DK155605B

DK155605B - Dipeptidsoedemiddelsalt samt oploesning, materiale og drikkevareblanding indeholdende saltet

Info

Publication number: DK155605B
Application number: DK246483A
Authority: DK
Inventors: Josep Heng-Ko Tsau; James George Young
Original assignee: Searle & Co
Priority date: 1982-06-01
Filing date: 1983-05-31
Publication date: 1989-04-24
Also published as: NO831940L; FI831971A0; FI77671C; AU1521983A; GR79205B; NO160523B; US4439460A; DK246483D0; ATE18973T1; ES522857A0; IE831292L; PT76784B; DE3362893D1; AU554052B2; ES8407013A1; NO160523C; FI831971L; ZA833954B; DK155605C; NZ204424A

Description

DK 155605 B

Den foreliggende opfindelse angår et hidtil ukendt dipeptidsødemiddelsalt, der har lavt kalorieindhold og ikke har nogen ubehagelig eftersmag, og som endvidere har høj termisk stabilitet og hurtigt opløses i vandige medier.

5 Opfindelsen angår desuden en opløsning, et til fremstilling af sukkervarer og slik egnet materiale og en drikkevareblanding indeholdende saltet.

Kendte dipeptidsødemidler er aspartyl-substituerede alaninforbindelser, der har en sødeevne, der er mange gange 10 kraftigere end saccharoses. De blev opdaget i 1960’erne og er blevet udviklet som sukkererstatninger med lavt kalorieindhold. De har ikke kunstige sødemidlers bitre eftersmag, og eftersom de er sammensat af naturlige aminosyrer, assimileres de naturligt.

15 Farmakologisk acceptable syresalte af dipeptidsøde- midlerne er blevet beskrevet som værende i besiddelse af samme sødevirkning som de frie base-sødemidler. Desuden opløses de hurtigt i vandige medier, jfr. USA patentskrifterne nr. 4.029.701 og 3.714.139. Kendte dipeptidsalte om-20 fatter hydrohalogenidsaltet, hydrogensulfatsaltet og dihydro-genphosphatsaltet som beskrevet i USA patentskrifterne nr. 4.031.258 og 4.029.701.

Til trods for det tiltrækkende ved anvendelsen af dipeptidsødemidlerne og deres syresalte som sødemidler fore-25 kommer der visse vanskeligheder. De frie base- og kendte s al tf ormer af sødemidlerne udviser i reglen ringe termisk stabilitet. Når de derfor anvendes i fødemidler, der kræver varm tilberedning, eller når de blandes med fødevarebe-standdele og gennemgår en opvarmningsproces, såsom pasteuri-30 sation, har de en tendens til at blive varmenedbrudt. Desuden påvirker deres lave varmestabilitet lagerholdbarheden på negativ måde. Som følge heraf er de frie base-former og kendte saltformer af sødemidler ikke særlig anvendelige til brug i fødevarer med mange anvendelsesformål, og de kan 35 ikke universelt anvendes i stedet for sukker.

Det er således opfindelsens formål at udvikle et

DK 155605B

2 dipeptidsødemiddelsalt, der kan anvendes til næsten alle former for sødning, har høj varmestabilitet, lang lager-holdbarhed og en høj grad af opløselighed i vandige medier, specielt et aspartyl-dipeptid-sødemiddelsalt, der har disse 5 egenskaber.

Dette formål opnås med dipeptidsødemiddelsaltet ifølge opfindelsen, der er ejendommeligt ved, at det har den almene formel

10 [APS.H]2S04 eller [APS.H]S03R

hvor R er C^_3~alkyl, og APS har formlen I^NCHCONHCHCC^R1 ho2cch2 R2 15 hvor R^ er C- c-alkyl, og 2 -L”0 R er phenyl, phenylalkyl, phenylalkenyl eller cyclohexyl-alkenyl, hvor alkenylgruppen har 2-5 carbonatomer, og alkyl-gruppen har 1-5 carbonatomer.

20 Disse salte udviser høj varmestabilitet ved anvendelse i bagte produkter, buddinger, sukkervarer, gelé og varme drikke, opløses hurtigt i mad, der skal sødes, og har lang lagerholdbarhed.

Især foretrækkes ifølge opfindelsen sødemiddelsalte, 1 12 25 hvor R er methyl, eller hvor R er methyl, og R er benzyl, specielt et sødemiddelsalt med formlen H^CHCONHCHCC^R1 * H SC>4 H0«CCHo CHtC^-Hc 0 2 2 2 6 5 2 30 L - i i hvilken R er methyl.

Sødemiddelsaltet ifølge opfindelsen kan anvendes i fødevarer, nydelsesmidler og farmaceutiske præparater. Ved fødevarer forstås en blanding, opslæmning, dej, emulsion 35 eller pasta af tørre, fedtholdige, olieholdige eller fugtige fødevarebestanddele, der kan kombineres med sødemiddelsaltet.

DK 155605B

3

Foretrukne former for fødevarebestanddele består af en bagede j, en dressingemulsion og en sukkervareopslæmning. Desuden omfatter fødevarerne en hovedsagelig tør fødevareblanding til fremstilling af ikke-alkoholiske drikke, der kan kom-5 bineres med sødemiddelsaltet. En sådan form for drikkevareblanding kan være en sammenpresset tablet.

Opløsningen ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav 5’s kendetegnende del anførte. Materialet ifølge opfindelsen, der er egnet til fremstilling af sukkervarer 10 og slik, er ejendommeligt ved det i krav 6's kendetegnende del angivne. Drikkevareblandingen ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav 7’s kendetegnende del angivne.

Ved farmaceutiske præparater skal forstås f.eks. tabletter, væsker, eliksirer og sirupper, der skal sødes.

15 Sødemidlet vil maskere den ubehagelige smag, der er typisk for sådanne lægemidler som penicillin og tetracyclin.

De her omhandlede dipeptidsødemiddelsalte i form af sulfater eller organosulfonatsalte kan fremstilles ved at dispergere den fri base af dipeptidsødemidlet i en lille 20 smule af et varmt polært medium såsom vand, der indeholder den saltdannende syre, hvorefter der tilsættes et varmt, mindre polært, dermed blandbart opløsningsmiddel til fældning af saltet. Desuden kan denne fremgangsmåde anvendes til at fremstille næsten alle dipeptidsødemiddel-syre- og -basesalte 25 såsom hydrochloridsaltet og natriumbisulfatsaltet. Fremgangsmåden vil som udbytte give store mængder af saltene i meget ren tilstand i forhold til de udbytter og renheder, der opnås ved hjælp af andre fremgangsmåder.

Dipeptid-sødemiddel-sulfat- og organosulfonatsaltene 30 ifølge opfindelsen udviser betydelig termisk stabilitet og opløses hurtigt i vandige medier. Desuden forlænger de faktorer, der medvirker til forøget varmestabilitet, også saltenes lagerholdbarhed.

Den lave varmestabilitet, der gør sig gældende hos 35 de kendte dipeptid-sødemiddel-salte, såsom hydrochloridet og bisulfatet, hænger sammen med den lave varmestabilitet, som

DK 155605B

4 de frie baseformer af dipeptidsødemidlerne udviser. Heraf følger, at syredipeptid-sødemiddelsalte almindeligvis ikke vil kunne forventes at have en væsentlig højere varmestabilitet.

5 Det er derfor overraskende, at dipeptidsødemiddel- -sulfat- og -sulfonatsaltene ifølge opfindelsen, der er syresalte, udviser varmestabilitet, der tillader en effektiv anvendelse i minimale sødemiddelniveaumængder og under varme tilberednings-, opvarmnings- eller bagebetingelser. Desuden 10 er det overraskende at konstatere, at saltene ifølge opfindelsen har en meget hurtig opløsningshastighed i kolde vandige medier. Følgelig kan saltene ifølge opfindelsen næsten overalt anvendes i stedet for sukker. De kan anvendes i såvel varm som kold mad og til drikkevarer, hvorimod de 15 frie base-former og kendte saltformer af dipeptidsødemidler ikke har disse egenskaber.

Ved fremstilling af saltene ifølge opfindelsen blandes et dipeptidsødemiddel med en lille smule stærkt polært opløsningsmiddel, der indeholder den passende syre til saltdan-20 nelse, så at vægtforholdet mellem sødemiddel og polært opløsningsmiddel er fra ca. 30 til 50%. Mængden af syre, dvs. svovlsyre eller sulfonsyre (RSO^H), der typisk anvendes, vil ligge på ca. 1 ækvivalent, dvs. hhv. mængder på | og 1 mol. Under dette trin kan blandingen forblive ved omgivel-25 sernes temperatur eller kan varmes forsigtigt op til en temperatur på ca. 40-60°C, fortrinsvis 50°C. Hvis blandingen opvarmes, vil saltdannelse have en tendens til at forløbe ud fra en homogen opløsning (medens blandingen ved lavere temperaturer forbliver uklar og heterogen). Almindeligvis 30 er der dynamisk ligevægt mellem fast stof ogopløste former for sødemidlet, hvilket vil forårsage dannelse af saltet, selv om blandingen er heterogen. Det er typisk, at der ved opvarmning vil fås en klar opløsning.

Efter omrøring og eventuelt opvarmning af den vandige 35 blanding i ca. 2-60 minutter, fortrinsvis 5-10 minutter, sættes der til blandingen et moderat polært organisk opløsningsmiddel, der er blandbart med det stærkt polære opløs-

DK 155605 B

5 ningsmiddel, og som er opvarmet til en tilsvarende temperatur. Den mængde moderat polært opløsningsmiddel, der skal anvendes, bør være tilnærmelsesvis 5-15 gange mængden af det tilstedeværende stærkt polære opløsningsmiddel, fortrins-5 vis ca. 10 gange denne mængde. Omdannelsen af mediet fra et stærkt polært til et moderat polært system bevirker opløsning af alt fri base-sødemiddel og urenheder, såsom dipeptidsyre og diketopiperaziner, der kan være til stede, samt udfældning af saltet. Der kan også anvendes køling for at fælde yder-10 ligere salt fra mediet.

Anvendelige stærkt polære opløsningsmidler omfatter vand, dimethylsulfoxid, dialkylformamid med 1 eller 2 car-bonatomer i hver alkylgruppe og alkylalkoholer med 1-4 car-bonatomer. Det moderat polære opløsningsmiddel, der anvendes, 15 skal vælges således, at dets polaritet er mindre end det særlige stærkt polære opløsningsmiddels, som anvendes. Anvendelige moderat polære opløsningsmidler omfatter alkylalkoholer med 1-4 carbonatomer, dialkylketoner med 3-6 carbon-atomer, aliphatiske estere med 3-6 carbonatomer, chlorerede 20 carbonhydrider med 1-3 carbonatomer, carbonhydrider med 5-8 carbonatomer og andre lignende organiske væsker. Foretrukne stærkt polære opløsningsmidler er vand og alkylalkohol. Foretrukne moderat polære opløsningsmidler er alkylalkohol og chlorerede carbonhydrider. Særligt foretrukne stærkt 25 polære og moderat polære opløsningsmidler er hhv. vand og alkohol.

Dersom der er en betydelig mængde uopløst fast stof til stede under processen, vil ændringen i de uopløste faste stoffers fysiske udseende være et tegn på saltdannelse. I 30 vand eller vand/organisk opløsningsmiddelmedium fremtræder saltet som et fibrøst, tykt og skylignende bundfald, der har tendens til at koagulere og danne en geleret blanding.

Dette er i modsætning til fri base-dipeptidsødemiddel, der fremtræder som en findelt, partikelformet suspension med 35 lav viskositet.

Det er vigtigt at bemærke, at betingelser, der omfatter varme, vand og syre, almindeligvis vil bevirke hydrolyse

DK 155605 B

6 og nedbrydning af dipeptider. Heraf følger, at behandling af et dipeptidsødemiddel på ovenstående måde i reglen bør undgås, eftersom sødemidlet må forventes at blive ødelagt.

Ikke desto mindre sker dette ikke. Man mener, at hastigheden 5 af saltdannelse og udfældning under fremgangsmådens betingelser effektivt hindrer hydrolyse.

Andre metoder, der er anvendelige til fremstilling af saltene ifølge opfindelsen, omfatter sprøjtetørring, frysetørring, lyophilisering eller tromletørring. Medens 10 disse fremgangsmåder og ovennævnte fremgangsmåde vil give et dipeptidsødemiddelsalt med høj termisk stabilitet, giver den indledningsvis omtalte fremgangsmåde et salt med moderat højere opløsningshastighed og meget høj renhed. Årsagerne til den forbedrede opløsningshastighed som funktion af frem-15 gangsmåden er ikke fuldt opklarede.

Prøver med hensyn til stabilitet over for varmened-brydning og ved lagring foretages på prøver af nogle salte ifølge opfindelsen, fri base-dipeptidsødemidlet, hydrochlo-ridsaltet og hydrogensulfatsaltet belyser den forøgede varme-20 stabilitet hos saltene ifølge opfindelsen. Ved varmenedbryd-ningsprøver viser analytisk undersøgelse af resten, der er til stede efter 7 minutters, 15 minutters eller 25 minutters opvarmning til ca. 170°C, at sulfatsaltet ifølge opfindelsen udviser væsentlig varmestabilitet, medens sammenlignings-25 eksemplerne udviser betydelig nedbrydning. Fri base-dipeptidsødemidlet og dets bisulfatsalt vil vise helt op til 85% nedbrydning, og hydrochloridsaltet vil have en nedbrydning på mindst ca. 45%, medens sulfat- og methylsulfonatsaltene ifølge opfindelsen udviser mindre end hhv. ca. 10 og ca.

30 30%'s nedbrydning under disse betingelser. Ved prøverne med hensyn til lagerstabilitet udviser sulfatsaltet ifølge opfindelsen typisk mindre nedbrydning end hydrochloridsaltet efter opvarmning under fremskyndede betingelser såsom ca.

85°C i ca. 15 dage eller 70°C i ca. 15 dage i en atmosfære 35 med 100%’s fugtighed.

Varmestabiliteten hos saltene ifølge opfindelsen påvises endvidere ved forsøg med kagebagning. Ved dette

DK 155605B

7 forsøg fremstilles sødede formkager ved kendte procedurer og under anvendelse af de korrekte ingredienser, men ved brug af dipeptidsødemiddel i stedet forsukker. Anvendelse af eksempler på salte ifølge opfindelsen og kendte dipeptider 5 og salte såsom hydrochloridet giver ca. 20 cm’s gule kager, der kan anvendes til en sammenligning af sødemiddelindhold.

Kagerne bages typisk ved ca. 175°C i ca. 30-45 minutter.

Når der udtages midterudsnit af prøvekagerne, og disse analyseres for indhold af dipeptidsødemiddel, kan der også 10 foretages en bestemmelse af den procentvise nedbrydning af den form for dipeptidsødemiddel, der anvendes. Ved en typisk kageprøve med hensyn til termisk stabilitet vil en kage bagt med sulfatsaltet ifølge den foreliggende opfindelse typisk indeholde ca. 50% mere dipeptidsødemiddel end en 15 kage bagt med hydrochloridsaltet; smig. f .eks. ca. 34% søde-middeludvinding for sulfatet med ca. 25% for hydrochloridet.

En prøvesmagning af de med dipeptidsødemiddel bagte formkager kan også foretages under standardbetingelserne for enkeltblindprøve. En prøvesmagning af et panel vil vise, 20 at dipeptidsødemiddel-sulfatsaltet ifølge opfindelsen giver en sødhed i kagen, der næsten svarer til sukkers, medens fri base-dipeptidsødemidlet i reglen giver kager med ringe sødhed og en fad smag.

Undersøgelser med hensyn til opløsningshastighed for 25 sulfat- og sulfonatsaltene ifølge opfindelsen sammenlignet med kendte salte såsom hydrochlorid- og bisulfatsalte illustrerer, at salte ifølge opfindelsen i reglen udviser meget høje opløsningshastigheder, der ligner hydrochloridets.

Desuden har sulfatsaltet uventet en opløsningshastighed, 30 der er mindst ca. 5-6 højere end hastigheden for det tilsvarende hydrochloridsalt. Ved et typisk sulfat-hastigheds-eksempel vil sødemængden af sulfatsaltet opløses fuldstændig i køleskabskølet lemonade uden omrøring. Det tilsvarende hydrochlorid kræver betydelig tid og omrøring for at opløses 35 i den i køleskab afkølede lemonade.

Under den termiske nedbrydning af dipeptidsødemidler 8

DK 15S605B

omfatter de fremkomne nedbrydningsprodukter de individuelle aminosyrer, der udgør dipeptidet, og diketopiperaziner dannet ved aminosyrecyclisering. Disse produkter har ikke dipep-tidsødemidlets søde smag. Eftersom varmenedbrydningen øde-5 lægger sødemidlets vigtigste egenskab, vil der derfor kræves store mængder sødemiddel for effektivt at søde bagværk, sukkervarer og væsker. Dette er helt klart uønsket, fordi der også vil forekomme store mængder nedbrydningsprodukter.

Dipeptidsødemiddelsaltene ifølge opfindelsen løser 10 dette problem og opfylder et behov for et enkelt effektivt dipeptidsødemiddel til almen brug i såvel kolde som varme fødevarer og nydelsesmidler. Saltene opløses hurtigt i kolde vandige medier. De er derfor effektive sødemidler til brug i ikke-alkoholiske drikke og kolde drikkevarer. Desuden har 15 saltene forøget varmestabilitet. De er derfor effektive sødemidler til brug ved bagning og madtilberedning, og de har lang lagerholdbarhed.

Til typiske anvendelsesformål kan dipeptidsødemiddelsaltene ifølge opfindelsen anvendes alene eller sammen med 20 søde, tørre eller flydende fødevarer eller nydelsesmidler. Sammensætninger med saltet kan omfatte inaktive rumfangs-forøgende midler såsom gummiarter, dekstriner, maltose og hydrolyserede stivelser. Disse sammensætninger kan anvendes til at producere sødemidler med samme sødeevne som sukker 25 regnet efter rumfang. Typiske anvendelsesformål for sødemiddelsammensætninger omfatter sødede cornflakes og frugt. I forvejen emballerede kageblandinger og andre tørre føde-vare-og nydelsesmiddelblandinger kan også fremstilles ved anvendelse af dipeptidsødemiddelsalte i mængder, der svarer 30 til sukkers sødeniveau, og idet man regner med den mindre nedbrydning, der forekommer under bagning.

Fremgangsmåderne til fremstilling af sådanne nydelsesmidler og fødevarer er enkle. Fysisk blanding af sødemiddelsaltet med produktet, der skal fremstilles, vil i reglen 35 være tilstrækkeligt til at sørge for ensartet og fuldstændig sødning. De niveauer sødemiddel, der skal anvendes, vil

DK 155605B

9 være de, der tilnærmelsesvis svarer til sukkersødheds-niveauer. Selv om disse niveauer almindeligvis kan bestemmes empirisk ved smagning på sammenligningsprøver, vil det i reglen være tilstrækkeligt at anvende den molære mængde 5 salt, der svarer til ca. 19 mg methylaspartylphenylalanin, svarende til ca. 5 g sukker.

Man mener, at den fuldstændige fordeling af sødemiddelsaltet i blandingen, der skal bages eller tilberedes, lettes ved den høje opløsningshastighed. Saltet diffunderer 10 igennem dejens, buddingens eller blandingens vandfase, fordi det er let opløseligt deri. Sødemidlet fordeles igen gennem blandingen, efterhånden som det føres videre med vandfasen.

Man mener derfor, at den hurtige opløsningshastighed og den høje varmestabilitet begge er gavnlige til bageformål.

15 En yderligere fordel er de hurtigt opløselige saltes højere åbenbare sødhed. Når man smager på dem, vil den lethed, hvormed de opløses, hurtigt optage smagssansen. Dette skaber så igen følelsen af en meget sød smag i sammenligning med smagen af de salte, der opløses langsommere.

20 Vandige opløsninger og drikkevarer, der indeholder sødemiddelsaltene ifølge opfindelsen, kan også fremstilles på enkel måde. Blanding, rystning og omrøring alene eller kombineret med opvarmnings- og omrøringstrin vil tillade fremstilling af sådanne sødede væsker. Iskolde opløsninger 25 og blandinger af vandige væsker, drikkevarer og sødemiddel-saltene kan også fremstilles ved at blande sødemidlet og andre bestanddele i vandige eller andre opløsninger. En fore trukken sammensætning til et drikkevarepulver er en komprimeret tablet, der indeholder saltet og de andre faste 30 bestanddele. Det vil være en fordel ved længere tids lagring af drikkevarer, hvori sødemiddelsaltene indgår, at anvende hovedsagelig tørre blandinger, der kan rekonstitueres med f .eks. vand og vand med kulsyre, på fremstillingstidspunktet.

Saltene vil undergå en vis nedbrydning ved længere tids 35 kontakt med vand.

Et væskesødemiddeIkoncentrat, der kan anvendes straks

DK 155605 B

10 til at søde fødevarer og drikkevarer eller som oparbejdnings-hjælpemiddel ved fremstilling af sødede nydelsesmidler eller fødevarer, kan fremstilles ud fra sødemiddelsaltene ifølge opfindelsen ved at mætte en vandopløsning med sødemiddel-5 saltet. I reglen vil sådanne vandopløsninger indeholde ca.

10-60 vægtprocent sødemiddelsalt. De kan fremstilles ved enkle metoder såsom omrøring eller iblanding. Der kan, om nødvendigt, benyttes hjælpeopvarmning.

Koncentrerede sødemiddelopløsninger kan anvendes i 10 stedet for sødemiddel i tør form til at søde drikkevarer og tørre fødevarer såsom cornflakes, kaffe, te, limonade, vand og andre tilsmagte flydende opløsninger eller suspensioner. Koncentratet fungerer som oparbejdningshjælpemiddel, der muliggør hurtig og i det væsentlige fuldstændig fordeling 15 af sødemidlet. Et typisk eksempel er en sødemiddelopløsning anbragt i en automat, hvorfra sødemidlet kan afmåles nøjagtigt. Opløsningen sprøjtes derpå, dryppes eller afmåles på anden måde til produktet under dettes fremstilling.

Typiske anvendelsesformål til fødevarer og drikkevarer 20 for sødemiddelsaltene ifølge opfindelsen omfatter sådanne materialer, der kan emballeres som fødevare- eller drikkevareblandinger med et lille indhold af vand. Disse omfatter kage- eller småkageblandinger, buddingpulvere, ikke-alkoho-liske drikkevareblandinger, sukkervareblandinger, gelatine-25 pulvere og andre lignende fødevareblandinger, der indeholder tørre bestanddele eller desuden indeholder organiske fedtstoffer og olier. Eksempler, der indeholder fedtstoffer og olier, omfatter salatdressing, mayonnaise, sennep, færdiglavede fødevaresystemer med indhold af olier og fedtstoffer 30 og olieemulsioner i mindre mængde vand.

De følgende eksempler tjener til yderligere belysning af enkeltheder ved tilberedning og afprøvning af saltene ifølge opfindelsen.

DK 155605 B

11

Eksempel 1

Bis(hydrogen-aspartylphenylalanin-methylester)-sulfat 1,66 g (96%'s) svovlsyre opløses i 40 ml destilleret vand og opvarmes til ca. 40°C. Til denne opløsning tilsættes 5 10,0 g aspartylphenylalanin-methylester, og blandingen om røres. Efter at esteren er opløst, så at der fremkommer en klar opløsning, tilsættes 400 ml ethanol opvarmet til ca.

60°C under omrøring. Opløsningen filtreres hurtigt, og filtratet afkøles til ca. 5°C til fældning af sulfatsaltet.

10 Det udfældede salt filtreres, vaskes med kold ethanol og tørres i vakuum ved ca. 50°C i ca. 2 timer, hvilket giver ca. 11 g af det i overskriften nævnte salt. De fysiske data for dette sulfatsalt er anført i tabel I.

Eksempler på sulfonatsaltene ifølge opfindelsen frem-15 stilles ved den ovenstående fremgangsmåde, og der anvendes en passende organisk sulfonsyre (RSO^H) i stedet for svovlsyre. De fysiske data for sulfonatsaltene, der fremstilles, findes i tabel I.

Sulfonatsaltene har formlen: [aspartyl-phenylalanin-20 -H] S03R.

Tabel I Sulfonatsalte Højtydende væskechromatografianalyse 25

Svovl- APM- DKP AP Vand indhold (%) indh. (%) (¾) (%) (%)

Eks. R Teor. Fundet Teor. Fundet 30 1 ingen 4,66 4,78 85,7 83,7 ikke 0,14 0,56 R-grup- på- pe vist (svovlsyre) 2 methyl 8,20 7,83 75,4 73,2 0,1 0,5 3,5 35 *) Den højtydende væskechromatografianalyse (HPLC) foretages ved anvendelse af standardteknik og et analytisk HPLC-system fremstillet af Water Associates, Milford, Mass., USA. Kolonnen er en "Dupont Zorbax C-8"® (E.I. Dupont, Inc.

DK 155605 B

12

Wilmington, Delaware)-kolonne, der måler 15 cm x 4,6 mm.

Den mobile fase er en blanding af acetonitril, tetrahydro-furan og 0,05 molær vandigt natriumphosphat i forholdet 4:1:45. UV-påvisning af produktet måles ved 210 nm. Strøm-5 ningshastigheden er 2 ml pr. minut, og injektionsvoluminet er 10 mikroliter. Typiske opholdstider er for aspartylphenyl-alanin-methylester (APM) 4,3 minutter, diketopiperazin (DKP) 2,2 minutter, aspartylphenylalanin (AP) 1,5 minut. DKP og AP er nedbrydningsprodukter, der typisk findes som urenheder 10 i APM. Procentindholdet af vand bestemmes ved Karl Fischers titreringsmetode.

Eksempel 3

Varmestabilitetsundersøgelse 15 Prøver af saltene i eksemplerne 1 og 2 med en vægt svarende til ca. 40 mg APM og sammenligningsprøver (40 mg) af fri base-aspartylphenylalanin-methylester (APM) og de tilsvarende hydrochlorid-, dihydrogenphosphat- (I^PO^) og bisulfat-(HSO^)-salte med vægt svarende til ca. 40 mg APM 20 anbringes i hver sit 10 ml bæger og sættes i en ovn, der er forvarmet til 170eC. Prøverne bager i forud bestemt tid (7,15 og 25 minutter), hvorefter de tages ud af ovnen og analyseres ved HPLC som omtalt ovenfor. Resultaterne af prøverne med hensyn til salte ifølge opfindelsen og sammen-25 ligningsforbindelser er anført i tabel II.

DK 155605 B

13

Tabel II Varmestabilitet

% nedbrydning (170°C) Fysisk udseende efter Prøve 7 min. 15 min. 25 min. 25 min, ved 17Q°C

5 Eks. 1 hvidt krystal- (sulfat) 1,3 O 5,5 linsk pulver

Eks. 2 (me- thylsulfonat) 0,0 0,5 28,0 næsten hvidt pulver A 0 22,2 87,6 lysegråt materiale 10 B 2 8,5 44,7 smeltet lysebrun masse C 62,8 78,2 89,2 smeltet farveløs masse D 0,1 60,6 86,6 gult pulver A = aspartylphenylalanin-methylester (APM) 15 B = aspartylphenylalanin-methtylester-hydrochlorid C = aspartylphenylalanin-methylester-bisulfat D = aspartylphenylalanin-phosphat, monobasisk

Eksempel 4 20 Varmestabilitetsundersøgelser i bagte kager

Der bages lyse kager efter en standardopskrift, men der anvendes et dipeptidsødemiddel eller dets salt og et hævemiddel af modificeret maltdekstrinstivelse i stedet for sukker. De flydende bestanddele piskes sammen og foldes 25 derefter i en sigtet blanding af de tørre bestanddele. Den fremstillede dej fyldes i en smurt bageform på ca. 20 cm og bages ved 175°C i 40 minutter. Der bages tre kager på denne måde: kage nr. 1 indeholder (APM-H)2SC>4, kage nr. 2 indeholder APM-HC1, og kage nr. 3 indeholder APM.

30 De flydende bestanddele omfatter mælk (193 g), fedtstof til bagværk (54 g), 1 æg (53 g), vanilje (3,6 g).

De tørre bestanddele omfatter mel (167 g), bagepulver (6,9 g), salt (3,4 g), hævemiddel (126,5 g), dipeptidsøde-middelsalt: (APM-H)2SC>4 (kage nr. 1) (1,2 g), 35 APM-HC1 (kage nr. 2) (1,2 g), APM (kage nr. 3) (1,0 g).

DK 155605 B

14

Der tages kerneprøver fra hver af de tre kager, og prøverne analyseres ved HPLC-metoder som beskrevet i eksempel 1. HPLC-analyseresultaterne er anført i tabel III.

5 Tabel III

Kageanalyse APM %* DKP %* AP %* Smag

Kage 1 33,8 41 1,7 sød

Kage 2 25,5 35,5 1,8 sød 10 Kage 3 11 — — let sød

Kage 1 - (APM-H)2SC>4 Kage 2 - APM-HCl Kage 3 - APM

15 *APM = aspartylphenylalanin-methylester *DKP = diketopiperazin, et nedbrydningsprodukt af APM * AP = aspartylphenylalanin, et nedbrydningsprodukt af APM.

20 Eksempel 5

Undersøgelser af opløsningshastighed

Prøver af saltene i eksempel 1, 2 og APM-hydrochlo-ridet og de tilsvarende bisulfat- og dihydrogenphosphatsalte anvendes til at bestemme forholdet mellem opløsningshas-25 tigheder i drikkevarer. Den mængde salt, der anvendes i hvert tilfælde, beregnes som værende ækvimolær med 57 mg APM. Prøverne foretages i fire typer flydende drikkemedier: (1) køleskabskølet vand tilsat kulsyre (240 ml), (2) køleskabskølet limonade uden sukker (240 ml), (3) køleskabskølet 30 kaffe (80 ml) og (4) kaffe ved omgivelsernes temperatur (80 ml). Opløsningshastigheden i medium (1) måles uden omrøring, og hastighederne i (2), (3) og (4) måles under omrøring. Opløsningen anses for at være fuldstændig, når der ikke mere forekommer faste partikler eller mediet er uklart.

35 Resultaterne findes i tabel IV.

DK 155605 B

15

Tabel IV

Opløsningshastigheder

Opløsningstidsrura (sekunder) i medie

Prøve (D* (2)* (3)* (4)* 5 Eks. 1 22 ca. 0 24 22

Eks. 2 168 250 - 167 B 120 52 94 90 C - 330 D - - - 600 * 10 (1) er køleskabskølet vand med tilsat kulsyre (2) er køleskabskølet limonade uden sukker (3) er køleskabskølet kaffe (4) er kaffe ved omgivelsernes temperatur.

Eks. 1 er (APM.H)2S04 15 Eks. 2 er (APM.H)S03CH3 B er APM-hydrochlorid C er (APM.H)HS04 d er (APM.H)H2P04 20 Eksempel 6

Bestemmelse af lagerholdbarhed To sæt prøver af APM-sulfatsaltet ifølge eksempel 1, APM-hydrochlorid og APM, hver med en vægt svarende til 40 ml APM, anbringes i ovne, der indeholder et åbent bæger 25 med vand. Det første sæt prøver opvarmes ved 70°C og 100%'s fugtighed i 14,7 dage. Det andet sæt prøver opvarmes ved 85°C og atmosfærisk fugtighed i 14,7 dage. Prøverne analyseres med mellemrum ved hjælp af HPLC som beskrevet tidligere for at bestemme den procentvise nedbrydning. Resultaterne 30 er anført i tabel V.

35

DK 155605B

ie

Tabel V

Bestemmelse af lagerholdbarhed HPLC-analyseresultater (% sammensætning) (APM % 1.70° begynd. 6,8 dage 14,7 dage begynd♦)

5 _ APM DKP AP APM DKP AP APM DKP AP

Eks. 1 84,8 nd nd 83,9 nd nd 82,1 nd 0,2096,7 A 96,6 1,0 nd 95,3 1,1 nd 92,6 1,2 0,2195,9 B 80,2 nd nd 77,7 0,25 0,33 75,1 0,6 0,3693,6

2.85°C

10 Eks. 1 som ovenfor 83,0 0,15 nd 80,9 0,08 0,2095,4 A som ovenfor 95,2 1,6 nd 91,7 2,0 0,2094,9 B som ovenfor 62,1 4,0 1,1 46,0 3,2 1,6 57,3

A = APM

15 B = APM.HC1 DKP = diketopiperazin AP = aspartylphenylalanin nd = ikke påvist 20 *) Tallene angiver procent af forbindelsessammen sætning (APM, DKP og AP), der er til stede på analysetidspunkt. Den sidste kolonne viser den procentmængde APM, der er tilbage i prøverne efter 14,7 dage i forhold til det fra begyndelsen tilstedeværende.

Claims

1. Dipeptidsødemiddelsalt, kendetegnet ved, at det har den almene formel 5 [APS.H]2S04 eller [APS.H]S03R hvor R er C^_3-alkyl, og APS har formlen H^CHCONHCHCC^R1 io ho2cch2 R2 hvor R1 er C- c-alkyl, og

2 R er phenyl, phenylalkyl, phenylalkenyl eller cyclo-hexylalkenyl, hvor alkenylgruppen har 2-5 carbonatomer, og alkylgruppen har 1-5 carbonatomer. 15 2. Sødemiddelsalt ifølge krav 1, i kendetegnet ved, at R er methyl.

3. Sødemiddelsalt ifølge krav 1, 1 2 kendetegnet ved, at R er methyl, og R er benzyl.

4. Sødemiddelopløsning, 20 kendetegnet ved, at den omfatter et sødemiddelsalt ifølge krav 1 i vandig opløsning.

5. Opløsning ifølge krav 4, kendetegnet ved, at koncentrationen af saltet er mindst 8 vægtprocent.

6. Til fremstilling af sukkervarer og slik egnet materiale, kendetegnet ved, at det indeholder en på modificeret stivelse baseret bestanddel og et sødemiddelsalt ifølge ethvert af kravene 1-3.

7. Drikkevareblanding, kendetegnet ved, at den omfatter en tør, ikke— alkoholisk drikkeblanding og et sødemiddelsalt ifølge krav 1-3.

8. Materiale eller blanding ifølge krav 6 eller 7, 35 kendetegnet ved, at den indeholder [aspartyl-phe-nyl-alaninmethylester-H]2S04 som sødemiddelsalt.