DK161098B - Antistoffer mod modificeret beta2-mikroglobulin, fremgangsmaader til detektering af modificeret beta2-mikroglobulin samt farmaceutiske praeparater indeholdende saadanne antistoffer - Google Patents

Description

i

DK 161098 B

Opfindelsen angår generelt antistoffer rettet mod modificerede B2-mikroglobuliner (nd32m) med den nedenfor anførte formel, hvilke antistoffer kan være poly- eller monoklonale, fremgangsmåder til detektering af m/?2m samt farmaceutiske 5 præparater, der indeholder anti-mfi2m antistoffer.

De modificerede S2-mikroglobuliner som der ifølge opfindelsen rejses antistoffer mod, har den almene formel I:

RrCys-R2-X

10 I I

Y-R3-Cys-R4 hvori R1 er en 24 aminosyregruppe med sekvensen: Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val-Tyr-Ser-Arg-His-Pro-Ala-Glu-Asn-Gly-Lys-Ser-Asn-Phe-Leu-Asn-, 15 R2 er en 30 aminosyregruppe med sekvensen: -Tyr-Val-Ser-Gly-Phe-His-Pro-Ser-Asp-Ile-Glu-Val-Asp-Leu-Leu-

Lys-Asn-Gly-Glu-Arg-Ile-Gly-Lys-Val-Glu-His-Ser-Asp-Leu-Ser-, R3 er en 20-aminosyregruppe med sekvensen: -Trp-Ser-Phe-Tyr-Leu-Leu-Tyr-Tyr-Thr-Glu-Phe-Thr-Pro-Thr-Glu-20 Lys-Asp-Glu-Tyr-Ala-, R4 er en 19 aminosyregruppe med sekvensen: -Arg-Val-Asn-His-Val-Thr-Leu-Ser-Gln-Pro-Lys-Ile-Val-Lys-Trp-Asp-Arg-Asp-Met, -X er -Phe, -Phe-Ser, eller -Phe-Ser-Lys, fortrinsvis -25 Phe, og Y- er Asp-, Lys-Asp-, Ser-Lys-Asp-, fortrinsvis Asp-, idet summen af antallet af aminosyrerester i X og Y højest er 4.

30 Modificeret fi2-mikroglobulin (mB2m) er en variant af ft2-mikroglobulin (B2m), hvilken variant er blevet opdaget i forbindelse med et antal cancertyper og immunsystemlidelser.

Dets præcursor B2m er et serumprotein med en molekyl-35 vægt på 11.800 Daltons bestående af et enkeltkædet polypeptid med 99 aminosyregrupper med en disulfidbro mellem cysteingrup-

DK 161098 B

2 perne i positionerne 25 og 80, og med en kendt aminosyrese-kvens (1). Strukturelt fremviser B2m en markeret homologi med det konstante område i IgG, især CH3 området og a3 området i den tunge kæde HLA-B7. B2m er en del af det store histokompati-5 bilitetskompleks på cellemembraner og er i fri form til stede i legemsvæsker såsom serum, spinalvæske, spyt, sæd og kole-strum (2, 3). Hos sunde individer er serumkoncentrationen af B2m 50 - 200 nmol/1 (4) .

10 Serumkoncentrationen af B2m er forhøjet ved en række sygdomme f.eks. rheumatoid arthritis (RA), systemisk lupus erythomatosus (SLE), malignt lymphom (ML), og visse typer lungecancer såsom småcellet lungecancer (SLC) (5-7). Høje serum B2m niveauer ved ML falder under påvirkning af kemotera-15 pi, mens tilbagefald i almindelighed ikke medfølges af stigende serum B2m.

Småcellet lungecancer (SLC) er næsten altid dissemineret på diagnosetidspunktet, og hovedbehandlingen er derfor kombinationskemoterapi. Med kemoterapi er det muligt at in-20 ducere remission hos mere end 80% af alle patienter, men i de fleste tilfælde vil tumoren senere undslippe kontrol. Den tidligst mulige diagnose, fortrinsvis på et trin hvor sygdommen er lokaliseret, kan følgelig være afgørende for at forbedre overlevelsesgraden for patienter, der lider af SLC.

25 Erhvervet immundefektsyndrom (AIDS) er den sluttelige kulmination for en sygdom, der øjensynlig foreligger i andre former, såsom AIDS-relateret kompleks eller lymphadenopathi-syndrom, og i mindre udtrykte tilstande, inklusive bærertilstanden. Bloddonorundersøgelse med et antistof mod den for-30 modede frembringende virus (HTLV-III/LAV) er påbegyndt. En sådan undersøgelse for viruset opdager kun en udsættelse for det, ikke tilstedeværelsen af eller en prognose for udviklingen af sygdommen. Endvidere lykkes det til tider ikke for antistofprøven for HTLV-III at detektere tilstedeværelsen af 35 viruset (1). Der foreligger således et behov for en anden undersøgelse, der vil muliggøre en mere kvantitativ bedøm-

DK 161098 B

3 melse af immunsystemets respons overfor udsættelse for HTLV- III.

B2m har modtaget megen opmærksomhed som en mulig 5 markør, der kunne anvendes til diagnose og overvågning af sygdomme såsom de ovennævnte.

Det er således blevet rapporteret, at de fleste undersøgte AIDS-patienter har B2m niveauer over det normale. Det er 10 endvidere blevet rapporteret, at forøgede B2m niveauer har vist sig i et antal tilfælde endog to år inden klinisk diagnose af AIDS.

In vitro inkubering af serum fra patienter med RA, SLE, kimcelletumorer og ML har vist sig at resultere i fore-15 komsten af en fi2m fraktion med "α-elektroforetisk mobilitet" ved krydset radioimmunelektroforese (CRIE). Hos patienter med ML har man fundet en omvendt korrelation mellem mængden af denne a-fraktion og reaktion på kemoterapi.

Rhavi B. Bhalla et al.: Clinical Chemistry 31 (1985) 20 s. 1411 har rapporteret, at den α-elektroforetiske form af B2m eller modificeret B2m var til stede hos alle deres AIDS-patienter inklusive dem, der havde normale B2m niveauer, og derudover også en patient, som var HTLV-III negativ.

Swanson et al.: Clinical Chemistry 28 (1982) s. 2033-25 2039 beskriver på side 2038, at deres B2-mikroglobulin be stemmelser viser 5 forskellige former ved 2-dimensional elektroforese, alle med forskellige pi·er, men ensartede molekylvægte.

30 Det er således endnu ikke fastlagt, hvilken eller hvilke fraktioner, der er interessante til brug ved de ovennævnte metoder.

Den α-elektroforetiske form eller modificeret )92m 35 (mj82m) synes derfor at være yderst attraktiv som en markør for en række immunologiske lidelser. mj82m er øjensynlig ikke

DK 161098 B

4 specifik for nogen af de ovennævnte sygdomme, men måling heraf vil ikke desto mindre være et værdifuldt værktøj til undersøgelse af et stort antal prøver eller til overvågning af disse sygdommes udvikling.

5 Følgelig har det med opfindelsen været til hensigt at udvikle midler til anvendelse af m/?2m som generel markør ved diagnosen og bedømmelsen af prognosen for cancer og immunologiske lidelser, der manifesterer sig ved abnormale m/32m niveau-10 er. Dette opnås ifølge opfindelsen ved at angive en effektiv metode til bestemmelse og måling af m/32m i legemsvæsker. Ved fremgangsmåden anvendes specifikke polyklonale antistoffer opnået i antisera mod mjS2m eller specifikke epitoper derpå, eller mjS2m specifikke monoklonale antistoffer opnået ved 15 sammensmeltning af sådanne antistof producerende celler med myelomceller til opnåelse af hybridomer og udvælgelse af hybridomceller, der frembringer monoklonale antistoffer, der binder sig specifikt med m/?2m.

20 Hidtil er der ikke blevet beskrevet nogen biologisk betydning af nogen af de i litteraturen anførte modificerede former for fi2m, men under arbejdet på opfindelsen fandtes det overraskende, at mB2m er biologisk aktiv som biologisk responsmodificerende middel, der forstærker immunologiske 25 reaktioner, der allerede er blevet aktiveret, idet mB2m forøgede den cytotoksiske aktivitet i blandede lymphocytkulturer samt stimulerede produktionen af lymphokinen interleukin-2, og at B2m i denne henseende virker som præcursor for det aktive stof mB2m, idet B2m øjensynlig i organismen nedbrydes til det 30 aktive stof. Endvidere viste det sig, at mjS2m specifikke antistoffer var i stand til at blokere den stimulerende virkning af mjS2m.

På baggrund af disse opdagelser er det ved opfindel-35 sen også til hensigt at angive farmaceutiske præparater inde-

DK 161098 B

5 holdende anti-mj82m antistoffer til brug som biologiske responsmodificerende midler.

I sit første aspekt angår opfindelsen et antistof, der 5 er ejendommeligt ved, at det reagerer specifikt med modificeret B2-mikroglobulin med den almene formel I:

Rj-Cys-Rj-X

I I

Y-R3-Cys-R4 10 hvori R1 er en 24 aminosyregruppe med sekvensen:

Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val-Tyr-Ser-Arg-Hi s-Pro-Ala-Glu-Asn-Gly-Lys-Ser-Asn-Phe-Leu-Asn-, R2 er en 30 aminosyregruppe med sekvensen: -Tyr-Val-Ser-Gly-Phe-His-Pro-Ser-Asp-Ile-Glu-Val-15 Asp-Leu-Leu-Lys-Asn-Gly-Glu-Arg-Ile-Gly-Lys-Val-Glu-His-Ser-Asp-Leu-Ser-, R3 er en 20-aminosyregruppe med sekvensen: -Trp-Ser-Phe-Tyr-Leu-Leu-Tyr-Tyr-Thr-Glu-Phe-Thr-Pro-Thr-Glu-Lys-Asp-Glu-Tyr-Ala-20 R4 er en 19 aminosyregruppe med sekvensen: -Arg-Val-Asn-His-Val-Thr-Leu-Ser-Gln-Pro-Lys-Ile-Val-Lys-Trp-Asp-Arg-Asp-Met, -X er -Phe, -Phe-Ser, eller -Phe-Ser-Lys, fortrinsvis -Phe, og 25 Y- er Asp-, Lys-Asp-, Ser-Lys-Asp-, fortrinsvis Asp-, idet summen af antallet af aminosyrerester i X og Y højest er 4.

Endvidere angår opfindelsen et antistof af ovennævnte art, som er ejendommeligt ved, at det er et polyklonalt anti-30 stof, og at det kan fremstilles ved immunisering af et dyr med et antigen valgt blandt modificeret B2-mikroglobulin med den almene formel I, hvor R1f R2, R3, R4, X og Y har de ovenfor nævnte betydninger, og forbindelser med den almene formel II R-Z II

35 hvori R er et bæreprotein, fortrinsvis keyhole limpet hemo- cyanin, og Z er et peptid med formlen R2'-X eller R3'-Y, hvori

DK 161098 B

6 X og Y er som defineret ovenfor, R2' er et peptid med fra 1 til 30 aminosyregrupper svarende til et fragment fra den c-termi-nale ende af R2 som defineret ovenfor, og R3' er et peptid med fra 1 til 20 aminosyregrupper svarende til et fragment fra den 5 N-terminale ende af R3 som defineret ovenfor, serum isoleres, og oprenses til fuld specificitet mod modificeret B2-mikroglobulin.

I et yderligere aspekt angår opfindelsen et monoklo-nalt anti-m/?2m antistof, der kan fremstilles ved dyrkning af en 10 hybridomcellelinie, der er opnået ved sammensmeltning af myelomceller med miltceller fra dyr, der er blevet immuniseret med et antigen valgt blandt modificeret B2-mikroglobulin med den almene formel I, hvor R,, R2, R3, R4, X og Y har de ovenfor nævnte betydninger, og forbindelser med den almene formel II, 15 hvori R og Z har de ovenfor nævnte betydninger.

I et yderligere aspekt angår opfindelsen en fremgangsmåde til detektering af mjS2m i humane legemsvæsker, ved hvilken fremgangsmåde legemsvæsken, der indeholder eller mistænkes for 20 at indeholde modificeret B2-mikroglobulin, bringes i kontakt med et antistof som angivet ovenfor, de herved eventuelt dannede antistof-antigen-komplekser separeres fra ikke-kom-pleksbundet antistof/antigen, og det detekteres om der er dannet antistof-antigen-komplekser.

25 I endnu et yderligere aspekt angår opfindelsen farma ceutiske præparater, der er ejendommelige ved, at det indeholder et eller flere antistoffer som angivet ovenfor, især et biologisk resr. nsmodificerende middel.

30 Opfindelsen beskrives nedenfor i detaljer under henvisning til tegningen, hvori

Fig. 1 viser resultaterne af titrering ved ELISA af et antiserum ifølge opfindelsen, 35

DK 161098 B

7

Fig. 2 viser resultaterne fra den primære undersøgelse af anti-mB-jin antistofproducerende kulturer,

Fig. 3 viser resultaterne fra den sekundære under-5 søgelse ved ELISA af kulturer udvalgt fra den primære undersøgelse i fig. 2, og

Fig. 4 resultatet af et assay for mB2m under anvendelse af et af de i fig. 3 angivne monoklonale antistoffer.

10

Modificeret B2-mikroglobulin er defineret som den fraktion af B2m, der har en relativ mobilitet på 2,0 i sammenligning med det native protein ved CRIE analyse.

15

Det modificerede B2-mikroglobulin ifølge opfindelsen opnåedes ved at isolere det sammen med B2m fra serumprøver fra patienter med histologisk verificeret småcellet anaplastisk lungecancer og efterfølgende adskillelse fra B2m.

20

Isolering af mB2m og B2m fra serumet udførtes ved gelfiltrering efter 5 dages inkubation ved 20ec.

Fraktioner indeholdende mB2m og B2m kromatofokusere- 25 des ved pH 7-4 for at adskille mB2m fra B2m, og den mB2m holdi-ge fraktion rensedes efterfølgende ved gelfiltrering.

mB2m karakteriseredes fysisk-kemisk og biokemisk ved CIE, CRIE, natriumdodecylsulfatpolyacrylamid gelelektroforese 30 (SDS-PAGE) og analytisk isoelektrisk fokusering (IEF) og fandtes at svare til den α-elektroforetiske form af B2m eller mB2m som angivet i Fig. 4 B, s. 630, i Piesner: Allergy 35 (1980) S. 627-637.

35 MB2m havde en tilsyneladende molekylvægt på 15.000 i ikke-reduceret form, og opspaltes i to mindre peptider med

DK 161098 B

8 molvægt under 12.000 i reduceret form ved SDS-PAGE analyse. I ikke-reduceret form havde mB2m et pi på 5,3 ved analytisk IEF.

Det isolerede mfi2m underkastedes aminosyresekven-5 tering og fandtes at bestå af en blanding af peptider med den almene formel I

R^Cys-R^X

I I

Y-R3-Cys-R4 10 hvori R1 er en 24 aminosyregruppe med sekvensen:

Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val-Tyr-Ser-Arg-His-Pro-Ala-Glu-Asn-Gly-Lys-Ser-Asn-Phe-Leu-Asn,

Rg er en 30 aminosyregruppe med sekvensen: Tyr-Val-Ser-Gly-Phe-His-Pro-Ser-Asp-Ile-Glu-Val-Asp-Leu-Leu-15 Lys-Asn-Gly-Glu-Arg-Ile-Gly-Lys-Val-Glu-His-Ser-Asp-Leu-Ser, R3 er en 20-aminosyregruppe med sekvensen: Trp-Ser-Phe-Tyr-Leu-Leu-Tyr-Tyr-Thr-Glu-Phe-Thr-Pro-Thr-Glu-Lys-Asp-Glu-Tyr-Ala R4 er en 19 aminosyregruppe med sekvensen: 2 0 Arg-Val-Asn-His-Val-Thr-Leu-Ser-Gln-Pro-Lys-Ile-Val-Lys-Trp-

Asp-Arg-Asp-Met, -X er -Phe, -Phe-Ser, eller -Phe-Ser-Lys, fortrinsvis -Phe, og Y- er Asp-, Lys-Asp-, Ser-Lys-Asp-, fortrinsvis Asp-, 25 idet summen af antallet af aminosyrerester i X og Y højest er 4.

Aminosyresekvensen for R1 -Cys-R2-X-kæden (A-kæden) er identisk med den i (l) offentliggjorte sekvens af grupperne 1-30 56 (58) i det native B2m med den eneste undtagelse af amino- syrerest 42, hvor resten ifølge opfindelsen er Asn, hvorimod den offentliggjorte sekvens angiver Asp. Sekvensen ifølge opfindelsen er imidlertid i overensstemmelse med den sekvens, der udledtes ud fra klonet cDNA af Suggs et al.:Proc. Natl.

35 Acad. Sci. USA 78 (1981) s. 6613-6617, som også angiver Asn i position 42.

DK 161098 B

9

Sekvensen for den C-terminale ende af R^-Cys-R2-X-kæden bestemmes både ved Edman nedbrydning fra den N-terminale ende og ved carboxypeptidasenedbrydning fra den C-terminale ende, og det 5 fandtes, at produktet i overvejende grad bestod af det peptid, hvor X er Phe. Den C-terminale bestemmelse kompliceredes af tilstedeværelsen af srinrester i positionerne 52, 55 og 57.

Aminosyresekvensen for Y-R^-Cys-R^j-kæden (B-kæden) er 10 identisk med resterne (57) 59 - 99 i den i (1) offentliggjorte sekvens fro nativ B2m, idet Y overvejende var Asp.

Det til immuniseringen anvendte antigen kan være m62m , men andre antigener, der er udvalgt for deres evne til at rejse 15 anti-m62m antistoffer, der specifikt vil binde sig til epitoper på m32m, kan også anvendes. Generelt kan der anvendes antigener med den almene formel II

R-Z II

20 hvori R er et bærerprotein, og Z er et peptid med formlen R2'-X eller R^'-Y, hvori X og Y er defineret som ved formel I, R21 er et peptid med fra 1 til 30 aminosyrerester svarende til et fragment fra den C-terminale ende af R2, som defineret i formel I, og R^' er 25 et peptid med fra 1 til 20 aminosyrerester svarende til et fragment fra den N-terminale ende af R^, som defineret i formel I.

ét tilfælde anvendtes et antigen omfattende aminosyre-grupperne -Lys-Val-Glu-His-Ser-Asp-Leu-Ser-Phe med en fri C-30 terminal ende og den N-terminale ende koblet til keyhole limpet hemocyanin (KLH) med succes til fremstilling af anti-sera samt monoklonale antistoffer, der binder sig specifikt til epitoper i de ni C-terminale aminosyregrupper i A-kæden på m32m.

DK 161098 B

10

Immuniseringen udførtes i mus ved subkutan injektion af antigenet adskillige gange og efterfølgende boosting intravenøst med antigenet. Efter passende tidsrum aflivedes musene og deres milt fjernedes til sammensmeltning med myelomceller. De sammen-5 smeltede celler afledtes efter R.T. Taggart og I.M. Samloff:

Science 219 (1983) s. 1228 - 1230 (APRT+ selektion), som beskrevet nedenfor.

Undersøgelsen af de udvalgte hybridomkulturer for speci-10 fikke monoklonale antistoffer udførtes med et ELISA, og der fandtes et antal kloner, der reagerede specifikt med mf32m uden krydsreaktion med f32m.

15 Antistofferne ifølge opfindelsen kan anvendes i frem gangsmåder til detektering af tilstedeværelsen af mf^m og også til at anslå de tilstedeværende mængder kvantitativt.

Detekteringen af tilstedeværelsen af det fuldstændige 20 mf^m antigen eller dets karakteristiske epitop, kan udføres i kilder eller prøver af legemsvæsker såsom serum, blod, spyt, urin, sæd, spinalvæske, kolostrum, væv, vævsprøver, bronchial skyllevæske og lignende.

25 Detekteringen af m82m på basis af specifikke antistoffer kan udføres ved immunoassays såsom de kompetitive eller immunome-triske ("sandwich") typer. I et kompetitivt assay mærkes det rensede m|32m antigen eller molekyle, omfattende dets karakteristiske epitop, med et detekterbart mærke. Den prøve, der mistænkes for at 30 indeholde mf32m antistoffet eller epitopen, inkuberes med m|32m antistof og mærket m82m antigen og efter dannelsen af immunkomplekser separering og detektion, fastlægges niveauet af m32m antigen let.

DK 161098 B

11

En anden type kompetitivt assay involverer immobiliseret m32m antigen eller epitop og mærket 11162111 antistof. Tilstedeværelsen af 11162^1 antigen i kilden eller prøven forhindrer binding af antistof til immobiliseret antigen eller epitop, hvorved der gives et 5 inverst mål for tilstedeværelsen af antigen.

I et assay af kompetiv type kan antistoffet også immo-biliseres på en fast fase enten inden eller efter dannelsen af immunkomplekset. F.eks. kan et andet, anti-muse IgG, antistof 10 immobiliseret på en fast fase sættes til blandingen ved, hvad der kendes som en "dobbelt-teknik”.

I et immunometrisk (sandwich) assay mærkes ét anti stof detekterbart. Et andet antistof insolubiliseres på en fast 15 fase. Inkuberingen af prøven med mærket og insolubiliseret antistof fører til en sandwich, hvor mængden af mærke efter fraskillelse fra ikke-bundne antistof(fer) er proportional med mængden af antigen. Immunometriske assays kan udføres på ligefrem, omvendt eller samtidig måde afhængig af rækkefølgen af tilsætning af de insolubi-20 liserede og/eller mærkede antistoffer.

Assayet kan også være en såkaldt "dot-blot" analyse.

Til en forøget følsomhed i sandwich-systemet kan de 25 beskrevne procedurer modificeres med biotinyleret mB2m antistof, der reagerer med avidin-peroxidase konjugater.

Andre trin såsom vask, omrøring, rystning, filtrering eller præassayekstraktion af antigen og lignende kan naturlig- 30 vis tilføjes assayene alt efter ønske eller hvad, der er nødvendigt til en særlig situation.

De specifikke koncentrationer, temperaturen og inkube-ringstiden samt andre assaybetingelser kan varieres afhængigt af 35 sådanne faktorer, som koncentrationen af antigen i prøven, prøvens art og lignende. Fagmænd vil være i stand til at fastlægge operati-

DK 161098B

12 ve og optimale assaybetingelser for hver bestemmelse under anvendelse af rutineeksperimenter. F.eks. kan immunoassayet udføres ved 4 - 37°C, fortrinsvis 26°C, og hvert inkuberingstrin kan vare så længe som 72 timer.

5 I stedet for antigenet eller den karakteristiske epitop er det muligt ved assays at anvende anti-idiotypiske antistoffer eller immunologisk aktive fragmenter deraf, der er fremstillet ved at rejse antistoffer mod bindingsstedet for monoklonalt 10 mB2m antistof. I stedet for det specifikke mf^m antistof, der beskrives her, er det også muligt at anvende ækvivalente antistoffer fremstillet ved at undersøge hybridomer med antigen efter rutinemetoder. Hybridomerne fremstilles ved sammensmeltning af lympho-cytter, der er sensitiviseret overfor passende renset antigen og 15 passende myelomer.

Der findes mange bærere, hvortil antistoffet/antistofferne kan bindes, og som kan anvendes ved opfindelsen. Velkendte bæremidler inkluderer glas, polystyren, polypropylen, polyethylen, 20 dextran, nylon, amyloser, naturligt og modificeret cellulose, poly-acrylamid, agaroser og magnetit. Bæremidlets art kan enten være opløseligt i nogen grad eller uopløseligt til opfindelsens formål. Fagmænd kender mange andre passende bæremidler til binding af antistof fet/stof ferne eller vil være i stand til at fastlægge sådanne 25 ved rutineeksperimenter.

Afhængigt af den særlige udførelsesform for det omhandlede assay, kan antigenet eller et eller flere af antistofferne, kobles med et detekterbart mærke såsom et enzym, radioaktivt iso-30 top, fluoriserende forbindelse eller metal, kemiluminiscerende forbindelse eller bioluminiserende forbindelse. Endvidere kan bindingen af disse mærker til det ønskede molekyle udføres efter standardteknikker, der er velkendte for fagmænd.

DK 161098 B

13

En af de måder, hvorpå det ønskede molekyle i et vilkårligt immunoassay kan mærkes detekterbar, er ved at knytte det til et enzym. Dette enzym vil for sin del, når det senere udsættes for dets substrat, reagere med substratet på en sådan måde, at der 5 frembringes en kemisk enhed, der kan detekteres ved f.eks. spek-trophotometri (ELISA system) eller fluorometri. Eksempler på enzymer, der kan anvendes som detekterbare mærker, er peberrods-peroxidase, maleat dehydrogenase, staphylococ nuclease, delta-5-steroid isomerase, gæralkoholdehydrogenase, a-glycerophosphat-10 dehydrogenase, triosephosphat isomerase, alkalisk phosphatase, asparaginase, glucoseoxidase, β-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glucose-6-phosphatdehydrogenase, glucoamylase og acetylcholinesterase.

15 Tilstedeværelsen af antigen eller antistof (og som følge heraf dets tilsvarende m^111 antigen) kan også detekteres ved at mærke det ønskede molekyle med en radioaktiv isotop. Tilstedeværelsen af den radioaktive isotop bestemmes derefter ved sådanne midler som gammatæller eller scintillationstæller. Isotoper der er særligt on - - , · 3 125T 131_ 32_. 35„ 140 51- 36-.

20 anvendelige er Η, I, I, P, S, C, Cr, Cl, 57. 58- 59_ 75c 111_ 99m,,, 67_ 90v

Co, Co, Fe, Se, In, Tc, Ga, og Y.

Det er også muligt at detektere tilstedeværelsen af antigenet eller antistoffet ved at mærke det ønskede molekyle med en 25 fluorescerende forbindelse. Når det fluorescerende mærkede molekyle udsættes for lys af den passende bølgelængde kan dets tilstedeværelse detekteres ved farvestoffets fluorescens. Blandt de mest vigtige fluorescensmærkende forbindelser kan nævnes fluorescein, isothiocyanat, rhodamin, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocya-30 nin, o-phthaldehyd og fluorescamin.

Fluorescensemitterende metalatomer såsom Eu (europium) og andre lanthanider kan også anvendes. Disse kan knyttes til det ønskede molekyle med metalchelaterende grupper såsom DTPA eller 35 EDTA.

DK 161098 B

14

En anden måde, hvorpå antigenet eller antistoffet kan mærkes detekterbart, er ved at koble det til en chemiluminiscerende forbindelse. Tilstedeværelsen af det chemiluminiscerende mærkede immunologiske molekyle bestemmes derefter ved at detektere tilste-5 deværelsen af luminiscens, der opstår under et kemisk reaktionsforløb. Eksempler på særligt anvendelige chemilusminiscerende mærkende forbindelser, er luminol, isoluminol, aromatisk acridinester, imidazol, acridinsalt, og oxalatester.

10 Tilsvarende kan en bioluminiscerende forbindelse også anvendes som mærke. Bioluminiscens er en særlig type chemilumini-scens, der findes i biologiske systemer, og hvorved et katalytisk protein forøger effektiviteten af den chemiluminiscerende reaktion. Tilstedeværelsen af et bioluminiscerende molekyle kan fastlægges 15 ved at detektere tilstedeværelsen af luminiscens. Vigtige bioluminiscerende forbindelser til mærkningsforaål er luciferin, luciferase og aequorin.

En anden mulig assayteknik for m32m antigen eller dets 20 tilsvarende karakteristiske epitop er ved agglutinering, hvor mP2m antistof bindes på latexkugler, og tilstedeværelse af m32m antigen måles ved kugleaggregering.

Alternativt kan tilstedeværelsen af m32m antistof detek-25 teres ved agglutinering af partikler overtrukket med m^2m antigen eller den relevante epitop.

En alternativ anvendelse af mf32m antistoffet er ved immunohistokemisk analyse ved anvendelse af mærket antistof.

30

Ved de ovennævnte fremgangsmåder til at detektere m32m antigenet er det muligt at anvende et specifikt anti-m32m antistof. Det er imidlertid også muligt for at forøge fremgangsmådens selektivitet at anvende kombinationer af to eller flere specifikke 35 anti-m32m antistoffer f.eks. et antistof, der er specifikt for en

DK 161098 B

15 epitop i den C-terminale ende af A-kæden i kombination med et antistof, der er specifikt for en epitop i den N-terminale ende af B-kæden.

5 De materialer, der anvendes ved de omhandlede assay, er velegnede til fremstillingen af sæt. Et sådant sæt kan omfatte en æske med rum til én eller flere beholdere såsom glas, rør og lignende, idet hver af disse beholdere omfatter et at de enkelte elementer, der skal anvendes ved en vilkårlig ønsket metode.

10 F.eks. kan en af disse beholdere, der er anvendelige ved immunometriske assays, omfatte monoklonalt n^m antistof bundet til et bæremiddel. En anden beholder, kan indeholde opløseligt detek-terbart mærket monoklonalt anti-n^m antistof i lyophiliseret form 15 eller i opløsning.

Et sæt, der er anvendeligt til et kompetiv assay, ville indeholde en første beholder indeholdende et detekterbart mærket antigen, og en anden beholder indeholdende anti-mf^111 antistof frit 20 eller bærebundet.

Derudover kan æsken også indeholde et antal beholdere, der hver indeholder forskellige givne antigenmængder. Disse sidstnævnte beholdere kan da anvendes til at fremstille en standardkurve 25 til interpolering af de resultater, der opnås fra prøven, der indeholder den ukendte antigenmængde.

Under arbejdet med opfindelsen viste det sig, at renset ir^m forøgede den cytotoksiske aktivitet i blandede 30 lymphocytkulturer (MLC) samt stimulerede produktionen af lympho-kinen interleukin-2 (IL-2). Vekselvirkningen af n^m med det store histocompatibilitetskompleks (MHC), hvori 02m er en normal komponent, kunne føre til aktivering af celler resulterende i f.eks. en forøget cellulær receptorexpression for generel stimulatorisk 35 aktivitet såsom interleukin-1 (IL-1) og en forøget ekspression af receptorer for IL-2 og forhøjet endogen produktion af denne lympho-

DK 161098 B

16 kin. Denne biologiske aktivitet ved mi^111 angiver en farmaceutisk anvendelighed af såvel poly- som monoklonale antistoffer mod m32m som biologisk responsmodificerende middel, hvor den farmakologiske virkning vil være relateret til immun'systemets tilstand.

5 Farmakologiske virkninger af de omhandlede antistoffer vil som nævnt tidligere kunne være som biologiske responsblokerende midler af mg2^1/ hvilke virkninger kunne være relateret både til virkningen på membranniveauet på grund af item's vekselvirkning med MHC eller kunne være relateret til s specifikke stimulatoriske virkning 10 på IL-2 produktion.

Opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler.

15 Eksempel 1

Fremstilling af polyklonale antisera RBF/Dn-stamme mus (fra Jackson Laboratory, Bar Harbor, 20 Maine, U.S.A.) immuniseredes tre gange med to ugers intervaller med det syntetiske peptid Lys-Val-Glu-His-Ser-Asp-Leu-Ser-Phe koblet via den N-terminale ende til keyhole limpet hemocyanin (KLH).

Peptidkonjugatet (25 μg pr. mus i PBS, 100 μΐ) emulsificeredes 1:1 i Freund's fuldstændige adjuvans ved den første immunisering, og i 25 Freund's ufuldstændige adjuvans i de følgende immuniseringer, og der blev indgivet en total på 200 μΐ subkutant (s.c.). Blodprøver fra immuniserede mus udtoges fra den retroorbitale plexus eller øjet, og serumprøver opnåedes efter centrifugering af prøverne

efter koagulering. Serumprøvernes specificitet bedømtes ved ELISA

30 med immunoplader (NUNC, Roskilde, Danmark) overtrukket med 1 μg/ml af enten nativt 3~m eller m39m. Serumprøverne fortyndedes i tidob- ^ -1 -2 -3 -4 belte fortyndinger (10 ,10 ,10 og 10 , og inkuberedes med de overtrukne plader, og antistofaktiviteten overfor det respektive antigen måltes kolorimetrisk med et kanin anti-museimmunoglobulin 35 konjugeret med peberrodsperoxidase (Dakopatts, Danmark) og o-phenylendiamin (OPD) substratreaktionen.

DK 161098 B

17

Fig. 1 illustrerer titrering af et repræsentativt museserum analyseret for binding af (skraverede søjler) og nativt 8_m (udfyldte søjler). Antiserumet reagerer på selektiv vis med * o-4 og synes at være specifikt for mf^m ved fortyndinger pa 10 5 under disse betingelser. Et fuldstændigt specifikt polyklonalt antiserum mod m32m kunne opnås ved yderligere absorption med nativt e2m.

Eksempel 2 10

Immuniserings- og fusions eksperimenter 1 mg af peptidet Lys-Val-Glu-His-Ser-Asp-Leu-Ser-Phe blandedes med 3 mg KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin, Calbiochem) og 15 glutaraldehyd (Merck) tilsattes til slutkoncentrationen på 0,25% v/v i en total på 1 ml. pH justeredes til 8,0. Omsætningen udførtes i en time ved stuetemperatur efterfulgt af 18 timer ved 4°C. Derefter dialyseredes blandingen mod PBS til opnåelse af konjugatet, der anvendtes som antigen ved den følgende immunisering.

20

Fremstilling af monoklonal antistoffer RBF/Dn-stamme mus indeholdende RB (8.12)5Bnr Robertsonian translokation kromosomet (fra Jackson Laboratory, Bar Harbor, 25 Maine, U.S.A.) immuniseredes tre gange med to ugers intervaller med peptidet Lys-Val-Glu-His-Ser-Asp-Leu-Ser-Phe koblet via den N-terminale ende til KLH. Konjugatet (25 μg pr. mus i PBS, 100 μΐ) emulgeredes 1:1 i Freund's fuldstændige adjuvans til den første injektion og ufuldstændigt Freund's adjuvans til de følgende 30 injektioner og 200 μΐ blev indgivet subkutant (s.c). Musene blev boosted intravenøst (i.v.) med 10 μg konjugat i 100 μΐ PBS 30 dage efter den sidste s.c. immunisering. Efter yderligere tre dage aflivedes musene og deres milt fjernedes til fusion med myelom-celler.

35 7

DK 161098 B

18

Miltceller fra én RBF/Dn mus (13,3 x 10 celler) smelte- 7 des med 3,5 x 10 celler af FOX-NY myelomlmien, der manglede de selekterbare enzymmarkørloci adenosinphosphoribosyltransferase (APRT ) og hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT ) (fra 5 HyClone Laboratories, Logan, Utah, U.S.A.)· Herved fjerner exponering af cellefusionsblandingerne for et medium, der kræver APRT-aktivitet (APRT+ selektion) både ikke smeltede APRT myelomer, og APRT- hybridomer (R.T. Taggart og I.M. Samloff: Science 219(1983) s. 1228 - 1230). De smeltede celler podedes på Balb/c-10 stamme musemacrophagfødelag i en total på 10 96-brøndsmikrotiter-plader (NUNC, Roskilde, Danmark) i et medium bestående af RPMI-1640 med 15% w/v føtalt kalveserum (Gibco) suppleret med adenin (7,5 x 10 ^ M), aminoterin (8 x 10 ^ M)og thymidin (1,6 x 10 M), (AAT).

15 Kulturer inkuberedes i 7 dage ved 37°C i luft indeholden de 5% CC>2 inden medium erstattes med frisk medium, og efter en 4-dages inkuberingstid underkastedes kulturerne en primær undersøgelse ved et ELISA.

20 Undersøgelsesprocedure (ELISA)

Mikrotiterplader (NUNC Immunoplates, NUNC, Roskilde, Danmark) blev overtrukket med antigen. Det anvendte ELISA var en modifikation af den procedure der er beskrevet af A. Voller og E.

25 de Savigny (i R.A. Thompson: Techniques in Clinical Immunology, 2. udgave (1981) s. 157 - 169. Blackwell Scientific Publications, Boston, Mass.). Overtrækningen udførtes natten over med antigenet i phosphatpufret saltopløsning (PBS), 50 μΐ pr. brønd. Pladerne tømtes og blokeredes med PBS indeholdende 2% w/v okseserumalbumin 30 (BSA) 200 μΐ pr. brønd ved 20°C i 1 time, efterfulgt af tre vask med PBS-Tween-20 (0,05% v/v Tween-20 in PBS). Den ufortyndede ovenstående væske fra en hybridomkultur (50 μΐ pr. brønd) blev påført ved 20°C i 1 time efterfulgt af vask af pladerne som beskrevet ovenfor. Antistofaktiviteten mod det til overtrækning anvendte 35 antigen, måltes kolorimetrisk ved inkubering ved 20°C i 1 time med 100 pg pr. brønd kanin anti-museimmunoglobulin konjugeret med

DK 161098B

19 peberrodsperoxidase (Dakopatts, Danmark) fortyndet til 1:1000 i PBS indeholdende 0,5% w/v BSA og efter yderligere 3 vask i 0,1 M citrat-phosphat puffer på pH 5,0 (citronsyre monohydrat 7,3 g, Na2HPO^.I2H2O: 23,87 g fortyndet til 1 liter) og inkuberedes 5 derefter som beskrevet ovenfor med o-phenylendiamin (OPD) substrat (o-phenylendiamin, 2HC1:8 mg; citratpuffer: 15 mlj^C^ (30% v/v): 5 μΐ). Reaktionen standsedes efter 3 minutter ved tilsætning af 150 μΐ 1 M H2^4 °9 aksorkansen ve^ 492 nm aflæstes med et dobbeltstråle KONTRON SLT-210 fotometer (SLT, Zurich, Schweiz) med 620 nm 10 aflæsningen som reference.

Primær undersøgelse

Under anvendelse af 10 mikrotiterplader overtrukket med 15 det til immunisering anvendte nonapeptid, men imidlertid ikke koblet til KLH (1 μg/ml) ved den ovennævnte metode, undersøgtes 960 hybridomkultursupernatanter. 27 kulturer reagerede signifikant positivt og underkastedes yderligere afprøvning.

20 Fig. 2 angiver et eksempel på resultaterne af ELISA ved den primære undersøgelse. Resultaterne fra en af de ti mikrotiterplader er anført. Den vandrette linie repræsenterer et arbitrært baggrundsniveau, der er udvalgt til den primære undersøgelse. Kun de kulturer, der er mærket med x, udvalgtes til yderligere afprøv-25 ning.

Sekundær undersøgelse

Mikrotiterplader blev overtrukket med enten nonapeptidet, 30 82m (nativt) eller n^m (variant) i koncentrationer på henholdsvis 1 μg/ml, 10 μg/ml og 10 pg/ml. De 27 kultursupernatanter blev tilført, og undersøgelsen udførtes efter den ovennævnte undersøgelsesprocedure .

DK 161098 B

20 I fig. 3 er resultaterne af den sekundære undersøgelse vist for de fra den primære undersøgelse udvalgte kulturer bortset fra kulturerne FI, F3 og F7, der var negative i den betydning, at de ikke reagerede med nogen af de ovenfor anførte antigener. Af 5 figurerne fremgår det, at 3 kloner (F2, F10, F25) udelukkende reagerede med peptidet 15 reagerede med peptidet og m32m og 3 (F5, F8, F26) reagerede med peptidet, m$2m og 02m (nativt). De resterende 3 kloner (F12, F18, F21) havde mistet reaktivitet.

10 Udvælgelse af hybridomer

Alle de hybridomantistoffer, der reagerede med m32m og/eller 82m fandtes yderligere at være af museimmunoglobulin klassen IgM. Dette fandtes ved undersøgelser under anvendelse af 15 den ovennævnte ELISA procedure med en modifikation bestående af erstatning af det peroxidasemærkede kanin anti-museimmunoglobulin med mærkede antistoffer, der var specifikke for de murine klasser og underklasser.

20 Eksempel 3

Enzymimmunoassay for m82m

Til afprøvning af anvendeligheden af de opnåede monoklonale antistoffer mod m82m i assay til bestemmelse af m82m indholdet i biologiske prøver konstrueredes et assay under 25 anvendelse af antistof F19 i fig. 3.

Assayet gennemførtes efter følgende procedure:

Kanin anti-human 82m antistof (Dakopatts, København, Danmark) påførtes bundene i mikrotiterplader. Efter blokering af pladerne ved tilsætning af fosfatbuffer (pH 7,2) indeholdende 1% 30 BSA og inkubation i 1 time ved stuetemperatur med efterfølgende 3 gange vask med fosfatbuffer (pH 7,2) indeholdende 0,1% Tween® sattes prøver indeholdende 82m eller m32m til mikrotiterpladerne i forskellige koncentrationer på 20, 61, 185, 555, 1600 og 5500 ng/ml. Efter 1 times inkubation ved stuetemperatur tilsattes 35 antistof F19, og prøverne inkuberedes i 1 time ved stuetemperatur.

I næste trin inkuberedes pladerne med et peroxidasemærket

DK 161098 B

21 museimmunoglobulinantistof (Tago, Inc., Burlingame, Californien, U.S.A.) i en time ved stuetemperatur, og endelig fremkaldtes pladerne ved inkubation i 1 time med et peroxidase substrat bestående af OPD i citratbuffer (pH 4,5), hvorefter den frembragte 5 farvereaktion måltes ved absorbansen ved 492 nm.

Resultaterne fra dette assay er angivet i fig. 4, der viser den målte absorbans ved 492 nm som funktion af koncentrationen af henholdsvis É>2m (punkteret linie) og n^m (fuld linie) .

10 Af fig. 4 fremgår det klart, at der ved dette assay opnås en tydelig angivelse af tilstedeværelsen af m^111/ uden at et indhold af ikke modificeret (32m påvirker målingen.

DK 161098 B

22

Litteraturhenvisninger: 5 1. Cunningham, B.A., Wang, J.L., Berggård, I. & Peterson, P.A. (1973) Biochemistry 12, 4811 - 4822.

2. Suggs, S.V., Wallace, R.B., Hirose, T., Kawashima, E.H. & 10 Itakura, K. (1981) Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 78, 6613 - 6617.

3. Berggård I. Bearn A.G. (1968) J.Biol.Chem. 243, 4095 - 4103.

4. Piesner T. & Bjerrum O.J. (1980) Scand.J.Immunol. 11, 341 - 15 351.

5. Solheim, B.G. & Thorsby, E. (1974) Nature (Lond) 249, 36 - 38.

6. Peterson P.A., Rask, L. & Lindblom, J.B. (1974) Proc.Natl.- 20 Acad. Sci. U.S.A. 71, 35 - 39.

7. Cotner, J., Mashimo, H., Kung, P.G. Goldstein, G. &

Strominger, J.L. (1981) Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 78, 3858 -3862.

25 8. Terhorst, C., Agthoven, v.A., LeClair, K., Snow, P., Reinherz, E. & Schlossman, S. (1981) Cell 23, 771 - 780.

9. Peterson, P.A., Cunningham, B.A., Berggård, I. & Edelman, G.M.

30 (1972) Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 69, 1697 - 1701.

18. Piesner, T., Wilken, M., Bjerrum, O.J. & Hansen, M.M. (1982) J.Clin.Lab.Immunol. 8, 137 - 414.

II

DK 161098B

23 19. Weeke, B. (1973) in Manual of quantitative Immunoelectrophoresis. Methods and applications. 1st edn. (Axelsen, N.H., Krøll, J. & Weeke, B., eds.) s. 47 - 56, Universitetsforlaget, Oslo.

5 20. Piesner, T., Nørgaard-Pedersen, B. & Boenisch T. (1975)

Scand.J. Clin.Lab.Invest 35, 729 - 735.

22. Wycoff, M., Rodbard, A. & Chrambach, A. (1977) Anal.Biochem.

78, 459 - 482.

10 23. Bury, A.F. (1981) J.Chromatography 213, 491 - 500.

25. Moody, A.J., Thim, L. & Valverde, I. (1984) FEBS Lett. 172, 142 - 148.

Claims (10)

24 DK 16109 8 B

1. Antistof, kendetegnet ved, at det reagerer specifikt med modificeret B2-mikroglobulin med den almene 5 formel I: R.,-Cys-R2-X I I Y-R3-Cys-R4 hvori R1 er en 24 aminosyregruppe med sekvensen:

10 Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val-Tyr-Ser-Arg-His-Pro-Ala-Glu-Asn-Gly-Lys-Ser-Asn-Phe-Leu-Asn-, R2 er en 30 aminosyregruppe med sekvensen: -Tyr-Val-Ser-Gly-Phe-His-Pro-Ser-Asp-Ile-Glu-Val-Asp-Leu-Leu-Lys-Asn-Gly-Glu-Arg-Ile-Gly-Lys-Val-15 Glu-His-Ser-Asp-Leu-Ser-, R3 er en 20-aminosyregruppe med sekvensen: -Trp-Ser-Phe-Tyr-Leu-Leu-Tyr-Tyr-Thr-Glu-Phe-Thr- Pro-Thr-Glu-Lys-Asp-Glu-Tyr-Ala- R4 er en 19 aminosyregruppe med sekvensen:

20 -Arg-Val-Asn-His-Val-Thr-Leu-Ser-Gln-Pro-Lys-Ile-Val-Lys-Trp-Asp-Arg-Asp-Met, -X er -Phe, -Phe-Ser, eller -Phe-Ser-Lys, fortrinsvis -Phe, og Y- er Asp-, Lys-Asp-, Ser-Lys-Asp-, fortrinsvis Asp-, 25 idet summen af antallet af aminosyrerester i X og Y højest er 4.

2. Antistof ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er et polyklonalt antistof, og at det kan fremstilles ved 30 immunisering af et dyr med et antigen valgt blandt modificeret B2-mikroglobulin med den almene formel i, hvor R1, R2, R3, R4, X og Y har de i krav 1 nævnte betydninger, og forbindelser med den almene formel II R-Z II 35 hvori R er et bæreprotein, fortrinsvis keyhole limpet hemo- cyanin, og Z er et peptid med formlen R2'-X eller R3'-Y, hvori 25 DK 1610 9 8 B X og Y er som defineret i krav 1, R2' er et peptid med fra 1 til 30 aminosyregrupper svarende til et fragment fra den C-terminale ende af R2 som defineret i krav 1, og R3' er et peptid med fra 1 til 20 aminosyregrupper svarende til et 5 fragment fra den N-terminale ende af R3 som defineret i krav 1, serum isoleres, og oprenses til fuld specificitet mod modificeret B2-mikroglobulin.

3. Antistof ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 10 det er et monoklonalt antistof, og at det kan fremstilles ved dyrkning af en hybridomcellelinie, der er opnået ved sammensmeltning af myelomceller med miltceller fra dyr, der er blevet immuniseret med et antigen valgt blandt modificeret B2-mikroglobulin med den almene formel I, hvor R1f R2, R3, R4, X og 15 Y har de i krav 1 nævnte betydninger, og forbindelser med den almene formel II, hvori R og Z har de i krav 2 nævnte betydninger.

4. Antistof ifølge krav 1, 2, eller 3, kendetegn-20 et ved, at det er koblet til et detekterbart mærke, såsom et enzym, radioaktiv isotop, fluorescerende forbindelse, eller metal, kemiluminescerende eller bioluminescerende forbindelse, fortrinsvis et enzym.

5. Antistof ifølge krav 1, 2, eller 3, kendetegn- e t ved, at det er bundet til en uopløselig fast fase.

6. Fremgangsmåde til detektering af modificerede B2- mikroglobuliner i humane legemsvæsker, kendetegnet 30 ved, at legemsvæsken, der indeholder eller mistænkes for at indeholde modificeret B2-mikroglobulin, bringes i kontakt med et antistof ifølge krav 1, 4 eller 5, at de herved eventuelt dannede antistof-antigen-komplekser separeres fra ikke-kom-pleksbundet antistof/antigen, og at det detekteres om der er 35 dannet antistof-antigen-komplekser. i DK 161098 B 26

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at fremgangsmåden er et kompetitivt assay.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6,kendetegnet 5 ved, at fremgangsmåden er et immunometrisk assay.

9. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det indeholder et eller flere antistoffer ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 5. 10

10. Farmaceutisk præparat ifølge krav 9, kendetegnet ved, at det er et biologisk responsmodificerende middel.