単球および顆粒球は直
角光散乱に基づいて区別されうるので、緑の蛍光対直角
散乱のサイトグラムはこれらの白血球の型のいずれが着
色されるかを示すであろう。図６および図７は、対照、
図６、または抗Ｔ細胞、図７、抗体で培養した血液試料
についてのこのようなサイトグラムを示す。対照は非抗
体生成クローンからの上層であり、一方抗Ｔ細胞抗体は
モノクローン性抗体であった。対照の場合において、顆
粒球だけが有意の蛍光を示した。
最終の細胞の調製は図３に示すものと本質的に同一の光
散乱集団を生成する。リンパ球、単球および顆粒球は直
角光散乱に基づいて区別されうるので、緑の蛍光対直角
散乱のサイトグラムはこれらの白血球の型のいずれが着
色されるかを示すであろう。図６および図７は、対照、
図６、または抗Ｔ細胞、図７、抗体で培養した血液試料
についてのこのようなサイトグラムを示す。対照は非抗
体生成クローンからの上層であり、一方抗Ｔ細胞抗体は
モノクローン性抗体であった。対照の場合において、顆
粒球だけが有意の蛍光を示した。
【００３７】しかしながら、抗Ｔ抗体を用いて着色した
血液は、比較的強い蛍光をもつ明確なリンパ球の集団を
示した。この「Ｔ」集団は７７％のリンパ球（光散乱で
定められるような）を含有し、明らかなようにＴ−リン
パ球のみを含有する。
血液は、比較的強い蛍光をもつ明確なリンパ球の集団を
示した。この「Ｔ」集団は７７％のリンパ球（光散乱で
定められるような）を含有し、明らかなようにＴ−リン
パ球のみを含有する。
【００３８】図８は、リンパ球の集団（図３の集団）か
らの青色蛍光のヒストグラムを示す。図８のヒストグラ
ムＡは対照抗体を有する試料についてのものであり、一
方図８のヒストグラムＢは抗Ｔ抗体を有する試料につい
てのものである。Ｔ細胞は図８のヒストグラムＢにおい
て明確なピークを生成する。Ｔ細胞は非常に明確なピー
クを形成する。すべての白血球からの緑の蛍光のヒスト
グラムは、Ｔリンパ球のピークと部分的に重なる顆粒球
によるピークを有する。
らの青色蛍光のヒストグラムを示す。図８のヒストグラ
ムＡは対照抗体を有する試料についてのものであり、一
方図８のヒストグラムＢは抗Ｔ抗体を有する試料につい
てのものである。Ｔ細胞は図８のヒストグラムＢにおい
て明確なピークを生成する。Ｔ細胞は非常に明確なピー
クを形成する。すべての白血球からの緑の蛍光のヒスト
グラムは、Ｔリンパ球のピークと部分的に重なる顆粒球
によるピークを有する。
【００３９】数人のヒトの提供者からの血液を用いる、
いくつかの異なるリンパ球−亜綱特異性抗体を使用した
実験は、上に報告したものに類似する性質の結果を与え
た。抗Ｔ細胞がリンパ球の集団中に７０〜８０％の細胞
を典型的には有したと特徴づけられた抗体を用いて試験
した血液は、有意な蛍光を生成する。抗Ｂ細胞がリンパ
球集団中に２０％の細胞を典型的には有したと特徴づけ
られた抗体を用いて試験した血液は、有意な蛍光を生成
する。これらの結果は、Ｔ細胞およびＢ細胞の百分率の
正常の範囲にある。
いくつかの異なるリンパ球−亜綱特異性抗体を使用した
実験は、上に報告したものに類似する性質の結果を与え
た。抗Ｔ細胞がリンパ球の集団中に７０〜８０％の細胞
を典型的には有したと特徴づけられた抗体を用いて試験
した血液は、有意な蛍光を生成する。抗Ｂ細胞がリンパ
球集団中に２０％の細胞を典型的には有したと特徴づけ
られた抗体を用いて試験した血液は、有意な蛍光を生成
する。これらの結果は、Ｔ細胞およびＢ細胞の百分率の
正常の範囲にある。
【図１】図１は、商業的に入手できる流れ蛍光装置の様
式化した相を示す。
式化した相を示す。
【図２】図２は、信号処理装置の略線図であり、この装
置により図１に示した型の装置を、本発明の原理と組み
合わせて、リンパ球の特異性亜綱を同定および計数でき
る。
置により図１に示した型の装置を、本発明の原理と組み
合わせて、リンパ球の特異性亜綱を同定および計数でき
る。
【図３】図３は、本発明の原理の応用を図解するヒスト
グラムを示す。
グラムを示す。
【図４】図４は、本発明の原理の応用を図解するヒスト
グラムを示す。
グラムを示す。
【図５】図５は、本発明の原理の応用を図解するヒスト
グラムを示す。
グラムを示す。
【図６】図６は、本発明の原理の応用を図解するヒスト
グラムを示す。
グラムを示す。
【図７】図７は、本発明の原理の応用を図解するヒスト
グラムを示す。
グラムを示す。
【図８】図８は、本発明の原理の応用を図解するヒスト
グラムを示す。
グラムを示す。
１０１ アルゴン・イオンのレーザー １０２ Ｈｅ−Ｎｅレーザー １０３ 鏡 １０４ 二色鏡 １０５ レンズ １０６ 流れチャンネル １０７ 集光レンズ １０８ 吸光センサ １０９ 光センサ １１０ 光センサ １１１ 開口 １１２ 二色鏡 １１３ 鏡、第２の鏡 １１４ フイルタ、第１の色フイルタ、赤フイルタ・ブ
ロック １１５ フイルタ、第２のフイルタ １１６ 第２の光センサ １１７ 光センサ、光電子増倍管 １１８ 増幅器 １１９ 増幅器、第１の蛍光チャンネル １２０ 増幅器 １２１ 増幅器 １２２ センサ・セレクタ １２３ 表示 １２５ 球面鏡 ２０１ 前方散乱参照「窓」 ２０２ 前方散乱パルス信号 ２０３ コンパレータ ２０４ 直角散乱参照「窓」 ２０５ 直角散乱パルス ２０６ コンパレータ ２０７ アンド・ゲート ２０８ 緑の蛍光パルス ２０９ 緑の蛍光チャンネル ２１０ 緑の蛍光補正（制御または記憶データ） ２１１ パルス高さ分析器 ２１２ 出力データの表示
ロック １１５ フイルタ、第２のフイルタ １１６ 第２の光センサ １１７ 光センサ、光電子増倍管 １１８ 増幅器 １１９ 増幅器、第１の蛍光チャンネル １２０ 増幅器 １２１ 増幅器 １２２ センサ・セレクタ １２３ 表示 １２５ 球面鏡 ２０１ 前方散乱参照「窓」 ２０２ 前方散乱パルス信号 ２０３ コンパレータ ２０４ 直角散乱参照「窓」 ２０５ 直角散乱パルス ２０６ コンパレータ ２０７ アンド・ゲート ２０８ 緑の蛍光パルス ２０９ 緑の蛍光チャンネル ２１０ 緑の蛍光補正（制御または記憶データ） ２１１ パルス高さ分析器 ２１２ 出力データの表示
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロバート・エイ・ホフマン アメリカ合衆国マサチユセツツ州02048・ マンスフイールド・バルコムストリート 130
Claims (5)
- 【請求項１】 特異性化Ｔリンパ球の表面上の選択した
抗原決定基に対する蛍光応答性抗体と共にインキュベー
トした試料中の特異性化Ｔリンパ球の同定および計数装
置であって、 ａ）該インキュベートした試料の細胞を、急速に且つ一
度に実質的に一つずつ、一定の領域を通過させるための
流れ血球計算流れセル； ｂ）該抗体中の蛍光を刺激する光源； ｃ）光を該光源から細胞流れに該一定領域において結合
および集束するための手段； ｄ）該結合手段からおよび該領域を通過する細胞が該領
域から分散した前方光散乱を検知する第１の光感知手
段； ｅ）細胞流れの軸に実質的に直角の軸上で該細胞が散乱
した光を検知する第２の光感知手段； ｆ）蛍光パルスを感知する第３の光感知手段； ｇ）前方光散乱および直角光散乱のためにそれぞれの参
照範囲を提供するための手段； ｈ）該第１および第２の光感知手段が検知した光パルス
を、提供手段からの参照範囲と比較するための手段； ｉ）該提供手段に応答し、該検知された光のパルスが関
連する参照範囲内で生ずるとき、該第３の光感知手段を
選択的に動作させるための手段；および ｊ）蛍光パルスを、該領域における該特異性化Ｔ細胞の
存在の指示として表示するための手段、からなることを
特徴とする装置。 - 【請求項２】 該選択的に動作させるための手段に応答
し、予備選択した為の蛍光効果を考慮するため該第３の
光感知手段が検知した信号を補正するための手段をさら
に含み、該表示手段が順番に該補正手段に応答性である
特許請求の範囲第１項記載の装置。 - 【請求項３】 該結合および収束手段が該光源からの光
を該一定領域において細胞流れに対して実質的に直角に
放出するように配置されている特許請求の範囲第１項記
載の装置。 - 【請求項４】 該光源がアルゴンイオンのレーザーから
なり、そして該第３の光感知手段が緑の蛍光パルスを感
知するための手段からなる特許請求の範囲第１項記載の
装置。 - 【請求項５】 該第３の光感知手段が該直角軸に沿って
該緑の光パルスを感知することができる特許請求の範囲
第４項記載の装置。
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