SE462017B - Raffinerat, detoxifierat endotoxin, saett foer dess framstaellning jaemte terapeutisk komposition och dess anvaendning foer framstaellning av laekemedel mot cancer - Google Patents

Description

462 10 15 20 25 30 35 017 2 Cellväggskelett är väsentligen cellvägg varifrån mycket av proteinet och lipiderna som normalt finns i cellväggen avlägsnats. Det är en polymer mykolsyra- arabinogalaktanmukopeptid som innehåller rester av tre- halosmykolat (”P3") och odigererade tuberkuloproteiner.

Cellväggskelett erhålles från vilka som helst mykobak- terier inbegripet, men icke begränsat därtill, M.smeg- matis, M.phlei, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Corynebacterium diphteriae, Corynebacterium parvum, M.kansasii, M.tuberculosis (Stam H 37 RV och Ayoma B), samt M.bovis, stam BCG. Därtill kan cellväggsekelett erhållas från sådana icke-mykokbakterier som E.co1i, B.abortus och Coxiella burnettii. _ Cellväggskelett alstras genom att först odla och skörda en bakterie, såsom M.bovis, stam BCG (bacillus Calmette-Guerin). Den resulterande återstoden av hel cell processas genom en cellfraktioneringsanordning (Ribi Cell Fractionator (Sorvall, Modell RF-1)) som söndrar cellerna och separerar cellhöljet eller cellväg- gen från protoplasmaföroreningar. De resulterande cell- väggarna underkastas sedan en serie lösningsmedelsextrak- tioner och enzymatiska behandlingar (t ex trypsin och/eller kymotrypsin) för att ge renat cellvâggskelett.

Därför är det ett föremål för föreliggande uppfin- ning att åstadkomma en överlägsen, raffinerad, detoxi- fierad endotoxinprodukt som har en hög tumörregressiv pontens utan toxiska biverkningar som normalt är associe- rade därmed. Ett annat föremål för föreliggande uppfin- ning är att åstadkomma ett raffinerat, detoxifierat endotoxin i kombination med cellväggskelett såsom en synnerligen potent komposition för behandling av can- cerösa tumörer.

SAMMANFATTNING AV UPPFINNINGEN Föreliggande uppfinning avser även ett raffinerat, detoxifierat endotoxin (RDE) och sätt att framställa detsamma. Uppfinningen avser även en synnerligen potent kombination av RDE och cellväggskelett (CWS) som effek- u» 10 ~ 15 20 25 4652 0'17 3 tivt kan användas för behandling av cancerösa tumörer.

RDE som användes i denna uppfinning har inget detekterbart 2-keto-deoxioktanoat, mellan ca 350 och 475 nmoler/mg fosfor och mellan ca 1700 och 2000 nmoler/mg fettsyror.

Endotoxinextrakt av den typ som användes såsom ett utgângsmaterial för framställning av RDE kan er- hållas från vilken som helst Enterobacteriaciae inbegri- pet moderorganismer och mutanter. Såsom exempel är föl- jande genus belysande för den typ av mikroorgnaismer som kan användas: ' p Salmonella, Shigella, Escherichia, Brucella, Borde- tella, Citrobacter, Pseudomonas, Pasturella, Neisseria, Proteus, Klebsiella, och Serratia.

Typiskt användes följande arter: S.minnesota, S.typhimurium, B.pertussis, B.abortus, S.enteritidis, E.coli, S.typhi, S.marcescens, S.typhosa, Shigella flexni, och S.abortus equi.

De såsom ett utgångsmaterial använda endotoxiska extrakten kan framställas genom en av flera kända meto- der (se, t ex Webster, M.E., Sagin, J.F., Landy, M., and Johnson, A.e., J. Immunol. less, 353, ss, westpnai, 0., Luderitz, O., and Bister F., Z. Naturforsch, 1§ 148 (1952), Westphal, O., Pyrogens, Polysaccharides in Biology, Tr. Second Macy Conference (George F. Springer, ed.), Madison, N.J. Madison Printing Co., 1957, 115; Galanos, C., Luderitz, 0., Westphal, 0., Eur. J. Biochem. ¶*.g,~24s (1969), cnen, c.H., Johnson, A.G., kasai, N., 30 35 Key, B.A., Levin, J., Nowotny, A., J. Infect. Dis. šgå 543 (l973); Ribi, E., Haskins, W.T., Landy, M., Milner, K.C., The Journal of Experimental Medicine llí 647 (l961); Leive, L., Biochem. Biophys. Res. Comm. 21 290 (1965); och Ribi, E., Milner, K.C., och Perrine, T., J. Immunol. åg 75 (1959)).

Den föredragna metoden att erhålla det endotoxiska extraktet är det som beskrivs av Chen, et al; nämligen metanol-kloroformutfällning. 462 017 10 15 20 25 30 35 4 Metanol-kloroformfällningen (MCP) bringas sedan att reagera med en organisk eller oorganisk syra och lyofiliseras därpå för att ge en hydrolyserad rå lipid A med reducerad toxicitet och pyrogenisitet jämfört med endotoxinutgångsmaterialet. Den resulterande pro- dukten behandlas sedan med ett lösningsmedel som har förmåga att specifikt lösa fettsyror och andra förore- ningar utan att lösa den råa lipiden A. Det föredragna lösningsmedlet för detta ändamål är aceton. Fosfathalten hos den detoxifierade, raffinerade lipiden A är ca hälf- ten av den som observerats för den toxiska motsvarighe- ten, vilket tyder på att fosfathalten är relaterad till endotoxinernas toxiska effekter.

Föredragna oorganiska syror som användes för att reagera med MCP är klorvätesyra, svavelsyra eller fos- forsyra och de föredragna organiska syrorna är toluen- sulfonsyra eller triklorättiksyra. Reaktionen kan lämp- ligen utföras vid en temperatur mellan ca 90° och l30°C under en tidsperiod som är tillräcklig för att fullborda hydrolysen, vanligen mellan ca 15 och 60 minuter.

Framställningen av rått, detoxifierat endotoxin kan även åstadkommas genom att utgångsmaterialet bringas att reagera med syran i närvaro av ett organiskt lös- ningsmedel, såsom kloroform, metanol och etanol eller kombinationer därav.

Den resulterande råa lipiden A löses i aceton, som är särskilt väl ägnad för att avlägsna fettsyra- komponenterna. Lösningsmedlet avlägsnas sedan för att ge rått, detoxifierat endotoxin.

Det råa, detoxifierade endotoxinet löses sedan i ett lösningsmedel och får passera genom en lämplig kromatografisk kolonn, såsom exempelvis en kromatografisk molekyluteslutningskolonn, för att separera RDE-fraktio- nerna som sedan kombineras efter avlägsning av lösnings- medlet. I en utföringsform får den råa, detoxifierade endotoxinlösningen passera genom en Sephadex-kolonn 10 15 20 25 30 35 462 017 5 i närvaro av ett lösningsmedel, såsom kloroform, metanol aceton, pyridin, eter eller ättiksyra, eller kombina- tioner därav. Kolonnens tryck kan variera, men typiskt är det i området mellan ca atmosfäriskt tryck och 7 kp/cmz och flödeshastigheten är mellan ca 0,1 och lO ml/minut.

I en annan utföringsform får den råa, detoxifierade endotoxinlösningen passera igenom en DEAE-cellulosakolonn under samma tryckbetingelser som ovan nämnts för Sephadex- kolonnen. Flödeshastigheten kan hållas mellan ca 2 och 15 ml/min. De använda lösningsmedlen är likaledes samma som användes för Sephadex-kolonnen, ehuru vatten och/eller diethylamin kan sättas till alla blandningar vid en koncentration upp till ca 1%.

Andra metoder för framställning av RDE från rått, detoxifierat endotoxin inbegriper passage av lösningen genom en làgtryckskolonn av silikagel 60 med en partikel- storlek mellan ca 15 och 63_pm.0ch användning av ett lösningsmedel som valts bland kloroform, metanol, vatten och ammoniumhydroxid. Det föredragna volymförhållandet i den ovannämnda lösningsmedelsblandningen är ca 50:25:4:2.

RDE som framställt i enlighet med föreliggande uppfinning och CNS sammanförs för att ge en komposition med potent anti-tumör aktivitet. De cancertyper som kan behandlas med RDE-CWS-kompositionen inbegriper djur- tumörer, såsom skvamös bovincellkarcinom, bovin fibro- ~sarkom, hästsarkoid, hästmelanom, skvamös hästcellkarci- nom, hundbrösttumörer, hundadenom och hundmelanom samt humana tumörer såsom brösttumörer, lungtumörer, en coleo- rektal tumör, malign melanom, skvamösa cellkarcinom och ovariala tumörer.

Kompositionen administreras företrädesvis genom injektion i ett farmaceutiskt acceptabelt medium, såsom en oljedroppsemulsion, direkt in i tumören under beting- elser som mera detaljerat beskrives nedan. Den ovannämnda 462 017 10 15 20 25 30 35 6 kompositionen kan stabiliseras exempelvis genom en lyo- filiseringsprocedur och därefter rekonstitution utan förlust av potens.

Mängden av RDE i en enda injektion för behandling av djur är mellan ca 6,25 och 250 mikrogram/ml. Mängden av CWS är mellan ca 125 och 750 mikrogram/ml. Antalet millilitrar av den biologiska lösningen som injiceras i tumören bestämmes av tumörens storlek i enlighet med följande tabell: Djurdos enligt tumörstorlek Mängd av injicerad biologisk lösning Tumördiameter (cm) 0-l cm upp till 0,5 ml 1-2 om 0,5 till 2,5 ml 2-3 cm 2,5 till 5 ml 3-5 cm 5 till l0 ml 5-8 cm 10 till 15 ml större än 8 cm 15 till 20 ml Den maximala dosen per injektion är ca 1500 mikro- gram för RDE och ca 4500 mikrogram för CWS. Behandlings- omgàngen omfattar upp till 5 injektioner som administre- ras med en veckas mellanrum.

RDE-CWS-kompositionen i ett lämpligt, injicerbart medium, såsom en oljedroppsemulsion, administreras di- rekt i humana tumörer. Mängden av RDE respektive CWS i en enda injektion är mellan ca 50 och 1000 mikrogram, med en föredragen singeldosnivà mellan ca 275 och 325 mikrogram av vardera komponenten för en typisk 70 kg fullvuxen patient. Injektionslösningarna adminsitreras ungefär en gång i veckan upp till totalt 15 injektioner.

I allmänhet är det önskvärt att administrera komposi- tionen som innehåller mellan ca 50 och 500 mikrogram/ml RDE och mellan ca 50 och 500 mikrogram/ml CWS per in- jektion.

Såsom ovan beskrivits kan kompositionen för be- handling av varmblodiga djur och människor användas i form av en oljedroppsemulsion. Mängden av olja som användes är i omrâdet mellan ca 0,5 och 3,0 vol% baserat .-på kompositionens totala volym. Det är föredraget att 10 15 20 'zs 30 35 462 017 7 använda mellan ca 0,75 och 1,5 vol% av oljan. Exempel på sådana oljor inbegriper lätt paraffinolja, squalan, 7-n-hexyloktadekan, Conoco superoil och Drakeol 6 VR paraffinolja (framställda av Pennreco Company, Bulter, Pennsylvania).

Den homogeniserade oljehaltiga blandningen kombi- neras sedan med en detergent som eventuellt kan vara löst i en fysiologisk saltlösning före blandningen.

Mängden av detergent är typiskt mellan ca 0,02 och 0,20 vol% och företrädesvis mellan ca 0,10 och 0,20 vol%, baserat på kompositionens totala volym. Vilket som helst vanligt detergentmaterial kan användas, inbegripet Tween- 80 och Arlacel (framställda av Atlas Chemical Company).

Den blandning som resulterar från tillsättningen av detergent homogeniseras för att bilda en suspension, som har en hög procentsats av oljedroppar belagda med RDE och CWS, såsom konstaterats vid observation under ett mikroskop.

Följande exempel ges enbart i illustrerande syfte och de är inte avsedda att på något sätt begränsa eller omdefiniera uppfinningen såsom den framgår av efterföl- jande patentkrav.

EXEMPEL 1 Framställging av râtti detggifierat ggggtgëig Ett 650 mg prov av en metanol-kloroformfällning som framställts i enlighet med förfarandet enligt Chen, et al J. Infect. Dis. 128 543 (1973) suspenderades i 150 ml 0,ln HCl i en trehalsad, rundbottnad kolv till vilken en kylare var ansluten, och nedsänktes i en ljud- vågsansläggning (sonicator). Efter ultraljudbehandling (sonication) sänktes glasapparaturen i ett oljebad som hölls vid 12000, vilket tillät kolvens innertemperatur att uppnå eller överskrida lösningsmedlets kokpunkt. överhettning av lösningen minimerades genom att ett kapillärrör, som var anslutet till en kvävgaskälla, anslöts igenom en av kolvens halsar. Ett kontinuerligt 462 017 10 15 20 25 30 35 8 flöde av kvävgas upprätthölls under hela hydrolysförfa- randet.

Hydrolysen fick fortgå i 30 minuter, varefter lös- ningen kyldes i ett isbad, ultraljudbehandlades för dispergering av det fasta materialet och fördelades i corex-rör. Kolven tvättades med destillerat vatten för att avlägsna allt fast material som vidhäftade vid kolvens sidor och tvättvätskan sattes till suspensionen i corex-rören. Centrifugering utfördes vid 12000 varv per minut under 80 minuter. Det överliggande lagret dekanterades och kasserades. Den fasta återstoden äter- suspenderades i destillerat vatten, ultraljudbehandla- des tills suspensionen var väl dispergerad och äter- centrifugerades. Centrifugeringsförfarandet upprepades. Återstoden togs upp i destillerat vatten, varpå skal- frysning och lyofilisering gav 382 mg av rä lipid A. 150 mg av detta material behandlades med kall (0°C) aceton för avlägsning av fettsyror, ultraljudbehandlades och filtrerades genom en Whatman nr l självtrycksfilt- reringsapparat vid 5°C. 100 mg rått, detoxifierat endo- toxin kvarstod efter torkning.

EXEMPEL 2 årenssållaiaasiasêisl-êsieëiâiszëasaéeëeëia Ett 120 mg prov av MCP (metanol-kloroformfällning) suspenderades i 120 ml absolut metanol, ultraljudbe- handlades för dispergering av fast material och fördela- des i 6 (l x 10 cm) flaskor med skruvkork.~2 ml av 0,2 n HCl sattes till varje rör och den resulterande suspen- sionen inkuberades i ett kokande vattenbad under 45 minuter. Efter hydrolys kyldes rören i ett isbad och centrifugerades under ca 10 minuter vid 2500 r/min.

Det överliggande lagret dekanterades och 5 ml av en 2:1 kloroform/metanol-blandning sattes till återstoden för att verkställa upplösning. 2 ml vatten tillsattes per rör och lösningen blandades. Tvåfaslösninaen åter- centrifugerades vid 2=00 r/min under 10 minuter. Den 'QX 10 15 20 25 30 35 462 017 9 övre vattenfasen kasserades och l ml av en 4:1 kloro- form/metanol-blandning sattes till varje rör, vilket ledde till en klar lösning. Lösningarna sammanfördes och lösningsmedlet avdunstades medelst en rotationsin- dunstare. Återstoden torkades under högt vakum och lyo- filiserades för att ge 45 mg av rå lipid A. 20 mg av detta material behandlades med kall (0°C) aceton, ultra- ljudbehandlades och filtrerades genom en Whatman nr l självtrycksfiltreringsapparat vid 5°C. 13 mg av rått, detoxifierat endotoxin kvarstod efter torkning.

EXEMPEL 3 E:sasEëllQiLIasX.2ëäâiss:air-êsëeëišiszsasaêsëeëia 110 g LH-20-100 (25-100 pm partikelstorlek: Phar- macia) kombinerades med 600 ml av en 2:1 kloroform/meta- nol-blandning som fick stå i 30 minuter. Den resulterande uppslamningen sattes till en 25 x 1000 mm kromatografi- kolonn av glas (BRL Laboratories) som var försedd med trycktàliga kopplingar. Efter det att packningen var avslutad anslöts kolonnen medelst Teflon-trvckslangar till en ISCO modell 132 pump. 400 ml av en 4:1 kloro- formjmetanol- blandning pumpades genom kolonnen vid en takt av 3 ml/min. 100 mg rått, detoxifierat endotoxin som framställts i enlighet med exempel l sattes på kolon- nen i 2,5 ml av en 4:1 kloroform/metanol-blandning via en provslinga. Flödet minskades till 1 ml/min och efter det att 150 ml elueringsmedel uppsamlats anslöts utflö- det till en fraktionsuppsamlare. 4 ml fraktioner upp- samlades och raffinerade, detoxifierade endotoxinfrak- tioner bestämdes genom tunnskiktskromatografisk analys av fraktionerna (E.Merck, 0,25 mm tjocklek, kloroform/me- tanol/H20/NH40H (50:25:4:2) som elueringsmedel).

De raffinerade, detoxifierade endotoxinfraktionerna sammanfördes och lösningsmedlet avdunstades för att ge 30 mg av raffinerat, detoxifierat endotoxin i form av ett vitt pulver. 462 017 10 15 20 25 30 35 10 EXEMPEL 4 ÉššäšÉëål2i§S-â!-EâiÉšEššâåi-§§E9ëiÉl§EêE-ÉE§9EQ§š2 33 g DEAE-cellulosa (Whatman DE-32) suspenderades i 150 ml isättika och omrördes varsamt under 10 minuter för att ge ett slampulver. Blandningen sattes åt sidan över natten.

Slammet hälldes i en 25 x 400 mm kolonn, och fick sätta sig under knackning, och överskottssyra fick där- efter rinna av. Kolonnen tvättades med 2000 ml metanol, efterföljt av 200 ml av en 4:1 kloroform/metanol-bland- ning. Ett 100 mn prov av rått, detoxifierat endotoxin som framställts i enlighet med exempel l sattes till kolonnen i 3 ml av en 4:1 kloroform/metanol-blandning eller en 80:20:l blandning av kloroform, metanol och vat+en- Koïonnen eluerades med 350 ml av 4:1 kloroform/ -metanol-blandning efterföljt av 300 ml av en 99:l metanol/ vatten-blandning. Med användning av en lineär gradient- apparat eluerades kolonnen med 2000 ml av lineär gradient, börjande med.100% metanol och slutande med 0,2 M ättik- syra i metanol. Kolonnen eluerades vid en takt av 6 ml/min och 15 ml fraktioner uppsamlades. Varannan frak- tion analyserades i fråga om total fosforhalt i enlighet med förfarandet enïigt Bartlett, G.R., J. Biol. Chem. 234, 466-471 (1959). Fraktionerna sammanfördes och in- dunstades medelst en rotationsindunstare nästan till torrhet och togs upp i 10 ml av en 2:1 kloroform/ meta- nol-blandning samt 40 ml av 0,001 M ättiksyra i en se- parationstratt. Det lägre skiktet avskiljdes, filtrera- des genom Whatman nr 2 filterpapper och indunstades till torrhet för att ge 19,2 mg av raffinerat, detoxi- fierat endotoxin.

EXEMPEL 5 Tretton stam 2 marsvin med linje-10 tumörsvulster av ca 9 mm injicerades en gång med 0,4 ml av en steril oljedroppsemulsion, dvs Drakeol 6 VR paraffinolja (Penn- 10 462 017 ll sylvania Refining Company, Butler, Pennsylvania), som innehöll 50 mikrogram (RDE) och 50 mikrogram (CWS) di- rekt in i tumörvävnaden.

Vid slutet av en tremånadersperiod undersöktes djuren och i 12 av 13 djur hade total regression av tumörsvulsten skett. Vid ett kontrollförsök injicerades 6 stam 2 marsvin med linje-l0 tumörsvulster av ca 9 mm en gång med 0,4 ml som enbart innehöll 50 mikrogram RDE. Injektionerna gjordes direkt i tumörvävnaden. Ingen av de 6 tumörerna uppvisade några tecken på regression efter 3 månader.

Claims (10)

462 017 12 PATENTKRAV

1. l. Sätt att framställa raffinerat, detoxifierat endotoxin med inget detekterbart 2-keto-3-deoxioktonoat, mellan ca 350 och 475 nmoler/mg fosfor och mellan ca 1700 och 2000 nmoler/mg fettsyror, k ä n n e t e c k - n a t därav, (a) att ett från mikroorganismer av familjen Ente- robacteriaciae erhållet endotoxínextrakt hydrolyseras med en syra, såsom klorvätesyra, svavelsyra, fosforsyra, toluensulfonsyra eller triklorättiksyra; (b) att den hydrolyserade produkten lyofiliseras för att ge rá lipid A; (c) att den råa lipiden A behandlas med ett första lösningsmedel, såsom aceton, för upplösning av däri innefattade fettsyror; (d) att den resulterande olösliga produkten löses i ett andra lösningsmedel, såsom metanol, kloroform, aceton, pyridin, eter eller ättiksyra, eller en bland- ning av dessa lösningsmedel; och (e) att den resulterande lösningen får passera genom en kromatografisk kolonn för att ge den önskade produkten.

2. Sätt enligt kravet 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att hydrolysen utföres vid en temperatur mellan ca 90 och l30°C.

3. Raffinerat, detoxifierat endotoxin med inget detekterbart 2-keto-3-deoxioktonoat, mellan ca 350 och 475 nmoler/mg fosfor och mellan ca 1700 och 2000 nmoler/mg fettsyror, k ä n n e t e c k n a t därav, att det framställts genom (a) att ett från mikroorganismer av familjen Ente- robacteriaciae erhållet endotoxinextrakt hydrolyserats med en syra, såsom klorvätesyra, svavelsyra, fosforsyra, toluensulfonsyra eller triklorättiksyra; (b) att den hydrolyserade produkten lyofiliserats för att ge rå lipid A; 462 017 13 (c) att den råa lipiden A behandlats med ett första lösningsmedel, såsom aceton, för upplösning av däri innefattade fettsyror; (d) att den resulterande olösliga produkten lösts i ett andra lösningsmedel, såsom metanol, kloroform, aceton, pyridin, eter eller ättiksyra, eller en bland- ning av dessa lösningsmedel; och (e) att den resulterande lösningen fått passera genom en kromatografisk kolonn för att ge den önskade produkten.

4. Terapeutisk komposition omfattande en terapeu- tiskt effektiv mängd av den raffinerade, detoxifierade endotoxinprodukten enligt kravet 3 i kombination med cellväggskelett och en farmaceutiskt acceptabel bärare.

5. Komposition enligt kravet 4, k ä n n e t e c k - n a d därav, att kompositionen är i en lyofiliserad form eller i form av en oljedroppsemulsion.

6. Komposition enligt kravet 4, k ä n n e t e c k - n a d därav, att den terapeutiskt effektiva mängden av raffinerat, detoxifierat endotoxin är upp till 1500 mikrogram per injektion och den effektiva mängden av cellväggskelett är upp till ca 4500 mikrogram per injektion.

7. Användning av en komposition enligt kravet 4, för framställning av ett läkemedel för behandling av cancer hos varmblodiga djur.

8. Användning enligt kravet 7, k ä n n e t e c k - n a d därav, att kompositionen innehåller mellan 6,25 och 250 mikrogram/ml av raffinerat, detoxifierat endotoxin och mellan ca 125 och 750 mikrogram/ml av cellväggskelett och att läkemedlet är i form av ett injektionspreparat för direkt administrering i tumörväv- nad hos ett varmblodigt djur.

9. Användning enligt kravet 7, k ä n n e t e c k - n a d därav, att kompositionen innehåller mellan ca 50 och 1000 mikrogram av vardera av raffinerat, detoxifierat, endotoxin och cellväggskelett, och före- 462 017 14 trädesvis mellan ca 275 och 325 mikrogram av vardera av de ovannämnda materialen, och att det varmblodiga djuret är människa.

10. Användning enligt kravet 9, k ä n n e t e c k - n a d därav, att kompositionen innehåller mellan ca 50 och 500 mikrogram per milliliter av raffinerat, detoxifierat endotoxin och mellan ca 50 och 500 mikro- gram/ml av cellväggskelett och att läkemedlet är i form av ett injektionspreparat för injicering direkt i tumörvävnad.