DK159799B - Fremgangsmaade til paavisning og/eller bestemmelse af en eller flere komponenter i reaktionen mellem et specifikt binderprotein og det tilsvarende bindelige stof, proeveudstyr til anvendelse ved fremgangsmaaden og frysetoerret reagens til anvendelse ved fremgangsmaaden - Google Patents

Description

DK 159799 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til påvisning og/eller bestemmelse af en eller flere komponenter i reaktionen mellem et specifikt binderprotein og det tilsvarende bindelige stof i en vandig prøve under anvendelse 5 af den kendte bindingsaffinitet af sådanne komponenter til hinanden. Disse komponenter kan være receptorproteiner eller immunokemiske komponenter, såsom haptener, antigener eller antistoffer.

Der kendes et stort antal immunokemiske metoder, ved hvilke 10 tilstedeværelsen af en vis immunologisk komponent bestemmes kvalitativt og/eller kvantitativt ved at udnytte de gensidige reaktioner mellem disse komponenter, såsom reaktionen mellem antigen og antistoffet til dette antigen.

Ved undersøgelsen af sådanne reaktioner til påvisning og/el-15 ler bestemmelse af den ønskede komponent kan der gøres brug af hjælpemidler, f.eks. fysiske hjælpemidler, såsom et elektronmikroskop, eller der kan gøres brug af et reagens, som er forsynet med en mærkning, der kan påvises eller bestemmes i en lavere koncentration end det dannede immunokompleks selv.

20 Som eksempler på kategorien af kvalitativ immunokemisk teknik kan nævnes immunodiffusionsmetoden udviklet i 1948 af Ouchterlony og varianten deraf, immunoelektroforese, udviklet i 1953 af Grabar. Radial immunodiffusionsmetoden udviklet af Mancini i 1965 kan anvendes kvantitativt.

25 Immunodiffusionsteknikken kan karakteriseres ved anbringelse af et tyndt lag agar på en glasplade, hvorefter der fremstilles to huller i gelen, lidt fra hinanden. Prøvevæsken med antigen indføres i et af hullerne, og et antiserum i det an det. Som følge af diffusionen af de to stoffer i gelen, møder 30 de hinanden og danner en synlig udfældningslinie. Selv om denne metode er forholdsvis simpel, har den et antal ulemper, især den kendsgerning, at diffusionen varer nogen tid, og at resultaterne i reglen kun giver en kvalitativ indikation. De 2

DK 159799 B

andre immunokemiske metoder har også deres ulemper, som bortset fra specifikke ulemper i almindelighed består af en for lang varighed af prøven, en lav følsomhed og/eller tilvejebringelse af kun kvalitative indikationer.

5 Foruden disse immunokemiske metoder med ikke-mærkede stoffer, er der udviklet nogle metoder med mærkede stoffer i de senere år, hvoriblandt der kan nævnes hæmagglutinationsprøven, ved hvilken en af komponenterne bindes til overfladen af erythro= cyter, immunofluorescensteknikken, ved hvilken en af kompo-10 nenterne mærkes med en fluorescerende forbindelse (fluorqdioi) , den radioimmunologiske bestemmelse udviklet af Yalow og Ber-son, ca. 1959, ved hvilken der i stedet for en fluorophor anvendes et radioaktivt atom eller en radioaktiv gruppe som mærke, og den nyeste teknik til enzymimmunologisk bestemmel-15 se, hvorom den første offentliggørelse fremkom i 1971 fra to grupper, der arbejder uafhængigt af hinanden, nemlig de svenske forskere Engvall og Perlmann og de hollandske Schuurs og van Weemen. Den sidstnævnte bestemmelse er i princippet analog med de kendte radioimmunologiske bestemmelser, men med 20 den forskel, at der anvendes et enzym som mærke i stedet for radioaktiv mærkning.

Den meget anvendte radioimmunologiske bestemmelse har givet mange fordele, men der findes nogle væsentlige ulemper i forbindelse med denne metode, såsom risikofaktoren, der står i 25 forbindelse med at arbejde med radioaktivt materiale, de høje priser for reagenser og apparat, den dårlige stabilitet af radioaktivt mærkede reagenser og det krav, at kun kvalificeret personale får lov at udføre disse bestemmelser.

Den enzymimmunologiske bestemmelsesmetode har ikke disse 30 ulemper, men det er alligevel ønskeligt, at der udvikles ny bestemmelsesteknik, som er endnu mere følsom, kan udføres hurtigere, lettere kan automatiseres og/eller gøre det muligt at bestemme mere end én immunokomponent samtidigt.

3

DK 159799 B

Desuden er der et stort behov for en pålidelig og praktisk bestemmelse af receptorproteiner.

Dette opnås ved den foreliggende opfindelse, der angår en fremgangsmåde til påvisning og/eller bestemmelse af en eller flere komponenter 5 af reaktionen mellem et specifikt binderprotein og det tilsvarende bindelige stof i en vandig prøve under anvendelse af den kendte bindingsaffinitet af disse komponenter til hinanden, og fremgangsmåden er ejendommelig ved, at der anvendes en eller flere mærkede komponenter, fremkommet ved 10 kobling direkte eller indirekte af den ønskede komponent af reaktionen til partikler i en vandig dispersion af et metal, en metalforbindelse eller polymere kerner overtrukket med et metal eller en metalforbindelse, og som har en partikelstørrelse på mindst 5 nanometer, idet under reaktionen eller ef-15 ter en passende reaktionstid, eventuelt efter adskillelse af de bundne og frie mærkede komponenter, de fysiske egenskaber og/eller mængden af metallet og/eller det dannede metalholdige agglomerat bestemmes i prøven eller en af de afledte fraktioner på i og for sig kendte måder, hvilken bestemmelse 20 giver en kvalitativ og/eller kvantitativ indikation af komponenten eller komponenterne, som skal påvises og/eller bestemmes .

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er særligt egnet til bestemmelse af immunokemiske komponenter, såsom haptener, anti-25 gener og antistoffer.

Partiklerne i den vandige dispersion af et metal, en metalforbindelse eller polymere kerner, overtrukket med et metal eller en metalforbindelse, har en partikelstørrelse på mindst 5 nanometer og fortrinsvis 10 til 100 nanometer. Dispersioner 30 med en partikelstørrelse på 10 til 100 nanometer af den disperse fase er i reglen soler, men andre typer dispersioner er ikke udelukket.

Komponenten, der skal mærkes, kobles direkte eller indirekte 4

DK 159799 B

til de disperse partikler. Ved kobling forstås enhver kemisk eller fysisk binding, såsom binding via kovalente bindinger, via hydrogenbindinger, polær attraktion og adsorption.

Hvor der i den foreliggende beskrivelse anvendes udtrykket 5 metalsolpartikler, skal dette forstås som betegnende partikler af en sol bestående af et metal, en metalforbindelse eller polymere kerner overtrukket med et metal eller en metalforbindelse .

Brugen af metalsolpartikler især .. af guldsoler, som er 10 dækket på overfladen med antistoffer,til påvisning af fordelingen af et antigen over en celleoverflade ved hjælp af scanningelektronmikroskopi, hvor metalsolpartiklerne anvendes som kontrastforøgende mærke, er allerede blevet beskrevet for nogle år siden (se en artikel af M. Horisberger i 15 Experientia, side 1147-1149, 15. oktober 1975), men anvendelsen af disperse partikler, fortrinsvis metalsolpartikler som mærke for en immunologisk komponent til en in vitro kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af immunologiske komponenter, såsom haptener, antigener og antistoffer i et vandigt prøve-20 medium er ikke tidligere beskrevet og har overraskende vist sig at være mulig.

Den immunokemiske teknik med metalsolpartikler ifølge opfindelsen kan være ikke blot mere følsom end den kendte radio-immuno- og enzymimmunoteknik, men gør det endvidere muligt 25 at påvise og bestemme mere end én immunologisk komponent i samme prøvemedium samtidig ved at anvende solpartikler af forskellig kemisk sammensætning som mærker.

Metalsolerne kan være af metaller eller metalforbindelser, såsom metaloxider, metalhydroxider og metalsalte eller af 30 polymere kerner overtrukket med metaller eller metalforbindelser. Som eksempler kan nævnes metallerne platin, guld, sølv og kobber og metalforbindelserne sølvjodid, sølvbromid, kobberhydroxid, jernoxid, jernhydroxid, aluminiumhydroxid,

DK 159799 B

5 chromhydroxid, vanadinoxid, arsensulfid, manganhydroxid, blysulfid, mercurisulfid, bariumsulfat og titandioxid.

Generelt kan anvendes alle metaller eller metalforbindelser, c som let kan påvises ved hjælp af kendt teknik.

5

Det er sommetider fordelagtigt at anvende soler med disper-gerede partikler bestående af polymere kerner, overtrukket med ovennævnte metaller eller metalforbindelser. Disse par-10 tikler har lignende egenskaber som den disperse fase af rene metaller eller metalforbindelser, men størrelse, vægtfylde og metalindhold kan kombineres optimalt.

Fortrinsvis anvendes metaller eller metalforbindelser, som 15 ikke er tilstede eller kun er tilstede i meget små mængder i prøvemediet, især de metaller eller metalforbindelser, som har lav sporingsgrænse ved egnet analyseteknik.

Metalsolpartiklerne, der skal anvendes som mærke, kan frem-20 stilles på mange forskellige måder, der er kendt i sig selv.

Til fremstilling af f.eks. en guldsol kan henvises til en artikel af G. Frens i Nature Physical Science 241, 20 (1973).

Metalsolpartiklerne bærer en ladning, som giver en stabili-25 serende virkning ved gensidig frastødning. Ved tilsætning af hovedsagelig stærke elektrolytter ændres ladningsmønstret, som følge af hvilket der sker aggregation og flokkulation. Dette kan forhindres ved at overtrække partiklerne med makro-molekyler, som har polære grupper, såsom proteiner, polyethy= 30 lenglycoler, polymere kulhydrater og polyvinylalkoholer.

Som beskyttende proteiner er det muligt at anvende antigener, antistoffer og anti-antistoffer, eller immunokemisk aktive fragmenter deraf, eller haptener, som er blevet koblet til 3 5 immunokemisk indifferente beskyttende makromolekyler, hvilket resulterer direkte i immunokomponenter mærket med metalsol- 6

DK 159799 B

partikler.

Det er ikke nødvendigt, at immunokomponenter anvendes udelukkende til overtrækning af metalsolpartiklerne, for selv om dette giver en stabiliserende virkning, kan den immuno= 5 kemiske reaktionsdygtighed være mindre end forventet, sandsynligvis på grund af sterisk hindring. Det har derfor vist sig fordelagtigt også at overtrække kun delvis med en immuno= komponent og at fuldende overtrækningen med et andet beskyttende, men immunokemisk indifferent materiale, såsom indif-10 ferente proteiner, f.eks. albumin, en polyethylenglycol eller et andet polært makromolekyle. Som overtrækningsmateriale kan der også gøres brug af protein Δ eller beslægtede proteiner, som har reaktionsdygtighed over for Fc-delen af antistoffer. Efter overtrækning af metalsolpartiklerne med pro= 15 tein A kan der bevirkes en yderligere overtrækning med et valgt antistof.

En anden mulighed består i først at overtrække metalsolpartiklerne med et indifferent hydrofilt makromolekyle, f.eks. en polymer eller copolymer, hvorefter den immunologiske kom-20 ponent kobles med overtræksmaterialet ved adsorption eller ved kovalent binding.

De små kugler fremkommet efter overtrækning kan indeholde en enkelt metalsolpartikel, men det er også muligt, at den poly= mere indeslutter mere end en metalsolpartikel.

25 Overtrækningen af metalsolpartiklerne med den indifferente polymer kan ske på to måder, enten ved at bringe metalsolén i berøring med den polymere eller ved indføring af metalsolen i omgivelser indeholdende en monomer eller forskellige monomere og bringe disse til at polymerisere eller copolyme= 30 risere in situ. Polymerisationen kan igangsættes under påvirkning af stråling eller ved tilsætning af igangsættere, såsom et persulfat.

DK 159799B

7

Overtrækning åf en metalsolpartikel ved polymerisation af det monomere medium, hvori partiklen befinder sig, under på-^ virkning af en uorganisk igangsætter, såsom et persulfat, indebærer praktiske vanskeligheder, da solen flokkulerer ved tilsætning af en sådan igangsætter. Det har nu vist sig, at en sådan overtrækning er mulig ved først at beskytte metal-solpartiklernej derpå indføre, de beskyttede partikler i det monomere medium og derpå til sidst igangsætte polymerisationen. De ovenfor nævnte forbindelser kommer i betragtning som beskyttende materiale.

Komponenterne mærket med metalsolpartikler anvendes som rea-gens i almindelighed i kombination med andre reagenser til påvisning og kvantitativ bestemmelse af receptorproteiner og haptener, antigener og antistoffer i et vandigt prøvemedium, hvortil enhver art immunokemisk teknik, der anvendes i radio-immunoprøver og enzymimmunoprøver kommer i betragtning.

20

Opfindelsen angår derfor også prøveudstyr til brug ved sådan immunokemisk teknik og som angivet i krav 10's indledning, hvilket udstyr er ejendommelig ved det i krav 10's kendetegnende del angivne.

25

En af de sædvanlige immunokemiske metoder er den kompetitive immunoprøve, som kan anvendes til påvisning og bestemmelse af enhver immunokomponent. Til påvisning af f.eks. et vist an-tigen består denne metode i at bringe en prøve indeholdende en ukendt mængde antigen i berøring med enten en vis mængde af det pågældende metalmærkede antigen og et uopløseliggjort antistof mod dette antigen, eller en vis mængde uopløselig-gjort antigen og et metalmærket antistof mod dette antigen.

35

Efter en tilstrækkelig reaktionstid bestemmes karakteren og/ eller mængden af metallet i den bundne eller frie fraktion, 8

DK 159799 B

hvilket giver henholdsvis en kvalitativ eller kvantitativ indikation af antigenet, som skal bestemmes. Med passende ændringer i enkelthederne anvendes en analog fremgangsmåde til bestemmelse af andre immunokomponenter.

5 De såkaldte sandwich-metoder anvendes også meget. Disse er også særligt egnede til brug af en metalmærkekomponent ifølge opfindelsen. Ved disse fremgangsmåder bliver en immunologisk komponent, f.eks. et antistof, hvis et antigen skal bestemmes, gjort uopløselig ved kobling til en fast bærer. Denne 10 faste bærer er f.eks. den indre overflade af reaktionsbeholderen, hvori den immunokemiske reaktion udføres. Efter en indledende inkubation, eventuelt fulgt af en vask, sker der en anden inkubation med et metalmærket antistof, hvorefter metallet bestemmes i den bundne eller den frie fase. Det er 15 fordelagtigt at bestemme metallet i den bundne fase. Efter fraskillelse af faserne bliver i dette tilfælde det bundne mærke fortrinsvis frigjort, således at metallet kan bestemmes i den fremkomne væske.

Endvidere kan anvendes en homogen agglutination. Hvis prøven 20 indeholder den immunokemiske komponent, som skal bestemmes, sker der agglutination med den mærkede immunokemiske komponent, hvilket resulterer i en ændring af optiske egenskaber.

Et kvalitativt eller semikvantitativt resultat kan opnås ved iagttagelse af farveændringen. Det er også muligt at iagttage 25 reaktionens forløb med et spektrofotometer.

Foruden de ovennævnte fremgangsmåder er der talrige andre immunokemiske metoder, hvori de metalmærkede immunokomponenter kan anvendes som reagens. Den foreliggende opfindelse gør det også muligt at påvise forskellige haptener, antigener, 30 antistoffer eller kombinationer deraf samtidig i én prøve ved som reagens for hver af komponenterne, der skal påvises at anvende en immunokomponent, der er blevet mærket med en forskellig metalsolpartikel.

. DK 159799 B

9 Målingen af de fysiske egenskaber og/eller koncentrationen af metallet og/eller det dannede metalholdige agglomerat i 5 en vis fase af reaktionsblandingen kan ske under anvendelse af meget forskellig teknik, der er kendt i sig selv. Som eksempler på disse fremgangsmåder kan nævnes den kolorime-triske bestemmelse, ved hvilken der gøres brug af den intense farve af nogle dispersioner, som endvidere ændrer far-10 ve med fysiskkemiske ændringer, den visuelle metode, der of te allerede er anvendelig til kvalitative bestemmelser i betragtning af den ovennævnte omstændighed, at metalsoler er farvede. Brugen af flammeemissionsspektrofotometri eller en anden plasmaemissionsspektrofotometrisk metode, som gør 15 samtidig bestemmelse mulig, og den meget følsomme metode med flammefri atomabsorptionsspektrofotometri.

Fortrinsvis indeholder prøveudstyret en metalmærket komponent 2Q bestående af en sol, som har partikler med en størrelse, der varierer fra 10 til 100 nanometer, som er enten direkte overtrukket med komponenten i reaktionen eller med en indifferent polymer, hvortil den ønskede komponent er blevet koblet.

25 Den metalmærkede komponent i prøveudstyret ifølge opfindel sen kan være en metalmærket immunokomponent. Den metalmærkede komponent kan være tilstede som en dispersion, men overraskende viste det sig at være muligt at få et stabilt frysetørret produkt, som kan gendispergeres før brugen. Opfindelsen 30 angår således også et frysetørret reagens til brug ved den om handlede fremgangsmåde, hvilket reagens er ejendommeligt ved det i den kendetegnende del af krav 12 angivne. Den frysetørrede, metalmærkede komponent kan også indeholde stødpudestoffet, som kræves til udførelse af reaktionen mellem det speci-35 fikke binderprotein og det tilsvarende bindelige stof.

10

DK 159799 B

Opfindelsen illustreres nærmere af følgende eksempler.

5 Eksempel 1.

Kolorimetrisk bestemmelse af human placental lactogen (HPL) ved hjælp af et antistof mærket med guldpartikler fra et kanin anti-HPL serum.

10 1.1. Fremstilling af guldsolen.

500 ml af en 0,10 g/1 hydrogenguldchlorid (HAuCl^) opløsning i destilleret vand opvarmes til kogepunktet i et bægerglas 15 ved en kapacitet på 800 ml. 3,5 ml af en 10 g/1 opløsning af trinatriumcitrat i destilleret vand indføres i den kogende opløsning, hvorefter guldsolen, som er blevet mørkerød efter en begyndende blå farve, koges i yderligere 15 minutter. Efter afkøling til stuetemperatur fyldes den således fremkomne 20 røde guldsol op til et rumfang til 500 ml med destilleret vand i en volumetrisk kolbe. Den på denne måde fremkomne guldsol består af guldpartikler med diametre mellem 45 og 70 nanometer, bekræftet med elektronmikroskopi. En guldsol fremstillet på denne måde havde en pH-værdi på 3,45 i 0,07 og et X cm.

25 lysabsorptionsmaksimum ved 536 nanometer, medens nm = 1,15 + 0,03.

1.2. Fremstilling af kanin anti-HPL sera.

30 Anti-HPL sera blev fremstillet ved at indsprøjte en HPL-opløs- ning i kaniner efter følgende skema: 35

DK 159799 B

11

Dag Injektionsmåde yg HPL Opløst i med CFA

NaCl 9 g/1 1 intramuskulært 100 0,5 ml 0,5 ml 15 " 200 0,5 ml 0,5 ml 5 29 " 400 0,5 ml 0,5 ml 43 intravenøst 200 1,0 ml 50 blodprøve til bestemmelse af titeren af antiserummet i en EIA-prøve.

10 Kaninerne blev tappet så snart titeren af antiserummet ved en EIA HPL-prøve var større end 1:5000. Hvis dette ikke var tilfældet, fik kaninerne en yderligere injektion af 200 yg HPL i 1,0 ml 9 g/1 NaCl (intravenøst), og titeren af antiserummet blev bestemt igen 7 dage efter denne injektion. An-15 tiseraene blev lagret ved -25°C eller frysetørret og deref ter lagret som et tørt pulver ved -25°C.

1.3. Fremstilling af anti-HPL immunglobulinopløsningen af kanin anti-HPL serum.

20

Til dette formål opløses 600 mg frysetørret kanin anti-HPL serum i 7,5 ml af en 9 g/1 NaCl opløsning. 10 ml 180 g/1 Na2SO^ opløsning i destilleret vand tilsættes så, efterfulgt af 1,35 g fast Na2SO^. Den fremkomne uklare væske får lov 25 at henstå i et centrifugeglas i 1 time, hvorefter væsken centrifugeres med 25000 N/kg i 10 minutter. Den overliggende væske frasuges, og remanensen gendispergeres i 20 ml af en 180 g/1 Na2SO^ opløsning i destilleret vand. Denne fremgangsmåde gentages to gange.

30

Efter den sidste centrifugering og fjernelse af den overliggende væske ved sugning opløses remanensen i 20 ml af en 9 g/1 opløsning af NaCl i destilleret vand. Denne opløsning dialyseres over for 6 liter dialysevæske bestående af en 35 0,3 g/1 NaCl opløsning i destilleret vand, som var blevet indstillet til en pH-værdi på 7,0 med en opløsning af 0,2 mol K2CO3 i 1 liter destilleret vand. Dialyse fortsættes i 16

DK 159799 B

12 timer ved 4°C, hvorefter den dialyserede væske centrifugeres ved 160.000 N/kg i 20 minutter. Immunoglobulinopløsningen lagres i 1 ml flasker ved en temperatur på -20°C.

1 ciu

Immunoglobulinindholdet bestemmes ved måling af A^gQ ^ og 5 A^ en tidobbelt fortynding af immunoglobulinopløsningen under anvendelse af et spektrofotometer. Immunoglobu= linindholdet G i mg/ml kan så beregnes ved anvendelse af formlen G = 10 x [(1,45 x A^cTnm1'(0'75 x ^SlTnm1 ] · 1.4. Fremstilling af konjugatet af guldpartikel og kanin 10 anti-HPL immunoglobulin.

500 ml af guldsolen fremstillet som beskrevet under 1.1. indstilles til pH 7,0 ved hjælp af en opløsning af 0,2 mol l^CO^ i 1 liter destilleret vand. 0,5 ml af kanin anti-HPL immuno= globulinopløsningen med et indhold af 125 ug immunoglobulin 15 pr. ml, sættes dråbevis under kraftig omrøring til 25 ml af den neutraliserede guldsol. 0,5 ml af en 50 g/1 opløsning af okseserumalbumin (BSA) i 5 mmol NaCl/liter i destilleret vand, som er blevet indstillet til pH 7,0 med en 0,2 ml I^COg opløsning i 1 liter vand, tilsættes så, ligeledes under om-20 røring.

Det på denne måde fremkomne konjugat af guldpartikel og kanin anti-HPL immunoglobulin centrifugeres ved 25.000 N/kg i 10 minutter, hvorefter den overliggende væske frasuges. Den røde pellet, bestående af konjugatet, optages i et sådant 25 rumfang (ca. 23 ml) TRIS, 0,01 mol/liter indstillet til pH 7,4 med 0,01 mol/liter HC1 i destilleret vand (0,01 mol/liter TRIS/HC1 stødpude, pH = 7,4) , at den endelige hl™ er 1,00.

536 nm fil)

1.5. Overtrækning af Microelisa^ plader med kanin anti-HPL

30 immunoglobuliner.

Til dette formål fremstilles en kanin anti-HPL immunoglobulin-

DK 159799 B

13 opløsning med et indhold af 25 yg immunoglobulin pr. ml, i en opløsning af 0,04 mol Na2HPO^ pr. liter indstillet til pH 7,4 med en opløsning af 0,04 mol Na^PO^ pr. liter, begge i destilleret vand, hvortil der er sat 0,1 g/1 Merthiolat.

5 0,1 ml af den ovenfor beskrevne immunoglobulinopløsning an bringes i hver fordybning i Microelisa® pladen, hvorefter pladen inkuberes i 16 timer ved 0-4°C. 0,1 ml 200 g/1 BSA-opløsning i en 0,04 mol/1 phosphatstødpude, pH 7,4, hvortil der er sat 0,1 g/1 Merthiolat, pipetteres så i hver fordyb-10 ning, og det hele inkuberes i yderligere 30 minutter ved stue- (5) temperatur. Fordybningerne i Microelisa ^ pladerne suges nu tomme og vaskes 3 gange med destilleret vand, hvorefter de holdes ved -20°C til brugen.

1.6. Forsøgsprotokol for HPL bestemmelse med konjugat af 15 guldpartikler og kanin anti-HPL immunoglobulin.

1.6. a. Bestemmelse af en standardkurve for HPL.

En standardkurve blev konstrueret for HPL efter nedenstående protokol.

1. Pipetter 0,1 ml af standard HPL-opløsning i en fordybning (ri 20 i en Microelisa ^ plade overtrukket med kanin anti-HPL immu= noglobulin og inkuber i 2 timer ved stuetemperatur.

2. Sug fordybningen tom og vask den med 0,1 ml 0,01 mol/1 tris/HCl stødpude, pH 7,4.

3. Pipetter 0,1 ml konjugat af guldpartikel og kanin anti- 1 cm 25 HPL immunoglobulin (A^g nm = 1/00) 1 fordybningen og inkuber natten over ved stuetemperatur.

4. Tøm fordybningen ved sugning og vask den med 0,3 ml 0,01 mol/1 tris/HCl/NaCl stødpude, pH 7,4.

DK 159799 B

14 5. Pipetter 0,1 ml 0,1 mol/1 HCl-opløsning i vand i fordybningen og lad denne virke i 30 minutter i et rysteapparat.

6. Mål lysabsorptionen ved 536 nm med et spektrofotometer af lille rumfang.

5 Resultaterne af bestemmelsen af en standardkurve er anført i nedenstående tabel.

1 cm HPL koncentration i a;t ved slutningen af prøven s tandardopløsningen, nm ng/ml 10 0 0,030 0,2 0,030 0,8 0,060 3,2 0,106 12,5 0,136 15 50 0,188 200 0,220

Opløsningsmidlet for HPL standardopløsningen er 0,04 mol/1 phosphatstødpude + 1 g/1 BSA + 9 g/1 NaCl, pH 7,4.

1.6.b. Bestemmelse af HPL i serum fra svangre kvinder.

20 Sera fra svangre kvinder blev fortyndet således, at HPL-niveauet lå fra 5 til 80 ng/ml.

Fortyndingsmidlet for seraene var 0,04 mol/1 phosphatstødpude, pH 7,4 + 1 g/1 BSA + 9 g/1 NaCl.

Ved hjælp af forsøgsprotokollen, beskrevet under 1.6.a., 25 blev HPL-koncentrationerne af de fortyndede sera bestemt under anvendelse af den konstruerede standardkurve. Efter korrektion for fortyndingsfaktoren, fremkom følgende resultater .

DK 159799 B

15

Serum HPL-indhold, EIA-prøve HPL-indhold, MIA

A 4,5+0,5 yg/yml 4 + 1 ygyml B 3,2+0,4 yg/ml 3,5 + 0,8 yg/ml C 0,7+0,1 yg/ml 1+0,3 yg/ml 5 Eksempel 2.

Bestemmelse af HPL ved hjælp af guldpartikelmærkede antistoffer og atomabsorptionsspektrofotometri.

2.1. Fremstilling af reagenser og overtrukne Microelisa ® plader.

10 Fremgangsmåden til fremstilling af konjugat af guldpartikler og kanin anti-HPL immunoglubulin og Microelisa ^ plader overtrukket med kanin anti-HPL immunoglobulin var den samme som beskrevet i eksempel 1.

2.2. Forsøgsprotokol.

15 2.2.a. Bestemmelse af standardkurve for HPL.

For at konstruere en standardkurve for HPL blev der foretaget seriefortyndinger af HPL af i rækkefølge 1, 10, 100 og 1000 ng/ml og en blank. Opløsningsmidlet for HPL var 0,04 rnol/1 phosphatstødpude, pH 7,4, hvortil der var sat 1 g/1 BSA og 20 9 g/1 NaCl.

1. Pipetter 0,1 ml standard HPL-opløsning i fordybningen i den overtrukne Microelisa-plade og inkuber i 2 timer ved stuetemperatur.

2. Sug fordybningen tom og vask med 0,1 ml 0,02 mol/liter 25 tris/HCl stødpude, pH 7,4.

3. Pipetter 0,1 ml konjugat af guldpartikel og anti-HPL antistof (A53gmnm = 1,00) i fordybningen og inkuber nat-

DK 159799 B

16 ten over (ca. 16 timer).

4. Sug fordybningen tom og vask den med 0,02 mol/1 tris stødpude, pH 7,4.

5. Pipetter 0,1 ml HC1, 0,1 mol/1, i fordybningen og lad 5 dette reagere under rystning på en rystemaskine i 30 minutter.

6. Mål nu topværdien af lysabsorptionen ved 242,8 nm i et flammeatomabsorptionsspektrofotometer udstyret med en injektor af lille rumfang.

10 Et typisk eksempel på en standardkurve fremkommet på denne måde er vist i nedenstående tabel.

HPL koncentration i Topværdi af lysabsorption standardopløsning ved 242,8 nm efter afslutning af prøven 15 0 ng/ml 0,020 1 ng/ml 0,040 10 ng/ml 0,160 100 ng/ml 0,200 1000 ng/ml 0,220.

20 2.2.b. Bestemmelse af HPL i serum fra svangre kvinder.

Sera fra svangre kvinder blev fortyndet således, at HPL-nivea-et lå i intervallet 5-80 ng/ml. Fortyndingsmidlet fra seraene var 0,04 mol/1 phosphatstødpude (pH =7,4) +1 g/1 BSA + 9 g/1 NaCl. Ved hjælp af den under 2.2.a. beskrevne forsøgs-25 protokol blev HPL-koncentrationerne af de fortyndede sera bestemt under anvendelse af den konstruerede standardkurve.

Eksempel 3.

Visuel påvisning af hepatitis B antigen (HBsAg) ved hjælp

•D

DK 159799 B

17 af konjugat af guldpartikler og fåreanti-HBs immunoglobulin.

3.1. Fremstilling af guldsolen.

Se eksempel 1.1.

3.2. Fremstilling af fåre anti-HBs sera.

5 Får blev injiceret med renset HBsAg-opløsning.

3.3. Fremstilling af fåre anti-HBs immunoglobulinopløsningen.

1,4 g fast Na2S04 sættes til 10 ml fåre-anti-HBsAg serum. Efter at alt natriumsulfatet er opløst, får den uklare væske lov at henstå 1 time ved stuetemperatur. Væsken centrifuge-10 res så ved 25.000 N/kg i 10 minutter. Den overliggende væske fjernes ved sugning, og remanensen gendispergeres i 10 ml 140 g/1 Na2S04-opløsning i destilleret vand. Denne fremgangsmåde gentages to gange.

Efter centrifugering sidste gang og fjernelse af den overlig-15 gende væske ved sugning, bliver den dannede pellet opløst i 10 ml 9 g/1 NaCl-opløsning i destilleret vand. Denne opløsning dialyseres over for 6 liter af en 0,3 g/1 NaCl-opløsning i destilleret vand, indstillet til pH 7,0 med en opløsning af 0,2 mol/1 I^CO^. Dialysen sker i 16 timer ved 4°C, hvor-20 efter den dialyserede væske centrifugeres i 20 minutter ved 160.000 N/kg.

Immunoglobulinopløsningen lagres i portioner på 1 ml i flasker ved -20°C. Immunoglobulinindholdet bestemmes ved den allerede beskrevne A^,^111 , A^0»m -metode.

260 nm 280 nm 25 3.4. Fremstilling af konjugat af guldpartikler og fåre anti- HBs immunoglobulin.

Fremstillingen af konjugatet er identisk med fremstillings-

DK 159799 B

18 måden, der er beskrevet i eksempel 1, pkt. 4, med undtagelse af, at der blev anvendt en fortyndet opløsning (125 ng immunoglobulin pr. ml) af fåre-anti-HBs immunoglobulinopløsningen i stedet for kanin anti-HPL immunoglobulinopløsningen.

5 3.5. Overtrækning af Microelisa ^ plader med fåre anti-HBs immunoglobuliner.

Overtrækningen af Microelisa® pladerne med fåre anti-HBs immunoglobuliner udføres på den måde, der er beskrevet i eksempel 1, pkt. 5, idet der blev anvendt fåre anti-HBs immu-10 noglobulinopløsning i stedet for en kanin anti-HPL immunoglo= bulinopløsning. Ti kontrolfordybninger var inkluderet i hver plade. Disse fordybninger blev overtrukket med en immunoglo= bulinopløsning fra human serum, som var negativ ved følgende prøver: 15 Hepanosticon og Hepanostika Monosticon Rheumanosticon

Immunodiffusion over for normal fåreserum EIA for anti-HBs.

20 3.6. Forsøgsprotokol for en visuelt aflæselig prøve.

1. Pipetter 0,1 ml af prøven i en fordybning i en overtrukket Microelisa-plade og inkuber i 2 timer ved 37°C.

2. Vask hver fordybning tre gange med 0,3 ml 0,02 mol/1 tris/ HC1 stødpude, pH 7,4.

25 3. Pipetter- 0,1 ml konjugat af guldpartikler og fåre-anti- 1 om HBs (A53g = 1/00) i fordybningen og inkuber natten over ved stuetemperatur.

4. Tøm fordybningen ved sugning og vask den tre gange med 0,3 ml 0,01 mol/1 tris/HCl/NaCl stødpude, pH 7,4.

DK 159799 B

19 5. Pipetter 0,1 ml 0,1 mol/1 HC1 opløsning i destilleret vand i fordybningen, og lad dette virke i 30 minutter på rysteapparat.

6. Bedøm visuelt farven af væsken i fordybningen og sammen-5 lign den med den tilstedeværende kontrolfordybning.

Sera, som gav en stærk positiv reaktion i Hepanostika-prøven, kunne generelt stadig skelnes fra kontrollerne i 8-dobbelt fortynding.

Eksempel 4.

10 Bestemmelse af testosteron ved hjælp af et konjugat af sølvpartikler og testosteron-lla-succinyl-okseserumalbumin.

4.1. Fremstilling af sølvsolen.

8,5 ml af en 10 g/1 AgNO^-opløsning i destilleret vand fortyndes med 486,5 ml destilleret vandlog 5 ml af en 10 g/1 15 opløsning af trinatriumcitrat, 21^0 i destilleret vand tilsættes så. 40,0 ml af en 10 g/1 opløsning af hydrazin i destilleret vand sættes til denne opløsning ved stuetemperatur under kraftig omrøring under anvendelse af magnetisk omrører. En grå-gul-grøn sølvsol med stærk Tyndall spredning 20 dannes i løbet af 60 sekunder. Efter 10-dobbelt fortynding med destilleret vand, var pH-værdien 8,85, og solen havde en lysabsorption på = Or 83.

20 ml af den ufortyndede sol blev centrifugeret i 10 minutter ved 25.000 N/kg. 15 ml af den overliggende væske blev 25 fjernet ved sugning og erstattet med 15 ml af en 0,1 g/1 trinatriumcitrat,2H20-opløsning i destilleret vand (pH 6,88).

Vaskeprocessen blev gentaget to gange. Efter den sidste vask blev rumfanget fyldt op til 20 ml med den 0,1 g/1 natriumci-tratopløsning.

20

DK 159799B

Efter 4-dobbelt fortynding med destilleret vand, havde solen følgende egenskaber: Λ λ maks. = 416 nm A1™ = 1,12 416 nm 5 pH = 7,0.

4.2. Fremstilling af testosteron-lla-hemisuccinat-BSA.

40 mg testosteron-lla-hemisuccinat opløses i 2 ml dimethyl= formamid, og opløsningen afkøles til -15°C.

140 mg okseserumalbumin opløses i 3 ml destilleret vand, hvor-10 efter der tilsættes 1 dråbe 4N NaOH og 2 ml DMF, og det hele afkøles til -15°C.

12,5 yl N-methylmorpholin og 12,5 yl isobutylchlorformiat sættes nu til steroidopløsningen. Efter 3 minutter sættes opløsningen til BSA-opløsningen. Efter omrøring i 1 time ved -15°C 15 og 3 timer ved 0°C, overføres opløsningen til en dialysesæk og dialyseres natten over over for rindende postevand. Dia-lysatet føres gennem en Sephadex G25 søjle, eventuelt efter centrifugering, og proteinfraktionen opsamles og frysetørres.

4.3. Fremstilling af antisera for testosteron.

20 Kaniner blev immuniseret ved injektion af 1,25 mg testosteron-lla-hemisuccinyl-BSA, opløst i 2,5 ml fysiologisk saltopløsning, og 2,5 ml fuldstændig Freunds adjuvant (1 ml i.m. 3 gange, interval 1 uge). De fik så en intravenøs injektion af 1 ml af en opløsning af 1,25 mg testosteron-lla-hemisuccinyl-25 BSA i 5 ml fysiologisk saltopløsning.

Injektionsskemaet blev gentaget, indtil titeren af antiserum-met var tilstrækkelig høj. Kaninerne blev så tappet, og seraene blev lagret ved -20°C indtil anvendelsen.

DK 159799 B

21 4.4. Fremstilling af polystyrenglas overtrukket med kanin-immunoglobulin over for testosteron.

En kanin-anti-testosteron-immunoglobulinopløsning fremstilles ved udsaltning med 180 g/1 Na2SO^ som beskrevet i eksem-5 pel 1, pkt. 2.

Den dialyserede immunoglobulinopløsning fortyndes (til en koncentration på 1 ug immunoglobulin/ml) med en stødpude bestående af 0,1 mol/liter NaE^PO^E^O, 60 g/1 saccharose, indstillet til pH 7,4 med 4 mol/1 NaOH. 1 ml af immunoglo= 10 bulinopløsningen pipetteres i hver 3 ml polystyrenglas og inkuberes natten over ved stuetemperatur. Glassene tømmes så ves sugning og fyldes med 1 ml 10 g/1 BSA-opløsning i ovennævnte stødpude. Efter to timer tømmes glassene ved sugning og vaskes tre gange med 3 ml destilleret vand. Rørene tørres 15 fuldstændigt ved sugning og tørres yderligere over silicagel natten over. De pakkes så i aluminiumfolie i sæt på 25 med en pose silicagel og lagres ved 4°C.

4.5. Fremstilling af konjugat af sølvpartikler og testosteron-llcc-hemisucciny 1-BSA.

20 20 ml af sølvsolen, fremstillet som beskrevet i 4.1., blev fortyndet med 80 ml 0,3 g/1 NaCl, og pH-værdien blev indstillet til 7,0 med 0,01 mol/1 NaOH-opløsning i destilleret vand.

A*™ = 1,08.

421 nm ' 3 ml af en opløsning af testosteron-lla-hemisuccinyl-BSA, 25 175 yg/rnl i 0,3 g/1 NaCl indstillet til pH 7,0 med 0,01 mol/1

NaOH, sættes så dråbevis til 15 ml af denne sol under kraftig omrøring med magnetisk omrører.

Det hele inkuberes i ca. 10 minutter, hvorefter der tilsættes 2 ml 10 g/1 Carbowax 20M-oplØsning i 0,3 g/1 NaCl, ind-30 stillet til pH 7,0 med 0,01 mol/1 NaOH. Det rå konjugat vaskes derefter ved at centrifugere 10 ml med 25.000 N/kg i 20 22

DK 159799B

minutter. 9 ml overliggende væske fjernes nu ved sugning og erstattes af 9 ml vaskevæske bestående af 1 g/1 Carbowax 20M-opløsning i 0,3 g/1 NaCl, indstillet til pH 7,0 med 0,01 mol/liter NaOH opløst i destilleret vand. Efter vask 3 gange, 5 centrifugeres konjugatet igen, hvorefter den overliggende væske fjernes ved sugning. Remanensen gendispergeres i 0,02 mol/liter phosphatstødpude, pH 7,4. Konjugatopløsningen har X cm nu en pH-vær di på 7,4 og A^-^ ^ = 1,08. De vaskede konjuga-ter lagres ved 4°c indtil brugen.

10 4.6. Forsøgsprotokol for bestemmelse af testosteron med kon jugatet af sølvpartikler og testosteron-lla-hemisucci= nyl-BSA.

1. Pipetter en 1 ml prøve i et polystyrenglas overtrukket med kanin-anti-testosteron immunoglobulin og inkuber i 2 timer 15 ved stuetemperatur.

2. Tøm glasset ved sugning og vask 3 gange med 2 ml 0,02 mol/ liter phosphatstødpude, pH 7,0.

3. Pipetter 1 ml af konjugatet af sølvpartikler og testoste= X cm ron-lla-hemisuccinyl-BSA, A^^ nm = 9lasset °9 inku- 20 ber i 16 timer.

4. Sug nu glasset tomt og vask med 2 ml 0,02 mol/liter phosphatstødpude, pH 7,0.

5. Pipetter 1 ml 0,1 mol/liter HC1, opløsning i destilleret vand, i glassene og lad dette virke i 30 minutter.

25 6. Mål væsken i glasset A^,,?™.

3 421 nm 4.7. Resultater.

Prøvemedierne blev kolorimetrisk bestemt ved hjælp af en standardkurve, hvorved der kunne bestemmes mængder af testo=

DK 159799 B

23 steron af størrelsesordenen 0,5 ng/ml og større.

Eksempel 5.

Bestemmelse af titeren af human anti-Rubella sera.

5.1. Fremstilling af Rubella-antigenet.

5 200 ml af en værtcellesuspension (BHK 21C3 fra Rijks Instituut 5 voor Volksgezondheid, RIV) i kulturmedium (koncentration 10 levende celler pr. ml) indføres i en rulleflaske (overflade 490 cm2). Cellekulturen holdes i 16 til 20 timer ved 37°C. Kulturmediet fjernes så, og cellelaget vaskes to gange med 10 20 ml phosphatpufret saltopløsning (PBS). 10 ml virussuspen sion (virustype M33 RIV) fortyndes så 1:100 med PBS og indføres i flasken, hvorefter det hele inkuberes ved 37°C i ca.

2 1/2 time.

100 ml vedligeholdelsesmedium tilsættes nu, og kulturen hol-15 des ved 37°C. Efter en periode på mindst 64 timer, men ikke overstigende 136 timer, afhængende af bedømmelsen af den cytopathiske virkning, høstes det inkuberede monolag af inficerede celler. Vedligeholdelsesmediet fjernes, og monolaget af celler vaskes én gang med 20 ml PBS. Cellerne løsnes fra 20 væggen ved hjælp af sterile glasperler, optages i 90 ml PBS og fryses ved -20°C.

Efter tøning sættes 10 ml glycinopløsning (1 mol/1), hvis pH-værdi er indstillet til 9,0 med fast NaOH, til 90 ml cellesuspension, og det hele blandes grundigt i 6 timer ved 25 37°C. Cellesuspensionen bliver nu ultralydbehandlet i 30 mi nutter med afkøling i is, og centrifugeres derefter ved 30.000 N/kg i 30 minutter ved 4°C. Den overliggende væske indeholdende Rubella-virussen opsamles og inaktiveres ved tilsætning i rækkefølge af: 30 1:100 (v/v) NaOH (1 mol/liter) opløsning i destilleret vand 1:100 (v/v) frisk fremstillet 10% p-propiolactonopløsning i

DK 159799 B

24 destilleret vand.

Væsken får lov at henstå i 48 timer ved 4°C, hvorpå den centrifugeres i 30 minutter ved 30.000 N/kg og 4°C.

Den overliggende væske er væsken indeholdende Rubella-virus-5 sen, som om nødvendigt kan lagres ved -20°C til brugen.

(R) 5.2. Belægning af Microelisa ^ plader med Rubella-antigener.

Rubellaantigenopløsningen,fremstillet som beskrevet i 5.1., fortyndes 1:100 med en 0,05 mol/liter carbonatstødpude, pH

9,6. 100 μΐ af denne flydende Rubella-antigenopløsning pipet-10 teres i hver fordybning i Microelisapladen, og det hele inkuberes så i 16 timer ved 4°C. Fordybningen i Microelisa® pladen tømmes nu ved sugning og vaskes tre gange med 300 yl 0,05 mol/1 phosphatstødpude, pH 7,4, hvortil der er sat 9 g/1 NaCl og 0,5 g/1 Tween 20.

15 5.3. Fremstilling af fåre-anti-human immunoglobulinopløsning.

Normal human serum udsaltes med 140 g/1 Na2SO^, der tilsættes som fast stof i små portioner. Efter henstand 1 time ved stuetemperatur centrifugeres den uklare væske ved 25.000 N/kg i 10 minutter. Den overliggende væske fjernes ved sug-20 ning, hvorefter remanensen vaskes med 140 g/1 Na2SO^-opløs-ning i destilleret vand. Efter centrifugering og fjernelse af den overliggende væske ved sugning, opløses remanensen i 9 g/1 NaCl, hvorefter immunoglobulinopløsningen dialyseres i 48 timer over for 9 g/1 NaCl ved 4°C. Immunoglobulinind-25 holdet bestemmes så ved Α·26 Ο™' metoden.

Får blev immuniseret med en fortyndet opløsning af denne humane immunoglobulinopløsning efter følgende skema:

Dag 1 0,5 mg human immunoglobulin opløst i 0,5 ml fysiolo= gisk saltopløsning, hvortil der er sat 0,5 ml fuld-

DK 159799B

25 stændig Freunds adjuvans.

Inj ektion: Intramuskulær.

Dag 14 1,0 mg human immunoglobulin opløst i 0,5 ml fysiolo= gisk saltopløsning, hvortil der er sat 0,5 ml ufuld-5 stændig Freunds adjuvans.

Injektion: Intramuskulær.

Dag 28 2,0 mg human immunoglobulin opløst i 0,5 ml fysiolo gisk saltopløsning, hvortil der er sat ufuldstændig Freunds adjuvans.

10 Injektion: Intramuskulær.

Dag 42 1,0 mg human immunoglobulin opløst i 1,0 ml fysiolo gisk saltopløsning.

Injektion: Intravenøs.

Dag 56 Prøveudtagning af blod.

15 Immunoglobulinfraktionerne blev fremstillet af fåre-anti- human immunoglobulin-seraene ved udsaltning ved den ovenfor beskrevne metode med 140 g/1 Na2SO^. Efter vask 3. gang blev remanensen opløst i 9 g/1 NaCl, hvorefter immunoglobulinop-løsningen blev dialyseret over for en 0,3 g/1 NaCl-opløsning 20 i destilleret vand, indstillet til pH 7,0 med 0,2 mol/1 K2CC>3 opløst i destilleret vand.

Efter centrifugering af denne dialyserede fåre-anti-human immunoglobulinopløsning ved 160.000 N/kg i 15 minutter, blev immunoglobulinindholdet bestemt ved , A~0~m metoden.

3 260 nm 280 nm 25 5.4. Fremstilling af konjugat af guldpartikler og fåre-anti- human immunoglobulin.

Guldsolen blev fremstillet ved fremgangsmåden beskrevet i 1.1., og konjugatet blev fremstillet på en måde analog med den, der er beskrevet i 1.4., idet der i dette tilfælde blev anvendt

DK 159799 B

26 fåre immunoglobulinopløsningen fremstillet i 5.3. med et im-munoglobulinindhold på 125 yg pr. ml.

5.5. Forsøgsprotokol.

Prøven af human sera fortyndes 1:25 med 0,2 mol/1 trometamol/ 5 IcyNaCl stødpude, pH 7,4, hvortil der var sat 0,5 g/1 Tween 20.

1. 100 μΐ fortyndet human serum pipetteres i hver fordybning, og det hele inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.

2. Fordybningen tømmes ved sugning og vaskes 3 gange med 10 300 μΐ 0,2 mol/1 trometamol/HCl/NaCl stødpude, pH 7,4, hvor til der var sat 0,5 g/1 Tween 20.

3. 100 μΐ konjugat af guldpartikler og fåre-anti-human immu= n cin.

noglobulin (AJlgg ^ = Ir00) pipetteres nu i fordybningen, og det hele inkuberes i 16 timer ved stuetemperatur.

15 4. Fordybningen tømmes ved sugning og vaskes tre gange med 300 μΐ 0,01 mol/1 trometamol/HCl/NaCl stødpude, pH 7,4, hvortil der var sat 0,5 g/1 Tween 20.

5. Pipetter 100 μΐ 0,1 mol/1 HCl opløst i destilleret vand i hver fordybning og lade dette virke i 30 minutter under 20 rystning.

6. Efter dette, mål lysabsorptionen ved 536 nm under anvendelse af et spektrofotometer med lille rumfang.

5.6. Resultater.

En på ca. 0,230 blev målt for sera med en HAI titer 536 nm 25 på 512, og yderligere blev der fundet en rimelig lineær sammenhæng mellem HAI titerne af de undersøgte humansera, og 1 citi

Ac_- -værdierne fremkommet ved ovennævnte prøve.

536 nm e 27

DK 159799B

Eksempel 6.

Bestemmelse af HCG ved hjælp af et konjugat af jernoxid og anti-HCG.

6.1. Fremstilling af jernoxidsolen.

5 En opløsning bestående af 9 mmol/1 FeCl3 og 1 mmol/1 HCl opvarmes til en temperatur på 95°C i 65 timer. Den først lysegule opløsning misfarves til orangerød på grund af dannelsen af jernoxidsolpartikler. Den på denne måde fremkomne jern= oxidsol består af kubiske jernoxidpartikler med en kant mel-10 lem 40 og 80 nm, bekræftet ved elektronmikroskopi. Et lokalt lysabsorptionsmaksimum findes ved 370 nm. En sol med et jern- i oxidindhold på 0,45 mmol/1 udviser en ΑΧ-η = 1,0 og en

3 /0 nm J

pH-værdi på 2,7 lige efter fremstillingen.

6.2. Fremstilling af konjugat og jernoxid og anti-HCG.

15 Kanin-anti-HCG blev fremstillet på en fremgangsmåde analog med den, der er beskrevet for anti-HPL sera i eksempel 1.2.

Immunoglobulinfraktionen heraf fremkom ved tilsætning af Na2SO^, fraskille remanensen, gendispergere den i en 180 g/1 Na2SO^-opløsning og dialysere denne dispersion over for 20 en opløsning indeholdende 5 mmol/1 NaCl. Immunoglobulinind-holdet blev bestemt som beskrevet i eksempel 1.3.

Jernoxidsolen fra 5.1. blev fortyndet og gav et jernoxidind-hold på 0,45 mmol/1. Til 25 ml heraf blev sat 0,5 ml glutar= aldehyd 250 g/1, og blandingen blev inkuberet i 30 minutter 25 ved stuetemperatur og pH 2,8. Derefter blev tilsat 0,63 ml kanin-anti-HCG immunoglobulinopløsning indeholdende 640 ug/ml immunoglobulin.

Efter inkubering i 1 time ved stuetemperatur og pH 2,7, blev blandingens pH-værdi indstillet til 7,0 med en NaOH-opløsning,

DK 159799 B

28 og inkubation af blandingen blev fortsat natten over ved 0-4°C.

Før brugen blev konjugaterne vasket ved centrifugering, fra-sugning af den overliggende væske og gensuspendering i en 5 stødpude bestående af 0,1 mol/1 tris/NaCl/HCl (pH = 7,4), 1 g/1 BSA og 0,2 g/1 Carbowax 20M. Til sidst blev rimfanget af solen indstillet således, at = (S) 6.3. Overtrækning af Microelisa^ plader med kanin-anti-HCG immunoglobuliner.

(5)

10 Microelisa ^ plader blev overtrukket med kanin-anti-HCG

immunoglobulin som beskrevet for overtrækning med anti-HPL immunoglobuliner i eksempel 1.5.

6.4. Forsøgsprotokol for HCG bestemmelse med konjugater af jernoxid og anti-HCG.

15 Der blev fremstillet en kurve over dosis og reaktion for HCG, der er opløst i en blanding af 0,04 mol/1 phosphatstødpude, 1 g/1 BSA og 9 g/1 NaCl (pH = 7,4), efter følgende forsøgsprotokol .

1. Pipetter 0,1 ml af standard HCG-opløsningen i en fordyb-20 ning i en Microelisa® plade, overtrukket med anti-HCG og inkuber i 2 1/2 time ved 37°C.

2. Sug fordybningen tom.

Ί rvm 3. Pipetter 0,1 ml jernoxid anti-HCG (A^q - 1»Q) i fordybningen og inkuber natten over ved 37°C.

25 4. Tøm fordybningen ved sugning og vask den otte gange med 0,3 ml af en opløsning indeholdende 0,1 mol/1 tris/HCl/NaCl stødpude (pH = 7,4) og 0,5 g/1 Tween 20.

DK 159799 B

29 5. Pipetter 0,1 ml af en opløsning indeholdende 0,1 mol/1 NaOH og lad dette reagere i 15 minutter.

6. Mål lysabsorptionen ved 360 nm med et spektrofotometer af lille rumfang.

5 Resultaterne af en kurve over dosis og reaktion er anført i nedenstående tabel.

HCG koncentration i 1 cm standardopløsningen j60 i mIU/ml 10 2000 0,367 1000 0,429 500 0,414 250 0,304 125 0,275 15 63 0,205 31 0,179 16 0,172 8 0,154 4 0,142 20 0 0,096.

6.5. Bestemmelse af HCG i urinen hos svangre kvinder.

Urinen fra svangre kvinder blev fortyndet således, at HCG-niveauet lå i intervallet 1 til 500 mlU HCG/ml. Ved hjælp af forsøgsprotokollen fra 5.4. blev HCG-koncentrationen af de 25 fortyndede prøver bestemt under anvendelse af den konstruerede standardkurve.

Eksempel 7.

Bestemmelse af HCG ved hjælp af konjugat af guldpartikler og anti-HCG ved en agglutinationsprøve.

DK 159799 B

30 7.1. Fremstilling af reagenser.

Der fremstilles en guldsol ved fremgangsmåden beskrevet i 1.1. og kanin-anti-HCG sera og immunoglobulinfraktioner heraf som beskrevet i 5.2.

5 Et konjugat af guldpartikler og anti-HCG fremstilles med guldsolen og kanin-anti-HCG-opløsningerne ved fremgangsmåden beskrevet i 1.4.

7.2. Forsøgsprotokol.

1. Pipetter 1 ml af konjugatet af guldpartikler og anti-HCG ^ cxn 10 (A54o nm = ^'^O) i et reagensglas på ca. 3 ml.

2. Pipetter heri 0,1 ml af urinen, som skal undersøges, og bland.

3. Bedøm farven af konjugatet efter en inkubation på 1 time ved stuetemperatur: 15 En farveændring fra rød til farveløs viser, at prøven er stærk positiv, en farveændring fra rød til purpur viser, at prøven er positiv og indeholder 1 IU HCG/ml eller mere, hvis farven ikke ændres,er prøven negativ, dvs. den indehol-20 der 0,4 IU HCG/ml eller mindre.

7.3. Resultater.

Ved hjælp af forsøgsprotokollen fra 7.2. er det muligt at diagnostisere svangerskab den 33. - 35. dag efter sidste menstruation.

DK 159799B

31

Eksempel 8.

Kompetitiv receptorprøve for HCG.

8.1. Fremstilling a£ renset HCG receptorprotein fra okse-corpora lutea (BCL).

5 HCG receptorprotein fra BCL blev fremstillet ved metoden, der er beskrevet i enkeltheder af Khan og Saxena i Enzyme Labelled Immunoassay of Hormones and Drugs, redaktør S.B.

Pal, udgivet af Walter de Gruyter, Berlin, New York, 1978. Frisk BCL-væv blev pulveriseret, homogeniseret, filtreret, 10 yderligere homogeniseret og centrifugeret ved 6.500 N/kg.

Den overliggende væske blev centrifugeret ved 130.000 N/kg, den fremkomne pellet blev homogeniseret og centrifugeret i en zonerotor med en saccharosegradient og elueret. De frysetørrede fraktioner indeholdende HCG-receptormembranerne blev 15 genopløst, og efter centrifugering blev der tilsat mannit til den klare overliggende væske, hvorefter pH-værdien blev indstillet til 7,0. Den fremkomne dispersion blev renset ved affinitetskromatografi på CNBr-aktiveret sepharose 4B koblet med human LH. Efter eluering af den bundne receptor blev pH-20 værdien straks indstillet til 7, og Triton X-100 blev fjernet ved adsorption på bio-perler. Den fremkomne dispersion af HCG receptorprotein blev grundigt dialyseret over for PBS, pH 7,0 og lagret ved 4°C.

8.2. Belægning af polystyrenmikrotitreringsplader med HCG

25 receptorprotein.

Til dette formål fremstilles en HCG receptorprotein receptoropløsning med et indhold af 25 yg protein/ml ved fortynding af HCG receptorproteinet i PBS med en opløsning af 0,04 mol/1 Na2HP04, indstillet til pH 7,4 med en opløsning af Q,Q4 mol/1 30 NaH2P04, hvortil der sættes 0,1 g/1 merthiolat. Mikrotitreringsplader blev belagt med denne HCG receptoropløsning ifølge protokollen, der er beskrevet i 1.5.

32

DK 159799 B

8.3. Fremstilling af en gulddispersion.

En gulddispersion bestående af partikler med en diameter mellem 6 og 15 nm blev fremstillet ved at sætte 40 ml af en opløsning indeholdende 10 g/1 natriumcitrat, 2^0 til en 5 kogende opløsning indeholdende 100 mg/1 hydrogenaurichlorid (HAuCl^), og blandingen holdes kogende i 15 minutter. Den fremkomne orangerøde gulddispersion afkøles til stuetemperatur og genindstilles til et rumfang på 500 ml i en volume-trisk kolbe. Gulddispersionen havde et lysabsorptionsmaksi- 10 mum ved 523 nm og ™ = 1,0.

bzJ nm 8.4. Fremstilling af et konjugat af guldpartikler og HCG.

En opløsning indeholdende 5 mg renset HCG/ml i PBS (pH = 7,0) blev grundigt dialyseret over for en opløsning indeholdende 5 mmol/1 NaCl, indstillet til en pH-værdi på 4,5 15 ved hjælp af HCl. 1 ml af den dialyserede HCG opløsning blev sat til 500 ml af gulddispersionen og omrørt i 10 minutter ved stuetemperatur. 10 ml af en opløsning indeholdende 10 g Carbowax 20 M/l blev sat til det friske konjugat og inkuberet i yderligere 10 minutter. Derefter blev pH-værdien ind-20 stillet 7,4 ved hjælp af en i^CO^-opløsning. Konjugatet blev lagret ved 4°C. Lige før brugen blev 1 ml af 1 mol/1 TRIS/ HCl/NaCl stødpude (pH = 7,4) indeholdende 1 g/1 BSA tilsat til 10 ml af den lagrede konjugatdispersion.

8.5. Forsøgsprotokol for en kompetitiv HCG-prøve.

25 100 yl af en standard HCG-opløsning (eller prøven) blev sat til en fordybning i mikrotitreringsplader belagt med HCG receptorprotein og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur. Derefter blev 10Q yl af det pufrede konjugat af guldpartikler og HCG tilsat og inkuberet i 4 timer ved stuetemperatur.

30 Fordybningen blev tømt og vasket med 0,3 ml 0,01 mol/1 TRIS/ HCl/NaCl stødpude, pH = 7,4.

Til sidst blev der tilsat 0,1 ml 0,1 mol/1 NaOH-opløsning j

DK 159799B

33 i vand, og der blev inkuberet i 10 minutter. Lysabsorptionen i væsken i en fordybning blev målt ved 536 nm under anvendelse af et spektrofotometer af lille rumfang.

8.6. Resultater.

5 En kurve over dosis og reaktion for fri HCG fremkom i et HCG-koncentrationsinterval mellem 0 og 1000 mIU/ml med et midterpunkt nær 100 mlU HCG/ml. Påvisningsgrænsen var ca. 10 mlU HCG/ml. HCG-koncentrationen målt i prøverne var i reglen højere end bestemt med EIA.

10 Eksempel 9.

Sandwichprøve for HCG under anvendelse af en uopløseliggjort HCG receptor og et konjugat af guldpartikler og anti-HCG.

Til denne bestemmelse blev mikrotitreringsplader belagt med HCG receptorprotein som beskrevet i eksempel 8.2.. Et konju-15 gat af guldpartikler og anti HCG blev fremstillet som beskrevet i eksempel 1.4. under anvendelse af kanin anti-HCG i stedet for kanin anti-HPL.

9.1. Forsøgsprotokol.

0,1 ml af en standardopløsning HCG i 0,1 mol/1 TRIS/HCL/NaCl 20 stødpude, pH = 7,4, indeholdende 1 g/1 BSA (eller prøven) pipetteres i en fordybning i mikrotitreringspladen belagt med HCG receptorprotein og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur. Derefter tømmes fordybningerne, og 0,1 ml af konjugatet af guldpartikler og anti-HCG pipetteres i hver fordybning og in-25 kuberes natten over ved stuetemperatur. Fordybningerne tømmes og vaskes 6 gange med 0,3 ml 0,01 mol/1 TRIS/HCl/NaCl stødpude, pH = 7,4.

0,1 ml og 0,1 mol/1 NaOH pipetteres i hver fordybning og inkuberes i 15 minutter. Lysabsorptionen ved 536 nm af indhol-

Claims (13)

1. Fremgangsmåde til påvisning og/eller bestemmelse af en eller flere komponenter i reaktionen mellem et specifikt binderprotein og det tilsvarende bindelige stof i en vandig 20 prøve under anvendelse af den kendte bindingsaffinitet af sådanne komponenter til hinanden, kendetegnet ved, at der anvendes en eller flere mærkede komponenter fremkommet ved direkte eller indirekte kobling af den ønskede komponent af reaktionen til partikler i en vandig dispersion af et 25 metal, en metalforbindelse eller polymere kerner overtrukket med et metal eller metalforbindelse, som har en partikelstørrelse på mindst 5 nm, idet under reaktionen eller efter en tilstrækkelig reaktionstid, eventuelt efter adskillelse af de bundne og de frie mærkede komponenter, de fysiske egen-30 skaber og/eller mængden af metallet og/eller det dannede me talholdige agglomerat bestemmes i prøven eller en af de afledte fraktioner på i og for sig kendt måde, hvilken bestemmelse giver en kvalitativ og/eller kvantitativ indikation af komponenten eller komponenterne, som skal påvises og/eller 3 5 bestemmes. DK 159799B 35

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der anvendes en eller flere mærkede komponenter, fremkommet ved direkte eller indirekte kobling af den ønskede reaktionsdeltager til partikler af en sol, som har en parti- 5 kelstørrelse varierende fra 10 til 100 nm.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1-2, kendetegnet ved, at den mærkede komponent er fremkommet ved til en sol af et metal, en metalforbindelse eller polymere kerner overil o trukket med et metal eller en metalforbindelse, at sætte en vis mængde af den immunokemiske komponent, som skal mærkes, hvilken sidstnævnte fuldstændigt eller delvis belægger solpartiklerne, hvorefter yderligere overtrækning kan udføres med et immunokemisk indifferent polært makromolekyle. 15

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 -2, kendetegnet ved, at den mærkede komponent er fremkommet ved til en sol af et metal, en metalforbindelse eller polymere kerner, overtrukket med et metal eller en metalforbindelse at sætte et 20 eller flere immunokemisk indifferente hydrofile makromole- kyler, som overtrækker solpartiklerne, hvorefter den immuno= kemiske komponent kobles til overtræksmaterialet.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1-2, kendetegnet 25 ved, at den mærkede komponent fremkommer ved at indføre en metalsol i omgivelser af monomere, og sidstnævnte bringes til at polymerisere eller copolymerisere in situ, således at der sker overtrækning af solpartiklerne, hvorefter den immu= nokemiske komponent kobles til det polymere materiale. 30

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1-2 og 5, kendetegnet ved, at solpartiklerne først beskyttes med et hydro= filt makromolekyle, hvorefter der sker polymerisation eller copolymerisation under indflydelse af en uorganisk igangsæt- 35 ter- DK 159799 B 36

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til 6 , kendetegnet ved anvendelse af partikler af en sol af guld, sølv eller platin eller forbindelser af disse metaller eller jern eller kobberforbindelser. 5

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1-7, kendetegnet ved, at der bestemmes to eller flere immunokemiske komponenter i én prøve ved anvendelse af to eller flere forskelligt mærkede komponenter. 10

9. Fremgangsmåde ifølge krav 1-7, kendetegnet ved, at forekomsten af en ændring i farve eller farveintensitet af reaktionsblandingen iagttages eller måles, hvilken ændring er en kvalitativ eller kvantitativ indikation af den immuno-15 kemiske komponent, som skal bestemmes.

10. Prøveudstyr til anvendelse til bestemmelse af en eller flere komponenter af reaktionen mellem et specifikt binderprotein og det tilsvarende bindelige stof i et vandigt medium ved 20 fremgangsmåden ifølge krav 1-9, kendetegnet ved, at det indeholder: a) en metalmærket komponent, som er fremkommet ved at koble en komponent af reaktionen til partikler i en vandig dispersion 25 af et metal, en metalforbindelse eller polymere kerner over trukket med et metal eller en metalforbindelse, hvilke partikler har en størrelse på mindst 5 nanometer. b) andre reaktionsdeltagere. 30

11. Prøveudstyr ifølge krav 10, kendetegnet ved, at den vandige dispersion er en sol med partikler af en størrelse varierende fra 10-100 mm, som er enten direkte overtrukket med en immunokomponent eller med en indifferent polymer, hvortil 35 immunokomponenten er blevet koblet. 37 DK 159799 B

12. Frysetørret reagens til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 1-9, k e n d e t e g n e t ved, at det indeholder en metalmærket komponent, der er fremkommet ved direkte eller indirekte at koble den ønskede komponent til partikler i en 5 vandig dispersion af et metal, en metalforbindelse eller polymere kerner overtrukket med et metal eller en metalforbindelse, og som har en partikelstørrelse på mindst 5 nm.

13. Frysetørret reagens ifølge krav 12, kendetegnet 10 ved, at det også indeholder et stødpudestof. 15 20 25 30 * 35