DK161106B - Fremgangsmaade til fremstilling af 2-keto-l-gulonsyre - Google Patents

Description

i

DK 161106 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre ud fra 2,5-diketo-D-gluconsyre i nærværelse af en levende eller forarbejdet mikroorganisme, der er i stand til at producere 2-keto-L-gulonsyre ud fra 2,5-diketo-D-gluconsyre, og som tilhører 5 slægten Corynebacterium.

Opfinderne af den foreliggende opfindelse har tidligere fundet frem til forskellige mikroorganismer, der er i stand til at fremstille 2-ke-to-L-gulonsyre ud fra 2,5-diketo-D-gluconsyre (herefter omtalt som 2-keto-L-gulonsyre producerende stamme (I)), og opfundet fremgangsmåder til 10 fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre ved hjælp af disse mikroorganismer (se fx. USA-patentskrift nr. 3.922.194 (RE 30.872), 3.959.076 og 3.963.574). Hver af disse stammer (I) fremstiller imidlertid ud over hovedproduktet, 2-keto-L-gulonsyre, 2-keto-D-gluconsyre som et uønsket biprodukt ud fra 2,5-diketo-D-gluconsyren. De har også opfundet en blandet 15 dyrkningsfremgangsmåde med det formål at hindre akkumulering af denne uønskede 2-keto-D-gluconsyre i mediet (se fx. USA-patentskrift nr.

3.998.697).

Det har nu overraskende vist sig, at mutanter tilhørende slægten Corynebacterium, der i det væsentlige mangler evne til at metabolisere 20 5-keto-D-gluconsyre og i det væsentlige er ude af stand til at fremstille 2-keto-D-gluconsyre, er i stand til at fremstille 2-keto-L-gulonsyre ud fra 2,5-di-keto-D-gluconsyre uden væsentlig fremstilling af den uønskede 2-keto-D-gluconsyre.

Opfindelsen angår derfor en fremgangsmåde af den indledningsvis om-25 talte art, som er ejendommelig ved, at der som mikroorganisme tilhørende slægten Corynebacterium anvendes en mutant, der (1) i det væsentlige mangler evne til at metabolisere 5-keto-D-gluconsyre og (2) i det væsentlige er ude af stand til at fremstille 2-keto-D-gluconsyre.

Med udtrykket "levende eller forarbejdet mikroorganisme" er det 30 hensigten i beskrivelsen og kravene at indbefatte et hvilket som helst forarbejdet produkt, der er fremkommet ved behandling af celler af mikroorganismen såvel som voksende eller hvilende celler. Det forarbejdede produkt kan fx. være en cellesuspension, en celleekstrakt, et råt eller renset enzym eller en cellemask, der er opnået ud fra mikroorganismen.

35 Udtrykket syre skal i forbindelse med alle de syrer, der indgår i fremgangsmåden, forstås således, at det også indbefatter et hvilket som helst salt eller en hvilken som helst ester af syren.

I en foretrukket udførelsesform af fremgangsmåden ifølge opfinde!-

DK 161106B

2 sen gennemføres dyrkningen af mutanten og omdannelsen af 2,5-diketo-D-gluconsyre til 2-keto-L-gulonsyre i nærværelse af en hydrogendonor eller et nitratsalt. Hydrogendonoren kan sættes til mediet sammen med den 2,5-diketo-D-gluconsyre, der skal sættes til mediet, eller separat. Nitrat-5 saltet kan sættes til mediet ved dyrkningens begyndelse og/eller ved begyndelsen af 2,5-diketo-D-gluconsyretiIsætningen eller på et hvilket som helst tidspunkt under denne.

(1) Frembringelse af mutanten (II) 10 Opfinderne af den foreliggende opfindelse har opnået en mutant (II) afledt af en forældremikroorganismestamme, der er i stand til at fremstille 2-keto-L-gulonsyre ud fra 2,5-diketo-D-gluconsyre (forældrestamme (I)) ved at behandle forældrestamme (I) på for mutation konventionel måde. Denne mutant (II) er udvalgt således, at den slet ikke eller næsten 15 ikke vokser på 5-keto-D-gluconsyre, men vokser på D-gluconsyre og har vist sig at være ude af stand til at fremstille 2-keto-D-gluconsyre.

Derfor defineres den her og vil senere blive omtalt som "en mutant, der i det væsentlige mangler evne til at metabolisere 5-keto-D-gluconsyre og i det væsentlige er ude af stand til at fremstille 2-keto-D-gluconsyre".

20 Når mutanten (II) bringes i kontakt med 2,5-diketo-D-gluconsyre under dyrkningsbetingelser, fremstilles 2-keto-L-gulonsyre nemlig og akkumuleres i en kontaktblanding uden væsentlig ledsagende akkumulering af den uønskede 2-keto-D-gluconsyre.

Et hvilket som helst konventionelt middel til mutation kan anvendes 25 til effektivt at opnå mutanten (II) ud fra (I), herunder eksponering for bestråling med ultraviolette stråler eller røntgenstråler og behandling med et mutagen, såsom N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (N.T.G.), acriflavin, ethylmethansulfonat o.l.

I en udførelsesform fortyndes en suspension af den behandlede stam-30 me (I) først med steriliseret fysiologisk saltvandsopløsning til en passende koncentration efter eventuel senere inkubation, og en portion (0,5-1 ml) af den fortyndede suspension spredes på et minimum (agar) medium indeholdende 0,5-2% D-gluconsyre (samt vitaminer og sporstoffer, der er essentielle for mikroorganismens vækst) og dyrkes derpå. Kolonier 35 dyrket på mediet overføres til et andet minimum (agar) medium indeholdende 0,5-2% 5-keto-D-gluconsyre ved replikaspredningsmetoden, og kolonier, som er ude af stand til at vokse med 5-keto-D-gluconsyre, udvælges dernæst. Cellerne i de udvalgt kolonier mangler fuldstændig den evne til

DK 161106 B

3 at udnytte 5-keto-D-gluconsyre, som forældrestammen (I) havde, eller evnen er reduceret til mindre end en tiendedel i forhold til forældrestammen (I).

Det bekræftes yderligere, at hver mutant (II) fremstiller 2-keto-L-5 gulonsyre uden væsentlig biproduktion af 2-keto-D-gluconsyre under dyrkningsbetingelser i nærværelse af 2,5-diketo-D-gluconsyre.

Som eksempler på mutanter (II), der er opnået på den ovenfor beskrevne måde, kan nævnes en mutant FERM-BP 108, der er afledt af en for-ældrestamme (I), Corynebacterium sp., FERM-P 2770, ATCC nr. 31.090, og 10 en mutant FERM-BP 107, der er afledt af en anden (I), Corynebacterium sp., FERM-P 2687, ATCC nr. 31.081 (tabel 1). Detaljerede taksonomiske beskrivelser af disse forældrestammer (I) findes i USA-patentskrifterne nr. 3.959.076 og 3.998.697. Mutanterne FERM-BP 107 og FERM-BP 108 er deponeret i overensstemmel se med Budapest-traktatens bestemmelser.

15

Tabel 1 (2-keto-L-gulonsyre producerende mikroorganismer (forældre) sat over for mutanter, der i det væsentlige mangler evne til at metabolisere 5-keto-20 D-gluconsyre og i det væsentlige er ude af stand til at fremstille 2-keto-D-gluconsyre (mutanter) afledt af førstnævnte).

Forældre Mutanter 25 Corynebacterium sp. FERM-P 2770 FERM-BP 108 ATCC nr. 31.090

Corynebacterium sp. FERM-P 2687 FERM-BP 107 ATCC nr. 31.081 30

Den ovenfor beskrevne kendsgerning, at fjernelse eller bemærkelsesværdig formindskelse af 2-keto-D-gluconsyre produktionsaktivitet udvirkes ved fjernelse af 5-keto-D-gluconsyre metaboliseringsaktivitet fra forældrestammen, er fælles for alle 2-keto-L-gulonsyre producerende mi-35 kroorganismer, der tilhører Coryneform bakteriegruppen (iht. den i

Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. udgave, givne definition). Eventuelle yderligere mutanter eller varianter af mutanten (II) kan også anvendes til udøvelse af den beskrevne fremgangsmåde, for så

DK 161106 B

4 vidt som de har denne evne. Endvidere kan enhver mikroorganisme, hvori det gen, der udtrykker denne egenskab ved mutanten (II), der er fremstillet ved genkloning, transformation eller cellefusion, anvendes.

5 (2) Omdannelse af 2,5-diketo-D-gluconsyre til 2-keto-L-gulonsyre i nærværelse af mutanten (II)

Enhver af de kendte konventionelle betingelser, der anvendes til dyrkning af forældrestamme (I), behandling af det dyrkede substrat og udvinding af 2-keto-L-gulonsyre fra substratet som fx. beskrevet i USA-10 patentskrifterne nr. 3.922.194, 3.959.076 og 3.963.574, kan ligeledes anvendes til dyrkning af mutanten (II) og til de efterfølgende trin, med nogle åbenlyse modifikationer.

Der bør ikke lægges særlige begrænsninger på sammensætningen af det næringsmedium, der anvendes til dyrkning af mutanten (II). Fx. kan suk-15 kerarter såsom glukose, saccharose og melasse samt polyhydroxyalkoholer såsom glycerol anvendes som carbonkilde i en koncentration på 0,5-5%, og konventionelle nitrogenholdige substanser såsom majsstøbevæske, pepton, kødekstrakt, ammoniumforbindelser, nitrater o.l. kan anvendes som nitrogenkilde i en koncentration på 0,5-5%. Andre uorganiske salte (fx. salte 20 af calcium, magnesium, kalium, zink, mangan og jern) eller enhver anden faktor, der er i stand til at fremme produktionen af slutproduktet, kan sættes til sammensætningen. Sammensætningen kan variere i afhængighed af den anvendte stammes egenskaber, mængden af råmateriale, 2,5-diketo-D-gluconsyre, og andre ledsagende betingelser.

25 En vandig opløsning af et hvilket som helst salt af 2,5-diketo-D- gluconsyre kan anvendes som råmateriale. Alternativt kan der også anvendes et fermenteringssubstrat opnået ved dyrkning af en mikroorganisme, som er i stand til at producere 2,5-diketo-D-gluconsyre ud fra D-glukose og som kan tilhøre slægten Erwinia eller slægten GIuconobacter 30 (iht. den i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. udgave, givne definition, og derfor omfattende slægterne Acetomonas, Acetobacter og GIuconobacter iht. 7. udgave) som et cellefrit filtrat eller en ved hjælp af kemikalier steriliseret opløsning (fx. natriumdodecylsul fonat).

Eksempler på sådanne mikroorganismer tilhørende slægten Gluconobac-35 ter eller slægten Erwinia er vist i tabel 2 nedenfor.

Tabel 2

DK 161106 B

5

Mikroorganisme FERM-P ATCC

5 Acetomononas albosesamea 2439 21998

Gluconobacter melanogenum IFO 3293 ---- ----- GIuconobacter rubisinosus IFO 3244 .... .....

Erwinia citreus 5449 31623

Erwinia punctata 5452 31626 10 Erwinia punctata var. 5450 31624

Erwinia punctata var. 5451 31625

Erwinia punctata var. 5453 31627

Erwinia terreus 5454 31628

Erwinia terreus var. 5455 31629 15 Erwinia terreus var. 5456 31630

Erwinia terreus var. 5457 31631

Detaljerede taksonomiske beskrivelser af disse stammer er givet en-20 ten i USA-patentskrift nr. 3.998.697 eller europæisk patentskrift nr.

0.046.284.

Prøver af disse mikroorganismestammer samt af de tidligere beskrevne stammer er blevet deponeret hos Fermentation Research Institute,

Yatabe, Japan og/eller American Type Culture Collection, Maryland, USA 25 og kan fås fra disse depoter iht. Budapest-traktatens bestemmelser. Mikroorganismer med IF0-nr. kan også fås fra Institute of Fermentation,

Osaka, Japan.

Selv om mængden af 2,5-diketo-D-gluconsyre, som skal sættes til mediet, og dens tilsætningsmåde varierer i afhængighed af den anvendte mi-30 kroorganisme og de i mediet og under dyrkningen tilstedeværende betingelser, tilsættes 2,5-diketo-D-gluconsyren i almindelighed på én gang eller portionsvis med mellemrum til opnåelse af en samlet koncentration på 1-10% i næringsmediet eller dyrkningssubstratet. Mængden af 2,5-diketo-D-gluconsyre ved hver portionsvis tilsætning indstilles fortrinsvis til 35 en koncentration på 0,05-2% i forhold til den totale mængde af medium eller dyrkningssubstrat på tilsætningstidspunktet.

pH-værdien i mediet eller dyrkningssubstratet kan sædvanligvis holdes på 5,0-9,0 og fortrinsvis på 6,0-8,5 under omdannelsen ved lej

DK 161106 B

6 lighedsvis tilsætning af en alkalisk substans, fx. calciumcarbonat. Alternativt kan en hvilken som helst egnet puffer sættes til mediet ved dyrkningens begyndelse.

Disse betingelser kan med nogle modifikationer anvendes i forbind-5 else med andre i det følgende beskrevne udførelsesformer for opfindelsen.

(3) Anvendelse af nitratsalt og hydrogendonor ved dyrkningen

Ved udførelsen af fremgangsmåden til fremstilling af 2-keto-L-gu-10 lonsyre ud fra 2,5-diketo-D-gluconsyre uden ledsagende akkumulering af 2-keto-D-gluconsyre ved anvendelse af mutanten (II) har opfinderne nu fundet, at produktionen af 2-keto-L-gulonsyre kan forøges bemærkelsesværdigt, og at det molære udbytte af 2-keto-L-gulonsyre ud fra 2,5-diketo-D-gluconsyre også kan forøges bemærkelsesværdigt ved tilsætning af et 15 nitrat til vækstsubstratet for mutant (II) og/eller til et medium, hvori mutanten (II) virker på 2,5-diketo-D-gluconsyre, og ved tilsætning af en hydrogendonor til substratet samtidig med tilsætning af 2,5-diketo-D-gluconsyre.

Når mutanten (II) inokuleres og inkuberes i et sådant medium supp-20 leret med 0,1-0,5% nitrat, når væksten af mutant (II) sit maksimum inden for 10-24 timer efter inkubationens begyndelse. Desuden sættes nitratet til mediet i en koncentration på 0,05-0,5% i en fase, i hvilken væksten når sit maksimum, eller inden for 10 timer efter denne fase. Nitraterne, som kan anvendes ved denne fremgangsmåde, omfatter alkalimetalsalte så-25 som kaliumnitrat og natriumnitrat, jordal kalimetal salte såsom calciumnitrat og magnesiumnitrat, og mangannitrat.

Nitratet kan sættes til næringsmediet på tidspunktet for påbegyndelse af dyrkningen af mutanten (II). Tilsætningen kan også gennemføres på én gang samtidig med tilsætningen af 2,5-diketo-D-gluconsyre eller 30 portionsvis efter tilsætningen. Fortrinsvis kan tilsætningen gennemføres ved dyrkningens begyndelse og ved starten af 2,5-diketo-D-gluconsyretil-sætningen. Det har også vist sig, at den ved tilsætning af nitrat opnåede fordel bliver mere udtalt ved tilsætning af en hydrogendonor til mediet samtidig med tilsætningen af 2,5-diketo-D-gluconsyren. Produktionen 35 af 2-keto-L-gulonsyre kan nemlig også forøges bemærkelsesværdigt ved tilsætning af en hydrogendonor.

Som hydrogendonor kan der anvendes et hvilket som helst carbohydrat og en hvilken som helst polyhydroxyalkohol for så vidt som stammen kan

DK 161106 B

7 udnytte dem. Det er ønskværdigt at tilsætte hydrogendonoren samtidig med tilsætningen af 2,5-diketo-D-gluconsyre i kombination med 2,5-diketo-D-gluconsyren. Selv om koncentrationen af hydrogendonoren kan variere i afhængighed af betingelserne ved tilsætningen af 2,5-diketo-D-gluconsy-5 ren og af den anvendte mutant eller substratet» hvori mutanten er blevet inkuberet, tilsættes hydrogendonoren sædvanligvis i en koncentration i området fra 5% til 50% af mængden af 2,5-diketo-D-gluconsyre, der skal tilsættes.

Fordelen ved tilsætning af nitratet ifølge opfindelsen kan til skri -10 ves den kendsgerning, at nitratet deltager i mikroorganismernes stofskifte på carbohydratet eller den organiske syre, der tilsættes som hydrogendonor. Det aktiverer også et system til reduktion af 2,5-diketo-D-gluconsyre til 2-keto-L-gulonsyre i mikroorganismecellerne og spiller en rolle ved en effektiv overførsel af det fra hydrogendonoren frigjorte 15 hydrogen til reduktionssystemet. Uden tilsætning af denne hydrogendonor ville virkningen af en tilsætning af nitrat alene kun være af lille værdi for produktionen af 2-keto-L-gulonsyre, dvs. fordelen af en nitratsal ttilsætning mht. forøgelse af produktionen og til opnåelse af et højt udbytte af 2-keto-L-gulonsyre kan forbedres bemærkelsesværdigt ved blot 20 at tilsætte hydrogendonoren.

Udover de ovenfor beskrevne fordele er nitrattilsætning også effektiv til en forlænget opretholdelse af den forud fastsatte pH-værdi (6,5-8,0) af substratet, hvilken værdi er foretrukket til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre ud fra 2,5-diketo-D-gluconsyre.

25 Det antages, at nitratet snarere tjener til forbedring af mikroorganismens metabolisme af hydrogendonoren og bidrager til aktivering og stabilisering af reduktionssystemet end som nitrogenkilde for mikroorganismen.

I almindelighed bedømmes virkningen af en nitrogenholdig forbindel-30 se som nitrogenkilde, der kan udnyttes, ved dens forøgelse af cellekoncentrationen. Blandt lignende uorganiske forbindelser har et ammoniumsalt en meget større virkning på denne forøgelse end nitratet. Ammoniumsaltet bevirker nemlig en forøgelse af cellekoncentrationen, når det sættes til substratet ved dyrkningens begyndelse eller på tidspunktet 35 for 2,5-diketo-D-gluconsyre tilsætningen, men har kun ringe virkning på forøgelsen af 2-keto-L-gulonsyre produktionen.

I modsætning hertil har nitratet en mindre virkning på forøgelsen af cellekoncentrationen end ammoniumsaltet, men bidrager til den bemær

DK 161106B

8 kelsesværdige forøgelse af 2-keto-L-gulonsyre produktionen. Disse virkninger vil senere blive vist i form af eksempler.

(4) Sterilisation af 2,5-diketo-D-gluconsyre-fermenteringssubstrat med 5 overfladeaktivt middel I det videre forløb af udformningen af en kommerciel produktion af 2-keto-L-gulonsyre har opfinderne forsøgt at fremstille 2-keto-L-gulon-syre på effektiv måde ved at tilsætte 2,5-diketo-D-gluconsyre fermenteringssubstratet, der blev fremstillet ved dyrkning af stamme (III) (in- O |f) 10 deholdende 10 - 10 levedygtige celler af (III) pr. ml), direkte til dyrkningssubstratet for mutanten (II)).

Ved dette forsøg blev det fundet, at produktionen af 2-keto-L-gu-lonsyre inhiberes bemærkelsesværdigt, når mutanten (II) anvendes i den ovenfor beskrevne fremgangsmåde i modsætning til, hvad der er tilfældet, 15 når forældrestammen (I) anvendes. Som et resultat af omfattende undersøgelser er det blevet klart, at inhiberingsfænomenet optræder i et tiΙέ fælde, hvor stammen (III) er vokset ud over 10 levedygtige celler/ml i processen.

Som en måde at sterilisere stammen (III) i 2,5-diketo-D-gluconsyre 20 fermenteringssubstratet på, kommer termisk sterilisation og sterilisation ved filtrering i betragtning. P.g.a. den termiske instabilitet af 2,5-diketo-D-gluconsyre og høje omkostninger i forbindelse med dårlige praktiske gennemførselsmuligheder for sterilisation ved filtrering ved produktion i kommerciel målestok, har man imidlertid fundet, at en eta-25 blering af alternative måder til sterilisation af stammen (III) er uundværlig for gennemførelse af en kommerciel produktion af 2-keto-L-gulon-syre. Efter en rwl'ke forskelligartede studier er yderligere fordele blevet opnået ved tilvejebringelse af en sikker og pålidelig måde til sterilisation af stamme (III) med et overfladeaktivt middel.

30 Dette aspekt af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse har den fordel, at ingen yderligere faciliteter, der specielt er udformet til sterilisation, er nødvendige til udførelse af fremgangsmåden, det overfladeaktive middel kan let udvælges blandt de mange mulige, således at det ikke vil inhibere produktionen af 2-keto-L-gulonsyre med 35 mutanten (II), og selve det overfladeaktive middel er billigt og let tilgængeligt.

En yderligere fordel består i, at fremgangsmåden let kan udnyttes til produktion i stor målestok.

9 DK 161106 B

Af de undersøgte overfladeaktive midler har natriumdodecylsul fat (SDS) vist sig at være specielt at foretrække.

Detaljer ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen beskrives kort i det følgende.

5 Først inokuleres et medium, der indeholder substratet, D-glucose, en nitrogenkilde såsom majsstøbevæske og uorganisk salt med den 2,5-di-keto-D-gluconsyre producerende stamme (III) og dyrkes ved 28°C under omrøring og luftning.

Dernæst deles fermenteringssubstratet, der er fremstillet som oven-10 for beskrevet, i to portioner, og den ene behandles ved aseptisk tilsætning af et af de overfladeaktive midler til opnåelse af en slutkoncen-tration på 0,01-0,25 vægt/vol-% og får lov at henstå ved 5-28°C i flere timer under lejlighedsvis og moderat omrøring. En anden portion uden tilsat overfladeaktivt middel holdes ligeledes ved 5-28°C i flere timer.

15 Ved behandlingen med overfladeaktivt middel, hvor der fx. anvendes natriumdodecylsul fat (SDS), formindskes antallet af levedygtige celler af stammen (III) i det behandlede substrat til mindre end én milliontedel af det antal levedygtige celler, der er til stede i det ubehandlede substrat. Formindskelsen kan imidlertid variere i afhængighed af de an-20 vendte stammer og det anvendte overfladeaktive middel. En del af den anden portion ubehandlet 2,5-diketo-D-gluconsyre fermenteringssubstrat steriliseres ved filtrering.

Dernæst tilsættes D-glucose som hydrogendonor aseptisk til henholdsvis det med overfladeaktivt middel behandlede substrat, det ved 25 filtrering steriliserede substrat og det ubehandlede 2,5-diketo-D-gluconsyre fermenteringssubstrat til opnåelse af en slutkoncentration på 1-10% før substraterne sættes til kulturen af mutanten (II).

Adskilt herfra dyrkes mutanten (II) i tidsmæssig overensstemmelse med behandlingen af 2,5-diketo-D-gluconsyre fermenteringssubstratet med 30 overfladeaktivt middel. Til kulturen af mutanten (II) sættes hver af de i forvejen fremstillede tre 2,5-diketo-D-gluconsyre fermenteringssubstrater portionsvis hver 15, til 120. minut til opnåelse af en 2,5-diketo-D-gluconsyre koncentration på 0,05-2,0%, mens mængden af 2,5-diketo-D-gluconsyre, der forbliver i substratet, overvåges, og dyrkningen 35 fortsættes i 48 timer efter tilsætningens begyndelse. Både i tilfælde af sterilisation ved behandling med overfladeaktivt middel og ved filtrering omdannes 2,5-diketo-D-gluconsyren problemløst til 2-keto-L-gulonsy- 5 re. Alligevel når cellepopulationen af stamme (III) op på mere end 10

DK 161106 B

10 celler/ml, når der ikke steriliseres, så produktionen af 2-keto-L-gulon-syre standser helt.

Som vist i de efterfølgende eksempler kan sterilisationen gennemføres ved behandling med overfladeaktivt middel eller ved filtrering. Men 5 da sterilisation ved filtrering af substratet imidlertid kun er mulig ved behandling i laboratoriemålestok, hvis substratet indeholder 2,5-di-keto-D-gluconsyre i høj koncentration, anses den næsten for umulig ved gennemførelse af en produktion i kommerciel målestok p.g.a. de høje omkostninger. Derfor har sterilisation med overfladeaktivt middel iht.

10 dette aspekt af opfindelsen vist sig at have store fordele.

I den efterfølgende beskrivelse vil den foreliggende opfindelse blive nærmere belyst ved hjælp af eksempler. Indholdet og rækkefølgen af beskrivelsen er som følger: 15 Eksempel 1: Afledning af mutanten (II).

Præparation A: 2,5-diketo-D-gluconsyre fermenteringssubstrat.

Præparation B: Opløsning af Ca-2,5-diketo-D-gluconat.

Eksempel 2: Anvendelse af mutanten (II) til 2-keto-L- gulonsyreproduktion ved fermentering.

20 Eksempel 3: Anvendelse af cellesuspension og celleekstrakt af mutanten (II) til 2-keto-L-gulonsyreproduk-tion ved kontakt.

Eksempel 4: Tilsætning af et nitratsalt og en hydrogendonor til fermenteringssubstratet.

25 Eksempel 5: Sterilisation af 2,5-diketo-D-gluconsyrefer- menteringssubstrat med overfladeaktivt middel.

Analysemetoder 30 (i) 2-keto-L-gulonsyre, 2-keto-D-gluconsyre og 2,5-diketo-D- gl uconsyre (a) Gas-væskekromatografi: Søjle: SE 52 (5%) Prøve: trimethylsi lyleret 35 Bæregas: helium

Temperatur: 160-210°C

DK 161106B

π (b) Papir- eller tyndtlagskromatografi: Bærer: Toyo Roshi nr. 50 eller TLC aluminium pi adecellul ose (kan fås fra Toyo Roshi K.K. eller Merck A.G.) 5 Fremkaldelsesopløsningsmiddel:

Phenol: myresyre: vand = 75:4:25 Farvefremkaldelse:

Sprøjtning med AHF-opløsning (fremstillet ved opløsning af 0,93 g anilin og 1,66 g 10 phthalsyre i 100 ml vandmættet n-butanol) og opvarmning til 105°C i 2 minutter.

(ii) D-glukose 15 "Glukose-B-test" kan fås fra Wako Junyaku Kogyo K.K.

Eksempel 1 (Afledning af mutanten (II)) 20 (1) Flydende medium

En vandig opløsning indeholdende: "Bacto" kødekstrakt 1,0% "Bacto" pepton 1,0% og 25 NaCl 0,5% indstilledes til pH 7,2. Hver 50 ml sattes portionsvis til en 500 ml konisk kolbe og steriliseredes ved 115°C i 20 minutter.

30 (2) Minimum!agar)medium

Et medium med følgende sammensætning indstilledes til pH 7,2 og steriliseredes ved 115°C i 15 minutter: NH4C1 0,5% 35 NH4N03 0,1%

Na2S04 0,2%

MgS04.7H20 0,1%

CaC03 0,0001%

DK 161106 B

12 kh2po4 0,3% k2hpo4 0,1%

Sporstofopløsn i ng 0,1% **

Vitaminopløsning 0,1% og 5 Agar 2,0% *

Sporstofopløsning (ingredienser per liter)

Na2B40y.l0H20 88 mg 10 (NH4)6Mo7024.4H20 37 mg

FeCl3.6H20 970 mg

ZnS04.7H20 88 mg

CuS04.5H20 270 mg og

MnCl2.4H20 27 mg 15 **

Vitaminopløsning (ingredienser per liter)

Thiamin 1,0 mg

Pantothensyre 10 mg 20 Niacin 10 mg og

Biotin 0,1 mg (3) Opløsning af D-gluconsyre og 5-keto-D-gluconsyre

Vandige opløsninger (10%) af natrium-D-gluconat og natrium-5-keto-25 D-gluconat indstilledes hver til pH 6,8-7,2 og steriliseredes ved filtrering.

(4) Fremgangsmåde til isolering af mutanterne

En løkkefula af hhv. Corynebacterium sp. FERM-P 2770 og Corynebac-30 terium sp. FERM-P 2687 inokuleredes i det flydende medium (1) og dyrkedes ved 28°C i 8 timer. Til hvert af de dyrkede medier sattes en forud steriliseret 0,2% vandig opløsning af N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguani-din til opnåelse af en slutkoncentration på 0,02%, og inkubationen fortsattes i yderligere 30 minutter. Det inkuberede medium centrifugere-35 des (10.000 opm, 15 minutter), og cellerne opsamledes derfra.

De opsamlede celler vaskedes tre gange med steriliseret fysiologisk saltvand og suspenderedes hver i 10 ml saltvand. Hver 1 ml portion af suspensionen inokuleredes i mediet (1) og dyrkedes ved 28°C i 15 timer.

13 DK 161106 B

Kulturen fortyndedes så til 102 - 103 levedygtige celler per ml med steriliseret saltvand. Dernæst fordeltes hver 0,5-1 ml portion af den fortyndede kultur over en plade med næringsmedium fremstillet ved blanding af D-gluconsyreopløsning (3) med minimum agar mediet (2) i et forhold på 5 1 til 9 og fik lov til at udvikle sig ved 28°C i 3-5 dage.

Kolonier af de udviklede celler (stamme (I) i tabel 3, der vokser i D-gluconsyre-medium), overførtes med et stykke bomuldsfløjl til en plade med næringsmedium fremstillet ved blanding af 5-keto-D-gluconsyre opløsning (3) med minimum agar mediet (2) i et forhold på 1 til 9. Efter in-10 kubering i 3-5 dage opsamledes cellekolonier, der voksede på D-gluconsy-remediet, men ikke på 5-keto-D-gluconsyremediet, og inokuleredes for derefter at blive inkuberet i D-gluconsyremediet.

Den således valgte mutant (stamme (2) i tabel 3, der ikke kan vokse på 5-keto-D-gluconsyremediet), inokuleredes i mediet (1) indeholdende 1% 15 5-keto-D-gluconsyre, og dyrkedes ved 28°C i 24 timer. Den i kulturen tilbageblevne 5-keto-D-gluconsyre bestemtes ved papirkromatografi for at bekræfte, at denne stamme (2) ikke var i stand til at udnytte 5-keto-D-gluconsyre.

Medium (2), der vil blive beskrevet i eksempel 2, inokuleredes med 20 en løkkefuld af den mutant, der havde vist sig at være ude af stand til at udnytte 5-keto-D-gluconsyre (stamme (3) i tabel 3) og inkuberedes i 20 timer. Til dette inkuberede medium sattes den calcium-2,5-diketo-D-gluconatopløsning, som vil blive beskrevet i præparation B til opnåelse af en slutkoncentration på 1,0%, og inkubationen fortsattes i yderligere 25 24 timer.

Mængden af 2-keto-D-gluconsyre og 2-keto-L-gulonsyre i dyrkningsmediet bestemtes ved papirkromatografi. Resultaterne er vist i tabel 3 nedenfor.

Således opnåedes 308 ønskede mutanter med manglende evne til at me-30 taboli sere 5-keto-D-gluconsyre og i det væsentlige ude af stand til at producere 2-keto-D-gluconsyre, ud fra 84.520 kolonier mutageniseret Co-rynebacterium sp. FERM-P 2770, og på lignende måde opnåedes 11 ønskede mutanter ud fra 29.100 kolonier mutageniseret Corynebacterium sp. FERM-P 2687.

35

DK 161106B

14

Tabel 3 2-keto-L-gulonsyre producerende mi kro- Corynebacterium Corynebacterium 5 organismer (forældre) sp. FERM-P-2770 sp. FERM-P 2687 (antal mutantstammer)

Stammer (1), som kan vokse på D-gluconsyremedium 84.520 29.100 10 Stammer (2) af sådanne (1), som ikke kan vokse på 5-keto- D-gluconsyremedium 363 45

Stammer (3) af sådanne (1), som ikke kan udnytte 5-keto- 15 D-gluconsyre 319 13

Stammer af sådanne (3), som producerer 2-keto-L-gulonsyre, med ikke producerer 2-keto-D- gluconsyre 308 11 20

Præparation A

(2,5-diketo-D-gluconsyre fermenteringssubstrat) (i) Podemedium 25

En vandig opløsning indeholdende: D-glukose 1,0%

Majsstøbevæske (CSL) 5,0% 30 Primært kaliumphosphat (K^PO^) 0,1%

Magnesiumsulfat (MgSO^HgO) 0,02% og

Calciumcarbonat (CaCOg) 0,5% indstilledes til pH 6,8-7,0 med 10% NaOH opløsning og opdeltes i 50 ml 35 portioner, som anbragtes i en 500 ml konisk kolbe respektivt. Podemediet steriliseredes ved 120°C i 20 minutter.

DK 161106B

is (ii) Podekultur

Podemediet (i) i kolben inokuleredes med en løkkefuld Erwinia punctata FERM-P 5452 vist i tabel 1 og inkuberedes under omrøring (am-5 pi i tude 71 mm, 270 opm) ved 28°C i 8-11 timer. Podekulturen afsluttedes på et tidspunkt, da dens optiske tæthed nåede op på ca. 8 (slutpunkt).

(iii) Fermenteri ngsmedi um 10 En vandig opløsning indeholdende: D-glukose 20% CSL 3% kh2po4 0,1% 15 CaC03 6,3% og

Antiskumdannelsesmiddel, polypropylenglycol (P-2000) 0,01% indstilledes til pH 6,8-7,0, steriliseredes ved 120°C i 20 minutter, 20 hver 455 ml portion hældtes aseptisk i en steriliseret 1 1 fermente-ringsbeholder, og der tilsattes 45 ml af ovennævnte podekultur (ii) til hver portion.

(iv) Fermentering 25

Fermentering gennemførtes ved 28°C med en luftstrømningshastighed på 600 Nml/minut og omrøring ved 1740 opm i 20-30 timer (2,5-diketo-D-gluconsyre-slutkoncentration ca. 19 vægt/vol-%). Substratet centrifugeredes til fjernelse af cellerne, og supernatanten steriliseredes ved 30 filtrering. Dette anvendtes som 2,5--diketo-D-gluconsyre fermenterings-substratet.

(v) Slutpunkt 35 Fermenteringen afsluttedes på et tidspunkt, da den lyserøde plet af 2-keto-D-gluconsyre forsvandt fra et tyndtlagskromatogram af substratet.

DK 161106 B

16

Præparation B

(Opløsning af calcium-2,5-diketo-D-gluconat)

En vandig opløsning indeholdende 5% pulveriseret calcium-2,5-dike-5 to-gluconat i en koncentration på 5,0% steriliseredes ved filtrering.

Eksempel 2 (Anvendelse af mutanten (II) til 2-keto-L-gulonsyreproduktion ved fermentering) 10 (1) Podemedium (fælles for de efterfølgende eksempler)

En vandig opløsning indeholdende: 15 D-glukose 1,0% "Bacto" gærekstrakt 0,5% "Bacto" pepton 0,5%

Primært kaliumphosphat (KH2P04) 0,1% og 20 Magnesiumsulfat (MgSO^.7H20) 0,02% indstilledes til pH 7-7,2 med 10% NaOH opløsning. Hver 50 ml portion hældtes i en 500 ml konisk kolbe og steriliseredes ved 115°C i 20 minutter.

25 (2) Fermenteri ngsmedi um

En vandig opløsning indeholdende: D-glukose 1,0% 30 Majsstøbevæske (CSL) 3,0% KH2P04 0,1% og

MgS04.7H20 0,02% indstilledes til pH 7,0-7,2 med 10% NaOH. Hver 50 ml portion anbragtes i 35 en 500 ml konisk kolbe og steriliseredes ved 115°C i 20 minutter.

(3) Fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre

Podemediet (1) inokuleredes med en løkkefuld 2-keto-L-gulonsyre-

DK 161106 B

17 producerende mikroorganisme (forælder (I)) eller mutanter (II) afledt fra (I), som er vist i tabel 4, og det inokulerede medium dyrkedes ved 28°C i 24 timer. Dernæst inokuleredes 5 ml af hver podekultur i fermenteringsmediet (2) og dyrkedes. En af opløsningerne af 2,5-diketo-D-glu-5 consyre (præparationer A og B) sattes til dette fermenteringsmedium til opnåelse af en slutkoncentration på 2% ved fermenteringens begyndelse eller på et hvilket som helst tidspunkt inden for 16 timer efter fermenteringens begyndelse, og fermenteringen fortsattes i yderligere 48 timer.

10 Resultaterne af gas-væskekromatografien af produkterne er sammen fattet i tabel 4 nedenfor. Som vist i tabel 4 påvistes der ingen 2-keto-D-gluconsyre i substraterne for mutant (II), hvorimod der påvistes en betydelig mængde af denne syre i substraterne for forælder (I).

DK 161106 B

I · O) O ___ $2 ? <— oj .E _ C Έ □ E a> \ f S cvi S- cn ω S ** ε ^ S £ n 4-cscoinooTrcooo

, S o. □ in <t CVJ CO

E S 1 "O ^ Λ Λ r S S, Σ oj cvj o ri o o > O* d: >

C JjJ

* _ ° Ε «»ο o ε CVJ 00 \ -C ^ +J KO *r- ΟΪ ^ t *-h i— ε 1.¾ £« X .

^ £ 00 O «DCSlOOCOOCOOOOlO

·+” rr _a o +j ir-incocviror^^i-oo J® ® 3 j— (/) V/ «vfv^AfvftfVfv

^ j, W< — CVJ·—i *3" in 03 O O O O

00 ε XI ·ι-3 -P 00 r- CO _ QJ^ £ %. c .= _ >ϊ QJ ( c ω \ ΟΌ +j i* u qj i; = = > ^ 'Z.J, 4- i 4-yjcOCOOOCVJOO© Y’-g IS O Q ti· CO *3" ri E1 2 cn ω "S ^ © π o o •p ω c -5 x> ω-Q S7 ω

, Sild S- i— QJ

1 ·* __ „4_j tu e S- _ o i c ·*— cn w

ΟΪΌ es Q ^ « C

°«J D)i8 ^ E o

„f -r-r3 1. . O

p r- -O Ui— QJCDOlOOOOOOlOoO 3 ir x> c i— cn 4-> i in oo cvj cn CM ri cvj oo i— ΙΟ Ιβ I CΛ iZ r r r «- *> <- r. « O) r2_ > o Q >— cvi i—i co m ri o o o o i

__ C Q

o o” -

§ =w -S

* 7* qj J

“71 F cn 1 i Λ ω E ° " ^ ·>- -p <u

Zr.TZ c qj s- s- oo SE +j^: >i<u c o cs

+j fti -r M +J 0) W Q

' ti ^ mo cl·· cn·— i<£

03 ^3 Cl— i O 0J C OJ O CO O CO O Π O CO CVJ

1—I t, 13 ·ρ~ LO u ·Γ- “O Γ-4 »—I *—< ^ Q_ α-P ~ 3 s- e c *· ^'ttocsjp— <ϋ^>ϊ d> _ 10 OS- DiE i- O) s- o 4- -r- >, ai ~o -o >>

^ E (-4- (8Q4JOU i— I— CO

E S I rs. I 3r-1 C

. 0J4-C0 · QJ 4— ri o 0) Q. S- i— O CL S- i— O i— =, _ S- C/) >101 00 >1 CU 1—c 3 — 2* >j oo cn oo cn cn ,°οοι ε c c a. ε c c cl i

E C OJ 3O0t0CQ3n0t0C0_J

cur-v o ε •Γ-σ»υε>·'-οουε> 1

i? EL r— QJ 00 S- »o 3 S S- »O 3 S O

V- — 3 T3 -r- QJ O 1—1 I— CU QQ Ojrit-1 i— QJ QC +J

Trti cn c c p n oo cn ε lu -pcoco cn ε lu qj ES i QJ rO ori i OO Ll O CO i OO u.

QJC _I S- σο ro CVJ . Q-I-W recvj· Q -r- H I

ΓΙ E lOJS-S- XJS- II— XJS- li— cvj 3 Ϊ o o o qj aja.c o o -p aj o_ c οο·ρ I I -P 3 O ε Cl -P XS C C I -P XI c 3 = OJ-a S- ε >iSO QJ to ro >,Σ O QJ ro CO ¢3 S ™ ^ O ^ ro S-0C O Jui+J 4J S-QCU U<1+J+J _|

i s_ -r- +J O LU f— I QJ 3 O LU I— I 0J 3 iZ

01 cvj ο. ε oo ull< ιηεε o u_ < m ε ε cvj o m o in o in i—i i-ι cvj cvi co

DK 161106 B

19

Eksempel 3 (Anvendelser af cellesuspension og celleekstrakt ved 2-keto-L-gulonsyre-produktion ved kontakt) 5 (1) Podekultur

Det i eksempel 2 (1) beskrevne podemedium inokuleredes med en løkkefuld af Corynebacterium sp. FERM-P 2770 (I) eller af mutanten, der mangler evne til at metabolisere 5-keto-D-gluconsyre og i det væsentlige er ude af stand til at fremstille 2-keto-D-gluconsyre, FERM-BP 108 (II), 10 og dyrkedes under omrøring i 28°C i 24 timer.

(2) Dyrkning til fremstilling af en cellesuspension eller ekstrakt Det i eksempel 2 (2) beskrevne fermenteringsmedium (455 ml), men yderligere indeholdende 0,01% af antiskumdannelsesmidlet polypropylen-15 glycol 2000 (P 2000), anbragtes aseptisk i en 1 liter fermenteringsbeholder og inokuleredes med en 45 ml portion af podekul tursubstratet (I). Fermentering gennemførtes ved 28°C i 16 timer under omrøring ved 1740 opm og ved en luftstrømningshastighed på 600 Nml/min.

20 (3) Fremstilling af cellesuspension

Dyrkningssubstratet (2) centrifugeredes (15.000 opm) til opsamling af celler, som dernæst vaskedes to gange med fysiologisk saltvand. De vaskede celler suspenderedes i 0,05 M Tris-puffer (pH 7,5) til opnåelse af en suspension med ODggg nm = 12.

25 (4) Fremstilling af celleekstrakt

Cellerne, der blev vasket på den under (3) ovenfor beskrevne måde, suspenderedes i 0,05 M Tris-puffer (pH 7,8) til opnåelse af en suspension med ODggQ nm - 100, som ledtes gennem en fransk trykcellepresse ved 30 1.000 kg/cm. De intakte celler og celleresterne fjernedes ved centrifugering ved 20.000 G i 30 minutter. Den resulterende supernatant dialyseredes over for 0,05 M Tris-puffer (pH 7,5) i 15 timer og defineredes som en celleekstrakt.

35 (5) Fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre med cellesuspension (3)

Otte (8) ml af cellesuspension (3) kombineredes med 2 ml Ca-2,5-di-keto-D-gluconat-opløsning (præparation B), og blandingen fik lov til at reagere ved 30°C i 15 timer under omrystning. Dernæst centrifugeredes

20 16110 6 B

reaktionsblandingen (15.000 G. 15 min) til fjernelse af cellerne og undersøgtes for tilstedeværelse af 2-keto-L-gulonsyre og 2-keto-D-gluconsy-re ved gas-væskekromatografi. Resultaterne af den kvantitative bestemmelse er vist i tabel 5 nedenfor.

5

Tabel 5

Mikroorganismer anvendt til Koncentration i fremstilling af cellesuspensionen: reaktionsblandingen: 10 _ 2-keto-L- 2-keto-D- gulonsyre gluconsyre

Corynebacterium sp. FERM-P 2770 15 ATCC 31090 1,93 mg/ml 0,64 mg/ml

Mutant med manglende evne til at metabolisere af 5-keto-D-gluconsyre, FERM-BP 108 2,65 mg/ml 0 mg/ml 20 (6) Fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre med celleekstrakt (4)

Celleekstrakt (4) (0,5 ml) sattes til 2,5 ml 0,1 M Tris-puffer (pH 7,5) indeholdende 75 /t-mol Ca-2,5-diketo-D-gluconat og 15 /i-mol NADPH (reduceret nicotinamidadenindinucleotidphosphat) og fik lov til at rea-25 gere ved 30°C i 16 timer. Resultaterne af den kvantitative bestemmelse af reaktionsblandingen er vist i tabel 6 nedenfor.

30 35

Tabel 6 5 21

DK 161106B

Mikroorganismer anvendt til Koncentration i fremstilling af celleekstrakten: reaktionsblandingen: 2-keto-L- 2-keto-D- gulonsyre gluconsyre

Corynebacterium sp. FERM-P 2770 10 ATCC 31090 285 mcg/ml 32 mcg/ml

Mutant med manglende evne til at metabolisere 5-keto-D-gluconsyre, FERM-BP 108 356 mcg/ml 0 mcg/ml 15

Ud fra de ovenfor i tabel 5 og 6 viste resultater blev det bekræftet, at 2-keto-L-gulonsyre produceredes ved omsætningerne, hvor enten cellesuspensionen (3) eller celleekstrakten (4) blev anvendt.

I begge tilfælde producerer de ud fra forælderen, den 2-keto-L-gu-20 lonsyre producerende mirkoorganismestamme FERM-P 2770 (I), fremstillede ’ produkter imidlertid 2-keto-D-gluconsyre sammen med 2-keto-L-gulonsyre, mens de ud fra mutanten (II) fremstillede produkter producerer 2-keto-L-gulonsyre, men ikke producerer 2-keto-D-gluconsyre.

25 Eksempel 4 (Tilsætning af et nitrat og en hydrogendonor til fermenteringssubstratet) (1) 2,5-diketo-D-qluconsyre fermenteringssubstrat 30 Det ifølge præparation A fremstillede fermenteringssubstrat centrifugeredes (10.000 opm, 15 minutter) til fjernelse af celler, og superna-tanten steriliseredes ved filtrering (2,5-diketo-D-gluconsyrekoncentra-tion: 19%).

Det steriliserede fermenteringssubstrat blandedes med en steril ise-35 ret, vandig D-glukose opløsning (50%) til opnåelse af en slutkoncentra-tion på 3,8% af hydrogendonoren, D-glukose, i substratet.

DK 161106 B

22 (2) Fermenteri ngsmedi um (fælles for de efterfølgende eksempler til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre) 5 En vandig opløsning indeholdende: D-glukose 2,0% CSL 3,0% kh2po4 0,1% 10 MgS04.7H20 0,02% og

Antiskumdannelsesmiddel: polypropylenglycol (P-2000) 0,01% indstilledes til pH 7,0-7,2, og hver 450 ml portion steriliseredes ved 15 115°C i 20 minutter og anbragtes aseptisk i en 1 liter steriliseret fermenter i ngsbehol der.

(3) Fremstilling af nitrogenforbindelseadditiver

Natriumnitrat, kaliumnitrat, natriumnitrit og ammoniumchlorid oplø-20 stes hver for sig i vand til en 10% vandig opløsning af hver, som steriliseredes ved filtrering, til opnåelse af additiverne til medierne ved dyrkningens begyndelse og ved starten af 2,5-diketo-D-gluconsyretiIsætningen.

25 (4) Fermenteri ng (til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre)

Det i eksempel 2 (1) beskrevne podemedium inokuleredes med en løkkefuld af en mutant med manglende evne til at metabolisere 5-keto-D-glu-30 consyre og i det væsentlige ude af stand til at fremstille 2-keto-D-glu-consyre, FERM-BP 108 afledt af Corynebacterium sp. FERM-P 2770, ATCC nr.

31090, og det inokulerede medium inkuberedes under omrystning ved 28°C i 20-24 timer. Hver 50 ml portion af denne podekultur inokuleredes i fermenteringsmediet (2) og efter aseptisk tilsætning sammen med de forskel-35 lige iht. (3) ovenfor fremstillede nitrogenforbindelsesadditiver til opnåelse af en slutkoncentration på 0,25% dyrkedes den ved 28°C ved en luftstrømningshastighed på 1,2 vvm og 1740 opm i 10-16 timer.

Efter at det ved hjælp af den ovenfor beskrevne kvantitative be-

DK 161106 B

23 stemmelse var blevet bekræftet, at D-glukose var forsvundet, tilsattes hvert af nitrogenforbindelsesadditiverne (3) igen til opnåelse af en slutkoncentration på 0,1%. Ydermere tilsattes 2,5-diketo-D-gluconsyre fermenteringssubstratet indeholdende 3,8% D-glukose til opnåelse af en 5 slutkoncentration på 0,2% af sidstnævnte.

Derefter tilsattes 2,5-diketo-D-gluconsyre portionsvis til kulturen hvert 15. til 120. minut til opnåelse af en koncentration på ca. 0,2% umiddelbart efter hver tilsætning, mens eliminering af syren fra substratet overvågedes.

10 Tilsætningen af 2,5-diketo-D-gluconsyre tilendebragtes ved den 45. time efter tilsætningens begyndelse, men dyrkningen fortsattes i yderligere 3 timer (total dyrkningstid efter start: 48 timer).

Efter endt dyrkning analyseredes substratet for 2-keto-L-gulonsyre, 2-keto-D-gluconsyre og 2,5-diketo-D-gluconsyre hver for sig ved gaskro-15 matografi.

Som et resultat blev det bekræftet, at der ikke iagttoges 2-keto-D-gluconsyre i nogen af medierne. Akkumuleringer af 2-keto-L-gulonsyre i substraterne med forskellige nitrogenforbindelseadditiver er sammenfattet i tabel 7 nedenfor.

DK 161106B

O) CD

I e e

CD <D W

ε i— i— +j i ' ’* ' 's * s·^' r— o <u ε id 00 co o m o <D <0 ε I— 3Ό *ø- r-- «i- σι oo 1 t<+J ^ Et r 03 CD 4-3 O O ε σι O CM m >. <o t/) o “o ot ε <— \ »· » « ·· ·» ·> ε ε .—. ε-c σ> ooto cn γή σι cd i— >i E CD < U Ε -Ί CM r-t •r— OT CD E — +J C > (+- r— ·> o T- ε oj

Oli— O <D \ ί- Ο 3 C S- Dl >> h'**-"-»

DlfØ >ι ε OT i 00 CM 1Λ 03 00 00

4-3 i 01 C E <0(0 M- 00 (O LO

Ο-J V) C *· O 3 4-3 *—·—'>— '—'—' i— I CD O Oli— ·»— -i— ι— tO O +4 i— C O S- S- ε CD O Μ" O (O 00 (U4-> C 3 -i- D3 44 4-3 \ ·- « - « ·> ·>

Ε O O O E I <3-1- Dl <0 to "0- (O MS

M4< l. I 0> —I Z C ε '-I

di i co —i i— i CN α I 3 0 •r· o ε +4

s_ (J_ -r- 4-3 3 CD

Ο Π3 CD -X -X — «—» —· 4- 3 0) .X -X I I CO (O (0(0 c ro c i ro cm ε 4-3 *ø- oo cn CD E CD CM i 3 ro I— ·—··— ·—·—' E-i-i—— CD (4- -I- S- ε

5— S— i— S- ro 1— 4-3 S, Οι-I CM CO

(D CD tø ·· >5 tø -i— Dl — — — —

<4— i— 4-> i— HU ^ C ε C31 CM CM O

i 3 CD C 4-» CM Hø· OT ε Dl ε 0 4-3 OJ 3 O S- i— >j OT -X O 3 43 r— -X ~(|- DIO -— cd tø 4-> i3i ro r-» co co "O CD CD I ε M- CO M- (31 C · ·ι- TO 14-3 3 4-3 '«—r —· >>4-> -o c o E -i- irs

Dl-C CD CD +4 M E Ε &ξ σ> O 1-1 CM

CD ε ε Ol Or— 4-3 4-> *> *· - -

_Ω i— Jsi O 10 -i— Dl 00 CM CM O

Dl-i- ΌΟ I ε Z Ε ε CM —l Μι— C 4- O CM

•r* ·!— φ i—I

^5 >>*S x ^in oj cm cm oo E ft! ot > «ί·^«0·σιιησΐΓθΐη<0·ι^.

> r— O 4-3 I— C r—

-I- -I- 1— CD O CD ε CM f-~ (OLD 0000 CM i—I CMO

4- 3+4 3 ·Π3 £ Dl \ - - «· - —* —- -·. -- •i- cd di c -— c di coin coco com coco σι r--

Ό Ε I Ο. HHι ε T—( CM CM I—I

"O >1—1 O 4-3 Cø OT I Ol OICOi-3 N W O+J O S- ^

r— U CD OT -Q CD

i— 0) 3 -X Ε E (DOT

0) Όι— 13 0 MO

-Ω E DICM-XE- <— -X

CØ -I- I fB <D I 3 1— -Ω O 4- S- (D EEi— E cø Q. E (ti CD D1

Ο O >> > Dl I

(μ+J C « OT CD TO Q

£ CD ID S- C T3 O - CD -X Dl*+- O CDS- 4-3+4 4-3 4-3+^

Dl··- Ε Ο Ό +4 >> E E (0 E CØ E 10 ECO E <0

OT3-I-CD3 CD OTjCO CD OT CD OT CUM CD OT CUM

5- I E E1— >1 1— E Dli- Dli— Dir— 0>i— Oil— «0- 43 in 0J >1 ro Q -1—14-0 Ε ·|— E -i- E ·!— Ε ·1— E -1— CM -ι- -ί— OT 1 4-3 1 Η t0O -r- 4-> -1-4-3 4-» -1-4-3 -Ι-4-»

E CM 3 E O CØ O

ε O I OT 4-3

CD (*- 3 1— O 1— CD

D1I0 3«: 3 4-i -I- -X I

-r- -X D1 Φ 4-3-1- OT

1— E tø I -X Ό D1 CD

1— CD —l-ι- CDtE CD OT ε CD OT E Ό OT in -i- OT I— 3

Jxi 1— CD Ο I r— - E r— CD -r-

M CD > 4-4 in CD CM 44 CD TO TO

E *D <D - TO ft! TOECD TO

Ο E Dl-X CM E +- OT C >)E

(4— >1 E 1 -1-C0I— -I-D3OT 44 +4 E

D1 (0 CM ·· Λ -r- Ό ® ro Cø +4 -I- 0 TO CD Ο Ε E 44 Ε XI Ε E <0 E 1—

ΦΌ CM-O 0 CD CD Ο -ι- +4 E +4 -E

> CD «0 1—1 4- Η Ε Έ1— E -i— 44 -ι— O

TO r— Ei— >1 Ε -1- CD C Ε ε CDCDi— CDX CDCDOTCD44+4 ε C ε 3 i— > CD 4J D1T3 E Dl E 3 E 3 ·-

<D -Q 44 —« Ο Ε O 0+3 CD C -r- 3 -i- C

TO E <0 >ir— E >i Ο E cø ε CD Ε -ι- Ε O

E3+4.QO 4J 013 +> Η E D1 +4 1— +4 ε 0-1- TO ε -I- CD i— -1- + 0) C C0 to tø ε

Li_ TO -i- 3 ·—' ZH Ο) Z + Ε- η—ι z Z eC

o m o m o

ΙΛ 1—i »—I CM CM CO

25 DK 161106 B

Som vist i tabel 7 ovenfor, hvori der foretages en sammenligning mellem et tilfælde, hvor et nitrat sættes til mediet eller substratet ved fermenteringens begyndelse samt ved starten af 2,5-diketo-D-glucon-syre tilsætningen, og hvor D-glukose, der tjener som hydrogendonor, ti 1 -5 sættes samtidig med tilsætningen af 2,5-diketo-D-gluconsyre, og et andet tilfælde, hvor der ikke foretages tilsætning, er det tydeligt, at akkumuleringen af 2-keto-L-gulonsyre i substratet forøges fra 8,2 mg/ml til 40 mg/ml (en ca. femfold forøgelse) og udbyttet (mol-%) af 2-keto-L-gulonsyre forøges fra 41 til 93%.

10 Cellekoncentrationen måles som optisk tæthed (O.D.) på det tidspunkt, hvor D-glukose forsvinder fra substratet som sammenfattet i tabel 8 nedenfor, der viser, at nitratet ikke er effektiv som nitrogennæringskilde. Som vist i tabel 8 når forøgelsen ved tilsætning af ammoniumsaltet ca. 40%, selvom forøgelsen af cellekoncentrationen ved ti 1 -15 sætning af nitratet er begrænset til kun 11,6%. Dette faktum viser, at virkningen af nitratet som nitrogenkilde er mindre end virkningen af ammoniumsalt.

De ovenfor anførte konstateringer bekræfter, at tilsætning af nitrat til mediet kun har ringe virkning på forøgelsen af cellekoncentra-20 tionen, men har store fordele hvad angår forøgelsen af 2-keto-L-gulonsy-' reproduktionen og til forbedring af molært udbytte ved omdannelse af 2,5-diketo-D-gluconsyre til 2-keto-L-gulonsyre.

Tabel 8 25 Virkning af additiverne tilsat ved dyrkningens begyndelse på mikroorganismevæksten (Tallene i tabellen angiver cellekoncentrationen på det tidspunkt, hvor D-glukose forsvinder udtrykt som optisk tæthed (O.D.) målt ved 660 nm) 30 Tilsætninger ved dyrkningens Optisk begyndelse tæthed (O.D.)

Ingen 13,7

Natriumnitrat 15,3 35 Kaliumnitrat 15,0

Natriumnitrit 11,1

Ammoniumchlorid 19,3

DK 161106 B

26

Eksempel 5 (Sterilisation af 2,5-diketo-D-gluconsyre fermenteringssubstrat med overfladeaktivt middel) 5 Det iht. præparation A fremstillede substrat opdel tes i flere por tioner umiddelbart efter dyrkningens afslutning. Hvert af de anførte overfladeaktive midler sattes aseptisk til hver portion af substratet til opnåelse af en siutkoncentration på 0,025 vægt/vol-%. De anvendte overfladeaktive midler er vist i tabel 9 nedenfor.

10 Behandlingen med overfladeaktive midler gennemførtes under lejlighedsvis omrøring ved 28°C i 6 timer. Et af disse 2,5-diketo-D-gluconsyre fermenteringssubstrater, der var blevet behandlet med SDS, anvendtes ved 2-keto-L-gulonsyre-fermenteringen med mutant (II), hvilket vil blive beskrevet senere.

15

Tabel 9

Baktericid virkning af forskellige overfladeaktive midler på stamme (III) FERM-P 5452

Formindskelse i antallet 20 Overfladeaktivt middel af levedygtige celler/ml (0,025 vægt/vol-%) _ I begynd- Efter behand-

elsen ling ved 28°C

i 6 timer 25

Intet 2,3 x 109 1,5 x 108

Natriumdodecylsul fat (SDS) " 7,5 x 103

Fedtsyresorbitat (Span 60, kan fås fra Kaoo Atlas K.K.) " 2,2 x 105 30 Natriumstearat " 1,7 x 108

Natriummyristat " 1,6 x 108 HS 210 " 3,8 x 104 HS 215 4,5 x 104 35 Nonion HS 230 " 6,7 x 104 (kan fås fra Nihon L 4 " 2,1 x 105

Yushi K.K.) NS 240 " 5,0 x 105 27

DK 161106B

(1) Tilsætning af D-glukose til 2,5-diketo-D-gluconsyrefermenterings- substrat

En vandig D-glukoseopløsning (50%) sattes til hvert af de med SDS behandlede fermenteringssubstrater, det ved filtrering steriliserede 5 fermenteringssubstrat og det ubehandlede substrat til opnåelse af en slutkoncentration på 3,8% individuelt umiddelbart før tilsætning af substratet til dyrkningssubstratet for mutant (II). Disse 2,5-diketo-D-glu-consyre fermenteringssubstrater vil i det følgende blive betegnet som "substratopløsning" og anvendes som råmateriale til fremstilling af 2-10 keto-gulonsyre.

(2) Fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre ud fra 2,5-diketo-D-gluconsyre med mutant (II) 15 (i) Podekultur

Det i eksempel 2 (1) beskrevne podemedium inokuleredes med en løkkefuld af mutanten med manglende evne til at metabolisere 5-keto-glucon-syre og i det væsentlige ude af stand til at fremstille 2-keto-D-glucon-20 syre (II), FERM-BP 108, afledt af Corynebacterium sp. FERM-P 2770, ATCC nr. 31090, og inkuberedes ved 28°C i 20-24 timer under omrøring (amplitude 71 mm, 270 opm).

(ii) Fermentering (a) 25

Det i eksempel 4 (2) beskrevne fermenteringsmedium, men yderligere indeholdende 0,2% natriumnitrat, inokuleredes med en 50 ml portion af podekul turopløsningen og inkuberedes ved 28°C i 10-16 timer ved en luftstrømningshastighed på 600 N ml/min. og omrøring (1740 opm).

30 (iii) Fermentering (b)

Efter at D-glukosen var opbrugt og elimineret fra kulturen af mutant (II), FERM-BP 108, sattes hver af de iht. (1) ovenfor fremstillede 35 substratopløsninger separat til kulturen, således at 2,5-diketo-D-glu-consyrekoncentrationen var 0,2%.

Dernæst sattes substratopløsningen portionsvis til kulturen hvert 15. til 120. minut, mens elimineringen af mængden af 2,5-diketo-D-glu-

DK 161106 B

28 consyre i kulturen overvågedes, til opnåelse af en koncentration på ca.

0,2% umiddelbart efter hver tilsætning.

Tilsætningen af substratopløsningen afsluttedes ved den 45. time, men dyrkningen fortsattes i yderligere 3 timer, hvilket gav en samlet 5 dyrkningstid fra tilsætningens begyndelse på 48 timer.

Der toges aseptiske prøver af fermenteringssubstratet med forud bestemte mellemrum til at analysere for 2,5-diketo-D-gluconsyre og 2-keto-L-gulonsyre, og levedygtige celler i prøverne taltes (måling (3)).

Resultaterne af analysen og målingerne er sammenfattet i tabel 10.

c DK 161106 B

c c O Ί—

-I- S- P -P -P

p φ 00 C/l l/l tO %. -r- -i- ·£- 00 P > > >

·Γ“ fmm KØ *flj WO

1-- CL O- Q.

P -i— op tt_ m s- cnajf^oroo) fH s_ φ Ό i- -X - -X - 4_) p φ o -x co -X oo .x CT 00 CO > r-l ·!- r-H -r- CM -Ι Ε: -O •i- 3 i— 00 "O 00

C O) -P

rt c OO 00

jC -r C *i— CO

φ S_ -I— > O O

ι-l Cl) ,— c/J tO <H I—I

P ΌΟ O.

"O C C CO X X

φ (O 03 dl (O OO

U ε J=T3 - .X - cr> ~ CM

•I- S- d) CL) O -X 00 ** OO »>

£_ φ CO ε t—i ·Γ- Γ—i CO CM CM

QJ 0j_

P

.X O

CO X3 m o LO p ^ CM CD CO LO f'' I— o o o

-ς} f-1 r—I i—I

<S X X _ X

J= CM 00 00 QJ λ OJ « CO O i-l

JQ o - 'Ll· - LO

ZD 1-4 00 —11 CM T-\ CO

Μ— M— «*- (0 to to i— S- -—> .*-«· i- '—' S- Ε φ 1— I— O) I— I— <D i—

\i— E Ei— E Ei— E

Oli— \ — X Xr- X

E d> S- 03 QJ i- Ol 0J S- —ό ω ε u οι ε o a> i— -—r— ·**' <— p φ i— Φ i— QJ i—

0J Dldl P Ol® P OlO

S_ -Γ- CJ 0J V- CJ 0) "I- u φ p —' S- P ^ S- P —' 3 Ol 01 Ol dl Ol o >>—s O >,—» o >>— o Ό I—I 3 Ό I—· 3 Ό i—i

S- φ i—I Od)·—i Ό 0)H

CL > i—i O > i—* O > I—I

O Φ — S- QJ--- S- d> —' d) 1—4 ·>!— CL I CLl * Φ d> 0) >>

_ 44 1 g r> I g l' I E CO

φ O ro E C3«E C3C0E C

o i p id 1 P cO P P rt O 0) co iC CP ϋ CP ^ CP o s- 1__ (Vl< W ΛΙ< « CM< III 3>Ϊ

i— W

Ol c o

Ol “ 3 ~ _ O Ol o .c -P? *

w ^ dJ P

d)Q ^ 1 tdinp ‘JZ 5

t— CM <0 T3P

Φ S- 1 QJ

-o op p m jji c to <a ‘ oi c o Φ Φ C/l O Dl« _ „

•<0 C σι "M" CO

CL-1- C CO CM Tf s__5 XI i«i <jj d) æ qj gd S™ Φ -Γ- Φ

P E

os- * i-OP dJ „ ΐ I— (BP * *

o LO O LO

lo 1-4 I—I CM CM

DK 161106 B

30 (3) Tælling af antallet af levedygtige celler af stamme (III)

Prøver på fermenteringssubstratet fortyndedes med steriliseret fysiologisk saltvand og fordeltes over et glycerin-bouillon-agar-medium, som derefter inkuberedes ved 28°C i 24-36 timer. De levedygtige celler 5 på mediet taltes som kolonier.

Bemærk: Da stammens (III) væksthastighed er meget højere end mutantens (II), kan celler af stamme (III), der er sammenblandet med celler af mutant (II), tælles separat uden væsentlige vanskeligheder.

Ud fra resultaterne af de ovenfor beskrevne forsøg kan følgende 10 fakta bekræftes: (1) Af de forskellige overfladeaktive midler, der er blevet foreslået og bedømt som baktericide midler for stamme (III) i 2,5-diketo-D-gluconsyre fermenteringssubstratet, er SDS (natriumdodecylsul fat) det mest fremragende hvad angår baktericid virkning (se tabel 9).

15 (2) Resultaterne (se tabel 10) af forsøgene til fremstilling af 2- keto-L-gulonsyre, hvori der anvendes de tre slags substratopløsninger, der er fremstillet under de ovenfor anførte betingelser: i) i et fermenteringsforsøg, hvor den ubehandlede substratopløsning anvendtes, nåede antallet af levedygtige celler af stamme 5 7 20 (III) op på 10 - 10 celler/ml inden for 24 timer efter påbegyndelsen af tilsætningen af substratopløsningen, mens akkumuleringen af 2-keto-L-gulonsyre næsten ikke forøgedes efter 24 timer i sammenligning med de andre to forsøg, ii) i et fermenteringsforsøg, hvor den SDS-behandlede sub-25 stratopløsning tilsattes, kontrol!eredes forøgelsen i antallet af leve- 4 dygtige celler af stamme (III) effektivt til mindre end 10 celler/ml endda efter 48 timer fra begyndelsen af tilsætningen af substratopløsningen, og akkumuleringen af 2-keto-L-gulonsyre nåede op på ca. 27 mg/ml, 30 iii) akkumulering af 2-keto-L-gulonsyre i ii) ovenfor er ækvi valent med akkumuleringen i et fermenteringsforsøg, hvor der anvendtes den ved filtrering steriliserede substratopløsning, og iv) i det sidstnævnte fermenteringsforsøg, hvor der tilsættes en ved filtrering steriliseret substratopløsning, påvistes selvfølgelig 35 ingen levedygtige celler af stamme (III), og fremstillingen af 2-keto-L-gulonsyre forløb uden vanskelighed.

Claims (18)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre ud fra 2.5- diketo-D-gluconsyre i nærværelse af en levende eller forarbejdet mi-5 kroorganisme, der er i stand til at producere 2-keto-L-gulonsyre ud fra 2.5- diketo-D-gluconsyre, og som tilhører slægten Corynebacterium, KENDETEGNET ved, at der som mikroorganisme anvendes en mutant, der (1) i det væsentlige mangler evne til at metabolisere 5-keto-D-gluconsyre og (2) i det væsentlige er ude af stand til at fremstille 2-keto-D-gluconsyre. 10

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at mutanten er Corynebacterium sp. FERM-BP 107.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at mutanten er 15 Corynebacterium sp. FERM-BP 108.

4. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af de foregående krav, KENDETEGNET ved, at mutanten dyrkes i et vandigt næringsmedium, hvortil der sættes 2,5-diketo-D-gluconsyre. 20

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, KENDETEGNET ved, at 2,5-diketo-D-gluconsyren tilsættes i form af et fermenteringssubstrat, som er fremstillet ved dyrkning af en 2,5-diketo-D-gluconsyreproducerende mikroorganisme tilhørende slægten GIuconobacter eller Erwinia i et næringsme- 25 dium indeholdende D-glukose.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, KENDETEGNET ved, at der som 2,5-diketo-D-gluconsyreproducerende mikroorganisme er anvendt Acetomonas al-bosesamea ATCC 21998, GIuconobacter melanogenum IFO 3293, GIuconobacter 30 rubisinosus IFO 3244, Erwinia citreus ATCC 31623, Erwinia punctata ATCC 31626, Erwinia punctata var. ATCC 31624, Erwinia punctata var. ATCC 31625, Erwinia punctata var. ATCC 31627, Erwinia terreus ATCC 31628, Erwinia terreus var. ATCC 31629, Erwinia terreus var. ATCC 31630 eller Erwinia terreus var. ATCC 31631. 35

7. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af de foregående krav, KENDETEGNET ved, at dyrkningen af mutanten og omdannelsen af 2,5-diketo-D-gluconsyre til 2-keto-L-gulonsyre gennemføres i nærværelse af et ni-

32 DK 161106 B tratsalt eller en hydrogendonor.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, KENDETEGNET ved, at nitratsaltet er af et alkalimetal eller et jordal kalimetal. 5

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, KENDETEGNET ved, at nitratsaltet er natriumnitrat eller kaliumnitrat.

10 NET ved, at koncentrationen af nitratsaltet er 0,05 - 0,5 vægt/vol-%.

10. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 7-9, KENDETEG-

11. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 7-10, KENDETEGNET ved, at hydrogendonoren er udvalgt blandt carbohydrater og polyhy-droxyalkohol er. 15

12. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 7-11, KENDETEGNET ved, at hydrogendonoren er udvalgt blandt glycerin, glukose, fruktose, saccharose og melasse.

13. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 7-12, KENDETEG NET ved, at hydrogendonoren er til stede i en mængde på 5-50% af 2,5-di-keto-D-gluconsyren.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 5 eller 6, KENDETEGNET ved, at 2,5- 25 diketo-D-gluconsyrefermenteringssubstratet er steriliseret med et overfladeaktivt middel før tilsætningen.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, KENDETEGNET ved, at der som overfladeaktivt middel er anvendt natriumdodecylsul fat (SDS). 30

16. Fremgangsmåde ifølge krav 15, KENDETEGNET ved, at SDS er anvendt i en koncentration på 0,01 - 0,25 vægt/vol-%.

17. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at mikroorganis- 35 men anvendes i form af en cellesuspension.

18. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at mikroorganismen anvendes i form af en celleekstrakt.