JPH02504341A - スーパーオキサイドディスムターゼ結合体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 スーパーオキサイドディスムターゼ結合体本発明は、スーパーオキサイドディス ムターゼ（ＳＯＤ）のアミノ基、カルボキシル基またはスルフヒドリル基の少な くとも一部がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリエチレンーポリプロ ピレングリコールコボリマーのようなポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）に結 合したスーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）結合体または付加物に関し 、ここでＰＡＧは２０，０００以上の分子量、好ましくは４０．０００〜１．０ ００，０００ダルトンの平均分子量を有する。特に断らない限り、ＰＡＧの分子 量はＰＥＧを標準として用いた高速サイズ排除液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ Ｃ）により決定したものである。ＦＡＧの平均分子量は、４０，０００よりも太 きく　２００，０００−よりも小さいのが好ましく、５０．０００〜１５０．０ ００であるのが最も好ましい。その上うなＰＡＧは直線状かまたは分枝鎖状であ り、非置換であるかまたはＣ１〜４アルキル基またはＣ１〜、アルコキシ基で置 換されているＣ２個のＳＯＤ分子へ■結合を防ぐのに特に有用なのは、１つの末 端基がイソプロポキン基のようなＣＩ”−４アルキルエーテル基であるＦＡＧ分 子でめる。

発明の前景 従来の研究者は、（ａ）血清持続性（ｓｅｒＬｍ　ｐｅｒｓｉｓｔａｎｃｅ）の 増加、および（ｂ）免疫原性の減少を種々の程度で示す付加物を得るにめに、ス ーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）および他のタンパク質に結合させ１ こ低分子量、特に分子量約５．０００以下のＰＥＧまたはメトキシ−ＰＥＧを用 いてきた。しかし戸から、（ａ）および（ｂ）の両目的を充分に達成するにめに 必要な、低分子量のＰＥＧまたはメトキシ−ＰＥＧによるタンパク質基の修飾が 、しばしば、酵素活性または生物学的活性の実質的な喪失を導くほどになること がある。

発明の詳細 スーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）は、スーパーオキサイドラジカル の酸素および過酸化水素への変換を触媒する細胞内酵素である。本発明の目的は 、天然のＳＯＤタンパク質よりもインビボでの持続性が優れた生成物を提供し、 腎臓に上る不活化を遅延させることにある。本発明の生成物が、低レベルの免疫 原性を示しながら長期間にわたって酵素活性を保持することは特に重要である。

たとえば従来のカラギーナン誘発足浮腫試験で示されるような抗炎症作用ををす る結合体を提供することもまた、この発明の特別の目的である。この作用により 本発明の生成物はリウマチ疾患の治療に特に有望なものとなる。

本発明により実現される新規な概念は、２０，０００よりも大きい高分子量のＦ ＡＧストランドを利用するものである。本発明に使用するＰＡＧは、たとえばポ リ（エチレンオキサイド）のようないかなるアルキレンオキサイドの水溶性ポリ マーであってよく、あるいはエチレンオキサイドやプロピレンオキサイドのある 種のコポリマーであってよい。ＦＡＧは直線状であっても分枝鎖状であってもよ く、Ｃ＋−ａ−アルコキシ基または他の化学基により１または２以上の水酸基部 位で置換されていてよい。しかしながら、本発明の結合体を調製するために使用 するＦＡＧポリマーの分子量は２０．０００よりも大きく、４０，０００〜２０ ０，０００ＭＷの範囲であるのが好ましい。２００，０００よりも大きな分子量 のポリマーを使用することもできるが、粘度が高くなることとせん断力により開 裂が起こりやすくなることから好ましくない。

本発明のＰＡＧ−ＳＯＤ付加物は、約８５，０００〜約２，０００゜０００ダル トン、好ましくは約９０，０００〜１，０００，０００ダルトンの範囲の分子量 （分子量の知られたＦＡＧ標準に相関して）を有する。さらに、本発明のＦＡＧ −ＳＯＤ付加物および他のＰＡＧ−付加物は、通常、天然タンパク質の酵素活性 をほぼ保持している。

（ここでの分子量は、分子量の知られたＰＡＧ標準に基づいていることに注意す べきである。ＨＰＬＣ検愈のために、タンパク質当量分子量、すなわちＭＷの知 られたタンパク質標準に基づ＜ＭＷは５〜８倍大きくなるように思われる。） 本発明の結合体は、一層少ないＦＡＧストランドを付着させることにより活性な 親分子の化学修飾を少なくし、親分子の本来の特性の保持を良くするという点に おいて従来の生成物の改良となるものである。従って、本発明におけるように一 層少ないストランドの高分子量ＦＡＧを使用することにより、得られる付加物は 親分子の活性の実質的にすべててはないにしてもその殆どを保持しながら、７） ）つ血流中における持続性も増加している。本発明の付加物の他の利点は、高分 子量のＰＡＧを使用することにより、他の研究者みによって達成されるのと同じ 程度の修飾の度合で一層大きな付加物を調製することができることである。さら に、幾つかの応用例においては、一層大きなＦＡＧ付加物は明らかに有利である 。７二とえば、この発明の方法により４０，０００〜１３０，０００ＭＷノ範囲 のＰＡＧ−ストランドを使用して調製され、この発明の原理を例証するこの発明 のＦ　Ａ、Ｇ　−Ｓ　ＯＤ付加物は、マウスにおける血清中の半減期が約３６時 間まにはそれ以上であり、従来の研究者らにより記載されたＦＡＧ−５ＯＤ付加 物よりも長い。

ＦＡＧ−ＳＯＤ付加物は、タンパク質分子当たりに結合しているＦＡＧの数は１ 〜１０鎖であるのが好ましく、タンパク質分子当ｆ二り２〜８鎖、とりわけ２〜 ６鎖であるのが一層好ましい。充分を血清持続性を達成するのに必要な鎖の数は 、長い鎖を使用するほど減少する。

この発明のｓｏＤｇ製物は、一般に、ウシ、他の動物（たとえばヒツジ、ウマ、 ブタ、イヌ、ウサギ、ニワトリ）またはヒト細胞由来酵素の哨乳動物類銅−およ び亜鉛−含有スーパーオキサイドディスムターゼ形のものである。鉄やマンガン のような他の金属を含有するＳＯＤ調製物もまた利用できる。微生物培養物由来 の同属構造を有する酵素もまた有用であり、そのような構造は該培養物中でクロ ーニングされ発現される。この発明の生成物は免疫原性が減少しているので、そ のような微生物培養物における不正確な翻訳の結果としてＳＯＤが天然に存在す るタンパク質と全く同じでなくてもよい。

他の方法で調製される５ＯＤｔ１８製物では、非経口投与を繰り返すことにより 免疫原的に安全でなくなるような非Ｓ　ＯＤタンパク質を痕跡量含有する上うな 場合、そのようなＳＯＤをこの発明の方法により結合させれば、不純物タンパク 質は゛実質的に免疫原性が減少するのでその生成物は相当有用になることもまた わかりｆ島結合工程には多くの従来反応を使用することができる。

好ましい反応は、カルボニルジイミダゾール、ｐ−ニトロフェニルりロロホルメ ートまγ二はビスーＮ−スクンンイミジルカーポ゛ネートなどの試薬を用い、反 応性カーボネートハーフェステル、Ｐ　Ａ　Ｇ−Ｏ−Ｃｏ−Ｘ（式中、Ｘは良好 な離脱基である）の生成により進行する。ついで酵素活性を破壊しない条件下で 活性化ＦＡＧＳＰＡＧ−ｏ−ｃｏ−ｘをタンパク質と反応させて、主として、リ ジンＯε−Ｎ　８２基のようなタンパク質アミノ基で結合し几ウレタン結合ＦＡ Ｇ−０−Ｃｏ−：＜）（−タンパク質を生成させる。

たとえば、カルボニルジイミダゾールをＰ　、Ａ　Ｇの末端水酸基と反応させる ことができる。反応混合物の反応を中性ｐ）（の水溶液中で停止させ、活性化Ｆ ＡＧ（ポリアルキレングリコールーカルホニルーイミダゾール）を透析および／ ま１こはサイズ排除クロマトグラフィーにより単離する。

過剰量の活性化ＦＡＧを用い、溶液中で行う。

この反応の変法において、ＳＯＤおよび活性化ＦＡＧの溶液を凍結乾燥する。結 合生成物は、サイズ排除クロマトグラフィーにより首尾よく単離される。イオン 交換クロマトグラフィーを含む他の精製法を用いることもできる。

別の結合反応においては、ポリアルキレングリコールを不活性有機溶媒に溶解し 、反応混合物を弱アルカリ性にし、塩化シアヌル酸と反応させる。

未反応の塩化シアヌル酸は、石油エーテルてＦＡＧを沈澱させることにより取り 除く。残留する溶媒を蒸発させて２−ＰＡＧ−６−クロロ−１，３，５−）リア ノンを得る。ついで、得られた活性化ポリマーを、たとえばホウ酸塩溶液のよう な適当な緩衝液中でＳＯＤと反応させる。未反応の活性化ＰＡＧを除き、生成物 をクロマトグラフィーにより単離する。こうして、４−ヒドロキシ−１，３，５ −トリアジンの２−位にポリアルキレングリコール基Ｐ　Ａ　Ｇ　−０−が結合 し、その６−位でＳＯＤの反応性リジン基のε−アミノ基に結合し几生成物が得 られる。

γことえば、無水コハク酸と反応させるかまたはブロモ酢酸エチルおよびアルカ リと反応させることにより、または過マンガン酸アルカリで末端−ＯＣＨ＊　Ｃ Ｈ＊　ＯＨを酸化させてＦＡＧ酢酸エーテル、ＰＡＧ−０−ＣＨ，−ＣＯＯＨを 生成させることにより、ＰＡＧ−０）（の１または２以上の水酸基をカルボキシ ル基に変換することもできる。ついで、タンパク質修飾に有用なものとして一般 に知ちれている方法、たとえばカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイ ミドとの反応によるＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの生成、またはアシ ルヒドラジドのニトロソ化（ｎｉｔｒｏｓａｔｉｏｎ）ｌ：よるアシルアジドの 生成により、カルボキシル基を活性化する。ついで、タンパク質の酵素活性を破 壊しない条件下で活性化ＰＡＧをタンパアミノ基など）を介してアミド結合（Ｐ ＡＧ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−タンパク質）を主として伍成させる。

たとえば、まず臭化チオニルと反応させてＰＡＧ−Ｂｒを生成させ、ついで過剰 のアンモニアでアミツリシスを行ってＦＡＧ−ＮＨ２を生成させることにより、 ＦＡＧの末端水酸基をアミノ基に変換することもできる。ついで、水溶性カルボ ジイミドやウラドウオード試薬Ｋ（Ｗｏｏｄｖａｒｄ’ｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋ ）のような試薬を用いることにより、アミド結合を介してアミノ−ＰＡＧをタン パク質のカルボキシル基に直接結合させることかできる。別法として、たとえば 無水コハク酸と反応させることによりアミノ官能性をカルボン酸官能性に変換す ることもでき、ついでこれを上記のようにして活性化しタンパク質と反応させる 。

ＰＡＧの末端−ＣＨ，ＯＨはまた、たとえばＭ　ｎ　Ｏｔで酸化することにより アルデヒド基、−ＣＨ（＝０）に変換することもできる。ついで、たとえば水素 化シアノホウ素を用い、タンパク質の遊離のアミノ基を介してアルデヒド基を還 元的にタンパク賃上にアルキル化して主として第二のアミン基を介して結合させ 、ｐ　Ａ　Ｇ　　ＯＣＨｔＣＨＩＮＨ−タンパク質を得ることができる。

タンパク質のアミノ基に加えて、タンパク質のカルボキシル基およびスルフヒド リル基もまたＰＡＧへの結合に使用することができる。

上述したごとく、結合反応の選択にあたって、ＰＡＧのタンパク質への結合橋の 部分として炭素、酸素、硫黄、窟素および水素からなる非芳香族基のみを残す反 応が好ましい。

結合したＳＯＤの反応溶液からの単離は、好ましくは透析して外来イオンを除去 した後、従来の凍結乾燥法により行うことができる。

所望または必要なときは、イオン交換クロマトグラフィー、電気泳動、および／ またはゲル濾過により結合体をさらに精製することができる。

たとえば塩化ナトリウムおよび／またはリン酸ナトリウムでイオン強度を等張ま で任意に調節しＴこ後、通常の方法で微孔フィルターにより滅菌バイアル中へ濾 過することにより、注射投与に適した滅菌溶液が得られる。

医薬組成物は、滅菌注射調製物、たとえば滅菌注射水溶液の形態であるのが好ま しい。この溶液は、上記薬理学的に許容し得る担体を用い、公知技術に従って調 剤することができる。滅菌注射調製物はまた、非毒性で非経口的に許容し得る希 釈剤または溶媒中の溶液または懸濁液であってもよい。

この発明の組成物は、特定の薬理学的担体に適した経路で単位投与量の組成物を 投与したときに所望の応答を引き起こすのに有効な濃度で有効単位投与量のＳＯ Ｄ結合体を配合している。たとえば、液体組成物は、通常、０．２５〜１０ｓ＋ ρ、好ましくは約０．５〜５１当１；り約０．５〜４０ｚｇの結合体タンパク質 を含有しているが、例外として静脈内注入溶液はもっと希釈してもよく、たとえ ば注入溶液５０〜１，０００ｉ１２、好ましくは１００〜５００１当たり０．５ 〜２００ｉｙのＳＯＤ結合結合体タンパクツ希釈してよい。錠剤、カプセル剤お よび坐剤は、通常、投与単位当たり０．１〜２５ｎ、好ましくは１〜１０１９の 結合体タンパク質を含有している。

この発明のＳＯＤ結合体は、既存の製品オルゴテインのように、広範囲にｒ）に る炎症疾患の治療に有効であり、この炎症疾患には、にとえば長期にわたる使用 による副作用のｆコめに合成抗炎症剤の有用性が限られている場合か含まれる。

さらに詳しくは、ＳＯｐ結合体は、種々の哺乳動物において、酸素毒性、再潅流 損傷（ｒｅｐｅｒｆＬｓｉｏｎ　ｉｎコＬ！ｒｙ）および炎症性疾患を改善し、 それらの影響、１；とえば尿管および関節への影響を軽減するのに有効である。

ＳＯ，Ｄ結合体は、外傷性関節炎、および滑液のう炎、けん炎および変形性関節 症のようなリウマチ性疾患の症状およびこれら疾患に伴う形態上の変形を緩和す るのに有用である。

つぎに本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。

実施例Ｉ ＰＥＧ（５０９：ユニオン・カーバイド社製のラベルのあるポリオックスまたは ポリエチレンオキサイド１００．０００．固有粘度測定により決定され几表示分 子量１００，０００（ＨＰＬＣては平均分子量約５０．０００）のイソプロポキ モル化ＰＥＧかみなる）を乾燥ビリノンｌａ中に溶解し、無水コハク酸２２ｙを 加えｆコ。二〇混合物を６０℃で３８時間攪拌し１：ｅ６０℃未満にて真空下で 溶媒を除き、残渣を水５００１中に再溶解した。この溶液をヘキサンで洗浄し、 ついで生成物をクロロホルム１０００ｘ（ｊに抽出しに。４０℃にて真空下でク ロロホルムを除き、生成物をベンゼン中に溶解した。石油エーテルでスクシニル 化ＰＥＧをベンゼンから２回再沈澱させた。

このスクシニル化ＰＥＧの水溶液をサイズ分画し、３００，０００（タンパク質 標準）分子量カットオフ膜を備えｆニミリボア３ミニタン駆１ｉｌｌｉｐｏｒｅ ＲＭｉｎｊｔａｎＲ）装置を用いた限外濾過により低分子量のＰＥＧを除いた。

サイズ分画生成物を真空下で乾燥した。水性サイズ排除ＨＰＬＣで分析し１：と ころ、限外濾過の結果、スクシニル化ＰＥＧの平均分子量が約５０，０００から 約８０，０００に増加したことが示された。ついて、かくして得られ１こサイズ 分画スクシニル化ＰＥＧをＮ−ヒドロキノスクシンイミドで活性化した。スクシ ニル化ＰＥＧ］２ｆ（分子量ｓ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ、０．１５ミリモル）を乾燥ジ メチルホルアミド１２０ｍＱ中に溶解し、攪拌しながらＮ−ヒドロキノスクシン イミド３００Ｆ、Ｓ＋（２，６ミリモル）を加えに。溶解後、ジシクロへキンル カルボジミド（２，４ミリモル）を加え、溶液を４０℃で３０分間攪拌し、つい で２４℃で攪拌什ずに５日間放置し１こ。

ついで、この混合物をガラス繊維フィルターで濾過し、濾液を４０℃にて真空下 で蒸発乾固し１こ。この残渣を、穏やかに加熱しながら、乾燥トルエン２００ｇ （中に溶解した。石油エーテル４００πｇを添加する二とにより、固体Ｎ−ヒド ロキノスクノンイミジルＰＥＧを沈澱させに。真空下、ガラス繊維フィルター上 に生成物を集め、ついで石油エーテルを用いてトルエンかみ再び沈澱させ、つい て真空乾燥した。サイズ排除ＨＰＬＣによりば、生成物の分子量は該活性化によ り変化しなかっ１こことが示され１ユ。

０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８，０）３９πＣ中にウンＣビ、Ｚｎ　５ ＯＤ８　（１＋９（２，４６フイクロモル、４４００単位／１９、ＤＤ＋ファー マシューティカルズ（Ｄ　Ｄ　Ｉ　　Ｐｈａｒｍａｃｅｐｔｉｃａ！ｓ、　ｉｎ ｃ、）製）を含有する溶液を、乾燥Ｎ−ヒドロキンスクンンイミジルＰＥＧ誘導 体４９Ｃ５０マイクロモル）に加え、その混合物を２４℃て溶解しに。

サイズ排除ＨＰＬＣによれば、未反応ＳＯＤの消失および約２００゜０００の分 子量の高分子１１ＪＶ−吸収付加物ピークの出現から明らかなように、結合反応 は１．５時間以内に実質的に完了したことが示されに。

ＳＯＤに結合しｔかっ１こ遊離のＰＥＧを、イオン交換クロマトグラフィーによ りＰＥＧ−９ＯＤ付加物から分離した。ＮａＣｌを用い溶出緩衝液（ｐＨ９）の イオン強度を増加させることにより、ＰＥＧ−ＳＯＤ含有含有フラクションめた 。そのＰＥＧ−ＳＯＤフラクションを水に対して透析して緩衝ＫＩ威分を除き、 ついで凍結乾燥または真空蒸発により濃縮し７こ。

一例として、５０ｍＭＮａＣ］で溶出する典型的な生成物の性質を記載する。こ の付加物は、２４巧のＳＯＤタンパク質および１６５杼のタンパク質−結合ＰＥ Ｇを含有していた。タンパク質含量およびＰＥＧ含量の決定は、屈折率検出（Ｒ Ｔ）を用い、タンパク質のＲＩ起因誤差を補正して、タンパク質についてはビウ レット分析により、ＰＥＧについてはＨＰＬＣにより行った。タンパク質結合Ｐ ＥＧについて決定しに平均分子量は７２，０００であっ１こ。タンパク質分解に より付加物から放出されるＰＥＧの上記ＭＷを、付加物中におけるＰＥＧに対す るＳＯＤタンパク質（３２，０００ＭＷ）の比が２４Ｍ９〜１６５ｘｇであると いうデータと組み合わせると、１分子のＳＯＤ当たり３ストランドの比でＰＥＧ が結合しているということになる。このようにして得られたＳＯＤ分子当たりの ＰＥＧストランドの数から、付加物のＭＷが２２０，０００（７２，０００ｘ３ ＋３２．Ｏｏ　Ｏ／ｓ）と計算され、この結果はＨＰＬＣにより得られたＭＷと 一致する。

上記付加物のＳＯＤ活性の決定は、マツコード（ＭｃＣｏｒｄ）およびフリドビ ッチ（ＦｒｉｄｏｖｉｃｈＸＪ　、　Ｂｊｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　　２４４　：６ ０４９〜６０５５；（１９６９））のチトクロームＣアッセイを用いて行った。

ＰＥＧ−ＳＯＤ付加物（約４３１７単位／Ｉｌ！９タンハク質）　ノ比活性ハ、 天然の酵素出発物質（４４００単位／！９）の９８％であった。従って、この生 成物は、本発明の他の要件を満足していながら、天然の酵素活性または生物学的 活性の殆どすべてを依然保持している。

成熟雌スイスウェブスターマウスにおける免疫学的感作能（アナフィラキシ−反 応を引き起こす作中）について、感作／攻撃試験を用い、この実施例に記載され たようにして得るれにＰ　Ｅ　Ｇ　−Ｓ　ＯＤ誘導体と高度に精製した未修飾Ｓ ＯＤ出発物質とを比較した。投与光たり０．０７５Ｈのタンパク質を２週間の間 に４回皮下注射することにより１０匹のマウスを免疫し、ついで２１日の間隔を おいてタンパク質０．０４ｚ９の同化合物を静脈注射して攻撃した。５回目の静 脈注射攻撃により、未修飾ＳＯＤの投与群においては、５匹の被験動物が死亡し 、残っに５匹の動物のうち３匹はアナフィラキシ−の兆候を示したが、同じ投与 ｌのｐＥａ−ｓｏＤを投与した１０匹の動物のいずれもアナフィラキシ−の兆候 を示さなかっｋわＳＯＤ＋分子当１こり５０００ＭＷのＰＥＧを約６ストランド 含有するＰＥＧ−ＳＯＤ付加物を同じプロトコールで試験したときには、５回目 の攻撃により１０匹の動物のうち２匹が死亡し、残る動物のうち４匹がアナフィ ラキシ−の兆候を示した。従って、ＳＯＤ当たり？２．０００ＭＷのＰＥＧを３ ストランド含有する本発明により製造されるＰＥＧ−５ＯＤは、２倍のストラン ドの５．Ｃ１Ｃ１０ＯのＰＥＧを倉荷するＰＥＧ−５ＯＤよりも免疫原性が小さ かった。

寒鬼烈主 実施例１の方法に従い、高分子量のＰＥＧをウシＣＬＩ、　Ｚｎ　Ｓ。

Ｄに結合した。１００．ＯＯＯＭＷのＰＥＧを５ストランド有する生成物および １２０．ＯＯＯＭＷのＰＥＧを３ストランド有する生成物は、天然のＳＯＤまた は３５，００（ＩＭＷのＰＥＧを４ストランド有する生成物よりもマウスにおけ る免疫原性が小さいことがね成熟雌スイスウェブスターマウスを用い、天然のＳ ＯＤの血清持続性を実施例１の方法により調製したＰＥＧ−９ＯＤの血清持続性 と比較した。１００μ２のＳＯＤを静脈内に注射した。血液を一定期間毎に集め 、その血漿について、ＰＥＧ−ＳＯＤをマウスＳＯＤから分離する電気泳動法に より特定のＰＥＧ−ＳＯＤ活性をアッセイした。試験したＰＥＧ−ＳＯＤ付加物 の一つは約６５゜ＯＯＯＭＷのＰＥＧを２ストランド有しており、他のＰＥＧ− ＳＯＤ付加物は約４０．ＯＯＯＭＷのＰＥＧを４ストランド有していた。マウス における天然ＳＯＤの消失半減期は５〜ｌＯ分であったが、これら両ＰＥＧ−Ｓ ＯＤ付加物の消失半減期はともに３６時間以上で、これら被験動物においてＰＥ Ｇ−ＳＯＤ活性は少なくとも９日間血液中で検出することができた。約４５．Ｏ ＯＯＭＷのＰＥＧを平均２゜６ストランド有する他の調製物からもまた３６時間 を越える半減期が得られた。

実施例４ １００．０００ＭＷ（固有粘度により決定した平均分子量）と表示されているが ＨＰＬＣにより測定した平均ＭＷは約５０，０００であるＰＥＧ（ユニオン・カ ーバイド）の水溶液を、３００，０００（タンパク質標準）分子量カットオフ膜 を備えたミリボアミニタン装置を用いた限外濾過によりサイズ分画した。サイズ 分画した生成物を真空下で乾燥させた。ＨＰＬＣによる分析によれば、試料の平 均ＭＷは限外１１１過後に５０，０００から１００．０００に増加した。そのよ うなサイズ分画したＰＥ０３．７７ｇを倉荷する乾燥アセトニトリル１００岐溶 液に、塩化シアヌル酸１．３９９の乾燥アセトニトリル２．８震ｅ溶液を加え１ ユ。２４℃で３日間放置した後、その溶液を等容儀のアセトニトリルで希釈し、 ついで濾過して澄明な溶液とし７ニ。

溶媒を３０℃にて真空下に蒸発除去し、その残渣を乾燥トルエン１２０ｘρ中に 再溶解した。乾燥ヘキサン３６０ｉｆｆを添加して生成物を沈澱させた。石油エ ーテルを用いて生成物をトルエンからもう一度沈澱させ、真空乾燥して塩化シア ヌル酸活性化ＰＥＧを得た。サイズ排除ＨＰＬＣによれば、ＰＥＧのＭＷは活性 化によっては変化しなかっに、上記のようにして得た種々の量の活性化ＰＥＧを 、１πりの一定のレベルで存在するウシＣｐ、Ｚｎ　ＳＯＤへの結合能について 試験した。最終のＰＥＧ濃度は、５〜Ｉ　００１１９ＩＲＱの範囲でありに。

２４℃で２４時間反応させた後、ＰＥＧ−３ＯＤの生成および残留するＳＯＤの 量についてＩＪＶ検出を用いにＨＰＬＣによりアッセイした。

第１表 （Ｗ：Ｗ）　　（ＭＵＭ）　　ＳＯＤの付加物　　ピーク１０　　　　３．３　 　　　　　２９％　　　　　９０に２０　　　　６．６　　　　　　６２％　　 　　１４０に５０　　１６．７　　　　　９０％　　　　１５０に７５　　２４ ．０　　　　　９５％　　　　２００に１００　　３３．３　　　　１００％　 　　　２００に＊市販のＰＥＧ樟準で検量したＴＳＫｐＷカラム上の）（ＰＬＯ により決定。

第１表に示されるように、５０：ｌ（Ｗ：〜°）のＰＥＧ／Ｓｏ′Ｄ比（１６、 ６：　１　モＬ比）テＳ　ＯＤ　ｆ）　９０　％がＰＥＧ−９ＯＤｉ：変換され 、平均分子量ｉ：１５０．０００であッｒ：　、Ｐ　Ｅ　Ｇ　／　Ｓ　ＯＤ比が 一層大きくなると、ＰＥＧ−５ＯＤに変換されるＳＯＤの量および付加物の分子 量がともに増加した。得られた付加物のサイズは、シアヌル酸を結合剤として用 いにこれら条件下で、１００．ＯＯＯＭＷのＰＥＧを２ストランドまでＳＯＤに 結合できることを示している。

マウスにおける血清持続性の測定は、第１表においてｌＧ：ｌ（Ｗ：Ｗ）および ７５：１（Ｗ：Ｗ）ＰＥＧ／ＳＯＤ反応のＰＥＧ−３ＯＤ生成物について行った 。上記実施例３に用いたのと同じ方法を用いた。

両被験生成物について少なくとも３６時゛藺の半減期が得られｆコ。

叉豊皿立 １００キロダルトンポリエチレングリコール（１００Ｋ　ＰＥＧ：ユニオン・カ ーバイド）１０ｇを２４時間凍結乾燥して試料中に存在するすべての湿気を除い た。乾燥１００ＫＰＥＧを約４５πａの乾燥アセトニトリルに溶解した。ついで １．１−カルボニルジイミダゾール５．１２ｇを加え、反応混合物を室温で１． ５時間インキニベートシ、ついで脱イオン水中で急冷して過剰のカルボニルジイ ミダゾールを破壊した。

活性化ＰＥＧの加水分解を防ぐためにｐＨを７に保持した。ついで、少なくとも １０回の交換をしながら蒸留水４ｇにて４℃で１日間混合物の透析を行い、アセ トニトリルおよびイミダゾールを除いた。透析後、活性化ＰＥＧを脱イオン水中 のセファクリルＳ−４００カラム上のクロマトグラフィーにかけ、低分子量断片 から活性化１００に−ＰＥＧを分離した。

得られた活性化ＰＥＧに充分なＳＯＤを加えて、５ＯＤ１モル当にりＰＥＧ３モ ルのモル比を得た。ＳＯＤ　　９２．８ｉｇをプール（容積１ｏ８ｙＱ）に加え た。所望のＰＥＧ−０−Ｃｏ−５ＯＤ生成物を生成させるために、混合物を４回 凍結乾燥し７こ。

実施例６ ３５℃で乾燥ジオキサン１１００ｎＱ中にポリエチレングリコール３０ｇを溶か しｉｓ溶液に、窪素雰囲気下に攪拌しながら水素化ナトリウム１０？をゆっ（り と加えた。２５℃でさらに１時間攪拌しに後、ブロモ酢酸エチル１５１１（！を 加えた。この溶液を２５℃で３０分間、ついで４５℃で２時間攪拌し、水２００ ｘＯを加えて反応を停止させ１こ。ついで攪拌しながら石油エーテル４００ｘＱ を加えた。有機相を捨て、粘性の水相を石油エーテルで洗浄しＴコ。ＰＥＧエチ ルエステルを含有する水相を約ｌＱに希釈し１、温度を６０〜７０℃に上げて５ 時間鹸化し１；。最後に、ｐＨ２の〉酸性にすることによってＰＥＧカルホキシ ル基を遊離の酸に変換した。残留するブロモ酢酸を、透析まｋはゲル濾過によっ て除い１こ。かくして調製しにＰ　Ｅ　Ｇエーテルは、実施例１で使用したスク シニル化ＰＥＧと置き換えることができる。

従って、分子量４０，０００の活性化ポリエチレングリコール９゜４９およびウ シＳＯＤ　　７．９ｘｇを用いて、ＳＯＤ１分子当たりＰＥＧを平均３．３スト ランド含有する付加物が得られた。ＨＰＬＣにより決定した生成物の分子量は１ ４０，０００であっに。この付加物は、マウスにおける免疫原性が非常に減少し ていた。

分子量１２０，０００のポリエチレングリコール６．５りおよびウシＳＯＤ８７ ｉｇを用い、ＨＰＬＣにより決定される分子量が約２４５’：０００の付加物を 得た。　　　　　　　　　　　　　′ル化ＰＥＧの試料２０ｒｎｇをガラス管中 に置いた。０．２モルのｐＨ８リン酸−ホウ酸緩衝液中の３＊ｇ／ｙ１２ヒトＳ ＯＤの溶液−１００＋ｎｃｌを加えた。混合後、各反応混合物の試料２ｍｃｌを 取り、２５０μＣマイクロチニーブ中の０．０１？％４１．１酢酸ナトリウム・ 酢酸緩衝液５８ｒｐｌＣ１中で急冷した。反応の進行をモニターするために、試 料を２５０ボルト、ｐＨ８，５にて１５分間電気泳動にかけ、ついでニトロブル ーテトラゾリウムで染色し乙。

室温で３〜３．５時間後、この溶液をＰＥＧＩｚ＠当たり０．０３モルｌ：ｌ酢 酸緩衝液４５ｔｒＱで急冷した。ｐＨ８の反応緩衝液０　、１　ｘＱおよび３０ ｍＭ酢酸塩０　、９　ｖ（ｌの添加により最終ｐＨは６．４となった。

このｐ）（の低下および１：１０希釈により、ＰＥＧ−ＳＯＤ結合および加水分 解がさらに進行するのを停止しに、３０〜４５分後］こは認め得るほどの反応は 認められなかった。

遊離のＳＯＤと同様に１９．０００ダルトンのＰＥ’Ｇストランドを有するＰＥ Ｇ−ＳＯＤは、注射１日後にはマウス血清中Ｚ二検出することはできなかっにが 、３０．０００ダルトンのＰＥＧストランドを有する調製物では一層長い持続時 間が得られ１為従って、ヒトＳＯＤはこの発明の目的に用いることができる。

叉ｌ鳳主 抗炎症作用を評価するために、マウスカラギーナン誘発足浮腫試験を用いた。足 浮腫試験において、雌スイスウェブスターマウスの右後脚足に１．０％カラギー ナン食塩液’ｔ１．０３Ｚｆｆを皮下注射し、ついで３０分後に、食塩水で希釈 しついで濾過滅菌することにより調製した被験化合物１００μｇを被験動物に皮 下投与した。カラギーナン注射の２４時間後に被験動物を層殺し、両後脚を切断 し重量を計った。浮腫は、注射脚（右）の重量マイナス未注射脚（左）の重量と して計算した。食塩水コントロールを含む各処置群における浮腫重量の平均およ び標準偏差を計算したわ マウス当たり３０μ？の投与量において、４５．ＯＯＯＭＷのＰＥＧを２．６ス トランド有する付加物の方が２１．ＯＯＯＭＷのＰＥＧを３．４ストランド有す る付加物よりも浮腫を減少させるのに一層有効であった（４３％抑制ｖｓ１４％ 抑制）。１２０．００ＣＩＭＷのＰＥＧを３ストランド用いて調製した付加物は 、マウス当たり１０μりの投与量で４１％の浮腫抑制を示した。天然のウシＣＵ ／Ｚｎ５ＯＤはこのアッセイで不活性であり、マウス当たり３００μ？て試験し に場合でも、５．ＯＯＯＭＷのＰＥＧを１４ストランド用いて調製し１こ付加物 を被験動物当たりｌＯＯμりで試験した場合と同様に不活性であっ７二。

ウシＣａ、Ｚｎ　ＳＯＤを含有するＰＥＧ−ＳＯＤ結合体と、高度に精製した天 然ウシＣｖ、Ｚｎ　ＳＯＤに対するウサギ抗体との交差反応性を測定するために 、抗原性アッセイとして固相競合結合酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用い た。この発明の結合体は、一層短いストランド、たとえば５．ＯＯＯＭＷのＰＥ Ｇを用いて調製した結合体に比べて、抗原性を減少させるのに一層少数のＰＥＧ ストランドしか必要とされなかった。たとえば、４５．ＯＯＯＭＷのＰＥＧを２ ．６ストランド用いて調製した付加物および３５．ＯＯＯＭＷのＰＥＧを４スト ランド用いて調製した付加物は、５．ＯＯＯＭＷのＰＥＧを６ストランド用いて 調製した付加物に比べて、それぞれ抗原性が１／３および１／ｌ　Ｏであった。

３５．ＯＯＯＭＷのＰＥＧ、を４ストランド用いて調製した付加物は、５．ＯＯ ＯＭＷのＰＥＧを１４ストランド含有する付加物に比べて抗原性ル・半分でうっ １；。

４未満のＰＥＧストランドを用いて調製し１こ付加物のうちで、ｌＯｏ、ｏ　ｏ 　ｏ〜１２０．ＯＯＯＭＷの範囲にあるＰＥＧを用いて調製した付加物が、一層 短いストランドを同数用いて調製した付加物よりも抗原性が小さかった。従って 、ＭＷ１２０，０００のＰＥＧを２ストランド用いて調製したＳＯＤ付加物は、 ３５．ＯＯＯＭＷのＰＥＧを２ストランド用いて調製した付加物と比べて抗原性 はわずかに１　／　５であるに過ぎなかっ１こ。

Ｉ際調糞報告 ―ｖ啼−−Ｉ　Ａｌ１ｍ＋　Ｎａ、　　？ごτ／ＨＥ　　Ｐ！ε′０２　：）　 ３０−１−　　　　　　　国際調査報告 ＬＩＳε８０２５３０ ＳＡ　　　　２３９４０

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．ポリエチレングリコールまたはポリエチレンポリプロピレングリコールコポ リマー残基であるポリアルキレングリコールに結合剤を用いて結合させたスーパ ーオキサイドディスムターゼの水溶性で実質的に非免疫原性の結合体であって、 該グリコールの平均分子量がＰＥＧを標準として用いたＨＰＬＣによる決定によ り約４０，０００〜１，Ｏ００，０００であり、該グリコールの末端が非置換で あるかまたはＣ１〜４アルキル基またはＣ１〜４アルコキシ基で置換されている 結合体。
2. ２．ポリアルキレングリコールが、ＨＰＬＣにより決定された平均分子量が約４ ０，０００〜２００，０００のポリエチレングリコールである請求項１記載の結 合体。
3. ３．ポリエチレングリコールが、平均分子量が約５０，０００〜１５０，０００ のポリエチレングリコールである請求項２記載の結合体。
4. ４．２〜８のポリエチレングリコール基が各銅および亜鉛含有スーパーオキサイ ドディスムターゼ分子に結合している請求項３記載の結合体。
5. ５．２〜６のポリエチレングリコール基が各スーパーオキサイドディスムターゼ 分子に結合している請求項４記載の結合体。
6. ６．ポリエチレングリコールがイソプロポキシポリエチレングリコールである請 求項５記載の結合体。
7. ７．ポリエチレングリコールの末端基がＣＯ結合を介してスーパーオキサイドデ ィスムターゼリジンの末端アミノ基に付着している請求項１記載の結合体。
8. ８．スーパーオキサイドディスムターゼの治療効果を発揮するのに有効な量の請 求項１記載の結合体を含有する医薬組成物。
9. ９．抗炎症に有効な量の該結合体を含有する請求項８記載の医薬組成物。
10. １０．酸素毒性を軽減するのに有効な量の該結合体を含有する請求項８記載の医 薬組成物。
11. １１．再潅流損傷の防止に有効な量の該結合体を含有する請求項８記載の医薬組 成物。