DK162631B - Forbindelse, betegnet fr-900216, til anvendelse som terapeutisk aktivt stof, farmaceutisk praeparat indeholdende forbindelsen samt anvendelse af forbindelsen - Google Patents
Forbindelse, betegnet fr-900216, til anvendelse som terapeutisk aktivt stof, farmaceutisk praeparat indeholdende forbindelsen samt anvendelse af forbindelsen Download PDFInfo
- Publication number
- DK162631B DK162631B DK348784A DK348784A DK162631B DK 162631 B DK162631 B DK 162631B DK 348784 A DK348784 A DK 348784A DK 348784 A DK348784 A DK 348784A DK 162631 B DK162631 B DK 162631B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- compound
- reaction
- designated
- pharmaceutically acceptable
- shoulder
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
- C07D493/22—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains four or more hetero rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungi isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/02—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/845—Rhizopus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Botany (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
DK 16263 1 B
Den foreliggende opfindelse angår forbindelsen med betegnelsen F-R900216 eller et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf til anvendelse som terapeutisk aktivt stof, fortrinsvis til anvendelse ved behandling af tumorer; et farmaceutisk præparat som er ejen-5 dommeligt ved det i krav 2's kendetegnende del angivne; samt anvendelse af forbindelsen eller et syreadditionssalt til fremstilling af et farmaceutisk præparat til behandling af tumorer.
Forbindelsen FR-900216 ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at den har følgende fysiske og kemiske egenskaber: 10 1) Molekylvægt: 625 (massespektrum) 2) Molekylformel: c35h47no9 3) Smeltepunkt: 15 130-135°C (sønderdeling) 4) Specifik drejning: [a]f5° = +140° (c - 1, CHC13) 5) Ultraviolet absorptionsspektrum:
Amax(CH3°H) = 232 nm (e - 11.300) 20 * 238 nm (skulder) - 285 nm (skulder) = 296 nm (e — 55500) - 308 nm (e - 70300) = 324 nm (e - 51900).
25 6) Infrarødt absorptionsspektrum:
UmaxCKSr) :3450, 3140, 2960, 2920, 2860, 1730, 1715 (skulder), 1607, 1575, 1455, 1445, 1435, 1377, 1360, 1343, 1305, 1280, 1260, 1225, 1190, 1170, 1140, 1107, 1077, 1045, 1030 (skulder), 980, 970, 950, 930, 915, 905, 895, 875, 860, 850, 835, 825, 790, 780, 755, 705, 670 30 og 635 cm'^·.
7) %-NMR-Spektrum (CDCI3, intern standard: tetramethylsilan), som vist på tegningen.
DK 162631 B
2 8) -^C-NMR-Spektrum (CDCI3, intern standard: te trame thyls ilan): 5 (ppm): 9,65, 11,41, 11,71, 13,77, 14,32, 16,93, 22,57, 29,24, 31,49, 31,85, 34,16, 35,86, 36,40, 37,98, 45,32, 54,18, 56,12, 63,77, 65,10, 76,81, 82,33, 89,25, 120,80, 123,77, 126,44, 129,29, 135,97, 5 136,21, 136,57, 137,67, 138,51, 139,54, 160,84, 168,01, 169,34.
9) Opløselighed:
Fuldt opløselig i methanol, ethanol, acetone og ethylacetat Opløselig i chloroform og benzen Svagt opløselig i hexan og diethylether 10 Uopløselig i vand 10) Farvereaktion:
Positiv: Dragendorff-reaktion, iodreaktion Negativ: Ferrichloridreaktion, Molisch-reaktion, nihhydrin-reaktion, Ehrlich-reaktion.
15 11) Natur:
Svagt basisk forbindelse.
Forbindelsen med betegnelsen FR-900216 antages at være den samme forbindelse som "Rhizoxin", som blev offentliggjort i "Symposium Papers of the 25th Symposium on the Chemistry of Natural Products", 20 afholdt i Tokyo i 1982.
"Rhizoxin" har følgende strukturformel:
DK 162631 B
3
Ay Oves Ο v=s, , i γ°γ OCH3
Det har nu overraskende vist sig, at forbindelsen FR-900216 og dens farmaceutisk acceptable syreadditionssalte har en bemærkeIsesvardig 5 antitumoraktivitet.
Forbindelsen med betegnelsen FR-900216 kan fremstilles ved fermentering af en stamme, som danner forbindelsen med betegnelsen FR-900216, og som hører til slægten Shizopus såsom Shizopus sp. nr.
F-1360 eller lignende i et næringsmedium.
10 Nærmere oplysninger om den mikroorganisme, der anvendes til at fremstille forbindelsen med betegnelsen FR-900216, og fremstillingen deraf gives nedenfor.
Den mikroorganisme, som kan anvendes til fremstillingen af forbindelsen med betegnelsen FR-900216, er en stamme, som hører til slægten 15 Shizopus, blandt hvilken en stamme af Shizopus sp. nr. F-1360 for nyligt er blevet isoleret fra en jordprøve, der blev indsamlet ved Uji-shi, Kyoto-fu, i Japan.
Taxonomiske karakteristika for Shizopus sp. nr. F-1360: 1) Morfologiske karakteristika 20 a) Makroskopisk iagttagelse
DK 162631 B
4 i) Kulturer på maltekstraktagar
Kolonierne spredes bredt ud og når op på over 8,0 cm i diameter efter 3-5 dage ved 30°C, og til sidst dækkes Petri-skålen med myceliet.
Overfladen af kolonien er plan og tyk. Medens unge kulturer er hvide, 5 bliver de, under dannelse og modning af sporehuse og sporer, grå eller sorte. Sporehusene og sporerne dannes i rigelig mængde. Kanten af kolonien er spindelvævslignende, og der opstår luftmycelium på væggene af Petri-skålene eller skråsubstratglassene. Bagsiden er glasklar eller bleggul. Der dannes hverken opløselige pigmenter eller 10 udsondringer. Lugten er sødlig. Kolonien vokser hurtigt ved 25°C.
ii) Kulturer på YpSs-agar:
Kolonierne er de samme som på maltekstraktagar iii) Kulturer på kartoffeldextroseagar:
Kolonierne er de samme som på maltekstraktagar.
15 iv) Kulturer på Czapek's opløsningsagar:
Kolonierne vokser meget begrænset, b) Mikroskopisk iagttagelse
Sporehusene er dækket med en tyndvægget membran. Når de modner, sprænges de og frigør et antal enterogene sporer. De er 20 kugleformede og 30-200 pm i diameter. Sporerne fra sporehusene er ellipseformede med en størrelse på 7,5 x 15 pm, glatte til rynkede. Substratmyceliet har ikke skillevægge, og det danner rhizoideme. Hver af sporerne fra sporehusene er forbundet via udløbere, og columella dannes ved toppen af disse.
25 2) Fysiologiske karakteristika: a) Temperaturområde for vækst: 5
DK 16263 ΊB
Denne stamme kan vokse ved en temperatur i området 10-48°C med en optimal vækst ved 33°C. Den kan danne sporehuse ved 14-39eC. Disse data blev bestemt på kartoffeldextroseagar.
b) Vækst i Pfeffer-opløsning: 5 Denne stamme kan vokse i et temperaturområde på 25-42°C; ingen vækst ved 10°C.
c) pH-område for vækst:
Denne stamme kan vokse ved en pH-værdi på 2,5-12,0 på maltekstraktagar og YpSs-agar.
10 d) Dannelse af organiske syrer:
Denne stamme danner organiske syrer.
Ud fra ovennævnte karakteristika blev stammen antaget at være en stamme af zygomycet-slægten Rhizopus Ehrerib. Følgelig blev stammen betegnet Rhizopus sp. nr. F-1360.
15 En kultur af Rhizopus sp. nr. F-1360 er blevet deponeret hos ATCC
(American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive Rockville, MD 20852, USA) den 21. november 1979 under deponeringsnummer ATCC 20577, og der er nu blevet ansøgt om, at deponeringen konverteres til Budapest-traktat-formål.
20 Man kan også anvende eventuelle mutanter, som er i stand til at danne forbindelsen med betegnelsen FR-900216, herunder naturlige mutanter, som dannes ved naturlig mutation af organismen, samt kunstige mutanter, som kan dannes ud fra den beskrevne organisme ved sædvanlige metoder såsom røntgenstråler, ultraviolet bestråling, behandling med 25 et muteringsmiddel såsom nitrogensennepsolier, azaserin, salpetersyrling, 2-aminopurin, N,N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) eller lignende, behandling med phag, transformation, transduktion, konjugation og lignende.
DK 162631 B
6
Forbindelsen med betegnelsen FR-900216 ifølge opfindelsen dannes, når en stamme, der danner forbindelsen med betegnelsen FR-900216, og som hører til slægten Ehizopus (fx Rhizopus sp. nr. F-1360 ATGC 20577), dyrkes i et næringsmedium indeholdende kilder af assimilerbart carbon 5 og nitrogen under aerobe betingelser (fx rystekultur, submers kultur, etc.).
Foretrukne carbonkilder i næringsmediet er carbonhydrater såsom glucose, saccharose, maltose, glycerin, stivelse, opløselig stivelse, dextrin og lignende.
10 Foretrukne nitrogenkilder er kødekstrakt, hydrolyseret casein, pepton, glutenmel, majsmel, mel af bomuldsfrø, sojabønnemel, majsstøbevand, tørret gær, gærekstrakt, urinstof, ammoniumphosphat, etc.
Det er ikke nødvendigt, at carbon- og nitrogenkilderne anvendes i deres rene form, selv om de med fordel anvendes i kombination, da 15 mindre rene materialer, som indeholder spor af vækstfaktorer og betydelige mængder af mineralnæringsstoffer, også er egnede til anvendelse.
Om ønsket kan der til mediet sættes mineralsalte såsom dinatrium-eller dikaliumhydrogenphosphat, magnesiumchlorid, magnesiumsulfat, 20 calciumcarbonat og lignende.
Om nødvendigt, især når kulturmediet skummer meget, kan der tilsættes et antiskummiddel såsom en planteolie (sojabønneolie, linolie, etc.), flydende paraffin, en fedtolie, en højere alkohol (octadecanol, tetradecanol, heptanol, etc.) eller silicone.
25 Til fremstilling af forbindelsen med betegnelsen FR-900216 i store mængder foretrækkes neddyppede aerobe kulturbetingelser. Til fremstilling i små mængder anvendes en ryste- eller overfladekultur i en kolbe eller flaske. Når dyrkningen udføres i store tanke, foretrækkes det endvidere at anvende den vegetative form af organismen til inoku-30 lering i produktionstankene for at undgå vækstforsinkelse i produktionsprocessen til dannelse af forbindelsen med betegnelsen FR-900216.
Således er det ønskeligt først at fremstille et vegetativt podestof
DK 162631 B
7 af organismen ved at inokulere en relativt lille mængde kulturmedium med sporer eller mycelium af organismen og dyrke dette inokulerede medium, og derefter aseptisk overføre det dyrkede vegetative podestof aseptisk til store tanke. Det medium, i hvilket det vegetative po-5 destof fremstilles, er i det væsentlige det samme som eller forskelligt fra det medium, der anvendes til fremstillingen af forbindelsen med betegnelsen FR-900216.
Omrøring og beluftning af kulturblandingen kan udføres på mange måder. Omrøring kan tilvejebringes af en propel eller lignende meka-10 nisk omrøringsudstyr, ved at dreje eller ryste fermenteringsbeholderen, ved forskelligt pumpeudstyr eller ved at lede steril luft gennem mediet. Beluftning kan foretages ved at lade steril luft passere gennem fermenteringsblandingen.
Fermenteringen udføres sædvanligvis ved en temperatur på ca. 20-40°C, 15 fortrinsvis 25-35°C i et tidsrum på ca. 50-100 timer.
Den således fremstillede forbindelse med betegnelsen FR-900216 kan udvindes fra kulturmediet ved sædvanlige metoder, som sædvanligvis anvendes til udvinding af andre kendte biologisk aktive stoffer.
Forbindelsen med betegnelsen FR-900216 kan inkluderes i både fil-20 treret kulturvæske og dyrket mycelium, men det meste at forbindelsen med betegnelsen FR-900216 findes sædvanligvis i det dyrkede mycelium. Forbindelsen med betegnelsen FR-900216 kan ekstraheres fra det dyrkede mycelium med et opløsningsmiddel såsom ethylacetat og lignende. Forbindelsen med betegnelsen FR-900216 kan endvidere isoleres 25 eller renses fra den således vundne ekstrakt eller den filtrerede kulturvæske ved sædvanlige metoder såsom inddampning under reduceret tryk, ekstraktion med et opløsningsmiddel, behandling med en harpiks (fx anion- eller kationbytterharpiks, ikke-ionisk adsorptionsharpiks), behandling med et sædvanligt adsorberende middel (fx aktivkul, 30 kiselsyre, silicagel, aluminiumcellulose, etc.), krystallisation, omkrystallisation, søjlechromatografi under anvendelse af silicagel og lignende, væskesøjlechromatografi under anvendelse af silicagel og lignende, og lignende.
DK 162631 B
8
Den således vundne forbindelse med betegnelsen FR-900216 kan omdannes til det tilsvarende farmaceutisk acceptable syreadditionssalt deraf ved behandling med en syre på sædvanlig måde.
Hensigtsmæssige farmaceutisk acceptable syreadditionssalte af for-5 bindeisen med betegnelsen FR-900216 kan omfatte uorganiske eller organiske syreadditionssalte såsom eddikesyresalt, mælkesyresalt, maleinsyresalt, fumarsyresalt, oxalsyresalt, citronsyresalt, methan-sulfonsyresalt, saltsyresalt, svovlsyresalt, phosphorsyresalt og lignende.
10 Det farmaceutiske præparat ifølge opfindelsen kan anvendes i form af et farmaceutisk præparat, fx i fast, halvfast eller flydende form, hvilket præparat indeholder forbindelsen med betegnelsen FR-900216 eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf som aktiv bestanddel i blanding med en organisk eller uorganisk bærer eller 15 excipiens, som er egnet til ekstern, enteral eller parenteral anvendelse. Den aktive bestanddel kan fx blandes med sædvanlige ikke-toxiske farmaceutisk acceptable bærere for tabletter, pellets, kapsler, suppositorier, opløsninger, emulsioner, suspensioner og en hvilken som helst anden form, der er egnet til anvendelse. Om nødven-20 digt kan der herudover anvendes hjælpestoffer, stabilisatorer, fortykkelsesmidler, farvestoffer og parfumer. Forbindelsen med betegnelsen FR-900216 inkorporeres i det farmaceutiske præparat i en mængde, som er tilstrækkelig til at fremkalde den ønskede antitumorvirkning på sygdomsprocesserne eller -tilstandene.
25 For at anvende dette præparat til mennesker foretrækkes det at anvende det til intravenøs, intramuskulær eller oral administration.
Medens doseringen af en terapeutisk virksom mængde af forbindelsen med betegnelsen FR-900216 varierer i henhold til og også afhænger af alderen og tilstanden af hver enkelt patient, som skal behandles, 30 gives der sædvanligvis, til behandling af tumor, ved intravenøs administration en daglig dosis på 0,01-1 mg/kg, fortrinsvis ca. 0,1 mg/kg, ved intramuskulær administration en daglig dosis på 0,1-10 mg/kg, fortrinsvis ca. 1 mg/kg, og ved oral administration en daglig dosis på 0,5-50 mg/kg, fortrinsvis ca. 5 mg/kg af forbindelsen med 35 betegnelsen FR-900216.
DK 162631 B
9
Opfindelsen angår også anvendelse af forbindelsen FR-900216 eller et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf til fremstilling af et farmaceutisk præparat til behandling af tumorer.
Antitumorvirkningen hos forbindelsen med betegnelsen FR-900216 il-5 lustreres nedenfor.
Test 1
Antitumorvirkning af forbindelsen med betegnelsen FR-900216 mod lymfocytisk leukæmi L1210 og P388: 1) Intraperitoneal administration: 10 Fremgangsmåde
Celler fra lymfocytisk leukæmi (L1210 eller P388) blev successivt overført til DBA/2-mus. På dag 7 blev ascites opsamlet fra bughulen for at isolere tumorcellerne, ud fra hvilke en suspension af tumorcellerne blev fremstillet. Cellesuspensionen (0,2 ml) indeholdende 15 10S celler (L1210) eller 10^ celler (P388) blev implanteret intra- peritonealt i BDF^-hunmus (7 uger gamle og med en vægt på 17,9-21,7 g for L1210, og 8 uger gamle og med en vægt på 18,4-22,5 g for P388).
Den til forsøget anvendte prøve af forbindelsen med betegnelsen FR-900216 blev solubiliseret i methanol, inddampet i vakuum og der-20 efter suspenderet i steriliseret vand.
24 timer efter implanteringen af tumorcellerne til musene blev forbindelsen med betegnelsen FR-900216 administreret intraperitonealt i de respektive graduerede doser til hver behandlingsgruppe (kun vand i kontrolgruppen) én gang daglig i 4 dage.
25 Antitumorvirkningen af forbindelsen med betegnelsen FR-900216 over for leukæmier blev bedømt ud fra stigningen i levetiden hos den behandlede gruppe i forhold til kontrolgrupperne (T/C x 100), hvor T
betegner den mediane overlevelsestid (MST) for den behandlede gruppe, og C betegner den mediane overlevelsestid for kontrolgruppen.
DK 162631 B
10
Resultat
Forsøgsresultatet er angivet i nedenstående tabel I.
5 Tabel I
Tumor- Doseret/ Antal Enkelt- Toxiske Gennem- T/C Vægtceller kontrol mus dosis døds- snitlig x 100 æn- (/ig/- fald overle- (%) dring kg) velses- (g) 10 tid dag (dage) 0-4
Lymfocy- doseret 10 1000 0 13,1 152 -1,8 tisk med for- 10 500 0 11,3 131 -0,6 15 leukæmi bindeisen 10 250 0 10,4 121 -0,1 L1210 FR-900216 10 125 0 9,3 108 +0,2
Kontrol 20 0 8,6 100 +0,6
Lymfo- doseret 10 500 0 14,5 121 -2,7 cytisk med for- 10 250 0 16,0 133 -2,2 20 leukæmi bindeisen 10 125 0 14,0 117 -1,7 P388 FR-900216
Kontrol 20 - 0 12,0 100 -1,0 2) Oral administration: 25 Fremgangsmåde
Celler fra lymfocytisk leukæmi L1210 blev successivt overført til DBA/2-mus. På dag 7 blev ascites opsamlet fra den intraperitoneale hule for at isolere tumorcelleme, ud fra hvilke en suspension af tumorcellerne blev fremstillet. Cellesuspensionen (0,2 ml) indeholdende
DK 162631B
11 iO5 celler blev implanteret intraperitonealt til BDF^-mus, der var 7 uger gamle og vejede 17,9-21,7 g.
Den til forsøget anvendte prøve af forbindelsen med betegnelsen FR-900216 blev solubiliseret i methanol, inddampet i vakuum og der-5 efter suspenderet i steriliseret vand.
24 timer efter implanteringen af tumorcelleme til musene blev forbindelsen med betegnelsen FR-900216 administreret oralt i doser på henholdsvis 10.000 og 30.000 /ig/kg til hver behandlet gruppe (kun vand til kontrolgruppen) én gang daglig i 4 dage.
10 Antitumorvirkningen af forbindelsen med betegnelsen FR-900216 blev bedømt ud fra stigningen i levetid for den behandlede gruppe i forhold til kontrolgruppen (T/C x 100) i leukæmi, hvor T betegner den gennemsnitlige overlevelsestid (MST) for den behandlede gruppe, og C betegner den gennemsnitlige overlevelsestid for kontrolgruppen.
15 Resultat
Forsøgsresultatet er vist i nedenstående tabel II.
Tabel II
Tumorceller Doseret/kontrol Antal mus Enkeltdosis T/C
(Mg/kg) x 100 20 (%)
Lymfocytisk doseret med for- leukæmi bindeisen 5 30000 173 L1210 FR-900216 5 10000 122 25
Kontrol 5 - 100
Test 2
DK 162631 B
12
Antitumorvirkning af forbindelsen med betegnelsen FR-900216 mod melanoma B16:
Fremgangsmåde 5 14 dage efter subcutan implantering af melanoma B16-celler til DBA/2- mus blev 1 g af tumoren adskilt aseptisk fra musen og homogeniseret i 10 ml Haiik's opløsning. 0,5 ml af homogenatet blev inokuleret i 12 uger gamle BDF^-mus med en vægt på 19,7-28,4 g. 24 timer efter im-planteringen af tumorcelleme blev graduerede doser af forbindelsen 10 med betegnelsen FR-900216 administreret intraperitonealt til musene én gang daglig på dag 1, 2, 3 og 4. Forbindelsen med betegnelsen FR-900216 blev først opløst i methanol og inddampet i vakuum ved tilsætning af vand og forelå til sidst i vandig suspension. Tumoraktiviteten blev bedømt ud fra T/C (Z), som beskrevet i test 1.
15 Resultat
Forsøgsresultatet er vist i nedenstående tabel III.
Tabel III
Tumorcel- Doseret/ Antal Enkelt- Toxiske Gennem- T/C Vægtler kontrol mus dosis døds- snitlig x 100 an- 20 (/*g/- fald overlevel- (Z) dring kg) sestid (g) (dage) dag 0-4 25 Mus doseret 10 1000 0 19,0 136 -3,6 melanoma med for- 10 500 0 17,5 125 -0,6 B16 bindeisen 10 250 0 17,0 121 +0,2 FR-900216
Kontrol 20 - 0 14,0 100 . -0,2 30___
Test 3
DK 162631 B
13
Antitumorvirkning af forbindelsen med betegnelsen FR-900216 overfor subrenalkapsel-fremmedpodet humant brystcarcinom MX-1:
Fremgangsmåde 5 Antitumorvirkningen af forbindelsen med betegnelsen FR-900216 blev bestemt i et eksperimentelt tumorsystem hos Swiss-nu/nu-mus, Swiss-nu/nu-mus blev subcutant implanteret med et 2 x 2 mm fragment af MX-1-celler. Når donorens tumor nåede en vægt på ca. 1 g (30 dage efter implantationen af tumorceller), blev MX-l-celler implanteret med et 10 1 x 1 x 1 mm fragment under den subrenale kapsel under anvendelse af en 16 gauge (1,62 mm) trokar efter at have blotlagt nyren med et 7 mm's dorsalt snit i huden. Såret blev lukket med en 9 mm's sårklemme, efter at bughinden var blevet lukket med 1-4 silkesuturer. Én dag efter implantering af tumorcellerne blev graduerede doser af for-15 bindeisen med betegnelsen FR-900216 administreret intraperitonealt til mus. De i forsøget anvendte prøver af forbindelsen med betegnelsen FR-900216 blev solubiliseret i methanol, inddampet i vakuum og derefter suspenderet i steriliseret vand. Behandlingen sker med 4 dages mellemrum på dag 1, 5 og 9. Kontrolmusene modtog intraperitone-20 alt doser af fysiologisk saltopløsning. Injektionsvolumenet var 0,2 ml i alle forsøgene. 6 mus blev anvendt til hver forsøgsgruppe. På dag 1 og 11 blev tumorlængden og tumorbredden målt. Antitumorvirkningen blev beregnet i henhold til protokollerne for selekterede in vivo-modeller i NGI, USA.
25 Resultat
Resultatet er vist i tabel IV.
DK 162631 B
14
Tabel IV
Doseret/kontrol Dosis (/ig/kg) T/C x 100
Doseret med for- 2000 -26 5 bindeisen 1000 3 FR-900216 ‘ 500 2 250 34
Kontrol - 100 10 Nedenstående fremstillinger tjener til belysning af fremstillingen af forbindelsen med betegnelsen FR-900216.
Fremstilling 1 80 ml podningsmedium indeholdende 1% majsstivelse, 0,5% glucose, 1% glutenmel, 1% tørgær og 1% majsstøbevand (justeret til en pH-værdi på 15 7,0 før sterilisering) blev hældt i hver af 6 Erlenmeyer-kolber på hver 275 ml og steriliseret ved 120eC i 30 minutter. En smule skråkultur af Rhizopus sp. nr. F-1360 ATCC 20577 blev inokuleret til hvert af medierne og dyrket ved 30°C i 48 timer ved 250 omdr./min. under anvendelse af en rotationsryster. Det samlede volumen af således vundet 20 podekultur blev inokuleret igen til et podningsmedium (20 liter) indeholdende 2% af en opløselig stivelse, 0,5% glycerin, 0,5% glucose, 1% glutenmel, 1% tørgær, 1% majsstøbevand (justeret til en pH-værdi på 7,0 før sterilisering) i en 30 liters rustfri fermenteringsbeholder, som var blevet steriliseret ved 120°C i 30 minutter, og dyrket ved 30°C i 25 24 timer under beluftning med 1 WM og rystning ved 200 omdr./min.
Endvidere blev et samlet volumen af således vundet podningskultur inokuleret til et produktionsmedium (150 liter) indeholdende 2% opløselig stivelse, 0,5% glycerin, 1% tørgær, 1% bomuldsfrømel, 0,5% sojabønnemel og calciumcarbonat (0,2%) (pH-værdi 7,0) i en 200 liters 30 rustfri fermenteringsbeholder, som var blevet steriliseret ved 120°C i 30 minutter, og dyrket ved 30°C i 72 timer under beluftning med 0,7 WM og rystning ved 250 omdr./min.
DK 162631 B
15
Den således vundne kulturvæske blev filtreret ved hjælp af 5 kg diatoméjord. Til det vundne mycelium blev sat 80 liter ethylacetat, og der blev ekstraheret. Denne ekstraktionsprocedure blev foretaget 2 gange, og ekstrakterne blev forenet. Ekstrakten blev inddampet i va-5 kuum til et volumen på 1 liter. Koncentratet blev vasket med 500 ml 0,5%'s vandig natriumhydrogencarbonatopløsning, tørret over vandfrit natriumsulfat og yderligere inddampet i vakuum til et volumen på 300 ml. Det således vundne koncentrat blev underkastet søjlechromatografi under anvendelse af 2500 ml silicagel. Søjlen blev vasket med chlo-10 roform og derefter elueret med en blanding af chloroform og methanol (100:1). De fraktioner, som indeholdt forbindelsen med betegnelsen FR-900216, blev koncentreret til et volumen på 20 ml. Til koncentratet blev der sat 1,5 liter hexan, og koncentratet blev filtreret. Det således vundne bundfald blev tørret, hvilket gav 1,1 g af et råt pul-15 ver. Råpulveret blev opløst i 100 ml methanol og blev derefter underkastet omvendt fase-søjlechromatografi under anvendelse af 1500 ml NS-gel (fremstillet af Nihon Seimitsukagaku Co., Ltd.). Søjlen blev elueret med methanol, og de fraktioner, som indeholdt forbindelsen med betegnelsen FR-900216, blev indsamlet (i alt 800 ml) og inddampet til 20 et volumen på 10 ml. 1 liter hexan sattes til koncentratet, som blev filtreret. Det således vundne bundfald blev tørret, hvilket gav 630 mg af et pulver. Pulveret blev renset under anvendelse af tyndtlags-chromatografi (fremkaldeopløsningsmiddel: chloroform/methanol - 20:1).
Bånd indeholdende forbindelsen med betegnelsen FR-900216 blev indsamlet 25 og suspenderet i en blanding af chloroform og methanol (10:1). Ekstrakten blev koncentreret til et volumen på 5 ml og sat til 500 ml hexan, hvilket gav 300 mg af et farveløst pulver af forbindelsen med betegnelsen FR-900216.
Analyse: C 66,30 H 7,61 N 2,18 30 Fremstilling 2 80 ml podemedium indeholdende 1% majsstivelse, 0,5% glucose, 1% glutenmel, 1% tørgær og 1% majsstøbevand (justeret til en pH-værdi på 7,0 før sterilisering) blev hældt i hver af seks Erlenmeyer-kolber på hver 275 ml og steriliseret ved 120°C i 30 minutter. En smule kultur på 35 skråsubstrat af Bhizopus sp. nr. F-1360 ATCC 20577 blev inokuleret til
DK 162631 B
16 hver af medierne og dyrket ved 30QC i 48 timer ved 250 omdr./min. under anvendelse af en rotationsryster. Det samlede volumen af således vundet podekultur blev igen inokuleret til 20 liter af et podemedium indeholdende 2%'s opløselig stivelse, 0,5% glycerin, 0,5% glucose, 1% 5 glutenmel, 1% tørgær og 1% maj s støbevand (justeret til en pH-værdi på 7,0 før sterilisering) i en 30 liters rustfri fermenteringsbeholder, som var blevet steriliseret ved 120°C i 30 minutter, og dyrket ved 30°C i 24 timer under beluftning med 1 WM og rystning ved 200 omdr./min. Et samlet volumen af den således vundne podekultur blev 10 endvidere inokuleret til 150 liter af et produktionsmedium indeholdende 2% opløselig stivelse, 0,5% glycerin, 1% tørgær, 1% bomuldsfrømel, 0,5% sojabønnemel og calciumcarbonat (0,2%) (pH-værdi 7,0) i en 200 liters rustfri fermenteringsbeholder, som var blevet steriliseret ved 120°C i 30 minutter, og dyrket ved 30eC i 72 timer under beluftning med 0,7 WM 15 og rystning ved 250 omdr./min.
Den således vundne kulturvæske blev filtreret ved hjælp af 5 kg diatoméjord. Til det vundne mycelium sattes 80 liter ethylacetat, og der blev ekstraheret. Denne ekstraktionsprocedure blev udført to gange, og ekstrakterne blev forenet. Ekstrakten blev koncentreret i vakuum til et 20 volumen på 1 liter. Koncentratet blev vasket med 500 ml 0,5%'s vandig natriumhydrogencarbonatopløsning, tørret over vandfrit natriumsulfat og yderligere koncentreret i vakuum til et volumen på 300 ml. Det således vundne koncentrat blev underkastet søjlechromatografi under anvendelse af 2500 ml silicagel. Søjlen blev vasket med chloroform og derefter 25 elueret med en blanding af chloroform og methanol (100:1). De fraktioner, som indeholdt forbindelsen med betegnelsen ER-900216, blev koncentreret til et volumen på 50 ml. Til koncentratet sattes 2 liter hexan, og koncentratet blev filtreret. Det således vundne bundfald blev tørret, hvilket gav 2,5 g af et råt pulver. Råpulveret blev opløst i 10 30 ml chloroform og underkastet høj tryksvæskechromatografi (fremstillet af Nippon Water Limited Co., Ltd., søjle: Prepack 500 pakket med silicagel) og elueret med en blanding af chloroform og methanol (100:15). De således vundne fraktioner, som indeholdt forbindelsen med betegnelsen FR-900216, blev indsamlet, koncentreret i vakuum til et volumen på 10 35 ml og sat til 100 ml hexan, hvilket gav et bundfald. Det således vundne bundfald blev tørret, hvilket gav 1,2 g af et pulver. Denne fremgangs- 17
DK 16263 1 B
måde blev udført endnu en gang, hvilket gav 500 mg af et farveløst pulver af forbindelsen med betegnelsen FR-900216.
Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler: EKSEMPEL 1 5 Suspension til intramuskulær injektion: FR-900216-forbindelse 50 mg
Polysolvat 80 10 mg
Natriumchlorid 0,09 g
Destilleret vand 4 ml 10 EKSEMPEL 2
Emulsion til intravenøs injektion: FR-900216-forbindelse 5 mg
Sesamolie 100 mg
Polysolvat 80 10 mg 15 Natriumchlorid 0,09 g EKSEMPEL 3
Suspension til langtidsvirkende intramuskulær injektion: FR-900216-forbindelse 50 mg
Sesamolie 4 ml
Claims (3)
1. Forbindelse med betegnelsen FR-900216 eller et farmaceutisk accepta belt syreadditionssalt deraf til anvendelse som terapeutisk aktivt stof, kendetegnet ved, at forbindelsen har følgende fysiske og kemiske egenskaber: 15 1) molekylvægt: 625 (massespektrum) 2. molekylformel: C35H47NO9 3. smeltepunkt: 20 130-135eC (sønderdeling) 4. specifik drejning: [a]g° = +140° (c -1, CHCI3) 5. ultraviolet absorptionsspektrum: Amax(CH3°H) - 232 nm (e - 11.300) 25 - 238 nm (skulder) = 285 nm (skulder) = 296 nm (« = 55500) = 308 nm (e - 70300) - 324 nm (e = 51900). DK 162631 B 19
6. Infrarødt absorptionsspektrum: umax(KBr): 3450, 3140, 2960, 2920, 2860, 1730, 1715 (skulder), 1607, 1575, 1455, 1445, 1435, 1377, 1360, 1343, 1305, 1280, 1260, 1225, 1190, 1170, 1140, 1107, 1077, 1045, 1030 (skulder), 980, 970, 950, 930, 915, 5 905, 895, 875, 860, 850, 835, 825, 790, 780, 755, 705, 670 og 635 cm'1. 7) 1H-NMR-Spektrum (CDCI3, intern standard: tetramethylsilan), som vist på tegningen. 8) ^C-NMR-Spektrum (CDCI3, intern standard: tetramethylsilan): S (ppm): 9,65, 11,41, 11,71, 13,77, 14,32, 16,93, 22,57, 29,24, 31,49, 10 31,85, 34,16, 35,86, 36,40, 37,98, 45,32, 54,18, 56,12, 63,77, 65,10, 76,81, 82,33, 89,25, 120,80, 123,77, 126,44, 129,29, 135,97, 136,21, 136,57, 137,67, 138,51, 139,54, 160,84, 168,01, 169,34.
9. Opløselighed: Fuldt opløselig i methanol, ethanol, acetone og ethylacetat 15 Opløselig i chloroform og benzen Svagt opløselig i hexan og diethylether Uopløselig i vand.
10. Farvereaktion: Positiv: Dragendorff-reaktion, iodreaktion 20 Negativ: Ferrichloridreaktion, Molisch-reaktion, nirihydr in- reaktion, Ehrlich- reakt ion.
11. Natur: Svagt basisk forbindelse.
2. Farmaceutisk præparat, 25 kendetegnet ved, at det omfatter forbindelsen med betegnelsen FR-900216 ifølge krav 1 eller et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf sammen med en farmaceutisk acceptabel, i det væsentlige ikke-toxisk bærer eller excipiens. DK 162631 B 20
3. Anvendelse af forbindelsen med betegnelsen FR-900216 ifølge krav 1 eller et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf til fremstilling af et farmaceutisk præparat til behandling af tumorer.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13350683 | 1983-07-21 | ||
| JP58133506A JPS6027390A (ja) | 1983-07-21 | 1983-07-21 | Ｆｒ−９００２１６物質を含有する抗腫瘍剤 |
| JP4074884 | 1984-03-02 | ||
| JP4074884 | 1984-03-02 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK348784D0 DK348784D0 (da) | 1984-07-16 |
| DK348784A DK348784A (da) | 1985-01-22 |
| DK162631B true DK162631B (da) | 1991-11-25 |
| DK162631C DK162631C (da) | 1992-04-13 |
Family
ID=26380266
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK348784A DK162631C (da) | 1983-07-21 | 1984-07-16 | Forbindelse, betegnet fr-900216, til anvendelse som terapeutisk aktivt stof, farmaceutisk praeparat indeholdende forbindelsen samt anvendelse af forbindelsen |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4680178A (da) |
| EP (1) | EP0132772B1 (da) |
| AU (1) | AU560728B2 (da) |
| DE (1) | DE3484155D1 (da) |
| DK (1) | DK162631C (da) |
| IE (1) | IE57748B1 (da) |
| IL (1) | IL72451A (da) |
| PH (1) | PH20405A (da) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1334757C (en) * | 1988-07-06 | 1995-03-14 | Masakatsu Kaneko | Rhizoxin derivatives and their use as anti-tumor agents |
| US5352689A (en) * | 1988-07-06 | 1994-10-04 | Sankyo Company, Limited | Rhizoxin derivatives and their use as anti-tumor agents |
| DE102005026417B3 (de) * | 2005-06-06 | 2006-05-11 | Leibniz-Institut für Naturstoff-Forschung und Infektionsbiologie e.V. | Mikroorganismen Burkholderia rhizoxina, neue Endosymbionten aus Rhizopus sp. und Verfahren zur Herstellung von Rhizoxin und/oder Rhizoxin-Derivaten unter Verwendung dieser Mikroorganismen |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MX7065E (es) * | 1980-06-06 | 1987-04-10 | Sankyo Co | Un procedimiento microbiologico para preparar derivados de ml-236b |
| JPS6084220A (ja) * | 1983-10-17 | 1985-05-13 | Norin Suisansyo Nogyo Kankyo Gijutsu Kenkyusho | 植物病原菌リゾ−プス・キネンシスの代謝産物リゾキシンを有効成分とする抗腫瘍剤 |
-
1984
- 1984-07-13 PH PH30984A patent/PH20405A/en unknown
- 1984-07-16 US US06/631,244 patent/US4680178A/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-16 IE IE1832/84A patent/IE57748B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-07-16 DK DK348784A patent/DK162631C/da not_active IP Right Cessation
- 1984-07-18 DE DE8484108444T patent/DE3484155D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1984-07-18 EP EP84108444A patent/EP0132772B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-19 IL IL72451A patent/IL72451A/xx not_active IP Right Cessation
- 1984-07-19 AU AU30853/84A patent/AU560728B2/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3484155D1 (de) | 1991-04-04 |
| IL72451A0 (en) | 1984-11-30 |
| EP0132772A2 (en) | 1985-02-13 |
| PH20405A (en) | 1987-01-05 |
| IE57748B1 (en) | 1993-03-24 |
| EP0132772A3 (en) | 1987-08-05 |
| IE841832L (en) | 1985-01-21 |
| DK348784D0 (da) | 1984-07-16 |
| DK162631C (da) | 1992-04-13 |
| AU3085384A (en) | 1985-01-24 |
| EP0132772B1 (en) | 1991-02-27 |
| US4680178A (en) | 1987-07-14 |
| IL72451A (en) | 1988-03-31 |
| DK348784A (da) | 1985-01-22 |
| AU560728B2 (en) | 1987-04-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3111470B2 (ja) | 新規ポリペプチド化合物およびその製造法 | |
| JP3039780B2 (ja) | 免疫抑制剤の生産法 | |
| JPH02257886A (ja) | Ｗｓ６０４９―ｂ物質、その製造法およびそれを有効成分として含有する抗癌剤 | |
| KR0135600B1 (ko) | 항암 항생물질 mi43-37f11, 그 제조방법 및 그 용도 | |
| WO1999041265A1 (fr) | Nouvelles substances kf-1040 et leur procede de fabrication | |
| EP0132772B1 (en) | Fr-900216 substance obtainable by cultivating atcc 20577 for use as an active therapeutic substance and pharmaceutical antitumor composition comprising fr-900216 substance | |
| US5756536A (en) | Microbial transformation of taxol and cephalomannine | |
| JPH0447648B2 (da) | ||
| JPH0327559B2 (da) | ||
| CN103275138B (zh) | 十六碳双乙酰化无双键内酯型槐糖脂及其应用 | |
| JPH03141290A (ja) | 抗腫瘍抗生物質ｂｍｙ―４１３３９ | |
| KR970002492B1 (ko) | 신규 트리펩티드 유도체 | |
| JP2646707B2 (ja) | 新規化合物ｗｆ２０１５ａおよびｂ、それらの製造法ならびにそれらを含有する組成物 | |
| JPH0434522B2 (da) | ||
| JP2607259B2 (ja) | 新規物質ｋｓ―５０４類 | |
| JP2706843B2 (ja) | 新規アントラキノン誘導体、その製造方法及び該誘導体を含有する抗腫瘍剤 | |
| JP2594085B2 (ja) | 新規抗腫瘍抗生物質ｓｆ２５７５物質ならびにその製造法 | |
| JPH07506332A (ja) | 医薬としての複素環化合物のリン酸エステル | |
| JP2002068980A (ja) | 生理活性物質ｎｋ３４８９６類縁体の用途 | |
| JP2002510335A (ja) | 新規化合物ｗｆ００１４４ | |
| JPH10265491A (ja) | 新規テルペン系化合物０４０６ｔｐ−１ | |
| JPH032184A (ja) | 新規抗生物質ｎｋ８６―０２７９、その製法及びその用途 | |
| JP2000026468A (ja) | ヒト免疫不全ウイルス増殖阻害物質およびそれらの製造方法 | |
| JPH04224559A (ja) | 血管新生阻害物質 ｆｒ−９０１４４８ およびｆｒ−９０１４４９ | |
| JP2001103990A (ja) | 新規ｆｏｍ−８１０８物質およびその製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |