JPS6041596B2 - 2,5−ジケト−d−グルコン酸の製造方法 - Google Patents

2,5−ジケト−d−グルコン酸の製造方法

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JPS6041596B2
JPS6041596B2 JP55112406A JP11240680A JPS6041596B2 JP S6041596 B2 JPS6041596 B2 JP S6041596B2 JP 55112406 A JP55112406 A JP 55112406A JP 11240680 A JP11240680 A JP 11240680A JP S6041596 B2 JPS6041596 B2 JP S6041596B2
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shs
erwinia
diketo
glucose
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滋雄 八木
文次 蔭山
正弘 谷本
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Shionogi and Co Ltd
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Shionogi and Co Ltd
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    • C12P7/40Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
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    • C12P7/602-Ketogulonic acid
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物学的方法による2・5−ジケトーD−グ
ルコン酸の新規な製造方法に係る。
2・5−ジケトーD−グルコン酸はアスコルビン酸製造
のための中間体として有用である。
すなわち、2・5−ジケトーD−グルコン酸はアスコル
ビン酸の前駆物質である2−ケトーL−グロン酸に選択
的に還元することができるからである。(たとえば特公
昭47−38193号、特開昭54−145283号公
報参照)これまで、2.5−ジケトーD−グルコン酸は
主として、アセトバクター、アセトモナスおよびグルコ
ノバクター属に属する好気性菌株によるグルコースの選
択的酸化によつて製造されて来た;が、エルウイニア属
に属する菌株によつて製造された例は報告されていない
本発明者らは後述のように、土壌および各種の果実から
分離した下記エルウイニア属菌株が本発明の目的に添う
D−グルコースから2・5−ジケトーD−グルコン酸へ
の選択的酸化を遂行することを発見し、本発明を完成し
た。
本発明方法においては、エルウイニア属に属し、D−グ
ルコースを選択的に酸化して2・5−ジケトーD−グル
コン酸に変換する能力を有するすべての菌株を使用しう
る。
そのうち本発明者らが新たに分離した新種を次頁の第一
表に列挙する。列挙されたものはすべてこの3新種に属
しこれらの変種を構成するものとする。
また、これらの菌株の分類学的諸性質を第二表に記述す
る。
なお、本明細書を通じSHSとは発明者等の整理上の記
号であり、ShionogiSei2obuを表わし、
FERM−Pは微工研菌寄託番号を表わす。
ATCCはアメリカン・タイプ、カルチユア・コレクシ
ョン寄託番号を、それぞれ表わす。なお、第一表に記載
の各菌株は、第二表に示した各菌株の分類学的諸性質を
バージイズ・マニュアル・オブ・デタミナテイブ・バク
テリオロジイ第8版(Bergey′SManualO
fDeternllnativeBacteriOlO
gy8thEdll974、以下単にマニュアルと記載
する)の記載と対比することによりそれぞれ同定した。
(1)科の同定: 上記全菌株がいずれもグラム陰性、通性嫌気性の短桿菌
であり、胞子を形成せず、オキシダーゼ陰性でカタラー
ゼ陽性であるところからエンテロバクテリア科(Ent
erObacteriaceae)と同定される。
(2)属の同定: β−メチルグルコシドおよびスクロースより生酸し(但
し、SHS−200?のみは例外的にスクロースより生
酸しない、しかしスクロースを単一炭素源として利用で
きる。
)、アドニトール、ズルシトール、メレチトースから生
酸しないこと;安息香酸、蓚酸、プロピオン酸を利用;
できないこと;澱粉を加水分解しないこと;グルタミン
酸、アルギニン、リジンおよびオルニチンからの脱炭酸
反応が陰性であること(但し、SHS−2004、20
0飄2006および200n朱はグルタミン酸を脱炭酸
する);およびウレアーゼ4およびリパーゼを生成しな
いことから、エルウイニア属(GenusErwini
a)と同定される。(3)種の同定:SHS−200淋 本菌株は鞭毛を有しないことからハービコラ.群(Gr
OupharbicOla)中のエルウイニア●ステユ
ーワーテイ(Erwiniastewartii)に近
縁とみなされるが次の点でその性質を異にしている。
(1)SHS−20B株は生育にニコチン酸または二.
コチンアミドを要求する、(Ii)システインから硫化
水素を生成する、(Iii)硝酸塩還元能を有する、(
Iv)スクロース※、アラビノース、ラフィノース、お
よびソルビトールから生酸しない、(v)サリシン、セ
ロビオース、およびグリセロールから生酸する、(Vi
)酒石炭を単一炭素源として利用できない、マニュアル
中には他に該当する菌種を見出せないことから、本菌体
は新種を構成するものと判定し、エルウイニア・シトレ
ウス(ErwiniaCitreL]S)と命名した。
(※ スクロースから生酸はしないが単一炭素源として
利用する。)SHS−2004、2005.2006お
よび2007株これらの菌株も鞭毛を有せず、エルウイ
ニア・スチユワーテイに近縁の菌株とみなしうるが、エ
ルウイニア・スチユワーテイに属する菌とは共通して次
の性質を異にする。
(1)生育にニコチン酸またはニコチンアミドを要求す
る、(Ii)システインから硫化水素を生成する、(I
ii)硝酸塩還元能を有する、(Iv)グルタミン酸脱
酸反応が陽性である、(V)アラビノース、マンニトー
ル、ラクトースおよびソルビトールから生酸しない、(
Vi)サリシンおよびセロビオースから生酸する、(財
)酒石酸を単一炭素源として利用出来ない、また、これ
らの菌株は前記SHS−2003とはグルタミン酸を脱
炭酸する点、マンニトール、乳糖から生酸しない点、乳
糖、酢酸及び乳酸を単一炭素源としてほとんど利用しな
い点、ならびにリトマスミルクに対してほとんど作用し
ない点において相違している。
マニュアル中には本菌株群を配すべき種を見出すことが
できないので、これらの菌株群は一新種を構成するもの
とみなし、エルウイニア・プンクタータ(Erwini
apunctata)と命名した。これらのうちSHS
−2004とSHS−2006とは、(1)ラフィノー
スからも生酸しない、また(Ii)マンニトール、酢酸
および乳酸を単一炭素源としてほとんど利用できない、
点において共通するが、SHS−2004はSHS一2
006と対比して、(1)グルコースからアセトインを
生成する、(Ii)硝酸塩を窒素源として利用できる、
(Ii)グリセロールから生酸する、また(Iv)ギ酸
を単一炭素源として利用する、点において相違を認める
一方SHS−2005もマンニトール、酢酸および乳酸
を単一炭素源としてほとんど利用できない点でSHS−
2006と共通するが、(1)グリセロールからも生酸
する、 (Ii)グルコースからアセトインを生成する、(Ii
i)キング(King)B培地で蛍光色素を生成する、
(Iv)ラフィノースからも僅かに生酸する、また(v
)ギ酸を単一炭素源として利用する、点において相違を
認める。
さらにSHS−2007も同様にマンニトール、酢酸お
よび乳酸を単一単素源としてほとんど利用できない点に
おいてSHS−2006と共通するが、(1)ラフィノ
ースからも生酸する、(Ii)グルコースからアセトイ
ンを生成する、(1i0ギ酸を単一炭素源として利用で
きる、また(Iv)生育温度が4.0〜47.5℃と幅
が広い、点において相違を認める。
上記により、これらの菌株群SHS−2004、SHS
−2005、SHS−2006およびSHS−2007
は、それぞれ上記エルウイニア・プンクタータに属し、
互にその変種を構成する。
SHS−2008およびSHS−2010:これらの菌
株は側鞭毛を有しエルウイニア・トラヘイフイラ(Er
winiatracheiphila)またはエルウイ
ニア●クエルシナ(E.quercina)に近縁とみ
なされるが、これらの性質をマニュアルに記載のエルウ
イニア・トラヘイフイラの性質と対比すると次の点で相
違している。
(1)SHS−2008およびSHS−2010は36
℃以上でも生育する、(Ii)肉汁寒天培地での生育が
良好である、(Iii)粘液状の生育(MucOidg
rOwth)をする、(1v)硝酸還元能を有する、(
v)サリシン、キシロース、メリビオースおよびマンノ
ースから生酸する、(Vi)乳酸を単一炭素源として利
用できる、またエルウイニア・クエルシナの性質と対比
しても次の点で異つている。
(1)グルコン酸の酸化能を有する、 (1i)硝酸の還元能を有する、 (Iii)メリビオース、セロビオースから生酸する、
(Iv)マンニトール、α−メチルグルコシド、エスク
リンおよびソルビトールから生酸しない、 (v)グルコース・ペプトン培地からガスを生成しない
マニュアル中にはこれらの菌株を配すべき種を見出すこ
とができないので新種を構成するものとみなし、エルウ
イニア テリウス(Erwiniaterreus)と
命名した。
なお、SHS−201吋はSHS−200洲朱と対比し
て(1)グリセロールから生酸しない、 (Ii)SHS−2008がリボースから生酸するのに
対しSHS−2010は僅かしか生酸しない。
(Iii)メチル・レッド・テストが微弱陽性である、
また、 (Iv)キングB培地で蛍光色素を生成する、点で相違
が認められるが他の性質においてはほS゛一致する。
SHS−2009: 本菌株は側鞭毛を有しエルウイニア・トラヘイフイラ、
エルウイニア●クエルシナ、またはエルウイニア●ハー
ビコラ●バリアント●ハービコラ(E.herbicO
lavar.harbicOla)に近縁とみなされる
本菌株の性質をマニュアルに記載のエルウイニア・トラ
ヘイフイラの性質と対比すると、(1)SHS−200
9は肉汁寒天培地での生育が良好、(Ii)36℃以上
でも生育する、 (Iii)粘液状の生育をする、 (Iv)硝酸還元能を有する、また (v)サリシン、キシロース、メリビオース、セロビオ
ース、グリセロールおよびマンノースから生酸する、点
において顕著な相違が認められる。
さらにエルウイニア●クエルシナの性質と比較すると、
(1)グルコン酸を酸化できる、(Ii)硝酸塩還元能
を有する、 (IOグルコースからのアセトインの生成力が弱い、(
Iv)キシロース、メリビオースおよびセロビオースか
ら生酸する、(■)マンニトール、α−メチルグルコシ
ド、工スクリン、リボースおよびソルビトールから生酸
しない、(Vi)酒石酸を単一炭素源として利用できな
い、また、(Vii)グルコース・ペプトン培地からガ
スを生成しない、点において顕著な相違が認められる。
さらにエルウイニア●ハービコラ●バリアント・ハービ
コラの性質と比較すると、(1)生育にニコチン酸また
はニコチンアミドを要求する、(Ii)グルコースから
のアセトインの生成力が弱い、(11i)ゼラチンの液
化能がない、(Iv)メリビオース、セロビオースおよ
びグリセロールから生成する、また(v)アラビノース
、マンニトール、マルトース、デキストリン、ラムノー
ス、リボースおよびソルビトールから生酸しない、点に
おいて顕著な相違が認められる。
一方、本菌株を前記SHS−20B株と対比すると、(
1)グルコースからのアセトインの生成力が弱い、また
(Ii) リボースから生酸しない、 点における相違が認められるが他の諸性質においてほS
゛一致しているので、本菌株も上記エルウイニア・テリ
ウスに属し、その一変種を構成する。
SHS−2011: 本菌株は側鞭毛を有しエルウイニア・トラヘイフイラま
たはエルウイニア・アミロボラ(E.amylOvOr
a)に近縁とみなされる。
本菌株の性質をマニュアルに記載のエルウイニア・トラ
ヘイフイラの性質と対比すると、(1)SHS−201
1は肉汁寒点培地での生育が中等度、(Ii)36℃以
上でも生育する、 (Iii)粘液状の生育をする、 (Iv)硝酸塩還元能を有する、 (v)サリシン、キシロース、メリビオース、セロビオ
ースおよびマンノースから生酸する、また、(vl)乳
酸を単一炭素源として利用できる、点において顕著な相
違が認められる。
さらにエルウイニア・アミロボラの性質と対比すると、
(1)システインから硫化水素を生成する、(Ii)3
6℃以上でも生育する、(Iii)硝酸塩還元能を有す
る、 (Iv)ゼラチン液化能がない、 (v)サリシン、キシロース、メリビオース、セロビオ
ースおよびマンノースから生酸する、また、(Vi)
リボースから生酸しない、 点において顕著な相違を有する。
一方、本菌株を前記SHS−200?と対比すると、リ
ボースおよびグリセロールから生酸しない、点に相違が
認められるが、他の諸性質においてほS゛一致している
ので、本菌株は上記エルウイニア◆テリウスの一変種を
構成する。
さらに、これらの分離株の自然変異株も2・5ージケト
ーD−グルコン酸産生能を有する限り使用しうるもので
あり、これらの分離株を所望に応じ、人工的に誘導して
得た変異菌株も、分離株と同様に、本発明の円滑な実施
に対し適応(馴致)させて用いることができることは勿
論である。
上記菌株はいずれもD−グルコースは主炭素源とし窒素
源としてのコーン・ステイープ・リツカーおよび少量の
無機塩類を含む培地中でよく生育する。
好気的に醗酵させるときは、従来使用されていた菌株に
比し、きわめて高いD−グルコース仕込み濃度で安定に
醗酵し2・5ージケトーD−グルコン酸を好収率で産生
する。培地中のD−グルコース濃度は、とくに望むなら
ば40WIV%もの高濃度とすることができるが、通常
15〜25W1V%好ましくは、ほぼ20WIV%程度
の濃度が2・5ージケトーD−グルコン酸の経済的な生
産にとつて都合がよい。発酵温度は15〜35℃、好ま
しくは20〜30℃、最も好ましくは約28℃が良い。
培地の初期PHは5.5から7.5の範囲、好ましくは
PH6.O〜7.0の範囲にあることがよい。またこの
PH値は当初より緩衝用の無機塩類を添加しておくか、
発酵途中に塩基類を投入することによつて所望の値PH
4.O〜5.5に維持する。塩および塩基の例は炭酸カ
ルシウムまたは水酸化ナトリウムである。また、接種後
の培地は、攪拌機(約1750r′.P.m.)によつ
て攪拌し、約60ひRt/分の割合で通気する。発酵は
2・5ージケトーD−グルコン酸の収.率が約90%(
D−グルコース基準)となるまで行なう。
所要時間は約17〜31時間である。また本発酵終了液
は、要すればPH調整その他の処理を経たのち、2・5
ージケトーD−グルコン酸またはその塩の結晶が得られ
るが、これlを分離することなく、そのまま次段用発酵
液として利用できる。たとえば2−ケトーL−グロン酸
の製造への直接利用が可能であり、従来法に比較して収
率良く目的を達成することが出来る。
1上記発酵工程に使用す
る菌株は通常の菌体の他にたとえば休止菌、または固定
化菌体、または菌体破砕物もしくはその処理物(たとえ
ば産生酵素)であつてもよい。以下実施例によつて本発
明をより詳細に説明す2る。
実施例1 (1)種培地 D−グルコース(含水、含量91%、以下同じ)
1.0%2コーン・ス
テイープ・リツカー(CSL)5.0%りん酸二水素カ
リウム(KH2PO4) 0.1%硫酸マグネシウム
(MgSO4・7H20) 0.02%炭酸カルシウム
(CaCO3) 0.5%を含む水溶液を、
PH値(10%NaOHにより調3節)
6.8〜7.0に調整し、500m1三
角フラスコ(滅菌)に50m1宛分注して種培地とする
(2)種培養 3上記
フラスコに第三表に示した各菌株を一白金耳ずつ植菌し
、28℃に保ちながら約8−11時間振盪培養(振巾7
1wm1回転数270r′.P.m.)した。
光学濃度(0D)が約8となる時をもつて種培養の終点
とした。 ノ3)発酵培地3D−
グルコース 20%CSL3%K
H2PO4O.l% CaCO36.3% を含む水溶液を上記と同様にPH調節、1′発酵槽に4
55m1宛分注し、上記種培養液45m1をそれぞれに
加えた。
4)本培養 温度 28、C 攪拌 1740r″.P.m. 通気 600Nm1/分 時 間 17〜31時間5)下記
要目による上昇法ベーパー・クロマトグラフィーで分離
し、デンシトメトリーにより定量した。
(1)担体:東洋淵紙NO.5O (Ii)展開溶媒: フエノールニ蟻酸:水=75:4:25(Iii)発
色: AHF溶液(アニリン0.93yとフタール酸1.66
ダを水飽和n−ブタノール100m1に溶解したもの)
噴霧、105℃で2分間処理して発色させる。
(Iv)色調およびRf値: 2・5ージケトーD−グルコン酸:褐色 0.16−0.182
−ケトーD−グルコン酸:ピンク色
0.27−0.29D−グルコースニ褐色
0.48−0.50このほか、担体としてRT
LCアルミシートセルローズJ(メルク商品名)を用い
上記した展開溶媒および発色法による薄層クロマトグラ
フィーを併用した。
この場合定量は標準試料との比較によつた。:)終了点
: 本培養は上記薄層クロマトグラフにおいて2−ケトーD
−グルコン酸のピング色のスポットが消失する時点を以
て終了点とした。
り 結果: 実施例2および3 (菌体懸濁液および粗酵素抽出液による生産)(1)菌
体採取用培地D−グルコース 2
.0%2・ポリペプトン(大五栄養薬品製) 0.
2%酵母工キズ(大五栄養薬品製) 0.1%K
H2PO4O.l%MgSO4・7H200.02% CacO3O.6%2 を含む水溶液のPH値を7.0に調整し、500m1三
角フラスコに80m1宛分注した。
(2)培養・集菌、粗酵素分離 上記培地に実施例1の種培養と同様に植菌し、28℃に
保ちながら16時間振とう培養3.(270!″.P.
m.振巾717Tfm)した。
培養終了後、菌体を遠心分離して集め、生理食塩水にて
2度洗浄した。このうち一部を生理食塩水中の懸濁液と
し、一部は1150モルートリ*スー塩酸緩衝液(PH
7.5)に懸濁させ、超音波処理して菌体を破砕し、遠
心分離により不溶性残渣を除去し、上澄液を粗酵素液と
した。上記懸濁液および粗酵素液とD−グルコースとの
接触反応とその結果を次に示す。
()菌体懸濁液との接触 反応液は、1110モルー3・3−ジメチルグルタール
酸緩衝液(PH5.O)中で、グルコース濃度が5wI
v%、菌体濃度が6607T1,μにおける0Dで測定
して約10となるように調製した。
この反応液を2377!77!(直径)×196順(長
さ)の試験管に10ntずつ分注したのち、28℃で3
時間振とう反応させた。遠心分離後の上澄液をベーパー
・クロマトグラフィにて分析し、次の第四表に総括した
結果を得た。
(振とう開始前のグルコース濃度も示す) −
ー −ー −ーー ?一ーーーーーーーL−?−j−
ーーー(4)粗酵素液との接触反応液は、1110モル
ー3・3−ジメチルグルタール酸緩衝液中でグルコース
濃度が5wIv%粗酵素濃度がタンパク量〔フォーリン
(FOlln)法にて測定〕として0.25m91m1
となる庫ようにi製した。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 1 エルウイニア(Erwinia)属に属し、2・5
    −ジケト−D−グルコン酸生産能を有する菌体またはそ
    の菌体の菌体処理物とD−グルコースとを接触させるこ
    とを特徴とする2・5−ジケト−D−グルコン酸の製造
    方法。
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