DK161152B - Polypeptid med egenskaber som human beta-nervevaekstfaktor og fremgangsmaade til fremstilling deraf, dna-isolat omfattende en sekvens som koder for polypeptidet, replicerbar udtrykkelsesvektor for dna-sekvensen, rekombinant vaertscelle transformeret med vektoren, farmaceutisk praeparat indeholdende polypeptidet og fremg. der omfatter anvendelsen af polypeptidet til fremst. af et farmaceutisk praeparat - Google Patents

Description

DK 161152 B

Opfindelsen angår et polypeptid med egenskaber som human P-nervevækst faktor (β-NGF) og en fremgangsmåde til fremstilling deraf, et DNA-isolat omfattende en sekvens, som koder for polypeptidet, en replicerbar udtrykkelses-5 vektor for DNA-sekvensen, en rekombinant værtscelle transformeret med udtrykkelsesvektoren, et farmaceutisk præparat indeholdende polypeptidet og en fremgangsmåde, der omfatter anvendelsen af polypeptidet til fremstilling af et farmaceutisk præparat.

10 Opfindelsens baggrund A. Nervevækstfaktor

Et multikomponent-protein med molekylvægt ca. 130 000 er blevet isoleret fra musespytkirtler, idet det er særligt koncentreret i kirtlerne hos hanmus, og betegnes 15 almindeligvis som "nervevækstfaktor". Den neurale hovedak tivitet, som udøves af proteinet, har været dets evne til at frembringe en forøgelse i størrelsen af sensoriske neuroner, nerveceller, som transmitterer impulser fra sensoriske receptorer til hjernen, og i størrelsen af 20 sympatetiske neuroner, en af de to slags neuroner, som udgør det autonome nervesystem, der regulerer den funktionelle af aktivitet af kredsløbssystemet, kirtlerne, glatte muskler og andre organer.

NGF opnået ved ekstraktion ved neutral pH-værdi fra 25 musespytkirtler er kendt som 7S-NGF og er sammensat af tre underenheder betegnet a-, β- og i-underenheder.

Hele den neurale aktivitet hos 7S-NGF udøves af β-under-enheden, en dimer af to identiske peptider på 118 aminosyrer, bundet sammen af ikke-kovalente kræfter. Denne 30 underenhed betegnes også som 2,5S-NGF. a-underenheden har ingen kendt biologisk aktivitet, l^-underenheden er imidlertid en argininesteropeptidase. Det første

DK 161152 B

2 genetiské produkt ved syntesen af NGF er et præpro-NGF-po-lypeptid, som spaltes af 'C-underenheden . ^-underenheden har også vist sig at fremskynde sårheling hos mus.

For nylig er en tredie NGF-komponent (molekylvægt ca.

5 116 000) blevet rapporteret at være isoleret fra muse- spytkirtler og at være påvist at udøve aktivitet som plasminogenaktivator, dvs. den omdanner plasminogen til plasmin, hvilket antyder dens nyttighed til lyse af blodpropper; se EP offentliggørelsesskrift nr.

10 2139 Al, offentliggjort den 30. maj 1979.

Som anført ovenfor udøves den neurale aktivitet hos NGF af β-underenheden (i det følgende betegnet β-NGF).

Den er blevet påvist i betydelig grad at stimulere regenerativ gendannelse af overskårne axoner i centrale 15 adrenergiske neuroner, en egenskab, som gør den nyttig til reparation af beskadigede axoner.

B. Rekombinant-DNA-teknologi

Rekombinant-DNA-teknologi har nået nogen forfinelse. Molekylærbiologer er i stand til at rekombinere forskel-20 lige DNA-sekvenser med nogen lethed og skabe nye DNA-en- heder, som er i stand til at producere rigelige mængder af et exogent proteinprodukt i transformerede mikroorganismer og cellekulturer. De almene midler og. m.e_tader er forhånden til in vitro ligering af forskellige stump-25 endede eller kohæsivt endede fragmenter af DNA til frem bringelse af kraftige udtrykkelsesvektorer, som er nyttige til transformation af bestemte organismer, hvorved deres effektive syntese rettes mod det ønskede exogene produkt. Imidlertid forbliver proceduren for det enkelte produkt 30 meget omfattende, og videnskaben er endnu ikke skredet frem til et stadium, hvor der kan foretages regulære forudsigelser af succes. Faktisk løber de, som påråber

DK 161152 B

3 sig heldige resultater uden det underliggende forsøgs-grundlag en betydelig risiko for manglende funktionsdygtighed af metoden.

DNA-rekomb.inering af de nødvendige elementer, dvs. et 5 replicer ingsorigin, en eller flere fænotypiske selek tionsegenskaber, en udtrykkelsespromotor, en heterolog genindsætning og resten af vektoren, gennemføres almindeligvis uden for værtscellen. Den resulterende rekombinante replicerbare udtrykkelsesvektor eller plasmidet indføres 10 i celler ved transformation, og store mængder af det rekombinante medium opnås ved dyrkning af transformanten.

Hvor genet er rigtigt indsat med hensyn til dele, som styrer transcript ionen og translationen af det indkodede DNA-budskab, er den resulterende udtrykkelsesvektor 15 nyttig til at producere den polypeptidsekvens, for hvilken det indsatte gen koder, en proces, der betegnes "udtryk-kelse". Det resulterende produkt, kan, om nødvendigt, opnås ved lyse af værtscellen og udvinding af produktet ved passende rensninger fra andre proteiner.

20 I praksis kan anvendelsen af rekombinant-DNA-teknologi udtrykke helt heterologe polypeptider, såkaldt direkte udtrykkelse, eller den kan alternativt udtrykke et heterologt polypeptid knyttet til en del af aminosyresekven-sen af et homologt polypeptid. I de sidstnævnte tilfælde 25 gøres det ønskede bioaktive produkt sommetider bio in aktivt i det sammenknyttede, homologe/heterologe polypeptid, indtil det spaltes i et ekstracellulært miljø.

På lignende måde er området celle- eller vævskulturer til studium af genetik og cellefysiologi veletableret.

30 Der rådes over midler og metoder til opretholdelse af permanente cellelinier fremstillet ved successive rækkeoverførsler fra isolerede normale celler. Til anvendelse inden for forskning opretholdes sådanne cellelinier

DK 161152B

4 og en fast bærer i flydende medium eller ved vækst i suspensionen indeholdende understøttende næringsstoffer. Opscallering til præparationer i stor målestok synes kun at frembyde mekaniske problemer.

5 På lignende måde er proteinbiokemien et nyttigt, faktisk nødvendigt, tilbehør til bioteknologien. Celler, som producerer det ønskede protein, producerer, også hundreder af andre proteiner, endogene produkter af cellens metabolisme. Hvis disse forurenende proteiner såvel som 10 andre forbindelser ikke fjernes fra det ønskede protein, kunne det vise sig toxisk, hvis det indgives· et dyr eller menneske under forløbet af terapeutisk behandling med det ønskede protein. Derfor kommer proteinbiokemiens teknikker i forgrunden, idet de tillader udformningen 15 af adskillelsesprocedurer, som er egnede for det bestemte betragtede system og tilvejebringer et homogent produkt, som er sikkert til den påtænkte anvendelse. Proteinbiokemien beviser også identiteten af det ønskede produkt, idet den karakteriserer det og sikrer, at cellerne har 20 produceret det pålideligt uden nogen ændringer eller mutationer. Denne gren af videnskaben er også involve- ! ret i udformningen af bioprøvninger, stabilitetsundersøgelser og andre procedurer, som er nødvendige, før heldige kliniske undersøgelser og markedsføring kan 25 finde sted.

Sammenfatning af opfiridélsen

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer β-underenheden af human NGF, som ikke tidligere er blevet isoleret ved ekstraktionsteknik eller på anden måde syntetiseret, 30 i hovedsageligt ren form. Endvidere har det uventet vist sig, at β-NGF kan udtrykkes som et heterologt protein i E. coli som et modent polypeptid, dvs. frit for ethvert tilknyttet homologt protein, som måtte være nødvendigt

DK 161152 B

5 for at give det beskyttelse mod cellulære enzymer, der genkender det som et fremmed protein. Det antages, at p-underenheden af NGF er det mindste protein, som direkte udtrykkes som modent protein i E. coli.

5 Polypeptidet ifølge opfindelsen har den i krav 1 angivne aminosyresekvens og har egenskaber som human p-nervevækst-faktor (P-NGF).

Den ifølge opfindelsen tilvejebragte p-NGF er nyttig til behandling af nervebeskadigelse eller til andre 10 beslægtede formål, til hvilke den er gavnlig. Da den er identisk med naturlig secerneret human P-NGF, men fri for andet protein af pattedyroprindelse, er det usandsynligt, at dens anvendelse vil resultere i en immunogen reaktion under behandling med den, til forskel 15 fra hvad der er tilfældet, når peptidhormoner af ikke- human oprindelse anvendes til at behandle human sygdom.

Da den endvidere opnås som et heterologt protein vil denne P-NGF være i hovedsagen fri for andre proteiner af pattedyroprindelse, som ledsager P-NGF opnået fra 20 vævsekstrakt, og som kan udøve uønsket biologisk aktivitet i præparater, som indeholder dem.

Opfindelsen tilvejebringer også et DNA-isolat omfattende en sekvens, som koder for polypeptidet ifølge opfindelsen, en replicerbar udtrykkelsesvektor omfattende 25 en sådan DNA-sekvens til udtrykkelse i en egnet værts celle transformeret med vektoren og en rekombinant værtscelle transformeret med en sådan udtrykkelsesvektor, så den er i stand til at producere polypeptidet ifølge opfindelsen ved udtrykkelse af den nævnte kodesekvens.

30 Endvidere tilvejebringer opfindelsen en fremgangsmåde, der omfatter udtrykkelse i en rekombinant værtscelle af DNA, som koder for polypeptidet ifølge opfindelsen,

DK 161152 B

6 og udvinding af polypeptidet fra værtscellekulturen, og en fremgangsmåde der, efter fremstillingen af polypeptidet ved den ovennævnte fremgangsmåde, omfatter anvendelsen af polypeptidet til fremstilling af et far-5 maceutisk præparat.

Endelig tilvejebringer opfindelsen et farmaceutisk præparat, der indeholder et polypeptid ifølge opfindelsen, som er frit for forurenende proteiner af human oprindelse, og især er egnet til parenteral indgivning.

10 Opfindelsen skal i det følgende fork.lare_s nærmere under henvisning til tegningerne, på hvilke fig. 1 viser aminosyresekvensen af β-underenheden af muse-NGF og'gensekvenser, der koder for den, samt de komplementære DNA-strenge for specifikke segmenter af 15 genet; fig. 2 viser en "Northern Blot" analyse af kloner indeholdende segmenter af β-NGF-mRNA; fig. 3 er et delvis restriktionskort af muse-NGF-genet og den tilnærmede, korrespondance mellem nucleotidsekven-20 serne af plasmider konstrueret ved udøvelsen af opfindel sen med nucleotidsekvensen af muse-NGF-genet; fig. 4 viser det fysiske kort over rekombinant-fagen X hN8 og flankerende områder i det humane genom; fig. 5 er nucleotidsekvensen af det humane β-NGF-kromoso-25 male gen; \ fig. 6 viser en sammenligning af nucleotidsekvenser i det humane præpro-R-NGF-gen og muse-prapro-R-NGF-genet og aminosyresekvenser; fig. 7 viser genet konstrueret til udtrykkelse af human 30 β-NGF;

DK 161152 B

7 fig. 8 viser en del af fremgangsmåden til samling af plasmidet phpNGFtrpl til transformation af E. coli til at udtrykke human p-NGF.

A. Værtscellekulturer og vektorer 5 I denne ansøgning skal betegnelsen "udtrykkelsesvektor" inkludere vektorer, som er i stand til udtrykke DNA-se-kvenser indeholdt deri, hvor sådanne sekvenser er opera-belt forbundet med andre sekvenser, som er i stand til at frembringe deres udtrykkelse. Dette implicerer, selv 10 om det ikke altid er udtrykkeligt anført, at disse ud- trykkelsesvektoer må være replicerbare i værtsorganismerne enten som episomer eller som en integreret del af den kromosomale DNA. Det er klart, at en manglende repli-cerbarhed ville gøre dem effektivt inoperable. Sammenfat-15 tende gives "udtrykkelsesvektor" en funktionel definition, og enhver DNA-sekvens, som er i stand til at frembringe udtrykkelse af en specificeret DNA-kode anbragt deri, er inkluderet i denne betegnelse, som den anvendes om den specificerede sekvens. I almindelighed er anvendelige 20 udtrykkelsesvektorer inden for rekombinant-DNA-teknik ofte i form af "plasmider", hvilket henfører til cirkulære dobbelstrengede DNA-løkker, som i deres vektorform ikke er bundet til kromosomet. I den foreliggende beskrivelse og krav anvendes "plasmid" og "vektor" valgfrit, eftersom 2 5 plasmidet er den mest almindeligt anvendte vektor form.

Imidlertid skal opfindelsen inkludere sådanne andre former af udtrykkelsesvektorer, som tjener ækvivalente funktioner, og som senere måtte blive kendt inden for faget.

30 Endvidere skal betegnelsen "rekombinante værtsceller" henføre til celler, som er blevet transformeret med vektorer konstrueret under anvendelse af rekombinant-DNA-teknik.

DK 161152 B

8

De heri angivne vektorer og fremgangsmåder er egnede til brug i værtsceller over et bredt område af prokary-otiske og eukaryotiske organismer.

I almindelighed foretrækkes selvfølgelig prokaryoter 5 til kloning af DNA-sekvenser ved konstruktion af vekto rer, som er nyttige i forbindelse med opfindelsen. F. eks. er E. coli K12 stamme 294 (ATTC nr. 31446) særligt nyttig. Andre mikroorganismestammer, som kan anvendes, inkluderer E. colistammer, såsom E. coli B og E. coli 10 X1776 (ATTC rrr. 31537). Disse eksempler er selvfølgelig blot belysende.

Prokaryoter kan også anvendes til udtrykkelse. De førnævnte stammer, såvel som E. coli W3L10- (F , X , proto-troph, ATTC nr. 27325), baciller såsom Bacillus subtilus, 15 og andre enterobacteriaceae, såsom Salmonella typhimu- rium eller Serratia marcescens og forskellige Pseudomonas-arter kan anvendes.

I almindelighed anvendes plasmidvektorer indeholdende replicon- og styringssekvenser, som er afledt fra arter, 20 der er kompatible med værtscellen, i forbindelse med disse værter. Vektorer bærer almindeligvis et relice-ringscenter såvel som markørsekvenser, der er i stand til at tilvejebringe fænotypisk selektion i transformerede celler. F. eks. transformeres E. coli typisk under anven-25 delse af pBR322, et plasmid afledt fra en E. coliart (Bolivar et al., Gene 2:95 (1977)). pBR322 indeholder gener for ampicillin- og tetracyclin-resistens og tilveje-bringer således lette midler til identifikation af transformerede celler. pBR322-plasmidet eller et andet mikro-50 bielt plasmid må også indeholde, eller modificeres til < at indeholde, promotorer, som kan anvendes af mikroorganismen til udtrykkelse af dens egne proteiner. De promotorer, som mest almindeligt anvendes til rekombinant-DNA-konstruktion, inkluderer P-lactamase-(penicillinase)-

DK 161152 B

9 og lactose-promotorsystemerne (Chang et al., Nature 275:615 (1978); Itakura et al., Science, 198: 1056 (1977)); Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)) og et tryptophan-(trp) promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids 5 Res., 8: 4057 (1980); EP offentliggørelsesskrift nr.

0036776). Selv om disse er de mest almindeligt anvendte, er der blevet opdaget og anvendt andre mikrobielle promotorer, og detaljer vedrørende deres nucleotidsekvenser er blevet offentliggjort, hvilket tillader en fagmand 10 at ligere dem funktionelt med plasmidvektorer (Siebenlist et al., Cell 20: 269 (1980)).

Foruden prokaryoter kan der også anvendes eukaryotiske mikroorganismer, såsom gærkulturer. Saccharomyces cere-visiae, eller almindelig bagegær, er den mest almindeligt 15 anvendte blandt eukaryotiske mikroorganismer, selv om et antal andre stammer er almindeligt tilgængelige.

Til udtrykkelse af Saccharomyces anvendes f. eks. almindeligvis plasmidet YRp7, (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7: 141 (1979); 20 Tschemper et al., Gene, 10: 157 (1980)). Dette plasmid indeholder allerede trpl-genet, som tilvejebringer en selektionsmarkør for en mutantstamme af gær, som mangler evnen til at vokse i tryptophan, f. eks. ATTC nr.

44076 eller PEP4-1 (Jones, Genetics, 85: 12 (1977)).

25 Tilstedeværelsen af trpl-læsionen som en karakteristisk egenskab ved gærværtscellegenomet tilvejebringer så et effektivt miljø til detektering af transformation ved vækst i fravær af tryptophan.

Egnede promoteringssekvenser i gærvektorer inkluderer 30 promotorerne for 3-phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)) eller andre glyco-lytiske enzymer (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968); Holland et al., Biochemistry, 17: 4900 (1978)), såsom enolase, glyceraldehyd-3-phosphat-dehydro-35 genase, hexokinase, pyruvatdecarboxylase, phospho- fructokinase, glucose-6-phosphat-isomerase, 3-phospho-

DK 161152 B

10 glyceratmutase, pyruvatkinase, triosephosphatisomerase, phosphoglucoseisomerase og glucokinase. Ved konstruktion af egnede udtrykkelsesplasmider ligeres stopsekvenserne forbundet med disse gener også ind i udtrykkelsesvektoren 5 3' for sekvensen, der skal udtrykkes, for at tilvejebrin ge polyadenylering af mRNA'en og afslutning. Andre promotorer, som har den yderligere fordel, at transcriptionen styres af vækstbetingelser, er promotorområderne for alkoholdehydrogenase 2, isocytochrome C, sur phospha- 10 tase, nedbrydende enzymer forbundet med nitrogenmetabolismen og den førnævnte glyceraldehyd-3-phosphat- dehydrogenase samt enzymer, der er ansvarlige for maltose-og galactose-udnyttelse (Holland, ibid.). Enhver plasmid-vektor indeholdende en gærkompatibel promotor, replice-15 ringsorigin og afslutningssekv.ensec er egnet.

Foruden mikroorganismer kan også kulturer af celler afledt fra flercellede organismer anvendes som værter.

I princippet er enhver sådan cellekultur brugbar, hvad enten den er fra hvirveldyr eller hvirvelløse dyr. Imid-20 lertid har interessen været størst for hvirveldyrceller, og formering af hvirveldyrceller i kultur (vævskultur) er blevet en rutineprocedure i de senere år [Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors (1973)]. Eksempler på sådanne nyttige værtscellelinier 25 er VERO- og HeLa-celler, kinesisk hamster-ovarie-(CHO) cellelinier og W138-, BHK-, C0S-7- og MDCK-cellelinier. Udtrykkelsesvektorer for sådanne celler inkluderer almindeligvis (om nødvendigt) et repliceringsorigin, en promotor anbragt foran genet, som skal udtrykkes, sam-30 men med alle nødvendige ribosombindingssteder, RNA- splejsningssteder, polyadenyleringssteder og transcrip-tionsafslutningssekvenser. Det vil forstås, at opfindelsen, selv om den her er beskrevet ved en foretrukken udførelsesform, ikke skal anses for at være begrænset til 35 de eksemplificerede sekvenser.

DK 161152B

11

Til anvendelse i pattedyrceller tilvejebringes styringsfunktionerne på udtrykkelsesvektorerne ofte af viralt materiale. F. eks. afledes almindeligt anvendte promotorer fra polyoma, Adenovirus 2 og hyppigst abevirus 40 5 (SV40). Den tidlige og den sene promotor hos SV40-virus er særligt nyttige, fordi begge opnås let ud fra virusset som et fragment, der også indeholder det virale SV40-re-pliceringsorigin ( Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978), der betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved 10 denne henvisning). Mindre eller større SV40-fragmen-ter kan også anvendes, forudsat at der inkluderes den ca. 250 bp sekvens, som strækker sig fra HindiII-stedet, hen imod Bgll-stedet lokaliseret i det virale replice-ringsorigin. Endvidere er det ofte muligt, og ofte ønske-15 ligt, at anvende promotor- eller styringssekvenser, der normalt er forbundet med den ønskede gensekvens, forudsat at sådanne styringssekvenser er kompatible med værtscellesystemerne.

Et repliceringsorigin kan tilvejebringes enten ved kon-20 struktion af vektoren til at inkludere et exogent origin, som det f. eks. kan afledes fra SV40 eller anden viral (f. eks. Polyoma, Adeno, VSV, BPV osv.) kilde eller kan tilvejebringes af værtscellens kromosomale replice-ringsmekanisme. Hvis vektoren er integreret i værtscelle-25 kromosomet, er det sidstnævnte ofte tilstrækkeligt.

B. Anvendte metoder

Hvis celler uden formidable cellevægbarrierer anvendes som værtsceller, udføres transcription ved calciumphos-phatfældningsmetoden som beskrevet af Graham and Van 30 der Eb, Virology, 52: 546 (1978). Imidlertid kan der også anvendes andre metoder til indførelse af DNA i celler, såsom kerneinjektion eller protoplastfusion.

DK 161152 B

12

Hvis der anvendes prokaryotiske celler eller celler, som indeholder væsentlige cellevægkonstruktioner, er den foretrukne transcriptionsmetode calciumbehandling under anvendelse af calciumchlorid som beskrevet af 5 Cohen, F.N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69: 2110 (1972).

Konstruktion af egnede vektorer indeholdende de ønskede kodnings- og styrings-sekvenser sker under anvendelse af standardligeringsteknik. Isolerede plasmider eller 10 DNA-fragmenter spaltes, skræddersys og ligeres sammen igen i den ønskede form til dannelse af de nødvendige plasmider.

Spaltning gennemføres ved behand-ling med restriktionsenzym (eller flere enzymer) i en egnet puffer. I almin-15 delighed anvendes omkring 1 yug plasmid eller DNA-fragmenter med omkring 1 enhed enzym i omkring 20 ^ul pufferopløsning. (Passende puffere og substratmængder for bestemte restriktionsenzymer er angivet af producenten). Inkubationstider på omkring 1 time ved 37 °C er brugbare.

20 Efter inkubationer fjernes protein ved ekstraktion med phenol og chloroform, og nucleinsyren udvindes fra den vandige fraktion ved fældning med ethanol.

Hvis der kræves stumpe ender, behandles præparatet i 15 minutter ved 15 °C med 10 enheder E. coli DNA-polyme-25 rase I (Klenou/), ekstraherés med phenol og chloroform og fældes med ethanol.

Størrelsesseparation af de spaltede fragmenter gennemføres under anvendelse af 6 % polyacrylamid-gel som beskrevet af Goeddel, D., et al.,Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980), 30 der betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved denne henvisning.

DK 161152 B

13

Til ligering behandles omkring ækvimolære mængder af de ønskede komponenter, passende endeskræddersyet til at give korrekt tilpasning, med omkring 10 enheder T4-DNA-ligase pr. 0,5 g DNA. (Når spaltede vektorer anvendes 5 som komponenter, kan det være nyttigt at forhindre reli-gering af den spaltede vektor ved forbehandling med bakteriel alkalisk phosphatase).

Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli K12 stamme 294 (ATCC 31 446), og heldige trans-10 formanter blev selekteret ved ampicillinresistens. Plas-mider fra transformanterne blev præpareret, analyseret v/ed restriktion og/eller sekvensbestemt ved den metode, som er beskrevet af Messing et al., Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981), eller den som er beskrevet af Maxam et 15 al., Methods in Enzymology, 65: 499 (1980).

C. Foretrukne udførelsesformer

C. 1 Isolering af cDNA-kloner, der koder for muse-pro-Ø-NGF

for at opnå et gen, der koder for Ø-underenheden af human NGF blev det besluttet at anvende klonet cDNA, 20 der koder for muse-Ø-NGE, som hybridiseringssonde.

cDNA-kloningen drog fordel af den kendte aminosyresekvens af muse-Ø-NGE-underenheden, som er vist i fig. 1, idet der anvendtes syntetiske oligo-nucleotid-primere; forskellen i NGE-niveauer fundet i han- og hun-muse-kirtler 25 blev anvendt som et yderligere middel til identifikation. 3 små portioner muse-Ø-NGF-aminosyresekvens blev udvalgt, og oligonucleotidsammenhældninger komplementære til alle mulige sekvenser, der koder for dem, blev syntetiseret ved den metode, der er beskrevet af Crea et 30 al., Nucleic Acids Res., 8: 2331 (1980). Nucleotidsekven-serne for kodestrengene og de komplementære strenge er vist i fig. 1.

DK 161152B

14

De første forsøg på at identificere eller isolere muse-(3-NGF-cDNA-kloner fra en oligo-dT-primet cDNA-bank fra hanmuse-spytkirtler slog fejl ved anvendelse af de syntetiske oligonucleotider som hybridiseringssonder. Dette 5 resultat tydede på, at selv om β-NGF udgjorde 0,1 % af proteinet i hanmuse-spytkirtlerne, var dens mRNA ikke lige så rigelig. Derfor anvendtes primersammen- hældningen repræsenterende sekvenser, som lå nærmest ved proteinets carboxylende (fig. 1, 1.) til specifikt 10 at prime revers transcription af poly A-holdig (A+) RNA fra hanmusespytkirtler for først at berige med hensyn til β-NGF-specifikke nucleotidsekvenser. Molekyler af cDNA på over 200 bp i længde blev klonet ind i det velkendte plasmid pBR322. I alt 10 000 kloner blev sigtet 32 15 under anvendelse af den 5'- P-mærkede NGF-primer-sammen-hældning., som oprindeligt blev anvendt ved cDNA-primingen-som hybridiseringssonde, og 0,8 % af klonerne gav et positivt signal under højstringente hybridiseringsbe-tingelser. Det er sandsynligt, at de resterende 99,2 20 % af den "primede" cDNA-bank resulterede fra selvpriming såvel som fra priming med spormængder af oligo-dT elue-ret under fremstillingen af poly A+-hanmusespytkirtel-RNA. Sl-nuclease-behandling under kloningsproceduren kan også have beskadiget noget af den terminale primerse-25 kvens og resulteret i 40 detekterede positive kloner.

Kloner anset for positive i den første sigtning blev sigtet igen under anvendelse af radiomærkede primersam-menhældninger 2 og 3 afledt fra DNA-sekvenser opstrøms fra oligonucleotidsammenhældning 1 som vist i fig. 1, 30 som hybridiseringssonder. Desuden anvendtes P-cDNA primet ved sammenhældning 1 fra poly A+-RNA fra enten han- eller hunmusespytkirtler som sonder på duplikatfiltre. Der blev identificeret i alt 10 hanspecifikke kloner, igen i pBR322, som hybridiserede med oligonucleotid-35 sammenhældningerne 2 og 3. Restriktionsenzymanalyser viste, at alle 10 havde fælles Haelll- og HinfI-fragmen-

DK 161152 B

15 ter. Klonen indeholdende et plasmid, som blev betegnet pmØN-9Gl, og som udtrykte den længste DNA-indsætning (ca. 700 bp) blev sekvensbestemt i dens helhed. Amino- syresekvenserne afledt fra nucleotidsekvensen indeholdt 5 den forventede NGF-sekvens i en translationsramme for uden en Nf^-terminal prosekvens; se fig. 4. Yderligere detaljer ved konstruktionen og identifikationen af bakterielle kloner indeholdende muse-NGF-cDNA-sekvenser er angivet i det følgende.

10 For at bestemme størrelsen af den fuldstændige NGF-mRNA, anvendtes "Northern Blot"-hybridisering såvel som primer- 32 forlængelsesanalyse. Et 470 bp langt P-mærket DNA-frag-ment (Rsal-Rsal 789, fig. 3), der inkluderede NGF såvel som propeptidsekvenser, hybridiserede til en RNA-art, 15 som var omkring 1300 nucleotider lang og var hanmusespyt- kirtel-specifik. Et primerforlængelsesforsøg under anvendelse af 2 korte dobbeltstrengede 5'-endemærkede restriktionsfragmenter (se teksten til fig. 3) lokaliserede 5'-enden af Ø-NGF-mRNA til omkring 230 baser opstrøms 20 fra 5'-enden af pmBN-9Gl-cDNA-fragmentet, hvilket efterlader omkring 370 baser nedstrøms fra 3'-enden af vor klon. Alle på nær ca. 30 nucleotider af de manglende 5'- sekvenser er indeholdt i kloner betegnet pmØN-16F7 og pmØN-21B5, som overlapper hinanden og klonen pmØN-9Gl 25 som vist i fig. 3, og som blev isoleret som beskrevet i den følgende mere detaljerede omtale af anvendelsen af restriktionsfragmenter til at prime cDNA-syntese.

For at opnå klonet cDNA, som inkluderede sekvenserne fra 3'-enden af primersekvensen nedstrøms for 3'-poly 30 A-sekvensen blev der først beriget med hensyn til Ø-NGF-mRNA ved fraktionering af totalt poly A+-hanmusespyt-kirtel-RNA på en præparativ urinstof-agarose-gel. Den største fraktion indeholdende sekvenser, der hybridiserede til en β-NGF-cDNA-sonde, blev anvendt til oligo-dT-35 primet cDNA-syntese og kloning. Sigtning af 3 700 kloner resulterede i 4 positive hybridiseringssignaler. Nucleo-tidsekvensanalyse af kloner betegnet pmØN-12E4 og

DK 161152 B

16 ριηβΝ-8Β3 tilføjede 239 nucleotider til 3'-kodningssekvenserne og de utranslaterede sekvenser. Selv om de var oligo-dT-primet, indeholdt ingen af klonerne hele det 3'-utranslaterede område af β-NGF-mRNA på grund 5 af ufuldstændig syntese af den anden DNA-streng eller for udstrakt Sl-nuclease-behandling. "Northern Blot"-analyse (fig. 2) viste, at poly A-sekvensen ikke var langt fra den sekvens, som blev klonet. Yderligere detaljer ved fremstillingen af oligo-dT-primede cDNA-klo-10 ner ud fra beriget mRNA er anført i de følgende.

C.2 Isolering og karakterisering af det humane kromosomale β-NGF-qen

Et humant bibliotek (bestående af 15 - 20 kb delvise Haelll/A-luI-DNA-fragmenter fra human fetal lever indsat 15 i ACharon 4A vektorer) blev sigtet under anvendelse af det klonede 470 bp muse-NGF-cDNA-fragment (ρπιβΝ-901 Rsal fragment), der er beskrevet ovenfor, som radioaktiv hybridiseringssonde. I alt 27 rekombinante fager blev plaquerenset og delvis karakteriseret ved EcoRI-nedbryd-20 ning; cfe 27 fager udviste 6 forskellige typer af restriktionsmønstre. Hver mønsterkategori havde fælles restriktionsfragmenter og syntes således at overlappe det samme genomiske område. Fagen betegnet λΐιβΝ8 blev yderligere karakteriseret ved fysisk kortlægning og nucleotidsekvens-25 bestemmelse; fig. 4 viser et fysisk kort over klonen

Ah8N8 og regioner, som flankerer dens sekvenser i det humane genom, frembragt ved fagkortlægning, sekvensbestemmelse og genomiske "Southern Blotting" forsøg. En portion af en 12 000 bp nucleotidsekvens afledt fra subklonede 30 overlappende EcoRI- og HindIII-fragmenter er vist i fig. 5.

DK 161152 B

17 C.3 Sammenligning af sekvenserne af muse-Ø-NGF-cDNA med det humane Ø-NGF-gen

Muse-ØNGF-cDNA-sekvensen indeholder en læseramme med evne til at kode for moden ØNGF, og den forudsagte amino-5 syresekvens svarer til den kendte sekvens af muse-ØNGF;

Angletti et al., Biochemistry, 12: 90 (1973) og 12: 100 (1973). Uventet forudsiger cDNA-sekvensen en C-ter-minal arginin-glycerin-dipeptid-udvidelse forbundet med enden af den rapporterede sekvens for muse-ØNGF.

10 Det humane ØNGF-gen indeholder et område, som forudsiger en aminosyresekvens, der er tilnærmelsesvis 90 % homolog med den modne muse-ØNGF-aminosyresekvens, som derfor må være genet for human ØNGF. Det humane ØNGF-protein har også en C-terminaldipeptidforlængelse.

15 Når man lægger de humane og muse-ØNGF-sekvenserne overens (fig. 6), bliver det klart, at udstrakt homologi strækker sig i en væsentlig afstand opstrøms fra den kendte sekvens af det modne museprotein. Der er fremlagt bevis for eksistensen af et 22 000 dalton biosyntetisk pro-20 ØNGF-forstadium, Berger and Shooter, Proc. Nat. Acad.

Sci. (USA), 74: 3647, (1977), som kan strække sig opad fra det modne protein til et potentielt arginin-arginin-spaltningscenter ved nucleotidpositionerne 419 og 420 i fig. 6. Det nucleotidsekvens-forudsagte forstadium 25 er længere end det tidligere detekterede; som det skal beskrives nedenfor forudsiges hele præpro-ØNGF-sekvensen at have en molekylvægt på 27 000, prosekvensen forudsiges at være på 25 000 dalton og i betragtning af tilstedeværelsen af specifikke par af argininrester forekommer 30 der forarbejdningsmellemprodukter på 21 500 og 18 000 dalton inde i cellen.

DK 161152 B

18 C.4 Lokalisering af start-methionin-codonen og siqnalse-kvensen 3 methioninrester er kandidater til udpegning som pro-teinsyntese-startcodonen (aminosyrerne -187, -121 og 5 -119 i fig. 6), men flere faktorer implicerer stærkt aminosyren -121 i den foreliggende sekvens som den faktisk anvendte startcodon. Da ØNGF er et secerneret protein, efterfølges startcodonen sandsynligvis af en signalsekvens til cotranslationel overførsel af dette polypeptid 10 til det indre af det endoplasmiske reticulum. Aminosyrerne -121 til -104 repræsenterer et udmærket bud på signalsekvensen. Disse 18 aminosyrer har den korrekte længde og inkluderer en strækning på 6 fuldstændigt hydrofobe aminosyrer (ala-phe-leu-ile- gly-val). Spaltning ved 15 hjælp af signalpeptidase kunne ske mellem den lille aminosyre ala-104 og glu-resten i stilling -103. Det er kendt, at signalpeptidase spalter efter en identisk gln-ala-sekvens og efterlader en identisk N-terminal glu-rest i tilfælde af præ-a-lactalbumin. Strækningen 20 af aminosyrer efter met-resten i stilling -187 indeholder en høj procentdel af polære og ladede aminosyrer og har ingen lighed med nogen tidligere beskrevet signalsekvens.

Derfor synes det mest sandsynligt, at methionin-121 25 anvendes til translationsstart af muse- og human præpro- ØNGF, som ville resultere i et 27 000 dalton præprohor-mon og 25 000 dalton pro-ØNGF, hvis signalpeptidforar-bejdningen sker ved rest -104.

C. 5 Direkte udtrykkelse af human ØNGF i E. coli 30 EcoRI-fragmenter fraAhØN8 blev subklonet i pBR322.

Et subklon-plasmid, betegnet phØN8-B9, indeholdt en 19 2 kb human DNA-indsætning, der inkluderede det meste af sekvenserne, som koder for den humane PNGF-underen-hed. Sekvensbestemmelse viste, at kun de 10 Nl^-terminale aminosyrer var udelukket fra denne sekvens. Forsøget 5 på udtrykkelse af pNGF-kodningssekvensen i E. coli gik ud på at udskære det størst mulige fragment fra PNGF-kod-ningsportionen af ph|3N8-B9, derefter indfylde manglende codoner og modificere 5'- og 3'-enderne af sekvensen for at gøre den velegnet til indsættelse i et E. coli 10 udtrykkelsesplasmid. Det anvendte udtrykkelsessystem var Trp-promotorsystemet beskrevet i US patentansøgning nr. 307 473, indleveret den 1. oktober 1981, som tidligere er anvendt til en række forskellige gener, med den sekvensvariation, som er beskrevet af M. Mateucci, 15 i trykken, hvis indhold betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved denne henvisning.

Plasmidet phpn8-B9 blev nedbrudt med EcoRI og HgiAI, og et ca. 300 bp fragment blev isoleret fra nedbrydnings-blandingen. Dette fragment er vist i fig. 7 med de kli-20 strende ender som er resultatet af den viste 2-trinsned- brydning. For at konstruere 5'-enden af den pNGF-sekvens til udtrykkelse, tilføjedes codoner for de 10 manglende aminosyrer, methionin-startcodonen (ATG) og nucleotider forud for ATG-codonen, som er en del af et ribisombin-25 dingscenter og inkluderer spaltningscentreret for restrik- tionsendonucleasen Xbal; 4 oligonucleotider blev syntetiseret kemisk til dette formål og er vist i fig. 7 som oligonucleotiderne I - IV.

3'-enden af PNGF-kodningsområdet blev modificeret som 30 følger: Nucleotidsekvensen af begge DNA-strenge nedstrøms fra det enkelte HgiAI-center, som er vist i fig. 7 (ved aminosyrepositionen val 111 og leu 112 i den modne humane PNGF) blev syntetiseret kemisk, herunder en afslut-

DK 161152 B

20 ningscodon (TAG) efter Arg 118 og en Sall-kohæsiv ende.

Disse oligonucleotider er fragmenterne 1/ og VI i fig.

7.

De syntetiske oligo-nucleotider I - VI blev radioaktivt 3 2 5 mærket med T4-polynucleotidkinase og %- p-ATP, og de radioaktive oligonucleotider blev blandet med hpNGF-DNA-fragmentet på omkring 300 bp i T4-DNA-1igase-puffer. Ligeringen blev udført med 10 enheder T4-DNA-ligase ved 12 °C i 12 timer. Blandingen blev phenolekstraheret, 10 og DNA'en blev udfældet i 70 % ethanol. Bundfaldet blev tørret, opløst i restriktionsendonuclease-puffer, og enzymerne Xbal og Sall tilsattes. Nedbrydningen blev udført i 2 timer.

Præparativ gelelektroforese af DNA-blandingen og auto-15 radiografi påviste tilstedeværelsen af en radioaktiv dublet ved ca. 300 bp. Båndene blev udskåret separat og elueret elektroforetisk. De eluerede DNA-fragmenter blev derpå ligeret (T4-DNA-ligase) til et HGH-Trp-udtryk-kelsesplasmid betegnet pHGH207-l, som var blevet behand-20 let med bakteriel alkalisk phosphatase efter nedbrydning med Xbal og Sall. (Behandling med alkalisk phosphatase anvendtes til at forhindre genindsætning af HGH-fragmen-tet i Trp-udtrykkelsesvektoren). Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli K12/294. Ampi-25 cillinresistente og tetracyclinmodtagelige kolonier blev selekteret på agarplader; 200 kolonier blev sigtet for tilstedeværelsen af humane pNGF-sekvenser ved hybridi-sering med en radioaktiv 300 bp EcoRI/HgiAI-sonde. 12 positive kolonier blev analyseret for tilstedeværelsen 30 af immunoreaktive PNGF-molekyler i deres celleekstrakter under anvendelse af kanin-antimuse-pNGF-antistoffer på en "Western Blot". Alle kloner på nær én viste et positivt signal for den forventede molekylvægt sammenlignet med

DK 161152 B

21 en negativ kontrolekstrakt. DNA-sekvensanalyse af en af klonerne bekræftede, at det endelige plasmid, betegnet pHPNGFtrpl, som resulterede i human ØNGF-udtrykkelse, havde den oprindeligt planlagte konstruktion.

5 Rækkefølgen af operationer fra nedbrydning af plasmid phØN8-B9 med EcoRI og HgiAI til samling af plasmidet phpNGFtrpl, er vist i fig. 8. Plasmidet pHGH207-l blev opnået ud fra plasmidet pHGH207, beskrevet i US patentansøgning nr. 307 473, ovenfor, ved nedbrydning med 10 BamHI efterfulgt af delvis nedbrydning med EcoRI. Det største fragment, som indeholdt trp-promotoren, blev isoleret. Det største EcoRI-BamHI-fragment fra pBR322 blev også isoleret, og de 2 fragmenter ligeret og anvendt til at transformere E. coli K12/294. Kloner, som var 15 resistente overfor både ampicillin og tetracyclin, indeholdt pHGH207-l.

C. 6 Konstruktion og identifikation af bakterielle kloner indeholdende PNGF-cDNA-sekvenser 2 sammenhældninger på hver 8 primere (14 baser) blev 20 syntetiseret kemisk. Hver primer var komplementær til en potentiel mRNA-sekvens for aminosyrerne 93 - 96 og en del af 97. En blanding af de 16 oligonucleotider

blev anvendt til specifikt at prime syntesen af cDNA

på poly(A+)-RNA. 220 pmol (1 ^ug) af hver sammenhældning 25 af 8 primere (i alt 440 pmol, 2 ^ug) blev sammensmeltet med 40 ^,ug poly(A+)-RNA i 50 ^ul 100 mmol KC1 ved inku- bering i 4 minutter hver ved 90 QC, 68 °C, 42 °C og 32 37 °C. P-mærket cDNA blev syntetiseret i en 100 ^ul reaktionsblanding i 50 mM "Tris" (pH 8,3), 10 mM MgC^, 30 10 mM DTT, 50 mM KC1. Reaktionsblandingen indeholdt foruden den sammensmeltede blanding 500 yuM dATP, TTP, dGTP, 100 yUM dCTP, 20 yuCi [a-32p]-dCTP (2000 Ci/mmol, Amersham), 0,5 enheder RNAsin og 90 enheder revers

DK 161152 B

22 transcriptase. Første-streng-syntesen foregik i 60 minutter ved 37 °C. Reaktionsblandingen blev kogt i 3 minutter, udslukt på is i 1 minut og centrifugeret i en mikrocen-trifuge. Supernatanten blev fortyndet med et lige så 5 stort volumen ddh^O, og ds cDNA blev syntetiseret ved tilsætning af 15 enheder Klenow-polymerase I i 18 timer ved 12 °C. Efter phenol-chloroform-ekstraktion og ethanol-fældning blev præparatet nedbrudt med 10^ enheder Sl-nu-clease i 150 ^ul 1 time ved 37 °C. Efter phenol-chloroform-10 ekstraktion og ethanolfældning blev cDNA'en fraktion- ret ved elekroforese på en 5 λ polyacrylamid-gel. To størrelsesområder af cDNA blev elektroelueret. Der blev udvundet 132 ng med en længde på ca. 550 bp (øvre) og 182 ng med en længde på 200 - 550 bp (nedre). I alt 15 20 ng af hver fraktion blev forlænget ved 3'-enderne med 20 - 40 d(C)-rester under anvendelse af terminal-nucleotidyl-transferase. Den med d(C)-hale forsynede cDNA blev sammensmeltet med 150 ng pBR322, som på lignende måde var blevet forlænget med d(G)-rester ved Pstl-cen-20 tret. Sammensmeltningerne foregik i 50 ^ul 100 mM NaCl, 10 mM "Tris" (pH 7,5), 250 mM EDTA. Blandingerne blev opvarmet til 70 °C, fik lov at afkøles langsomt til 37 °C (16 timer) og derpå til 4 °C (6 timer). Halvdelen af den sammensmeltede blanding blev anvendt til at trans-25 formere E. coli K-12 stamme 294. 500 kolonier fra hver størrelsesfraktion (øvre og nedre) blev sigtet ved filter- 32 hybridisering. En P-mærket sonde blev fremstillet ud fra en blanding af de 16 primere (1 ^ug i alt) ved phosphorylering med 200 ^uCi [æ-32p]-ATP (5000 Ci/mmol, 30 Amersham) og polynucleotidkinase (P-L Biochemicals) ved en publiseret procedure. Filtrene indeholdende de g 10 000 kloner blev hybridiseret med ca. 1 x 10 tællin- 32 ger/minut af den P-mærkede sonde ved stuetemperatur i 18 timer i en primerhybridiseringsblanding (100 mM 35 "Tris" (pH 7,5), 0,9 M NaCl, 6 mM EDTA, 1 x Dennardt's

DK 161152 B

23 opløsning, 100 ^uM rATP, 1 mM Nah^PO^-Na-pyrophosphat, 0,5 % Nonidet P-40, 0,1 mg/ml gær-RNA (Sigma R-6750).

Filtre blev vasket i 30 minutter (3 gange) i 6 X S5C ved 42 °C og eksponeret på røntgenfilm i 16 timer ved 5 -70 °C med en intensiveringsskærm (Dupont). Omkring 0,7 - 0,9 % (370 øvre, 460 nedre) af kolonierne blev udvalgt til en anden runde af sigtning med 2 yderligere syntetiske primere, som er 5' for det oprindelige primings-center. 12-mere komplementære til alle potentielle mRNA-10 sekvenser for aminosyrerne 74 - 77, blev syntetiseret i 2 sammenhældninger på 4 primere hver. 2 sammenhældninger på 8 14-mere hver blev syntetiseret på lignende måde, komplementære til potentielle mRNA-sekvenser for aminosyrerne 52 - 58 og en del af 56. Tre sæt identiske 15 filtre blev fremstillet ud fra de "øvre" og “nedre" 32 kolonier udvalgt i den første sigtningsrunde. P-mær-kede sonder blev fremstillet som ført ud fra de 4 syntetiske oligonucleotider. Filtre blev hybridiseret med 0,5 x 10 tællinger/minut i primerhybridiseringsblanding, 20 vasket og eksponeret på røntgenfilm. Der var 9 positive (3 fra "nedre", 6 fra "øvre"), som hybridiserede med alle 5 '-oligonucleotiderne. Plasmid-DNA blev isoleret ved en minisigtningsprocedure, og klonen med den længste indsætning blev bestemt ved restriktionsanalyse. Plas-25 midet betegnet pm8N-9Gl blev fuldstændigt sekvensbestemt ved Maxam-Gilbert-metoden. cDNA-indsætningen indeholdt 14 bp primersekvensen (fig. 1, sammenhældning 1) og 1 alt 716 bp.

C. 7 Oliqo-dT-primede cDNA-kloner fremstillet ud fra 30 mRNA beriget m.h.t. (3NGF-budskab 200 yug poly(A+)-RNA blev fraktioneret ved elektrofo-rese igennem en denaturerende agarosegel sammensat af

2 % agarose i 0,025 M natriumcitrat (pH 3,8) og 6 M

DK 161152 B

24 urinstof. Ribisomalbåndene blev synliggjort ved farvning af en tynd lodret skive med ethidiumbromid. Gelen blev udskåret i 0,5 cm skiver, smeltet ved 70 °C, ekstraheret kraftigt 2 gange med phenol og 1 gang med chloroform.

5 Efter 2 ethanolfældninger blev pillen opløst i 30 ^ul dd H^O. 1 yul aliquoter af hver fraktion (i 5 ^ul 4 M ammoniumacetat, pH 7,0) blev påsat et tørt nitrocellulosefilter og sigtet ved prikhybridisering under strin- 32 gente betingelser. En P-mærket sonde blev fremstillet 10 ud fra pmPN-9Gl-indsætningen ved en publiseret procedure under anvendelse af kalvethymus-DNA-fragmenter som primere ved en Klenow-polymerase I reaktion. Filtreret blev hybridiseret med ca. 10^ tællinger/minut i 50 mM NaPO^ (pH 7,0), 5 x Dennardt's opløsning, 5 x SSC, 50 ^ug/ 15 ml ultralydbehandlet sildesperm-DNA, 100 ^uM rATP, 1 mM NaH2P0^~natriumpyrophosphat og 50 % formamid ved 42 °C i 18 timer. Filtreret blev vasket i 20 minutter (3 gange) i 0,2X SSC/0,1 % SDS ved 42 °C og eksponeret på film. Hybridiseringsresultaterne lokaliserede NGF-20 budskabet til fraktionerne 11 og 12. 01igo-dT-primet cDNA blev fremstillet ved standardmetoder under anvendelse af 10 ^ul hver af fraktionerne 11 og 12. cDNA’en på over 600 bp blev elueret fra gelskiver efter elektro-forese på en 5 % polyacrylamid-gel. Omkring 40 ng cDNA 25 fra fraktion 11 og 20 ng fra fraktion 12 blev forsynet med d(C)-hale og sammensmeltet med pBR322 forsynet med d(G)-hale. Omkring 3 300 kloner fra fraktion 11 og 1 500 kloner fra fraktion 12 blev sigtet som kolonier ved filterhybridisering under stringente betingelser 32 30 under anvendelse af et P-mærket internt Hpall-fragment (216 bp) fra pmpn-9Gl. Filtre blev hybridiseret ved 50 x 10^ tællinger/minut ved 42.°C i 18 timer, vasket og eksponeret på røntgenfilm som før. 5 kloner fra fraktion 12 var "positive" med denne sonde. Restriktions-35 analyser viste, at de var søskende. pmPN-12G4 blev fuld-

DK 161152 B

25 stændigt sekvensbestemt ved Maxam-Gilbert-metoden. 2 kloner fra fraktion 11 var "positive". Den største, pmpi\i-8B3, blev fuldstændigt sekvensbestemt ved Maxam-Gilbert-metoden.

5 C . 8 Farmaceutiske præparater

Den humane β-NGF ifølge opfindelsen kan sammensættes ifølge kendte metoder til fremstilling af farmaceutisk nyttige præparater, hvorved β-NGF kombineres i blanding med et farmaceutisk acceptabelt bærermedium. Egnede 10 medier og deres sammensætning, inklusive andre humane proteiner, f. eks. humant serumalbumin, er beskrevet f. eks. i Remington's Pharmaceutical Sciences af E.

W. Martin, der betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved denne henvisning. Sådanne præparater vil inde-13 holde en effektiv mængde af det her omhandlede protein sammen med en egnet mængde af mediet til at fremstille farmaceutisk acceptable præparater, der er egnede til effektiv parenteral indgivning hos værten.

Den her omhandlede humane β-NGF kan indgives parenteralt 20 til individer, som lider af nervebeskadigelse eller andre tilstande, for hvilke den er terapeutisk effektiv. Dosering og doseringshastighed kan de være samme, som for tiden anvendes ved kliniske undersøgelser af sådanne midler afledt f. eks. fra musespytkirtler.

Claims (13)

1. Polypeptid med aminosyresekvensen: Ser-Ser-Ser-His-Pro-Ile-Phe-His-Arg-Gly-Glu-Phe-Ser-Val-Cys-Asp-Ser-Val-Ser-Val-Trp-Val-Gly-Asp-Lys-Thr-Thr-Ala-Thr-Asp-Ile-Lys-Gly-Lys-Glu-Val-Met-Val-Leu-Gly-5 Glu-Val-Asn-Ile-Asn-Asn-Ser-Val-Phe-Lys-Gln-Tyr-Phe-Phe-Glu-Thr-Lys-Cys-Arg-Asp-Pro-Asn-Pro-Val-Asp-Ser-Gly-Cys-Arg-Gly-Ile-Asp-Ser-Lys-His-Trp-Asn-Ser-Tyr-Cys-Thr-Thr-Thr-His-Thr-Phe-Val-Lys-Ala-Leu-Thr-Met-Asp-Gly-Lys-Gln-Ala-Ala-Trp-Arg-Phe-Ile-Arg-Ile-Asp-10 Thr-Ala-Cys-Val-Cys-Val-Leu-Ser-Arg-Lys-Ala-Val-Arg og med egenskaber som human β-nervevækstfaktor (β-NGF).

2. Polypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der er en methioninrest før den indledende serinrest i den angivne sekvens.

3. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det indeholder et polypeptid ifølge krav 1, som er frit for forurenende proteiner af human oprindelse.

4. Farmaceutisk præparat ifølge krav 3, kendetegnet ved, at det er egnet til parenteral indgivning.

5. DNA-isolat, kendetegnet ved, at det omfat ter en sekvens, som koder for polypeptidet ifølge krav 1 eller 2.

6. Replicerbar udtrykkelsesvektor, kendetegnet ved, at den omfatter en DNA-sekvens, som koder for po-25 lypeptidet ifølge krav 1 eller 2 til udtrykkelse i en egnet værtscelle transformeret med vektoren. DK 161152B

7. Rekombinant værtscelle transformeret med udtrykkel-sesvektoren ifølge krav 6, så den er i stand til at producere polypeptidet ved udtrykkelse af den nævnte kodesekvens.

8. Rekombinant værtscelle ifølge krav 7, k ende- tegnet ved, at den er en stamme af E. coli.

9. Fremgangsmåde, der omfatter udtrykkelse i en rekombinant værtscelle af DNA, som koder for polypeptidet ifølge krav 1 eller 2, og udvinding af polypeptidet 10 fra værtscellekulturen.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at polypeptidet udtrykkes i E. coli som en moden sekvens fri for yderligere protein, andet end N-terminalt methionyl, sammensmeltet med sekvensen.

11. Fremgangsmåde der, efter fremstillingen af poly peptidet ved fremgangsmåden ifølge krav 9 eller 10, omfatter anvendelsen af polypeptidet til fremstilling af et farmaceutisk præparat.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet 20 ved, at det farmaceutiske præparat er egnet til paren teral indgivning.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 11 eller 12, kendetegnet ved, at det farmaceutiske præparat er til anvendelse ved nervebehandling.