DK159275B - Fremgangsmaade til fremstilling af raffineret, afgiftet endotoksin - Google Patents

Description

DK 159275 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et raffineret, afgiftet endotoksin indeholdende intet påviseligt 2-ke-to-3-deoxyoctanoat, 350-475 nmol/mg phosphor og 1700-2000 nmol/kg fedtsyrer opnået ved hydrolysering af en endotoksi nekstrakt opnået fra 5 mikroorganismer af familien enterobacteriaceæ med en syre, såsom saltsyre, svovlsyre, phosphorsyre, toluensulfonsyre eller trichloreddike-syre, og lyofi 1isering af det hydrolyserede produkt til opnåelse af råt lipid A .

10 Kombination af det omhandlede endotoksi nprodukt (RDE-produkt) med cellevægtsskelet (CWS) resulterer i et terapeutisk effektivt middel til behandling af kræftsvulster uden de uheldige bivirkninger, der normalt er forbundet med endotoksiner.

15 Endotoksiske ekstrakter opnået fra enterobacteriaceæ inklusive stamor-ganismer og mutanter kendes. Disse ekstrakter har været benyttet til immunoterapi af forskellige immunogene svulster [se Peptides as Requirement for Immunotherapy of the Guinea-Pig Line-10 Tumor with Endotoxins, Ribi, et al., Cancer Immonol. Immunother., bind 7, side 43-58 20 (1979)]. Endotoksi nekstrakterne vides imidlertid at være meget toksiske og derfor at have begrænset anvendelighed til behandling af kræftsvulster. Bestræbelser har været udfoldet med henblik på "afgiftning" af endotoksinerne under bevarelse af deres svulstundertrykkende evne. Som vist, i Ribi, et al., kendes kemiske procedurer til "afgiftning" 25 af endotoksiner under bevarelse af deres hjælpestofkarakter, såsom succinylering og phthalylering, der begge resulterede i tab af endo-toksicitet og svulstundertrykkende evne. De kendte forsøg på opnåelse af et endotoksi nprodukt med høj svulstundertrykkende evne og ringe eller ingen toksicitet har derfor indtil nu ikke været vellykkede.

30

Fra Cancer Immunology and Immunotherapy, bind 12 (1982), side 91-96, kendes endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af raffinerede, afgiftede endotoksiner ved behandling af endotoksiske ekstrakter af mutantstammer af Salmonella thypimurium med kogende 0,1 N HC1.

Cellevægsskelet er i alt væsentligt cellevæg, som har fået fjernet meget af det protein og mange af de lipider, der normalt findes i celle- 35 2

DK 159275 B

væggen. Det er et polymert mycolinsyre-arabinogalactan-mucopeptid indeholdende rester af trehalosemycol ("P2") og uopløste tuberculopro-teiner. Cellevægsskelet opnås fra enhver mycobakterie inklusive, men ikke begrænset til M. smegmatis, M. phlei, Nocardia rubra, Nocardia 5 asteroides, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium parvum, M. kansasii, M. tuberculosis (stamme H 37 RV og Ayoma B) samt M. Bovis, stamme BCG. Endvidere kan cellevægsskelet opnås fra sådanne ikke-mycobakterier som E. coli, B. Abortus og Coxiella burnettii.

10 Cel levægsskelet produceres ved først at dyrke og derpå høste en bakterie, såsom M. bovis, stamme BCG (bacillus Calmette-Guerin). Den resulterende helcellerest oparbejdes ved hjælp af en cel lefraktionator [Ribi Cell Fractionator (Sorvall, Model RF-1)], der bryder cellerne under adskillelse af den ydre omslutning eller cellevæg fra de proto-15 plasmiske urenheder. De resulterende cellevægge underkastes derpå en række opløsningsmiddelekstraktioner og enzymatiske behandlinger (f.eks. trypsin og/eller chymotrypsin) til opnåelse af renset celle-vægsskelet.

20 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man behandler det rå lipid A med et første opløsningsmiddel, såsom acetone, til opløsning af deri indeholdte fedtsyrer, opløser det resulterende uopløselige produkt i et andet opløsningsmiddel, såsom methanol, chloroform, acetone, pyridin, ether og eddikesyre, eller en blanding af 25 disse opløsningsmidler, og fører den resulterende opløsning gennem en kromatografisk søjle til opnåelse af det ønskede produkt.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen omfatter således ud over den kendte behandling af en endotoksinekstrakt med en stærk syre samt lyofili-30 sering en særlig behandling med to forskellige opløsningsmidler og derefter en kromatografisk behandling.

Herved opnås et overlegent raffineret, afgiftet endotoksinprodukt (RDE), der har en høj svulstundertrykkende evne uden toksiske bivirk-35 ninger, der normalt er knyttet dertil. Det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede raffinerede, afgiftede endotoksini kan kombineres med cellevægsskelet (CWS) til opnåelse af et meget virksomt middel til behandling af kræftssvulster.

DK 159275 B

3

Endotoksinekstrakter af den type, der anvendes som udgangsmateriale til fremstilling af RDE, kan opnås ud fra hvilke som helst enterobacteriaceæ inklusive stamorganismer og mutanter. Eksempelvis er de følgende slægter eksempler på den type 5 mikroorganismer, som kan anvendes:

Salmonella, Shigella, Escherichia, Brucella, Bordetella, Citrobacter, Pseudomonas, Pasturella, Neisseria, Proteus, Klebsielle og Serratia.

10 Følgende arter bliver typisk benyttet: S. minnesota, S. typhimurium, B. pertussis, B. abortus, S. enteritidis, E. coli, S. typhi, S. marcescens, S. typhosa, Shigella flexni og S. abortus equi.

15 De som udgangsmateriale benyttede endotoksiske ekstrakter kan fremstilles ved hjælp af en af flere kendte metoder [se f.eks. Webster, M.E., Sagin, J.F., Landy, M., og Johnson, A.G., J. Immonol. 1955, 744, 55, Westphal, O., Luderitz, O., og Bister, F., Z. Naturforsch., 76, 148 (1952), Westphal, 20 o., Pyrogens, Polysaccharides in Biology, Tr. Second Macy

Conference (George F. Springer, ed.), Madison, N.J., Madison Printing Co., 1957, 115, Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O., Eur. J. Biochem. 9, 245 (1969), Chen, C.H., Johnson, A.G., Kasai, N., Key, B.A., Levin, J., Nowotny, A., J. Infect. Dis., 25 128, 543 (1973), Ribi, E., Haskins, W.T., Landy, M., Milner, K.C., The Journal of Experimental Medicine 114, 647 (1961), Leive, L., Biochem. Biophys. Res. Comm., 21, 290 (1965), og Ribi, E., Milner, K.C., og Perrine, T., J. Immonol. 82, 75 (1959)].

30 Den foretrukne metode til opnåelse af den endotoksiske ekstrakt er den af Chen, et al. beskrevne, nemlig methanol-chlo-roform-udfældning.

Methanol-chloroform-præcipitatet (MCP) omsættes derpå med 35 en organisk eller uorganisk syre og lyofiliseres derpå til fremstilling af et hydrolyseret, råt lipid A med formindsket toksicitet og pyrogenicitet sammenlignet med endotoksin-udgangs- 4

DK 159275 B

materialet. Det resulterende produkt behandles derpå med et opløsningsmiddel, som er i stand til specifikt at opløse fedtsyrer og andre urenheder uden opløsning af det rå lipid A.

Det foretrukne opløsningsmiddel til dette formål er acetone.

5 Phosphatindholdet i det afgiftede, raffinerede lipid A er ca. det halve af det indhold, der findes i det toksiske modstykke, hvilket antyder, at phosphatindholdet er forbundet med endotoksiners toksiske virkninger.

10 De foretrukne uorganiske syrer, der anvendes til omsætning med MCP, er saltsyre, svovlsyre eller phosphorsyre, og de foretrukne organiske syrer er toluensulfonsyre eller trichlor-eddikesyre. Reaktionen kan hensigtsmæssigt udføres ved en temperatur mellem ca. 90 og 130°C i et tidsrum, der er til-15 strækkeligt til fuldstændig hydrolyse, sædvanligvis mellem ca. 15 og 60 min.

Fremstillingen af råt, afgiftet endotoksin kan også foretages ved omsætning af udgangsmaterialet med syren i nærværelse 20 af et organisk opløsningsmiddel, såsom chloroform, methanol og ethanol eller kombinationer deraf.

Det resulterende rå lipid A opløses i acetone, der er særlig egnet til fjernelse af fedtsyrekomponenterne. Opløsnings-25 midlet fjernes derpå til fremstilling af råt, afgiftet endotoksin.

Det rå afgiftede endotoksin opløses derpå i et opløsningsmiddel og føres gennem en egnet kromatografisk søjle, såsom ek-30 sempelvis en kromatografisk molekularudelukkelsessøjle, til fraskillelse af RDE-fraktionerne, som derpå kombineres efter fjernelse af opløsningsmidlet. Den rå, afgiftede endotoksinopløsning føres gennem en Sephadex-søjle i nærværelse af et opløsningsmiddel, såsom chloroform, methanol, 35 acetone, pyridin, ether eller eddikesyre eller kombinationer deraf. Søjletrykket kan variere, men ligger typisk i in-tervallet mellem ca. atmosfærisk tryk og 7 kp/cm , og strømningshastigheden ligger mellem ca. 0,1 og 10 ml/min.

5

DK 159275B

Den rå, afgiftede endotoksinopløsning kan også føres gennem en DEAE-cellulosesøjle ved de samme tryk betingelser som ovenfor nævnt for Sephadex-søjlen. Strømningshastigheden kan holdes mellem ca. 2 og 15 ml/min. De benyt-5 tede opløsningsmidler er også de samme som de, der blev benyttet til Sephadex-søjlen, selvom vand og/eller diethylamin kan sættes til alle blandinger i en koncentration på indtil ca.

1 O.

1Ό « 10 Andre metoder til fremstilling af RDE ud fra råt, afgiftet endotoksin indbefatter passage af opløsningen gennem en si-licagel 60 lavtrykssøjle med en partikelstørrelse på mellem ca. 15 og 63 mikron under anvendelse af et opløsningsmiddel valgt blandt chloroform, methanol, vand og ammoniumhydroxid.

15 Det foretrukne volumenforhold i den ovennævnte opløsningsmiddelblanding er ca. 50:25:4:2.

RDE fremstillet ifølge den·foreliggende opfindelse samt CWS kombineres til fremstilling af et middel, der har kraftig 20 antisvulstvirkning. De kræftformer, der kan behandles med RDE-CWS-midlet indbefatter dyrs svulster, såsom kvæg-plade-cellecarcinoma, kvæg-fibrosarcoma, hest-sarcoid, hest-melanoma, hest-pladecellecarcinoma, kanin-brystsvulster, kanin-adenoma og kanin-melanoma samt humane svulster, såsom brystsvulster, 25 lungesvulster, en coleo-rektal svulst, ondartet melanoma, pladecellecarcinomaer og ovariesvulster.

Midlet administreres fortrinsvis ved indsprøjtning i et farmaceutisk acceptabelt medium, såsom en olie-smådråbeemulsion, 30 direkte ind i svulsten under betingelser, der beskrives mere indgående i det følgende. Det ovennævnte middel kan f.eks. stabiliseres ved hjælp af en lyofiliseringsprocedure og derpå genfortyndes uden tab af virkningsevne.

35 Mængden af RDE i en enkelt indsprøjtning til behandling af dyr ligger mellem 6,25 og 250 mikrogram/milliliter. Mængden af CWS ligger mellem 125 og 750 mikrogram/milliliter. Antallet 6

DK 159275 B

af milliliter af det i svulsten indsprøjtede biologiske middel bestemmes af svulstens størrelse i overensstemmelse med følgende tabel:

Dyrs dosis i overensstemmelse med svulststørrelse 5

Diameter af svulst (cm) Mængde af indsprøjtet biologisk middel 0- 1 cm indtil 0,5 ml 1- 2 cm 0,5 til 2,5 ml 2- 3 cm 2,5 til 5 ml 10 3-5 cm 5 til 10 ml 5-8 cm 10 til 15ml større end 8 cm 15 til 20 ml

Den maksimale dosis pr. indsprøjtning er ca. 1500 mikrogram 15 RDE og ca. 4500 mikrogram CWS. Behandlingsforløbet omfatter indtil 5 indsprøjtninger administreret med en uges intervaller.

RDE-CWS-midlet i et passende injicerbart medium, såsom en 20 oliedråbeemulsion, administreres direkte til humane svulster. Mængden af henholdsvis RDE og CWS i en enkelt indsprøjtning ligger mellem ca. 50 og 1000 mikrogram med en foretrukken enkeltdosismængde på mellem ca. 275 og 325 mikrogram af hver komponent til en typisk voksen patient på 70 kg. I løbet af 25 ca. 1 uge administreres injektionerne med indtil ialt 15 injektioner. Det er generelt ønskeligt at administrere midlet indeholdende mellem ca. 50 og 500 mikrogram/ml RDE og mellem ca. 50 og 500 mikrogram/ml CWS pr. injektion.

30 Som beskrevet ovenfor kan midlet til behandling af varmblodede dyr og mennesker benyttes i form af en oliedråbeemulsion. Mængden af benyttet olie ligger i intervallet mellem ca. 0,5 og 3,0 volumen%, regnet i forhold til midlet samlede volumen. Det foretrækkes at anvende mellem ca. 0,75 og 1,5 35 volumen% af olien. Eksempler på sådanne olier indbefatter • t

DK 159275 B

7 let mineralolie, squalan, 7-n-hexyloctadecan, "Conoco superoil" og "Drakeol" 6 VR mineralolie (fremstillet af Pennreco Company, Bulter, Pennsylvania).

Den homogeniserede olieholdige blanding kombineres derpå med 5 en detergent, som eventuelt kan være opløst i en saltvandsopløsning forud for blanding. Detergentmængden ligger typisk mellem ca. 0,02 og 0,20 volumen% og fortrinsvis mellem ca.

0,10 og 0,20 volumen%, regnet i forhold til midlets samlede volumen. Ethvert almindeligt detergentmateriale kan anven-10 des inklusive "Tween-80" og "Arlacel" (fremstillet af the Atlas Chemical Company).

Blandingen opnået ved detergenttilsætningen homogeniseres derpå til dannelse af en suspension, der har en højere procent-15 del af oliedråber overtrukket med RDE og CWS, således som bestemt ved iagttagelse under et mikroskop.

De følgende eksempler illustrerer fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

20

Eksempel 1 - Fremstilling af råt, afgiftet endotoksin • En 650 mg prøve af et methanol-chloroform-præcipitat, der 25 var fremstillet i overensstemmelse med proceduren ifølge Chen, et al., J. Infect. Dis. 128, 543 (1973), blev suspenderet i 150 ml 0,1N HC1 i en trehalset rundbundet kolbe, der var udstyret med en tilbagesvaler, og neddykket i en sonikator. Efter lydbehandling blev glasapparatet derpå sænket ned i 30 et oliebad, der blev holdt ved 120°C, hvilket gjorde det muligt for kolbens indre temperatur at nærme sig eller overstige opløsningens kogepunkt. Overophedning af opløsningen blev minimeret ved at udstyre kolben med et kapillarrør, som var tilknyttet en nitrogengaskilde, via en af halsene. En kon-35 tinuert strøm af nitrogen blev opretholdt under hele hydro-

DK 159275 B

8 lyseproceduren.

Hydrolyse blev fortsat i 30 min., hvorefter opløsningen blev kølet i et isbad, lydbehandlet til dispergering af det faste materiale og fordelt på corex-rør. Kolben blev vasket med 5 destilleret vand til fjernelse af alt fast materiale, der klæbede til kolbens sider, og vaskevandet blev sat til suspensionen i corex-rørene. Centrifugering blev udført med 12000 omdrejninger pr. min. i 80 min. Den ovenstående væske blev dekanteret fra og bortkastet. Den faste rest blev resuspen-10 deret i destilleret vand, lydbehandlet indtil suspensionen var godt dispergeret og recentrifugeret. Centrifugeringsprocessen blev derpå gentaget. Resten blev optaget i destilleret vand, skalfrosset og lyofiliseret under opnåelse af 382 mg råt lipid Δ. 150 mg af dette materiale blev behandlet med 15 kold (0°C) acetone til fjernelse af fedtsyre, lydbehandlet samt filtreret gennem et Whatman nr. 1 tyngdefiltreringsapparat ved 5°C. 100 mg råt, afgiftet endotoksin blev tilbage efter tørring.

20 Eksempel 2 - Fremstilling af råt, afgiftet endotoxin

En 120 mg prøve af'MCP (methanol-chloroform-præcipitat) blev suspenderet i 12 ml absolut methanol, lydbehandlet til dispergering af faste materialer og fordelt på 6 (1 x 10 cm) 25 glasrør med skruelåg. 2 ml 0,2N HC1 blev sat til hvert rør, og den resulterende suspension blev inkuberet i et kogende vandbad i 45 min. Efter hydrolyse blev rørene kølet i et bad af isvand og centrifugeret i ca. 10 min. ved 2500 omdrejninger pr. min. Den ovenstående væske blev dekanteret fra, og 5 ml 30 af en 2:1 chloroform/methanol-blanding blev sat til resten til frembringelse af opløsning. 2 ml vand blev tilsat pr. rør, og opløsningen blev blandet. Den tofasede opløsning blev recentrifugeret ved 2500 omdrejninger pr. min i 10 min. Den øvre vandfase blev bortkastet, og 1 ml af en 4:1 chloroform/ 35 methanol-blanding blev sat til hvert rør, hvilket resulterede i en klar opløsning. Opløsningerne blev samlet, og opløsningsmidlet blev fordampet på en rotationsfordamper. Resten blev

DK 159275B

9 tørret under højvakuum og lyofiliseret til opnåelse af 45 mg råt lipid A. 20 mg af dette materiale blev behandlet med kold (0°C) acetone, lydbehandlet og filtreret gennem et Whatman nr. 1 tyngdefiltreringsapparat ved 5°C. 13 ml råt, af-giftet endotoksin forblev tilbage efter tørring.

5

Eksempel 3 - Fremstilling af raffineret, afgiftet endotoksin 110 g LH-20-100 (25-100 mikron partikelstørrelse: Pharmacia) blev kombineret med 600 ml af en 2:1 chloroform/methanol-10 blanding og fik lov til at henstå i 30 min. Den resulterende opslæmning blev sat til en 25 x 1000 mg glaskromatografisøjle (BRL Laboratories), som var udstyret med tryktilslutninger.

Efter afsluttet pakning blev søjlen ved hjælp af "Teflon"-trykrør tilsluttet en ISCO-pumpe, model 132. 400 ml af en 4:1 15 chloroform/methanol-blanding blev pumpet gennem søjlen med en hastighed på 3 ml i min. 100 mg råt, afgiftet endotoksin fremstillet ifølge eksempel 1 blev påført på søjlen i 2,5 ml af en 4:1 chloroform/methanol-blanding via en prøvesløjfe. Strømningen blev formindsket til 1 ml/min., og efter at 150 20 ml af elueringsmidlet var opsamlet, blev afgangsstrømmen sluttet til en fraktionsopsamler. 4 ml fraktioner blev opsamlet, og raffinerede, afgiftede endotoksinfraktioner blev bestemt ved hjælp af tyndtlagskromatografisk analyse af fraktionerne [E. Merck, 0,25 mm tyk, chloroform/methanol/E^O/NI^OH 25 (50:25:4:2) som elueringsmiddel].

De raffinerede, afgiftede endotoksinfraktioner blev kombineret og opløsningsmidlet afdampet under efterladelse af 30 mg raffineret, afgiftet endotoksin som et hvidt pulver.

30

Eksempel 4 - Fremstilling af raffineret, afgiftet endotoksin 33 g DEAE-cellulose (Whatman DE-32) blev suspenderet i 150 ml iseddikesyre og forsigtigt omrørt i 10 min. til opnåel-35 se af et opslæmmet pulver. Blandingen blev henstillet natten over.

DK 159275 B

10

Opslæmningen blev udhældt på en 25 x 400 mm søjle, fik lov til at bundfældes under tapning, og overskud af syre blev derefter ledt bort. Søjlen blev vasket med 2000 ml methanol efterfulgt af 200 ml af en 4:1 chloroform/methanol-blanding.

En 100 mg prøve af råt, afgiftet endotoksin, som var frem-5 stillet ifølge eksempel 1, blev sat til søjlen i 3 ml af en 4:1 chloroform/methanol-blanding eller en 80:20:1 blanding af chloroform, methanol og vand. Søjlen blev elueret med 350 ml af en 4:1 chloroform/methanol-blanding efterfulgt af 300 ml af en 99:1 methanol/vand-blanding. Under anvendelse af 10 et lineær gradient-apparat blev søjlen elueret med 2000 ml af en lineær gradient startende med 100% methanol og endende med 0,2 M eddikesyre i methanol. Søjlen blev elueret med en hastighed på 6 ml/min., og 15 ml fraktioner blev opsamlet. Hveranden fraktion blev analyseret for samlet phosphorindhold 15 i overensstemmelse med proceduren ifølge Bartlett, G.R., J. Biol. Chem. 234, 466-471 (1959). Fraktionerne blev samlet og inddampet til næsten tørhed på en rotationsfordamper samt optaget i 10 ml af en 2:1 chloroform/methanol-blanding samt 40 ml 0,001 M eddikesyre i en skilletragt. Det nedre lag blev 20 fraskilt, filtreret gennem Whatman nr. 2 filtrerpapir og inddampet til tørhed til opnåelse af 19,2 mg raffineret, afgiftet endotoksin.

Eksempel 5 25

Tretten stamme 2 marsvin med Line-10 svulstvækster på ca.

9 ml blev indsprøjtet én gang med 0,4 ml af en steril olie-dråbeemulsion, dvs. "Drakeol" 6 VR mineralolie (Pennsylvania Refining Company, Butler, Pennsylvania), der indeholdt 30 50 mikrogram (RDE) og 50 mikrogram (CWS), direkte i svulst vævet .

Ved afslutningen af en 3 måneders periode blev dyrene undersøgt, og i 12 af de 13 dyr havde fuldstændig undertrykkelse 35 af svulstvæksten fundet sted. Ved et kontrolforsøg blev seks stamme 2 marsvin med Line-10 svulstvækster på ca. 9 mm ind-

Claims (2)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af raffineret, afgiftet 10 endotoksin indeholdende intet påviseligt 2-keto-3-deoxyocta- noat, 350-475 nmol/mg phosphor og 1700-2000 nmol/kg fedtsyrer opnået ved hydrolysering af en endotoksinekstrakt opnået fra mikroorganismer af familien enterobacteriaceæ med en syre, såsom saltsyre, svovlsyre, phosphorsyre, toluensulfonsyre el-15 ler trichloreddikesyre, og lyofi 1isering af det hydrolyserede produkt til opnåelse af råt lipid A, kendetegnet ved, at man behandler det rå lipid A med et første opløsningsmiddel, såsom acetone, til opløsning af deri indeholdte fedtsyrer, opløser det resulterende uopløselige produkt i et andet 20 opløsningsmiddel, såsom methanol, chloroform, acetone, pyri- din, ether og eddikesyre, eller en blanding af disse opløsningsmidler, og fører den resulterende opløsning gennem en kromatografisk søjle til opnåelse af det ønskede produkt. 25

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at hydrolysen udføres ved en temperatur mellem 90 og 130°C. 30 35