DK160842B - Vandoploeselige konjugater af superoxiddismutase, samt farmaceutisk praeparat indeholdende konjugatet - Google Patents

Vandoploeselige konjugater af superoxiddismutase, samt farmaceutisk praeparat indeholdende konjugatet Download PDF

Info

Publication number
DK160842B
DK160842B DK392789A DK392789A DK160842B DK 160842 B DK160842 B DK 160842B DK 392789 A DK392789 A DK 392789A DK 392789 A DK392789 A DK 392789A DK 160842 B DK160842 B DK 160842B
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
peg
sod
molecular weight
conjugate
superoxide dismutase
Prior art date
Application number
DK392789A
Other languages
English (en)
Other versions
DK392789D0 (da
DK392789A (da
DK160842C (da
Inventor
Mark Saifer
Ralph Somack
David L Williams
Original Assignee
Ddi Pharmaceuticals
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ddi Pharmaceuticals filed Critical Ddi Pharmaceuticals
Publication of DK392789D0 publication Critical patent/DK392789D0/da
Publication of DK392789A publication Critical patent/DK392789A/da
Publication of DK160842B publication Critical patent/DK160842B/da
Application granted granted Critical
Publication of DK160842C publication Critical patent/DK160842C/da

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A61K38/446—Superoxide dismutase (1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

DK 160842 B
Opfindelsen angår et hidtil ukendt vandopløseligt, i det væsentlige ikke-immunogent konjugat af en superoxiddismutase koblet med et koblingsmiddel til en polyalkylenglycol.
5 Man har tidligere benyttet PEG eller methoxy- PEG med lav molekylvægt, typisk ca. 5000 eller mindre, bundet til superoxiddismutase (SOD) og andre proteiner til opnåelse af addukter, der udviste forskellige grader af 10 (a) forøget serumpersistens, og (b) reduceret immunogenitet.
Imidlertid førte den grad af modificering af 15 proteingrupper, der var nødvendig med lavmolekylær PEG eller methoxy PEG til opnåelse af, at begge mål (a) og (b) blev opfyldt, ofte til væsentlige tab i enzymaktivitet eller biologisk aktivitet. Se Boccu, Z. Natur-forsch. bind 38 (1983), s. 94-99; Pyatak, Research Com-20 munications in Pathology and Pharmacology, bind 29, nr.
1 (juli 1980), s. 113-127, og Beauchamp, Anal. Biochem., bind 131 (1983), s. 25-33.
Superoxiddismutase (SOD) er et intracellulært enzym, der er ansvarligt for at katalysere omdannelsen 25 af peroxidradikaler til oxygen og hydrogenperoxid. Det er et mål med opfindelsen at tilvejebringe et produkt, der har længere levetid end det native SOD-protein in vivo og at forhindre dets inaktivering af nyrerne. Det er især vigtigt, at produktet opretholder enzymatisk 30 aktivitet i en længere tidsperiode, idet det samtidig har et lavt niveau af immunogenitet.
Det er endvidere et specielt mål med opfindelsen at tilvejebringe et konjugat med anti-inflammatorisk aktivitet som vist f.eks. ved sædvanlige carrageenanin-35 ducerede poteødemforsøg. Denne aktivitet gør produktet særlig lovende til behandling af rheumatoide tilstande.
DK 160842 B
2
Disse mål opfyldes af konjugatet mellem en superoxid-dismutase og en polyalkylenglycol ifølge opfindelsen. Konjugatet er ejendommeligt ved, at polyalkylenglycolen er en polyethylenglycol eller et polyethylen-polypropy-5 lenglycol copolymerisat, hvori denne glycol har en middelmolekylvægt målt ved HPLC med PEG som standard på ca. 40 000 - 200 000 Dalton og er terminalt usubstitue-ret eller substitueret med alkylgrupper. Fore trukne udførelsesformer for konjugatet ifølge opfindel-10 sen beskrives i kravene 2-6. Den ifølge opfindelsen anvendte PAG kan være lineær eller forgrenet.
Anvendelse af polymere med molekylvægte højere end 200 000 er ganske vist mulig, men sådanne er ubekvemme på grund af deres højere viskositet og risiko for 15 spaltning ved forskydningspåvirkninger.
PAG-SOD addukterne ifølge opfindelsen har molekylvægte (i forhold til PEG standarder med kendt molekylvægt), der ligger fra ca. 85 000 til ca.
2 000 000 Dalton, fortrukket fra ca. 90 000 til 20 1 000 000 Dalton. Derudover opretholder PAG-SOD addukterne og andre PAG addukter ifølge opfindelsen sædvanligvis hovedparten af den enzymatiske aktivitet hos det native protein. (Man bør bemærke, at molekylvægte i denne forbindelse er baseret på PEG standarder med 25 kendt molekylvægt. Ved HPLC kalibrering synes proteinækvivalen tmolekylvægtene , dvs. molekylvægte baseret på proteinstandarder med kendt molekylvægt, at være ca.
5-8 gange større).
Konjugaterne ifølge opfindelsen er en forbedring 30 i forhold til tidligere produkter, idet man ved at tilbinde færre PAG strenge kan klare sig med en mindre kemisk modifikation af det aktive udgangsmolekyle (SOD), hvorfor man bevarer mere af dettes oprindelige karakter. Idet man ifølge opfindelsen benytter færre strenge 35 af højmolekylær PAG, vil adduktet opretholde hovedparten af udgangsmolekylets aktivitet og samtidig have fo-
DK 160842 B
3 røget levetid i blodkredsløbet. En anden fordel ved addukterne ifølge opfindelsen er, at man ved at benytte højmolekylær PAG kan fremstille større addukter med samme grad af modifikation som ved kendt teknik. Yder-5 mere er større PAG addukter i visse tilfælde klart en fordel. For eksempel havde PEG-SOD addukter ifølge opfindelsen, der blev fremstillet under anvendelse af PEG-strenge med molekylvægte på 40 000 - 130 000 Dalton, halveringstider i museserum på ca. 36 timer og me-10 re, hvorimod man ved PEG-SOD addukter, ifølge kendt teknik (Boccu, se ovf.) højst har fundet en halveringstid på 25 timer.
PAG-SOD addukterne ifølge opfindelsen indeholder fortrinsvis 1-10 kæder tilbundet pr. SOD-molekyle, mere 15 foretrukket 2-8 og især 2-6 kæder PAG pr. SOD-molekyle. Antallet af kæder, der er nødvendig til at opnå en tilfredsstillende levetid i serum, falder, når man benytter længere kæder.
SOD-præparater, der anvendes i konjugater ifølge 20 opfindelsen er typisk pattedyrs kobber- og zinkholdige superoxiddismutaseformer af enzymet fra kvæg eller fra andre dyr, (f.eks. fra får, heste, grise, hunde, kaniner eller kyllinger) eller fra menneskelige celler. SOD-præparater, der indeholder andre metalioner, såsom 25 jern eller mangan, er også tilgængelige (se fx. Keele, B.B. jr. et al., J. Biol. Chem. 245 (1970), s. 6176-6181). Endvidere kan SOD-præparater fremstilles ved rekombinant DNA-teknik i mikrobekulturer (se Halle-well, R.A. et al., Nucleis Acids Res. 13 (1985), s.
30 2017-2034). Sådanne præparater kan som følge af en ukorrekt translatering i disse mikrobekulturer være ikke fuldstændig identiske med det naturligt forekommende protein, men kan anvendes i konjugatet ifølge opfindelsen på grund af dettes lavere antigenitet.
35 Man har også fundet, at hvis SOD-præparatet in deholder spor af ikke-SOD proteiner, der ellers ville gøre sådanne præparater immunologisk usikre for genta-
DK 160842 B
4 gen parenteral Indgivelse, kan kobling af sådanne SOD til PAG ifølge opfindelsen gøre produktet nogenlunde nyttigt, da urenhedsproteinerne gøres betydeligt mindre immunogene.
5 Ved koblingsprocessen kan man benytte en række reaktioner ifølge kendt teknik.
En foretrukket reaktion foregår via dannelsen af en reaktiv carbonathalvester, PAG-O-CO-X, hvori X er en god fraspaltelig gruppe, idet man benytter reagenser, 10 såsom carbonyldiimidazol, p-nitrophenylchlorformiat eller bis-N-succinimidylcarbonat. Man lader derefter det aktiverede PAG, PAG-O-CO-X, reagere med proteinet under betingelser, der ikke ødelægger dettes enzymatiske aktivitet, hvorved man fortrinsvis opnår urethan-15 bindinger PAG-O-CO-NH-protein ^ tilbundet via proteinaminogrupper, såsom s-NH2-gruppen i lysin.
20 Man kan f.eks. lade carbonyldiimidazol reagere med de terminale hydroxygrupper på PAG. Man standser reaktionen i reaktionsblandingen pludseligt i vandig opløsning ved neutral pH og isolerer det aktiverede PAG (polyalkylenglycol-carbonylimidazol) ved dialyse og/el-25 ler størrelseseksklusionskromatografi.
Reaktionen af PAG-O-CO-N-CH = N \ /
CH = CH
30 med SOD udføres i opløsning med et overskud af aktiveret PAG.
Ved en variant af denne reaktion frysetørrer man en opløsning af SOD og aktiveret PAG. Man isolerer 35 konventionelt de koblede produkter ved størrelseseksklusionskromatografi. Man kan endvidere anvende andre
DK 160842 B
5 rensningsfremgangsmåder, deriblandt ionbytterkromato-grafi.
Ved en anden sammenkoblende reaktion opløser man polyalkylenglycol i et inert opløsningsmiddel, gør re-5 aktionsblandingen svagt alkalisk og lader den reagere med cyanursyrechlorid.
Man fjerner ikke-reageret cyanursyrechlorid ved udfældelse af PAG med petroleumsether. Resten af opløsningsmidlet bortfordampes til opnåelse af en 10 2-PAG-6-chlor-l,3,5-triazin. De opnåede aktiverede polymere bringes derefter til reaktion med SOD i en passende puffer, f.eks. i en boratopløsning. Man fjerner ikke-reageret aktiveret PAG og isolerer produktet ved kromatografi. Man opnår på denne måde en 4-hydroxy-15 1,3,5-triazin, til hvilken der i 2-stillingen er fæstet polyalkylenglycolgruppen PAG-O-, hvorimod den i 6-stil-lingen er fæstet til ε-aminogruppen af en reaktiv ly-singruppe i SOD.
Man kan endvidere omdanne en eller flere hydro-20 xygrupper på PAG-OH til carboxylgrupper, f.eks. ved reaktion med ravsyreanhydrid eller med ethylbromacetat og alkali, eller ved reaktion af den terminale gruppe -OCH2CH2OH med alkalisk permanganat til dannelse af PAG eddikesyreethere, PAG-0-CH2-C00H. Derefter akti-25 verer man carboxylgrupperne ved kendt teknik for proteinmodifikation, f.eks. ved dannelse af N-hydroxysuccin-imidesteren ved reaktion med et carbodiimid og N-hy-droxysuccinimid, eller ved dannelse af acylazidet ved nitrosering af acylhydrazidet. Det aktiverede PAG 30 bringes derefter til reaktion med proteinet under betingelser, der ikke ødelægger den enzymatiske aktivitet af proteinet, hvilket hovedsagelig fører til amidbindinger (PAG-C(=0)NH-protein) via protein aminogrupper (såsom aminoterminale NH2 og lysin ε-aminogrupper).
35 En terminal PAG hydroxygruppe kan endvidere om dannes til en aminogruppe, f.eks. ved reaktion først
DK 160842 B
6 med thionylbromid til dannelse af PAG-Br, fulgt af ami-nolyse med overskud af ammoniak til dannelse af PAG-NH2· Dette amino-PAG kan derefter direkte med amidbindinger bindes til proteincarboxygrupper ved an-5 vendelse af reagenser, såsom et vandopløseligt carbo-diamid eller Woodward's Reagens K. Alternativt kan man omdanne aminofunktionen til en carboxylsyrefunktion, f.eks. ved reaktion med ravsyreanhydrid, der derefter aktiveres og bringes til reaktion med proteinet som 10 beskrevet ovenfor.
Den terminale -CH20H gruppe i PAG kan også omdannes til en aldehydgruppe, -CH(=0) f.eks. ved oxidation med MnC>2. Derefter kan man reaktivt alkylere aldehydgruppen på proteinet via det sidstnævntes frie 15 aminogrupper, f.eks. ved hjælp af cyanoborhydrid, til opnåelse af bindinger, fortrinsvis via sekundære aminogrupper, under dannelse af en PAG-OCH^CH^NH-protein-bro.
Ud over proteinaminogrupper kan proteincarboxy-20 og sulfhydrylgrupper også benyttes til kobling til PAG.
Som nævnt ovenfor vil man ved udvælgelse af sammenkoblingsreaktioner foretrække sådanne, der kun lader broen, der binder PAG til proteinet, bestå af ikke-aromatiske grupper, opbygget af carbon, oxygen, svovl, 25 nitrogen og hydrogen.
Det konjugerede SOD kan isoleres fra reaktionsopløsningen, foretrukket efter dialyse til fjernelse af overskud af ioner, ved sædvanlig frysetørring. Hvis det er ønsket eller nødvendigt, kan man yderligere ren-30 se konjugatet ved ionbytterkromatografi, elektroforese og/eller gelfiltrering.
Filtrering gennem et mikroporefilter ved kendt teknik i sterile småglas, eventuelt efter tilpasning af ionstyrken, f.eks. med natriumchlorid og/eller natrium-35 phosphat til opnåelse af en isotonisk opløsning, giver en steril opløsning, der er egnet til indgivelse ved inj ektion.
DK 160842 B
7
Opfindelsen angår endvidere farmaceutiske præparater, hvilke præparater er ejendommelige ved det i krav 7's kendetegnende del angivne, idet foretrukne udførelsesformer for de omhandlede præparater ses i un-5 derkravene 8-10.
De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen omfatter PAG-SOD konjugater ifølge opfindelsen, eventuelt sammen med en farmaceutisk acceptabel bærer.
Sådanne farmaceutiske præparater er foretrukket 10 i form af sterile injektionspræparater, f.eks. en steril vandig opløsning. Opløsningen kan formuleres ifølge kendt teknik under anvendelse af de ovenfor nævnte farmaceutisk acceptable bærere. Det sterile injicerba-re præparat kan også være en opløsning eller suspension 15 i et ugiftigt parenteralt acceptabelt fortyndingsmiddel ellr opløsningsmiddel.
Præparaterne ifølge opfindelsen kombinerer en effektiv enhedsdosismængde af SOD-konjugat ved en koncentration, der er effektiv til at fremkalde den ønske-20 de respons, når man indgiver en enhedsdosis af præparaterne via en indgivelsesvej, der svarer til den anvendte farmaceutiske bærer. Por eksempel indeholder væskeformige præparater sædvanligvis 0,5-40 mg konjugatpro-tein pr. 0,25-10 ml, foretrukket ca. 0,5-5 ml, undtagen 25 ved i.v. infusionsopløsninger, der kan være mere fortyndede, f.eks. 0,5-200 mg SOD-konjugatprotein pr.
50-1000 ml, foretrukket 100-500 ml, af infusionsopløsningen. Tabletter, kapsler og stikpiller indeholder sædvanligvis 0,1-2,5 mg, foretrukket 1-10 mg af konju-30 gatprotein pr. dosisenhed.
Præparatet ifølge opfindelsen er ligesom det kendte produkt orgotein effektive til behandling af en lang række inflammatoriske tilstande, deriblandt sådanne hvor syntetiske antiimflammatoriske midler har 35 begrænset anvendelighed, f.eks. på grund af toksiske bivirkninger ved langtidsanvendelse, idet det omhandle-
DK 160842 B
! i 8 ! de præparat har en meget ringe immunogenitet og anti-genitet.
Især er præparatet effektivt til at mildne oxygentoksicitet, reperfusionsbeskadigelser og inflam-5 matoriske tilstande og til at formindske virkningerne deraf, f.eks. sådanne i urinkanalen og i leddene hos forskellige pattedyr. Det er nyttigt til at mildne symptomerne for, og de strukturelle deformiteter, der står i forbindelse med posttraumatiske arthritis og 10 rheumatoide sygdomme, såsom bursitis, tendinitis og osteoarthritis.
Opfindelsen illustreres yderligere ved følgende eksempler.
15 Eksempel 1
Man opløste 50 g PEG (et Union Carbide produkt, mærket Polyox® eller polyethylenoxid 100,000, bestående af isopropoxyleret PEG med en mærket molekylvægt på 20 100 000 Dalton, som bestemt ved grænseviskositetsmålinger, for hvilke HPLC målinger gav en middelmolekylvægt på ca. 50 000 Dalton) ill vandfri pyridin og tilsatte 22 g ravsyreanhydrid. Man holdt blandingen under omrø- 0 ring i 38 timer ved 60 C, fjernede opløsningsmidlet un- 25 der vakuum ved mindre end 60°C og genopløste remanensen i 500 ml vand. Man vaskede opløsningen med hexan og ekstraherede derefter produktet med 1000 ml chloroform.
0
Man fjernede chloroformen under vakuum ved 40 C og opløste produktet i benzen. Det succinylerede PEG blev 30 udfældet to gange fra benzen ved hjælp af petroleums-ether.
En vandig opløsning af det succinylerede PEG blev fraktioneret efter størrelse til fjernelse af lavmolekylær PEG ved ultrafiltrering under anvendelse af 35 et Millipore Minitan apparat, udstyret med en 300 000 (proteinstandard) molekylvægt afskæringsmembran. Det
DK 160842 B
9 størrelsesfraktionerede produkt blev tørret under vakuum. Analyse ved vandig størrelseseksklusions HPLC tydede på, at middelmolekylvægten af det succinylerede PEG var vokset fra ca. 50 000 Dalton til ca. 80 000 5 Dalton som et resultat af ultrafiltreringen. Det således opnåede størrelsesfraktionerede succinylerede PEG blev derefter aktiveret ved hjælp af N-hydroxysuccin-imid. Man opløste 12 g af succinyleret PEG (molekylvægt 80 000 Dalton, 0,15 mmol) i 120 ml vandfri dimethylfor-10 mamid og tilsatte 300 mg (2,6 mmol) N-hydroxysuccinimid under omrøring. Efter opløsning tilsatte man 2,4 mmol dicyclohexylcarbodiimid og holdt opløsningen under omrøring ved 40°C i 30 minutter, hvorefter man lod den
O
henstå uden omrøring ved 24 C i fem dage. Blandingen 15 blev derefter filtreret gennem et glasfiberfilter, og filtratet blev inddampet til tørhed under vakuum ved 0 40 C. Man opløste remanensen under forsigtig omrøring i 200 ml vandfri toluen og udfældede fast N-hydroxy-succinimidyl PEG ved tilsætning af 400 ml petroleums-20 ether. Man indsamlede produktet under vakuum på et glasfiberfilter og genudfældede det fra toluen under anvendelse af petroleumsether, hvorefter det blev tørret under vakuum. Størrelseseksklusions HPLC viste, at molekylvægten af produktet ikke havde ændret sig som 25 følge af aktiveringen.
Man satte en opløsning med indhold af 80 mg bo-vin-Cu,Zn-SOD (2,46 μπιοί, 4400 enheder/mg, fra DDI Pharmaceuticals, Inc.) i 39 ml 0,1 M kaliumphosphatpuf-fer (pH 8,0) til 4 g vandfri N-hydroxysuccinimidyl PEG 30 derivatet (50 ymol) og foretog opløsning ved 24°C. Størrelseseksklusions HPLC analyse viste, at koblingsreaktionen i det væsentlige var færdig efter 1½ time, hvilket kunne ses af, at en top for ikke-reageret SOD forsvandt, og en top for højmolekylær υν-absorberende 35 addukt viste sig med en molekylvægt på ca. 200 000 Dalton.
DK 160842 B
10
Man fjernede frit PEG, der ikke var koblet til SOD, fra PEG-SOD adduktet ved ionbytterkromatografi. Fraktioner med indhold af PEG-SOD blev indsamlet ved voksende ionstyrke af elueringspuffer (pH 9) under an-5 vendelse af NaCl. Man dialyserede PEG-SOD fraktioner mod vand til fjernelse af pufferkomponenter, hvorefter man koncentrerede ved frysetørring eller ved vakuumfordampning .
Som et eksempel beskrives egenskaberne af et ty-10 pisk produkt, der elueres med 50 mM NaCl. Adduktet indeholdt 24 mg SOD protein og 165 mg proteinbundet PEG.
Man bestemte proteinindholdet ved biuretanalyse og PEG indholdet ved HPLC med påvisning med brydningsindeks (RI) og en korrektion for proteinets bidrag til ri.
15 Man bestemte en middelmolekylvægt for det proteinbundne PEG på 72 000 Dalton. Denne molekylvægt for PEG, frigjort fra adduktet ved proteolyse i kombination med data, der viste, at forholdet mellem SOD protein (molekylvægt 32 000 Dalton) og PEG i adduktet var 24 mg til 20 165 mg, giver et forhold på 3 strenge PEG bundet pr. molekyle SOD. Antallet af PEG strenge pr. SOD molekyle, opnået på denne måde, giver en beregnet molekylvægt for adduktet på 220 000 Dalton (72 000 x 3 + 32 000/8), et resultat der er i overensstemmelse med molekylvægten 25 opnået ved HPLC.
Man bestemte SOD aktiviteten af det ovennævnte addukt under anvendelse af cytochrom-C assay ifølge McCord og Fridovich (J. Biol. Chem. 244: 6049-6055; (1969)). Den specifikke aktivitet af PEG-SOD adduktet 30 (ca. 4317 enheder/mg protein) var 98% af aktiviteten af det native enzymudgangsmateriale (4400 enheder/mg). Produktet opretholdt således næsten fuldstændigt den native enzymatiske eller biologiske aktivitet og tilfredsstillede samtidigt opfindelsens øvrige krav.
35 PEG-SOD derivatet, opnået som beskrevet i dette eksempel, blev sammenlignet med høj renset, ikke modifi-
DK 160842 B
11 ceret SOD udgangsmateriale, hvad angår evnen til immunologisk sensitivering (aktivitet, der forårsager en anafylaktisk reaktion) i voksne Swiss Webster mus af hunkøn under anvendelse af en sensitiverings/belast-5 ningsprøve).
Man immuniserede ti mus med fire subkutane injektioner i løbet af to uger, hver gang med 0,075 mg protein, hvorefter man med 21 dages intervaller belastede dem intravenøst med samme forbindelse med 0,04 mg 10 protein. I gruppen, der modtog ikke-modificeret SOD, var fem dyr døde efter den fjerde intravenøse belastning, og tre ud af de fem resterende dyr viste tegn på anafylakse, hvorimod ingen af de ti dyr, der modtog den samme dosis PEG-SOD ifølge opfindelsen viste noget tegn 15 på anafylakse.
Ved afprøvning af et kendt PEG-SOD addukt med indhold af ca. 6 strenge af PEG med molekylvægt på 5000 Dalton pr. molekyle SOD, under anvendelse af samme fremgangsmåde, var ved den femte belastning to ud af ti 20 dyr døde, og fire af de resterende dyr viste tegn på anafylakse. Således var PEG-SOD ifølge opfindelsen med indhold af 3 strenge PEG med en molekylvægt på 72 000 Dalton pr. SOD mindre immunogent end et kendt PEG-SOD, der indeholdt dobbelt så mange strenge, men med en mo-25 lekylvægt på 5000 Dalton.
Detaillerede resultater for afprøvninger beskrevet i dette og senere Eksempler ses efter Eksemplerne.
Eksempel 2 30
Ved fremgangsmåden ifølge Eksempel 1 koblede man PEG med høj molekylvægt til bovin-Cu,Zn-SOD. Man fandt, at produkter med 5 strenge PEG med en molekylvægt på 100 000 Dalton og 3 strenge PEG med en molekyl-35 vægt på 120 000 Dalton var mindre immunogent i mus end nativ SOD eller et kendt produkt med 4 strenge PEG med 12
DK 160342 B
en molekylvægt på 35 000 Dalton.
Eksempel 3 5 Man sammenlignede levetiden i serum af nativt SOD med levetiden af PEG-SOD konjugater ifølge opfindelsen, fremstillet ved fremgangsmåden ifølge Eksempel 1, under anvendelse af voksne Swiss Webster-mus af hunkøn. Man injicerede 100 pg SOD intravenøst, aftap-10 pede blod med regelmæssige mellemrum og analyserede plasmaet for specifik PEG-SOD aktivitet ved en elektroforetisk fremgangsmåde, der skiller PEG-SOD fra rause-SOD. Et afprøvet PEG-SOD addukt indeholdt 2 strenge PEG med en molekylvægt på ca. 65 000 Dalton, og et an-15 det indeholdt 4 strenge PEG med en molekylvægt på ca.
40 000 Dalton. Halveringstiden for nedbrydning af nativ SOD i mus var 5-10 minutter, hvorimod halveringstiden for nedbrydning af begge disse PEG-SOD addukter var mere end 36 timer, og PEG-SOD aktiviteten kunne påvises i 20 blodet hos disse dyr i mindst ni dage. Et andet konju-gat ifølge opfindelsen, der indeholdt i middel 2,6 strenge med en molekylvægt på ca. 45 000 Dalton, gav også en halveringstid, der overskred 36 timer.
25 Eksempel 4
Man størrelsesfraktionerede en vandig opløsning af PEG (Union Carbide), der var mærket som 100 000 MW (vægtmiddelmolekylvægt, bestemt ved måling af grænse-30 viskositetstallet), men med en middelmolekylvægt på ca.
50 000 Dalton målt ved HPLC, ved hjælp af ultrafiltrering under anvendelse af et Millipore Minitan apparat, forsynet med en 300 000 (proteinstandard) molekylvægtsafskæringsmembran og tørrede det størrelsesfraktionere-35 de produkt under vakuum. Analyse ved hjælp af HPLC viste, at middelmoleklylvægten af prøven voksede fra
DK 160842 B
13 50 000 Dalton til 100 000 Dalton efter denne ultrafiltrering. Til en opløsning, der indeholdt 3,77 g af sådant størrelsesfraktioneret PEG i 100 ml vandfri aceto- nitril, satte man 1,39 g cyanursyrechlorid i 2,8 ml 0
5 vandfri acetonitril. Efter henstand i tre dage ved 24 C
blev opløsningen fortyndet med et lige så stort rumfang acetonitril og derefter renset ved filtrering. Man fjernede opløsningsmidlet ved inddampning under vakuum 0 ved 30 C og opløste remanensen i 120 ml vandfri tolu-10 en, hvorefter man udfældede produktet ved tilsætning af 360 ml vandfri hexan. Man udfældede igen produktet fra toluen under anvendelse af petroleumsether og tørrede det under vakuum til opnåelse af cyanursyrechlorid aktiveret PEG. Størrelseseksklusion's HPLC demonstrere-15 de, at molekylvægten for PEG ikke ændrede sig som en følge af aktiveringen. Man prøvede varierende mængder aktiveret PEG, opnået som beskrevet ovenfor, for evnen til at koble til bovin-Cu,Zn-SOD, hvis koncentration var konstant og 1 mg/ml. Slutkoncentrationerne af PEG 20 varierede fra 5 til 100 mg/ml. Efter reaktion i 24 timer ved 24°C analyserede man blandingerne ved hjælp af HPLC med UV påvisning for dannelse af PEG-SOD og også for restmængden af SOD.
DK 160842 B
14 TABEL 1 PEG:SOD Procent omdannelse PEG-SOD- (w:w) (M:M) af SOD til PEG-SOD- addukt 5 addukt Top MW* 5 1,7 25%
10 3,3 29% 90K
10 20 6,6 62% 140K
50 16,7 90% 150K
75 24,0 95% 20OK
100 33,3 100% 200K
15 * Bestemt ved HPLC på TSK PW kolonner, kalibreret med kommercielle PEG standarder.
Som vist i Tabel 1 kunne ved et 50:1 (w/w), PEG 20 til SOD forhold (16,6:1 molforhold) 90% af SOD omdannes til PEG-SOD med en middelmolekylvægt på 150 000 Dalton.
Ved større forhold mellem PEG og SOD voksede både mængden af SOD omdannet til PEG-SOD og molekylvægten af ad-duktet. De opnåede størrelser af addukterne tydede på, 25 at op til to strenge PEG med en molekylvægt på 100 000 Dalton kan fæstes til SOD under disse betingelser, når man benytter cyanursyre som koblingsmiddel.
Man målte levetiden i museserum for PEG-SOD produkterne i 10:1 (w:w) og 75:1 (w:w) PEG til SOD for-30 hold, der er vist i Tabel 1. De samme fremgangsmåder som i Eksempel 3 ovenfor blev benyttet. Man opnåede halveringstider på i det mindste 36 timer på begge de afprøvede produkter.
DK 160842 B
15
Eksempel 5
Man frysetørrede 10 g 100 kD polyethylenglycol (100K PEG, Union Carbide) i 24 timer til fjernelse af 5 enhver form for fugtighed i prøven. De tørrede 100K PEG blev opløst i ca. 45 ml vandfri acetonitril. Derefter tilsatte man 5,12 g 1,1-carbonyldiimidazol og inkuberede reaktionsblandingen ved stuetemperatur i 1½ time, hvorefter man afprøvede reaktionen ved hjælp af 10 ionbyttet vand til destruktion af overskud af carbo-nyldiimidazol.
pH-værdien blev opretholdt på 7 til forhindring af hydrolyse af det aktiverede PEG, og man dialyserede
Q
blandingen i en dag ved 4 C mod 4 1 destilleret vand og 15 byttede vand i det mindste ti gange til fjernelse af acetonitril og imidazol. Efter dialysen kromatografe-rede man det aktiverede PEG på en Sephacryl S-400 kolonne i deioniseret vand for at skille lOOK-PEG fra lavmolekylære fragmenter.
20 Til det opnåede aktiverede PEG satte man 92,8 mg SOD (rumfang af reaktionsopløsning = 108 ml) til opnåelse af et molforhold på 3 mol PEG pr. mol SOD. Blandingen blev frysetørret fire gange for at fremstille det ønskede PEG-O-CO-SOD produkt.
25
Eksempel 6
Til en opløsning af 30 g polyethylenglycol i 1100 ml vandfri dioxan satte man langsomt ved 35°C un- 30 der nitrogen og under omrøring 10 g natriumhydrid.
0
Efter yderligere omrøring ved 25 C i en time tilsatte man 15 ml ethylbromacetat. Opløsningen blev omrørt ved o o 25 C i 30 minutter og derefter i to timer ved 45 C, hvorefter man afsluttede reaktionen ved at tilsætte 200 35 ml vand. Nu tilsatte man 400 ml petroleumsether under omrøring, bortkastede den organiske fase og vaskede den
DK 160842 B
16 viskose vandige fase med petroleumsether. Man fortyndede den vandige fase, der indeholdt PEG ethylesteren til et rumfang på ca. l 1 og forsæbede, idet man holdt 0 temperaturen pa 60-70 C i fem timer. Endelig omdannede 5 man carboxygrupperne på PEG til frie syrer ved at gøre opløsningen sur til pH 2. Man fjernede rester af bromeddikesyre ved dialyse eller ved gelfiltrering. Den således fremstillede PEG ether kan erstatte den succiny-lerede PEG, der benyttes i Eksempel 1.
10 Således opnåede man ved at anvende 9,4 g aktive ret polyethylenglycol med en molekylvægt på 40 000 Dalton og 7,9 mg bovin SOD et addukt, der indeholdt i middel 3,3 strenge PEG pr. molekyle SOD. Molekylvægten af produktet var målt ved HPLC ca. 140 000 Dalton. Dette 15 addukt havde, som senere beskrevet, stærkt reduceret immunogenitet i mus.
Under anvendelse af 6,5 g polyethylenglycol med en molekylvægt på 120 000 Dalton og 87 mg bovin SOD opnåede man et addukt med en molekylvægt på 245 000 20 Dalton målt ved HPLC.
Eksempel 7 (Sammenligning)
Man fastslog anvendeligheden af fremgangsmåden, 25 når man anvendte human SOD.
Man anbragte 20 mg prøver af aktiveret succiny-leret PEG i reagensglas og tilsatte 100 yl af en opløsning af 3 mg/ml human SOD i 0,2 M pH 8 phosphat-bo-ratpuffer. Efter blanding fjernede man 2 yl prøver af 30 hver reaktionsblanding og standsede reaktionen i 58 yl 0,01 M 1:1 natriumacetat:eddikesyrepuffer i et 150 μΐ mikroreagensglas. Til kontrol af reaktionens fremad-skriden foretog man elektroforese af prøver ved pH 8,5, idet man benyttede 250 V i 15 minutter og derefter far-' 35 vede med nitroblå tetrazolium.
Efter 3-3,5 time ved stuetemperatur standsede man reaktionen i opløsningerne med 45 μΐ 0,03 M 1:1
DK 160842 B
17 acetatpuffer pr. mg PEG. Tilsætning af 0,1 ml pH 8 reaktionspuffer og 0,98 ml 30 mM acetat gav en slutværdi for pH på 6,4. Dette fald i pH og 1:10 fortyndingen standsede yderligere PEG-SOD sammenkobling og hydroly-5 se. Man fandt, at der ikke foregik nogen synderlig reaktion efter 30-45 minutters forløb.
Dette PEG-SOD med strenge af PEG på 19 000 Dalton kunne, lige som frit SOD, ikke påvises i museserum en dag efter injektionen, men et præparat med 10 strenge på 30 000 Dalton gav en forlænget levetid.
Human SOD kan således anvendes i forbindelse med opfindelsen.
Eksempel 8 15
Man benyttede et forsøg med carrageenan-induceret poteødem hos mus til at få et overslag over den antiinflammatoriske aktivitet. Ved dette poteødem forsøg indsprøjtede man 0,03 ml 1,0% carrageenan i salt-20 vand subkutant i trædepuderne på det højre bagben hos Swiss Webster mus af hunkøn, og derefter gav man 30 minutter senere dosis subkutant med 100 yl af prøveforbindelsen, der blev fremstillet ved fortynding i saltvand, fulgt af filtersterilisering. 24 timer efter 25 carrageenaninjektionen aflivede man dyrene, afskar begge fødder på bagbenene og vejede dem. Man beregnede ødemet som vægten af foden med injektionen (højre) minus vægten af foden uden injektion (venstre). Man beregnede middelværdi og standardafvigelse for vægten af 30 ødemerne for hver behandlingsgruppe, deriblandt en kontrolgruppe, der kun fik saltvand.
Ved en dosis på 30 yg pr. mus var et addukt med 2,6 strenge PEG med en molekylvægt på 45 000 Dalton mere effektiv, hvad angår reduktion af ødemerne, end et 35 addukt med 3,4 strenge af PEG med en molekylvægt på 21 000 Dalton (43% inhibition, henholdsvis 14% inhibi-
DK 160842 B
18 tion). Et addukt fremstillet med tre strenge PEG med en molekylvægt på 120 000 Dalton gav en 41% ødeminhibition med en dosis på 10 ug pr, mus. Nativ, bovin-Cu/Zn-SOD var inaktivt her, selv ved en dosis på 300 ug pr. mus, 5 og et addukt fremstillet med 14 strenge PEG med en molekylvægt på 5000 Dalton var også inaktivt ved en dosis på 100 ug pr. dyr.
Eksempel 9 10
Som et assay for antigenvirkning benyttede man et fastfase enzymimmunassay med kompetitiv binding (ELISA) til at måle krydsaktiviteten af PEG-SOD forbindelser med indhold af bovin-Cu,Zn-SOD med kanin-15 antistof rettet mod høj renset nativt bovin-Cu,Zn-SOD. Konjugater ifølge opfindelsen krævede færre strenge PEG til at reducere den antigene virkning, end forbindelser fremstillet med kortere strenge, f.eks. PEG med en molekylvægt på 5000 Dalton. For eksempel var et ad-20 dukt med et gennemsnit på 2,6 strenge PEG med en molekylvægt på 45 000 Dalton og et addukt med 4 strenge PEG med en molekylvægt på 35 000 Dalton henholdsvis en tre-diedel og en tiendedel så antigent virkende som et addukt med 6 strenge PEG med en molekylvægt på 5000 Dal-25 ton. Adduktet med 4 strenge PEG med en molekylvægt på 35 000 Dalton var halvt så antigent, som et addukt med 14 strenge PEG med en molekylvægt på 5000 Dalton.
Blandt addukter fremstillet med mindre end 4 PEG strenge, var sådanne med PEG i molekylvægtområdet 30 100 000-120 000 Dalton mindre antigene, end addukter med det samme antal kortere strenge. Således var et SOD addukt med 2 PEG strenge med en molekylvægt på 120 000 Dalton kun en femtedel så antigent virkende som et addukt med 2 strenge PEG med en molekylvægt på 35 35 000 Dalton.
DK 160842 B
19
Immunologisk sensitivering
Forsøg med immunisering af mus med konjugater ifølge opfindelsen, med konjugater med korte PEG-5 strenge og med nativ bovin-Cu,Zn-SOD er omtalt ovenfor i Eksemplerne l, 2 og 6. Nærmere detailler for disse forsøg gives i det følgende.
Prøveforbindelserne blev indgivet i en 0,9% NaCl injektionsopløsning fremstillet under udelukkelse af 10 pyrogent materiale o.l., der kunne fremkalde en falsk immunresponsreaktion.
For forbindelser fra Eksemplerne l og 6 immuniserede man mus ved 4 subcutane injektioner i den løse hud ved halsen, i løbet af to uger med 0,075 mg protein 15 pr. dosis, og foretog derefter et angreb med 0,04 mg protein gennem halevenen med 21 dages mellemrum. For forbindelser fra Eksempel 2 modtog hver mus én subcutan injektion med 5 mg/kg med to ugers mellemrum (sædvanligvis på dagene 0, 14, 28 og 42, i forhold til start 20 af forsøget). Man indgav angrebsdoser af identiske opløsninger gennem halevenen med to ugers mellemrum, begyndende to uger efter indgivelsen af den sidste subcutane dosis.
Efter hvert intravenøst angreb iagttog man muse-25 ne i op til % time efter injektionen, og igen 1 time efter injektionen til registrering af tegn på anafylak-tisk reaktion. Herved benyttede man følgende skala:
Mild anafylakse: 1 = overdreven slikning, gnidning eller kradsning 30 2 = strækning af underlivet 4 = usædvanlig ro Alvorlig anafylakse: 8 = bedøvelse 16 = kramper, og 35 32 = død
Resultaterne af forsøg hørende til Eksempel 2 ses i nedenstående Tabel 2.
DK 160842 B
20 TABEL 2
IMMUNOGENITET AF PEG-SOD'er MÅLT VED ET
MUSESENSITIVERINGS/ANGREBSFORSØG
I Resultat ved angreb nr. J
{Forbindelse Mus Nr.__1__2__3__4__5 1 I Nativ SOD 1 444| i ( eksempel 2) 2 32-—------—> |
I 3 4 2 4 4 I
I 4 1 I
5 32-----------> I
I 6 1 I
I 7 I
8 2 4 4 4|
, 9 4 32-----------------> I
I 10 32--------------------- --> I
, U 4 32-----------------> I
12 8 4 4 4 1 I 13 4 4 4 41
I 14 4 8 32-----------> I
I 15 32-----------------> I
( 16 12 1- 14 I 32 I
I 'Totalresultat 1 or 4 angreb = 308____j
j Vægt (g) Γ I
Middel.: 31.7 32.1 33.0 33.6 34.8| I SEM: 2.9 3.3 3.4 3.9 3.4| I-^-—H-^^^-l·-!
I 4XPEG-35K 1 21 1 I
I f eksempel2) 2 2 N |
3 1 O I
I 4 2 4 4 2 T 1
5 2 4 1 I
6 C I
7 1 1 1 Η I
I 8 A I
9 2 1 2 1 L I
I 10 2 2 1 L I
I 11 E I
12 N I
13 2 G I
14 E I
15 4 2 1 D I
I 16 [ II Ill 1 I Totalresultat~~or 4 angreb = 50___|
I Vægt(g) Γ I I iI
i Middel: 32.3 j 33.0 | 34.1 | 35.1 |35.2 | SEM: 2.6 I 3.2 I 3.5 | 3.2 | 4.0 | I_J_ I_I__i_1__l (fortsættes )
DK 160842 B
21 TABEL 2 (fortsat) I r- I Resultat ved angreb nr.
I Forbindelse Mus Nr. 1__2__3 4 5 I 3XPEG-120K 1 I ( eksempel2) 2 i 3 12 i i 7 12 I 8 9 I 10 11 « 12 I i! I tf i . i .iii I Totalresultat For 4 angreb = 13____ ! Miådel:30.8 ' 31.4 31.7 33.4 34.1 I SEM: 3.7 3.6 4.0 4.4 4.6
I 5XPEG-100K 1 JJ
I (eksempel 2) 2 ~ 4
5 C
6 H
7 1 A
8 * 9
10 1 E
11 N
12 G
13 E
14 D
j tt I I I I 2 I
I Totalresultat for 4 angreb = 4___ I Miådi?! 32.0 i 32.8 i 33.3 \ 34.1 |35.0 i__ J_i_i_i_
DK 160842B
22
Det ses, at 7 ud af 16 dyr i gruppen, der modtog nativ SOD, var døde efter det fjerde intravenøse angreb, og at man kunne registrere 22 yderligere tegn på 5 fra mild til alvorlig anafylakse. Modsætningsvis forekom ingen dødsfald i de tre grupper behandlet med PEGSOD, og man registrerede henholdsvis 27,7 og 3 tegn på mild anafylakse hos grupperne behandlet med 4xPEG-35K, 3XPEG-120K og 5XPEG-120K. Totalresultatet for anafylak-10 tisk reaktion var i disse tre grupper efter fire angreb henholdsvis 50, 13 og 4.
Resultaterne af forsøg hørende til Eksemplerne 1 og 6 ses i. nedenstående tabel 3: 23 TABEL 3
DK 160842 B
IMMUNOGENITET AF PEG-SOD's MÅLT VED ET
MUSESENE IT IVERINGS/ANGREBSFORSØG
I-1-^ |
Resultat ved angreb nr. | i Forbindelse Mus Nr. 112 13__4 I 5 |
I Nativ SOD 1 4 I
( eksempel1) 2 1 1 j i 3 4 4 8 32---->
4 32.........-............> I
I 5 4 I
i 5 4 4 1 32— --) 1
I 7 I
8 4 8 8 8 8
I 9 8 32----------> I
I_I _10_ 32—------------------I—> 1
I Total resul tat for 5 angreb_= 239__I
i Totalresultat for 4 angreb = 222 J omregnet til 16 dyr = 355 j I_______— .i I Miåde?: 31.5 33.7 35.2 37.4 N.D.j
I SEM: 2.2 2.4 2.9 3.3 N.DI
I______]_i
1 6XPEG-5K 1 I
(eksempel 1) 2 4 8 32— —> 1 I 3 32----- I 4 14 5 1 4 1 I 6 4 1 1 l 1 I 8 ,1 I 8 4 I_ 10__---U_ I Totalresultat for 5 angreb = 99_-
Totalresultat for 4 angreb = 96 |
omregnet til 16 dyr = 154 I
i , | I
I Væqt(g) I I I " Γ _
Miadel: 29.8 | 32.2 | 33.0 | 34.3 Μς n SEM: | 2.3 | 2.3 | 2.0 | 2.3 j Ί i_\_I I_I_I__L_I_i (fortsættes)
DK 160842 B
24 TABEL 3 (fortsat) I - i Resultat ved angreb nr.
jForbindelse Mus Nr. 1 | 2 13 4 I 5 I 3.3XPEG-40K 1 t ( eksempel 6)2 2 2 I 3 I 4 I 5 I 6 1 1 I 7 I 8 I 9 I 10 I 11 I 12 I 13 I 14 I 15 I 16 I I 1 __ I I otalresultat for 4 angreb = 4 I Vægt(q) I Miadel: 31.0 31.4 32.3 32.7 34.7 I SEN: 2.4 2.5 2.8 3.2 3.8 I Π I 3XPEG-72K 1 I (eksempel 1) 2 I 3 I 4 I 5 I 6 I 7 |
I 8 I
I 9 I
I_ 10 I 1 l i I Totalresultat for 5 angreb = 0 __ I Vægt(g) 1 1 1 I Middel: 29.0 j 30.3 | 32.0 | 33.4 J34.9 I SEN: 1.9 I 1.9 | 2.2 | 2.2 | 2.9 I . ....._i_I_1_I_
DK 160842 B
25
Som ovenfor nævnt kan det af tabellen ses, at 5 ud af 10 mus var døde efter det fjerde intravenøse angreb med nativ SOD, og 2 ud af 10 mus var døde efter det 5 fjerde intravenøse angreb med 6xPEG-5K, hvorimod ingen dyr var døde efter fire eller endog fem angreb med ’ 3xPEG-72K eller 3,3xPEG-40K.
Til sammenligning af resultater fra tabellerne 2 og 3 kan man benytte resultater i Tabel 3 for totalre-10 sultat (af anafylaktiske pointværdier) efter 4 angreb og multiplicere med 1,6 (16 mus/10 mus).
Herved findes følgende totalresultater:
Nativ SOD (Eks. 1) 355
Nativ SOD (Eks. 2) 308 15 6XPEG-5K (Eks. 1) 154 4XPEG-35K (Eks. 2) 50 3,3XPEG-40K (Eks. 6) 4 3XPEG-72K (Eks. 1) 0 5XPEG-100K (Eks. 2) 4 20 3XPEG-120K (Eks. 2) 13
De anafylaktiske totalresultater på 0-13 er næppe signifikant forskellige, men er tydeligt bedre end resultatet 50 for 35K-konjugatet, der ikke er ifølge 25 opfindelsen.

Claims (10)

1. Vandopløseligt, i det væsentlige ikke-immu- , 5 nogent konjugat af en superoxiddismutase koblet med et koblingsmiddel til en polyalkylenglycol, kendetegnet ved, at polyalkylenglycolen er en poly-ethylenglycol eller et polyethylen-polypropylenglycol copolymerisat, hvori denne glycol har en middelmolekyl- 10 vægt målt ved HPLC med PEG som standard på ca. 40 000 -200 000 Dalton og er terminalt usubstitueret eller substitueret med C1-C4 alkylgrupper.
2. Konjugat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at polyalkylenglycolen er en polyethylen- 15 glycol med en middelmolekylvægt på ca. 40 000 - 200 000 Dalton målt ved HPLC.
3. Konjugat ifølge krav 2, kendeteg net ved, at polyethylenglycolen er en polyethylen-glycol med en middelmolekylvægt på ca. 50 000 - 150 000
20 Dalton målt ved HPLC.
4. Konjugat ifølge krav 3, kendeteg net ved, at der er koblet 2-8, fortrinsvis 2-6, po-lyethylenglycolgrupper til hvert kobber- og zinkholdigt superoxiddismutasemolekyle.
5. Konjugat ifølge krav 4, kende.teg- n e t ved, at polyethylenglycolen er en isopropoxy-ethylenglycol.
6. Konjugat ifølge krav 1,kendeteg ne t ved, at den terminale gruppe i en polyethylen- 30 glycol er bundet via et CO-led til terminale aminogrup-per på lysinrester i superoxiddismutase.
7. Farmaceutisk præparat,kendetegnet ved, at det indeholder en tilstrækkelig mængde af et konjugat ifølge krav 1 til opnåelse af en terapeutisk 35 superoxiddismutasevirkning.
8. Præparat ifølge krav 7, kendeteg net ved, at det indeholder en effektiv antiinflamma-torisk mængde af konjugatet. DK 160842 B
9. Præparat ifølge krav 7, kendetegnet ved, at den terapeutiske superoxiddismutasevirk-ning er en mildning af oxygentoksicitet.
10. Præparat ifølge krav 7, kendeteg-5 net ved, at den terapeutiske superoxiddismutasevirk- ning er en beskyttelse mod reperfusionsskader.
DK392789A 1987-08-03 1989-08-10 Vandoploeselige konjugater af superoxiddismutase, samt farmaceutisk praeparat indeholdende konjugatet DK160842C (da)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8100987A 1987-08-03 1987-08-03
US8100987 1987-08-03
US8802530 1988-07-29
PCT/US1988/002530 WO1989001033A1 (en) 1987-08-03 1988-07-29 Conjugates of superoxide dismutase

Publications (4)

Publication Number Publication Date
DK392789D0 DK392789D0 (da) 1989-08-10
DK392789A DK392789A (da) 1989-08-10
DK160842B true DK160842B (da) 1991-04-22
DK160842C DK160842C (da) 1991-10-14

Family

ID=22161332

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK392789A DK160842C (da) 1987-08-03 1989-08-10 Vandoploeselige konjugater af superoxiddismutase, samt farmaceutisk praeparat indeholdende konjugatet

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP0377613B1 (da)
JP (1) JP2515389B2 (da)
KR (1) KR920001426B1 (da)
CN (1) CN1020458C (da)
AU (1) AU608901B2 (da)
CA (1) CA1309046C (da)
DE (1) DE3876997T2 (da)
DK (1) DK160842C (da)
ES (1) ES2007536A6 (da)
HU (1) HU203783B (da)
IE (1) IE64284B1 (da)
IL (1) IL87177A (da)
NZ (1) NZ225481A (da)
PH (1) PH27225A (da)
RU (1) RU1776275C (da)
WO (1) WO1989001033A1 (da)
ZA (1) ZA885249B (da)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2136595T5 (es) † 1989-04-19 2004-04-01 Enzon, Inc. Carbonatos activos de oxidos de polialquileno para la modificacion de polipeptidos.
US5109118A (en) * 1989-07-06 1992-04-28 Yutaka Mizushima Modified biologically active proteins
GB8919661D0 (en) * 1989-08-31 1989-10-11 Univ Alberta Superoxide dismutase-catalase conjugates
US5772996A (en) * 1990-08-03 1998-06-30 Public Health Laboratory Service Board Pharmaceutical compositions containing superoxide dismutase from Bacillus Stearothermophilus and Bacillus Caldotenax
EP0598037A1 (en) * 1991-08-05 1994-05-25 Sanofi Buffered formulation of peg-sod
FR2687681B1 (fr) * 1992-02-20 1995-10-13 Transgene Sa Conjugues polyethyleneglycol-hirudine, leur procede de preparation et leur emploi pour le traitement des thromboses.
US5349001A (en) * 1993-01-19 1994-09-20 Enzon, Inc. Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides
US5516703A (en) * 1993-08-20 1996-05-14 The University Of Utah Coating of hydrophobic surfaces to render them protein resistant while permitting covalent attachment of specific ligands
US6284503B1 (en) 1993-08-20 2001-09-04 University Of Utah Research Foundation Composition and method for regulating the adhesion of cells and biomolecules to hydrophobic surfaces
CA2332334A1 (en) * 1998-06-23 1999-12-29 Novozymes A/S A polypeptide-polymer conjugate
US6638526B1 (en) 1998-06-23 2003-10-28 Novozymes A/S Polypeptides conjugated to copolymers of ethylene oxide and propylene oxide to reduce allergenicity
CN1315997A (zh) * 1998-07-17 2001-10-03 诺沃奇梅兹有限公司 具有改进的洗涤性能的多肽－聚合物缀合物
US8129330B2 (en) 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US20040062748A1 (en) 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
JP5207590B2 (ja) 2002-12-26 2013-06-12 マウンテン ビュー ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 増強された生物学的能力を有するインターフェロン−βのポリマー結合体
CN1820024B (zh) 2003-05-12 2011-06-22 阿费麦克斯公司 新的聚(乙二醇)修饰的化合物及其用途
CN108445106A (zh) * 2018-04-11 2018-08-24 南京明捷生物医药检测有限公司 一种药物中消泡剂聚丙二醇残留的检测方法
CN108864309B (zh) * 2018-07-26 2021-07-13 广州暨南大学医药生物技术研究开发中心有限公司 重组人sod-生长因子融合蛋白、其制备方法及其应用
CN109112119B (zh) * 2018-08-28 2022-04-26 佛山科学技术学院 经化学修饰的鸭血sod制剂的制备方法
CN117551625B (zh) * 2024-01-12 2024-03-08 山东爱维德生物科技有限公司 一种用于木立芦荟sod胶的聚乙二醇二胺-海藻酸改性sod酶及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL74177A (en) * 1984-02-03 1989-09-10 Abbott Lab Stabilized enzyme conjugate composition containing a calcium salt and a polyethylene glycol
GB8430252D0 (en) * 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
GB8430253D0 (en) * 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
JPH084504B2 (ja) * 1985-04-26 1996-01-24 味の素株式会社 安定化ス−パ−オキサイドジスムタ−ゼ

Also Published As

Publication number Publication date
ES2007536A6 (es) 1989-06-16
JP2515389B2 (ja) 1996-07-10
CN1020458C (zh) 1993-05-05
AU608901B2 (en) 1991-04-18
DE3876997D1 (de) 1993-02-04
ZA885249B (en) 1989-04-26
EP0377613B1 (en) 1992-12-23
DK392789D0 (da) 1989-08-10
DE3876997T2 (de) 1993-04-29
CA1309046C (en) 1992-10-20
HU203783B (en) 1991-09-30
IL87177A0 (en) 1988-12-30
DK392789A (da) 1989-08-10
CN1031088A (zh) 1989-02-15
PH27225A (en) 1993-05-04
JPH02504341A (ja) 1990-12-13
DK160842C (da) 1991-10-14
RU1776275C (ru) 1992-11-15
IE64284B1 (en) 1995-07-26
HUT52816A (en) 1990-08-28
WO1989001033A1 (en) 1989-02-09
AU2326888A (en) 1989-03-01
IE882206L (en) 1989-02-03
EP0377613A1 (en) 1990-07-18
NZ225481A (en) 1990-11-27
KR890701736A (ko) 1989-12-21
KR920001426B1 (ko) 1992-02-13
IL87177A (en) 1992-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5468478A (en) Conjugates of superoxide dismutage coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
DK160842B (da) Vandoploeselige konjugater af superoxiddismutase, samt farmaceutisk praeparat indeholdende konjugatet
Boccu et al. Pharmacokinetic properties of polyethylene glycol derivatized superoxide dismutase
US5334382A (en) Lyophilized polyethylene oxide modified catalase composition, polypeptide complexes with cyclodextrin and treatment of diseases with the catalase compositions
AU2015242970B2 (en) Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
AU675798B2 (en) Low diol polyalkylene oxide biologically active proteinaceous substances
US5438040A (en) Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
KR101022577B1 (ko) 항원성이 감소한 중합체 콘쥬게이트, 이의 제조방법 및용도
US20100221808A1 (en) Polysialic acid derivatives
EP1534269A1 (en) Oxime conjugates and methods for their formation and use
AU2009246851B2 (en) Conjugates of a cholinesterase moiety and a polymer
EP1725583B1 (en) Methods for increasing protein polyethylene glycol (peg) conjugation
JP5458416B2 (ja) 二本鎖ポリエチレングリコール化成長ホルモン、その製造方法およびその使用
ES2395894T3 (es) Hemoglobinas de mamífero compatibles con plasma sanguíneo, reticuladas y conjugadas con poli(óxidos de alquileno) como portadores de oxígeno médicos artificiales, su preparación y su uso
Shahbazmohammadi et al. Synthesis and Analysis of Biochemical and Pharmaceutical Properties of Polysialylated Recombinant Streptokinase Enzyme

Legal Events

Date Code Title Description
PBP Patent lapsed

Country of ref document: DK