DK162651B

DK162651B - Fremgangsmaade til fremstilling af acryl-copolymere der er anvendelige som kationbyttere

Info

Publication number: DK162651B
Application number: DK513282A
Authority: DK
Inventors: Christian Aspisi; Bernard Calas; Jacques Daunis; Michel Follet; Robert Jacquier; Joseph Parello
Original assignee: Expansia Sa
Priority date: 1981-11-19
Filing date: 1982-11-18
Publication date: 1991-11-25
Also published as: MX169477B; DE3265458D1; EP0081408A1; PL137653B1; FI70234B; KR840002414A; CA1199448A; KR860000526B1; NZ202539A; PL138979B1; NO823864L; NO161978B; DK162651C; KR860000559B1; FI823905A0; NO161977B; AU556992B2; AU9067882A; ATE28468T1; US4439545A

Description

i

DK 16265 1 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte acrylcopolymere, der er anvendelige som kationbyttere.

5 De omhandlede acrylpolymere er tværbundne, statistiske acrylcopolymere, der er anvendelige i et stort udvalg af opløsningsmidler (vand, methylenchlorid, chloroform, methanol, ethanol, dimethylformamid, pyridin etc.) De er anvendelige ved kromatografering baseret på ionbytning.

10

Kromatografering ved ionbytning består i, at man anvender et 'uopløseligt bærestof (matrix), på hvilket er fæstnet ioniserbare grupper knyttet til ioner med modsat fortegn (mod-ioner).

15

Disse sidstnævnte kan udskiftes med andre ioner med samme fortegn, som er indeholdt i en mobil fase, som man bringer i kontakt med matrixen. Afhængig af den sure eller basiske karakter af de fastgjorte grupper taler man om en 20 kationbytterharpiks eller en anionbytterharpiks.

Ovenstående teknik er anvendelig ved adskillelsen af forskellige bestanddele i en blanding i opløsning; de ikke-ioniserede molekyler vil hurtigt blive elueret, de ioni-25 serede molekyler vil i større eller mindre udstrækning blive tilbageholdt på grund af udskiftningen af ioner, som trænger ind i matrix.

Den foreliggende opfindelse angår således fremstillingen 30 af hidtil ukendte copolymere, der især er anvendelige som kationbytterharpikser.

Der foreligger op til nu et vist antal acrylharpikser eller methacrylharpikser indeholdende carboxylsyregrupper, 35 som er anvendelige som bærestof ved kromatografering baseret på ionbytning (kationbyttere).

DK 162651 B

2

De opnås sædvanligvis ud fra ikke-funktionelle polymere, som fremstilles ved radikal-copolymerisation af acryl-syrederivater eller methacrylsyrederivater og et tværbindingsmiddel, som kan være enten methylen-bis-acrylamid 5 (N,N,-diacrylyldiaminomethan, forkortet MBA), eller di- vinylbenzen.

Syregrupperne indføres derpå i de fleste tilfælde i matricen ved hjælp af kemiske modifikationer, som indtræder 10 efter polymerisationen. Disse reaktioner er vanskelige at regulere, og de kan føre til en mangel på homogenitet med hensyn til funktionaliteten (hydrolyse af gitterstrukturen eller af tværbindingsmidlet).

15 Copolymerisatet af acrylamid og methylen-bis-acrylamid (der er kendt under handelsmærket "BIOGEL P" og fremstilles af firmaet "BIORAD Laboratories") fører således, efter delvis hydrolyse med natriumhydroxid, til det bærestof, der er kendt under handelsmærket "BIOGEL 70" (INMAN 20 og DINTZIS, Biochemistry, 1969 8, 4074).

Det fremgår af disse harpiksers kemiske struktur (se nedenstående afbildning), at carboxylgruppen er tætliggende- ved polymerkæden; som følge deraf vil steriske hin-25 dringer genere den gensidige reaktion mellem omfangsrige molekyler og syre-punktet.

R R R

I I I

30 -CH-CH--CH-CH —CH—CH—

I I I

0=C HOOC 0=C

I I

H2N m NH2J n R = H eller -CH..

35 3

DK 162651 B

Den samme kritik kan formuleres over for andre harpikser, såsom dem der kendes under handelsmærket "TRISACRYL" og fremstilles af "Pharmindustrie" (fransk patentskrift nr.

2 378 808 og 2 482 112), der er opnået ved copolymerisa-5 tion med en funktionsgruppebærende monomer.

Visse polyacrylamidgeler ("BIOGEL, DUOLITE") er kemisk ustabile i basisk medium på grund af hydrolysen af amidgrupper og carboxylgrupper, hvilket begrænser deres an-10 vendelsesområde (INMAN og DINTZIS, som citeret).

Man"bør ligeledes mærke sig de begrænsninger, som er indført ved den manglende mekaniske stabilitet af polyacryl-amider indeholdende primære amidgrupper (SCHOUTEN, Affi-15 ni ty Chromatography: Bioselective Absorption on Inert

Matrices, Wiley, 1981).

Man kan endelig nævne en harpiks omtalt af SHEPPARD et Coll. (J.C.S. Perkin Trans I, 1981, p. 529 og 538), som 20 er opnået ved copolymerisation af N-acrylyldimethylamid, l,2-N,N'-diacrylyldiaminoethan samt af methylesteren af N-acrylylsarcosin. Dette bærestof er imidlertid aldrig blevet hydrolyseret til en copolymer af N-acrylyldimethylamid, 1,2-N-diacrylyldiamino-ethan og N-acrylylsarco-25 sin for at blive anvendt som kationbytter. Dersom man gennemfører denne omdannelse og afprøver den således opnåede sure harpiks ved ionbytningskromatografi, konstaterer man meget betydelige volumenændringer som funktion af elueringsmidlets ionstyrke. Når man således arbejder 30 med natriumchloridopløsninger med progressivt stigende koncentrationer på mellem 0 og 0,5 M, kan man bemærke en rumfangs-kontraktion større end 50% for det hydrolyserede SHEPPARD-bærestof; dette medfører et betydeligt dødt rumfang og derigennem en meget betydelig usikkerhed med hen-35 syn til værdien for elueringsgradienten; herfra stammer den ømtålelige anvendelse af denne type bærestof ved kat-ionbytterkromatografi.

4

DK 162651 B

Til tilvejebringelse af en hidtil ukendt type acryl-copolymere, som ikke udviser de fra de allerede kendte forbindelser kendte ulemper, har man ved den foreliggende opfindelse tilvejebragt en fremgangsmåde til fremstilling 5 af en hidtil ukendt tværbundet, statistisk, polyvalent type copolymere, ved hjælp af copolymerisation af den i kravets indledning nævnte art af tre forskellige monomere, der er defineret, som det er anført i kravets kendetegnende del.

10

Anvendelsen som den monomere, der tjener til dannelsen af matrix, af N-acrylylpolymethylenimin (1) eller af N-acrylyldialkylamid (2) med disubstituerede amidgrupper, tillader fuldstændig undertrykkelse af angreb på hydro-15 gen-bindingerne. De fremstillede harpikser udviser ligeledes et kraftigt opkvældningsindeks i et stort udvalg af organiske opløsningsmidler (protiske og aprotiske) samt i vandige bufferopløsninger med forskellige pH-værdier.

20 Indføringen af funktionsdygtige grupper, som gennemføres under anvendelsen af N-acrylylaminosyrer (eller -estere) (4), (5) eller (6), muliggør modifikationen af arten og • af længden af den gren, som adskiller syregruppen eller estergruppen fra polymer-skelettet.

25

Man kender visse monomere, som kan indtræde i matrix. De er blevet omtalt sammen med fremgangsmåder til fremstilling deraf, i forskellige publikationer, deriblandt: 30 Forbindelser (1): R^ = Η Z = -(CH2)4, -(CH2)5 z = -(ch2)2-o-(ch2)2 PARROD et Coll., J. Polymer. Sci., 1958, 29, 111.

Forbindelser (2): R^ = H R2 = “^Η3 35 RATCHFORD et Coll., J. Amer. Chem. Soc., 1947, 69, 1911.

5

DK 16265 1 B

R1 * H R2 _C2H5 USA patentskrift nr. 2 683 741.

Forbindelser (3): 5

Man kender midler med formlen (3): n2 = 1 (handelsvare) n2 * 2 10 SHEPPARD et Coll., J. Chem. Soc. Perkin I, 1981, 529.

Endelig er i litteraturen omtalt funktionsgruppebærende midler med formlerne (4), (5) eller (6).

15 Forbindelser (4): R1 = R3 = H n3 = 1, 2, 3 eller 5.

BROWN og Coll., C.R. Acad. Sci., 1978, 287c, 125.

20 CHg, R3 = H n3 = 1, 2, 3 eller 5 BATZ og KOLDEHOFF, Makromol. Chem., 1976, 177, 683.

WINSTON og KIRCHNER Macromolécules 1978, 11, 89 25 LOUPEK og Coll., Bioch. Biophys. Act. 1977, 481, 289.

Forbindelser (5): R1 - H r3 CH3 30 CH-. OH., / / 'r\ r4 = -ch3, -ch , -CH2-CH , -CH2-CH2-S-CH3 ell. -CH2-^/> 'Nx'CH3 SAKOTA, KOINE NIPPON ZAGAKIN ZASHI 1967, 88 (10), 1087.

35

DK 162651 B

6

Copolymerisationen af disse to monomer-kategorier, I på den ene side og III på den anden side, der anvendes henholdsvis som matrix og som funktionelt middel, sammen med et tværbindingsmiddel af typen II, fører til opnåelsen af 5 harpikser med fysiske egenskaber, der er velegnede i forbindelse med ionbytterkromatografi, især med hensyn til elueringshastigheden. Volumen-sammentrækningerne i afhængighed af det vandige elueringsmiddels ionstyrke er således aldrig større end 15%.

10

Eftersom polymerisationsbetingelserne er fuldstændig under' kontrol, og udbytterne er høje, er det muligt at variere inden for vide rammer indholdet af funktionelle grupper. Til opnåelse heraf er det tilstrækkeligt at mo-15 dificere den relative mængde N-acrylylaminosyre (eller -ester) (III) i forhold til de to andre monomere.

De acrylpolymere som fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er tredimensionale, tværbundne, statistis-20 ke copolymere, som i copolymeriseret form indeholder: (a) 30 - 90 vægtprocent af en monomer svarende til N-acrylylpolymethylenimin med formlen (1) eller af en ' - N-acrylyldialkylamid med formlen (2); 25 (b) 2-50 vægtprocent af en monomer svarende til en N,N1-diacrylyldiaminoalkan med formlen (3); (c) 2 - 65 vægtprocent af en monomer svarende til en 30 acrylylaminosyre eller -ester, som kan være race- misk med formlen (4) eller optisk aktiv med formlen (5) eller (6).

De omhandlede forbindelser indeholder fortrinsvis: 70-90% monomer I (som definerer matrix) svarende til formlerne (1) og (2); 35 7

DK 162651 B

3 - 10% af en monomer II (tværbindingsmiddel) svarende til formlen (3); 10 - 20% af en monomer III (middel til indføring af 5 funktionelle grupper) svarende til formlerne (4), (5) og (6).

Man har ifølge opfindelsen været i stand til at fremstille bærestoffer indeholdende 0,2 - 10 milliækvivalenter 10 carboxylsyregruppe pr. gram tørt bærestof (direkte eller efter forsæbning). Man har på den anden side bemærket, at der'ikke forekommer nogen hydrolyse af estergruppen under polymerisationen.

15 De copolymere på syreform er kemisk stabile i klart sure eller basiske medier. Behandling igennem adskillige dage med saltsyreopløsninger eller med natriumhydroxidopløsninger på 0,5 og 1 M ved omgivelsernes temperatur har vist, at der ikke forekom nogen hydrolyse, heller ikke en 20 partiel hydrolyse.

Dette er knyttet til tilstedeværelsen på den monomere som danner matrix, af et forholdsvis pakket sekundært amid, som er meget mere stabilt end de primære aminer, der sæd-25 vanligvis anvendes. Dette tillader anvendelsen af de pågældende bærestoffer i et meget udvidet pH-område (1 til 14). · De således opnåede harpikser udviser pH-værdier varierende fra 4,5 til 5,0.

30 Disse copolymere er termisk stabile; man har ved opvarmning til 90 °C igennem 12 timer og et vakuum på 0,1 mm kviksølv ikke konstateret nogen ændringer.

Endelig udviser disse bærestoffer en fremragende mekanisk 35 stabilitet. Efter mekanisk omrøring gennem adskillige dage konstaterer man ikke dannelsen af smuld (ingen uklarhed i supernatantvæsken).

DK 162651B

s

De tværbundne copolymere fremstilles ifølge opfindelsen ved gennem radikal-polymerisation af de monomere I, II og III.

5 Copolymer!sationen kan især gennemføres enten som blokpolymerisation (i masse), i en blanding af ethylalkohol og vand eller dimethylformamid og vand i bufret medium (pH «s 6,0), eller i suspension i systemer bestående af vand og petroleum eller af polyvinylalkohol og vand.

10 Igangsætningen gennemføres under anvendelse af: - Koblingsforbindelser, såsom Ν,Ν,Ν',Ν'-tetramethylendi-amin (TMEDA) + alkalimetalpersulfat, 15 - ammoniumpersulfat, - eller azoisobutyronitril.

Man anvender 3 til 10% af vægten af tværbindingsmiddel 20 samt en mængde funktionel gruppe-bærende middel, der er beregnet således, at man opnår 0,2 - 5 milliækvivalenter carboxylsyregruppe pr. gram tør harpiks (direkte eller efter forsæbning); resten op til 100 vægtprocent består af den monomere, der er beregnet til at udgøre matrix.

25 Når det drejer sig om blokpolymerisation, underkaster man den vandige opløsning indeholdende de forskellige monomere og initiatoren en polymerisation i homogen fase. Den transparente gel, der dannes, formales hurtigt, vaskes og 30 sigtes; denne fremgangsmåde giver et kvantitativt udbytte især af copolymere med homogen størrelse.

Suspensionspolymerisation fører direkte til en harpiks i form af kugleformede partikler; disse vaskes omhyggeligt 35 og tørres. Deres størrelse er ligeledes meget homogen, idet deres diameter er på mellem 0,1 og 0,25 mm (mikroskopisk bestemmelse).

DK 162651 B

9 I dette tilfælde sætter man til den homogene opløsning indeholdende de forskellige monomere et polymerisationsinitieringsmiddel og en emulgator.

5 Det hele hældes derpå ud i en organisk væskefase, der ikke er blandbar med vand, og som holdes under omrøring. Omrøringshastigheden reguleres således, at man opnår en emulsion med den ønskede dråbestørrelse. Polymerisationen startes derpå enten ved tilsætning af TMBA eller ved en 10 let opvarmning.

Blandingen omrøres derpå, indtil omsætningen er tilendebragt. De opnåede harpiksperler vaskes med et carbon-hydrid-opløsningsmiddel, derpå med vand, med ethanol og 15 med ethylether. Harpiksen tørres til sidst ved omgivelsernes temperatur under et kraftigt vakuum.

Som anvendelig organisk væskefase kan man eksempelvis nævne vegetabilske olier (sojaolie, jordnøddeolie, sol-20 sikkeolie etc.) eller uorganiske olier (paraffinolie, si- liconeolie).

Emulgatoren kan være et af de produkter, der er kendt under-de kommercielle betegnelser "SPAN", "ARLACEL" eller 25 "TWEEN", anvendt i en koncentration på 0,1 til 4 volumenprocent .

De efterfølgende eksempler belyser de forskellige polymerisations-fremgangsmåder, såvel som de forskellige har- 30 pikser ifølge opfindelsen.

A. Blokcopolymerisation EKSEMPEL 1

Copolymerisation af acrylylpyrrolidin (forkortet AP), ethylen-bis-acrylamid, der også kaldes l,2-N,N'-di- 35 10

DK 162651 B

acrylyldiaminoethan (forkortet EBA) samt methylesteren af N-acrylylglycin (forkortelse A Gly 0 CHg).

Man opløser 0,12 mol (15 g) AP, 7,8 x 10-^ mol (1,31 g) -2 5 EBA og 1,631 x 10 mol (2,33 g) methylester af N-acrylylglycin i 34,2 ml vandfri ethanol. Den farveløse opløsning afgasses i 2 minutter med et ultralydapparat.

Ved tilsætning af 18 ml vand bliver opløsningen opak. Man af gasser yderligere 2 minutter og tilsætter 21,6 ml phos-10 phatbuffer (pH 6,0). Afgasningen fortsættes, indtil man genvinder en klar opløsning.

Derpå tilsættes 3,16 g ammoniumpersulfat, og man lader det opløse under afgasning. Derpå tilsættes 0,53 ml TMEDA 15 (N, N, N', N' -tetramethyl-1,2-diaminoethan). Der fremkommer hurtigt en temperaturforhøjelse, og opløsningen sætter sig til en transparent gel. Man lader henstå en halv time. Efter formaling på en såkaldt "THOMAS"-mølle lader man dekantere i vand for at fjerne det ovenpå flydende 20 smuld. Man gentager denne behandling endnu en gang. Efter filtrering vaskes harpiksen successivt med vand, med en blanding i forholdet 50:50 vand og acetone, med acetone og til sidst med ether. Det således opnåede hvide pulver tørres i 12 timer ved 80 °C under 2 mm. På denne måde 25 isoleres 13,86 g af den hvide harpiks.

Udbytte 74,4%

For at omdanne ester-harpiks til en syre-harpiks an-30 bringer man de ovenfor opnåede 13,86 g i 1300 ml molær natriumhydroxid og omrører ved 25 °C i 2 timer. Efter filtrering vaskes harpiksen successivt med vand, med saltsyre (10%), med vand indtil neutralitet, med molær natriumhydroxid (500 ml), med vand indtil neutralitet, 35 med saltsyre (10%), og til sidst med vand indtil neutralitet. Man tørrer som ovenfor ved 80 °C under 2 mm kviksølv. Efter sigtning for at fjerne de partikler, hvis

DK 162651 B

11 diameter er større end 0,25 mm, opnår man 8,8 g hvidt pulver. pKa-værdien af OH-formen er 4,4.

EKSEMPEL 2 5

Copolymerisation af AP, EBA, methylester af N-acrylyl-Æ-alanin (forkortet A 0 Ala 0 CH^).

Man anvender identiske polymerisationsbetingelser: Ud fra 10 15 g (0,12 mol) AP, 1,31 g (7,8 x 10-3 mol) EBA og 2,55 g _2 (1,631 og 10 mol) methylester af N-acrylyl-Æ-alanin i 34,2 ml ethanol og med de samme mængder vand (18 ml), phosphatbuffer (pH 6,0) (21,6 ml), ammoniumpersulfat (3,16 g) og TMEDA (0,53 ml) isolerer man efter forsæbning 15 under identiske betingelser til dem, der er omtalt i det foregående afsnit, samt efter sigtning 9,43 g tør og hvid harpiks. pKa-værdien for OH-formen er 4,8.

EKSEMPEL 3 20

Copolymerisation af AP, EBA, methylester af N-acrylyl-e-aminocapronsyre (forkortelse A e Cap. 0 CH^).

Man anvender de.samme polymerisationsbetingelser som i de 25 forudgående eksempler, og man går ud fra følgende monomere: N-acrylyl-pyrrolidin (0,12 mol, 15 g), EBA (0,0078 mol, 1,31 g) og methylesteren af N-acrylyl-e-aminocapron- _3 syre (16,31 x 10 mol, 3 g). På denne måde isolerer man efter fjernelse af smuldet 13 g (68%) hvid og tør har-30 piks.

Hydrolyse under samme betingelser som ovenfor beskrevet fører efter sigtning til 10,6 g tør og hvid syre-harpiks. pKa-værdien af OH-formen er 5,1.

35 EKSEMPEL 4 12

DK 162651 B

Copolymerisation af AP, EBA, methylester af N-acrylyl-r-aminosmørsyre (forkortelse A r But 0 CH3).

5

Ud fra 15 g (0,12 mol) AP, 1,31 g (7,8 x 10 ^ mol) EBA og 2,76 g (0,01631 mol) methylester af N-acrylyl-r-and.no-smørsyre isolerer man 12 g tør ester-harpiks. Efter hydrolyse i 300 ml molær natriumhydroxid opnår man ved 10 sigtning 10,8 g af den tørre syre-harpiks. pKa-værdien af OH-formen er 5,0.

EKSEMPEL 5 15 Copolymerisation af AP, EBA, methylester af N-acrylyl-L-leucin (forkortelse A(L)Leu 0 CH^).

De anvendte monomer-mængder er: 15 g N-acrylylpyrrolidin, 1,31 g EBA, 3,24 g methylester af N-acrylyl-L-leucin.

20

Den tørre ester-harpiks (10,05 g) hydrolyseres med 300 ml molær natriumhydroxid. Efter behandling som ovenfor an-• ført og sigtning isolerer man 8,45 g syre-harpiks. pKa-værdien af OH-formen er 4,8.

25 EKSEMPEL 6

Copolymerisation af AP, EBA, methylester af N-acrylyl-L-valin (forkortelse A (L) Val 0 CH^).

30

Man anvender 15 g N-acrylylpyrrolidin, 1,31 g EBA og 3 g methylester af N-acrylyl-L-valin. Polymerisationen og de sædvanlige behandlinger fører til 9,96 g tør ester-harpiks. Hydrolyse med 300 ml molær natriumhydroxid fører 35 under de samme betingelser som ovenfor anført til 7,64 g tør og hvid syre-harpiks. pKa-værdien af OH-formen er 5,0.

EKSEMPEL 7 13

DK 162651 B

Copolymerisation af AP, EBA, methylester af N-acrylyl-L-prolin (forkortelse A (L) Pro 0 CH^).

5

Ud fra 15 g (0,12 mol) N-acrylylpyrrolidin, 1,31 g (0,0078 mol) EBA og 2,98 g methylester af N-acrylyl-L-prolin (16,31 x 10-^ mol) isolerer man 15,03 g (77,7%) tør harpiks. Hydrolyse i 300 ml molær natriumhydroxid fø-10 rer efter sigtning til 11 g tør syre-harpiks. pKa-værdien af OH-formen er 4,7.

EKSEMPEL 8 15 Copolymerisation af acrylylmorpholin (forkortelse AM), EBA, methylester af N-acrylyl-e-aminocapronsyre).

5 g (0,0355 mol) N-acrylylmorpholin, 0,38 g (0,0023 mol)

_Q

EBA og 0,995 g (5,38 x 10 mol) methylester af N-acry-20 lyl-s-aminocapronsyre opløses i 10,4 ml ethanol. Efter afgasning med ultralydapparat tilsætter man successivt under de i første eksempel beskrevne betingelser 6 ml vand, 7,2 ml dinatriumphosphatbuffer med styrken 0,1 M, 1,05 g ammoniumpersulfat og 0,176 ml TMEDA.

25

Polymerisationen fører til 4,93 g (77,4%) hvid og tør harpiks. Hydrolyse fører efter sigtning til 2,35 g tør syre-harpiks. pKa-værdien for OH-formen er 5,1.

30 EKSEMPEL 9

Copolymerisation af AM, EBA, methylester af N-acryly 1 -/5-alanin.

35 Polymerisationen gennemføres under de i foregående afsnit beskrevne betingelser under anvendelse af som monomere 5 g (0,0355 mol) N-acrylylmorpholin, 0,38 g (0,0023 mol) _3 14

DK 162651 B

EBA og 0,844 g (5,38 x 10 mol) methylester af N-acry-lyl-Æ-alanin. På denne måde isolerer man 4,24 g (68,2%) tør ester-harpiks, som efter hydrolyse og sigtning fører til 2,18 g tør syre-harpiks. pKa-værdien for OH-formen er 5 4,8.

EKSEMPEL 10

Copolymerisation af N,N-dimethylacrylamid (forkortelse 10 ADM), EBA, methylester af N-acrylyl-e-aminocapronsyre.

4,653 g (0,047 mol) N,N-dimethylacrylamid, 0,51 g (0,003 _3 mol) EBA og 0,955 g (5,16 x 10 mol) methylester af N-acrylyl-e-aminocapronsyreester opløses i 13,4 ml ethyl-15 alkohol. Efter afgasning ved hjælp af ultralydapparat tilsætter man successivt under de ovenfor anførte reaktionsbetingelser 7,05 ml vand, 8,46 ml dinatriumphosphat-bufferopløsning med styrken 0,1 M, 1,237 g ammoniumper-sulfat og 0,2 ml TMEDA. Man opnår 4,64 g (73%) hvid 20 ester-harpiks, som efter hydrolyse og sigtning fører til 2,44 g syre-harpiks. pKa-værdien af OH-formen er 5,0.

EKSEMPEL 11 25 Copolymerisation af ADM, EBA, methylester af N-acrylyl-Ø-alanin.

Under samme reaktionsbetingelser som i foregående afsnit gennemfører man polymerisationen ud fra 4,653 g (0,047 30 mol) N-dimethylacrylamid, 0,51 g (0,003 mol) EBA og 0,81 -3 g (5,16 x 10 mol) methylester af N-acrylyl-Ø-alanin.

Der forekommer dannelse af 4,51 g (75,75%) af den tørre ester-harpiks, som efter hydrolyse og sigtning fører til 35 2,36 g af syre-harpiksen. pKa-værdien af OH-formen er 4,7.

EKSEMPEL 12 15

DK 16265 1 B

Copolymerisation af Ν,Ν-diethylacrylamid (forkortelse ADE), EBA, methylester af N-acrylyl-/)-alanin.

5

Polymerisationen gennemføres ud fra 2 g N-diethylacryl-amid, 0,17 g EBA og 0,32 g methylester af N-acrylyl-Æ-alanin i 4,5 ml ethanol, ved successive tilsætninger af 2,35 ml vand, 2,82 ml dinatriumphosphatbuffer med styrken 10 0,1 M, 0,42 g ammoniumpersulfat og 0,067 mol TMEDA. Efter hydrolyse og sigtning isolerer man 1,31 g tør syre-harpiks. pKa-værdien for OH-formen er 5,5.

EKSEMPEL 13 15

Copolymerisation af ADE, EBA, methylester af N-acrylyl-«-aminocapronsyre.

Man opnår ud fra 6 g N-diethylacrylamid, 0,5 g EBA og 20 1,12 g methylester af N-acrylyl-e-aminocapronsyre i 18,4 ml alkohol og ved successive tilsætninger af 7,05 ml vand, 8,46 ml dinatriumphosphatbuffer med styrken 0,1 M, 1,24 g ammoniumpersulfat og 0,2 ml TMEDA efter hydrolyse og sigtning 4,77 g tør harpiks. pKa-værdien af OH-f ormen 25 er 5,42.

EKSEMPEL 14

Copolymerisation af N-acrylyl-hexamethylenimin, EBA, me- 30 thylester af N-acrylyl-Æ-alanin.

Ud fra 6 g N-acrylyl-hexamethylenimin, 0,33 g EBA, 0,65 g methylester af N-acrylyl-Ø-alanin i 8,4 ml alkohol tilsætter man successivt under de sædvanlige reaktions-35 betingelser 5,6 ml vand, 6,9 ml bufferopløsning, 1,0 g ammoniumpersulfat og 0,18 ml TMEDA.

EKSEMPEL 15 16

DK 162651 B

Copolymerisation af N-acrylyl-N'-methylpiperazin, EBA, methylester af N-acrylyl-Ø-alanin.

5

Man behandler 3,0 g hydrogenchloridsalt af N-acrylyl-N'-methylpiperazin, 0,16 g EBA og 0,3 g methylester af N-acrylyl-Ø-alanin i 4,2 ml ethanol successivt med 2,8 ml vand, 3,5 ml bufferopløsning, 0,5 g ammoniumpersulfat og 10 0,09 ml TMEDA.

I samtlige disse eksempler har man verificeret, at de opnåede estere ikke hydrolyseres under polymerisationens forløb, idet harpikserne ikke indeholder frie carboxyl-15 syregrupper.

EKSEMPEL 16

Copolymerisation af AP, methylen-bis-acrylamid (MEBA), N-20 acrylyl - 0 -alanin.

Man opløser i 57 ml absolut ethanol 25 g (0,2 mol) AP, _2 2,15 g (1,3 x 10 mol) methylen-bis-acrylamid og 3,5 g -2 (2,4'x 10 mol) N-acrylyl-0-alanin. Man tilsætter 30 ml 25 vand og derpå 36 ml phosphatbuffer (pH 6,0). Den klare opløsning afgasses med ultralyd-apparat i 2 minutter.

Derpå tilsætter man 5,27 g ammoniumpersulfat og derpå 0,88 ml TMEDA, man lader polymerisere i 30 minutter. Den transparente gel formales i et såkaldt "THOMAS"-appara-30 tur, vaskes med vand, med ethanol og derpå med ether. Harpiksen tørres under vakuum.

Udbytte 27,6 g.

35 Man sigter derpå harpiksen. Derved opnår man følgende størrelsesfordeling: 17

DK 162651 B

d > 0,25 mm ... 4,08 g 0,2 > d > 0,18...... 15,18 g 0,18 > d > 0,16...... 5,37 g 0,16 > d > 0,125 ..... 0,72 g 5 B) Suspensionscopolymerisation EKSEMPEL 17 10 Copolymerisation af N-methacrylmorpholin, EBA, methyl-ester af N-acrylyl-Æ-alanin.

Man tilsætter under nitrogen en blanding af 18,6 g (0,12 mol) N-methacrylylmorpholin, 1,31 g EBA (7,8 x 10 mol), 15 2,55 g (1,63 x 10 2 mol) methylester af N-acrylyl-Ø-ala- nin og 100 mg azoisobutyronitril til en under omrøring værende opløsning af polyvinylalkohol (3 g) og vand (250 ml). Blandingen opvarmes 3 timer ved 70 °C. Den polymere vaskes med varmt vand, med ethanol, med acetone, med 20 ethanol og med ether. Efter tørring under vakuum (2 mm kviksølv) ved 80 °C isolerer man 14,8 g kugler, hvis diameter er på mellem 0,1 og 0,2 mm.

EKSEMPEL 18 25

Copolymerisation af N-methacrylylmorpholin, EBA, methylester af N-acrylyl-e-aminocapronsyre.

Ud fra en blanding af 18,6 g (0,12 mol) N-methacrylmor-30 pholin, 1,31 g (7,8 x 10-3 mol) EBA, 3,24 g (1,631 x 10-2 mol) methylester af N-acryly 1 -e-aminocapronsyre og 100 mg azoisobutyronitril, som er behandlet under de samme betingelser som ovenfor anført, isolerer man 12,6 g polymer.

35 EKSEMPEL 19 18

DK 162651 B

Copolymerisation af AP, EBA, methylester af N-acrylyl-Ø-alanin.

5 4 g (3,2 x 10 ^ mol) AP, 8 g (5 x 10 N-acrylyl-/J- -3 alanin-methylester og 1,2 g (7,14 x 10 mol) EBA opløses i 50 ml phosphatbuffer (KH2P04 0,1 M, som er bragt til pH 6,0 med 1 N natriumhydroxid) og 50 ml ethanol. Til den 10 således opnåede klare opløsning sætter man 0,6 g ammoniumper sul fat og 0,3 ml "SPAN 85". Blandingen anbringes i 400 ml paraffinolie, hvorpå den omrøres, indtil man opnår dråber af den ønskede dimension. Under stadig omrøring fjernes oxygen fra mediet ved gennembobling med 15 nitrogen i løbet af 20 minutter. Derpå tilsætter man 0,92 ml TMEDA. Efter 30 minutters omrøring fortynder man med petroleumsether, filtrerer, vasker med petroleumsether, med vand, med en blanding (50-50) vand og acetone, med acetone og derpå med ether.

20 På denne måde opnår man polymerkugler, der er fuldstændig runde, og hvor man kan variere deres størrelse mellem 0,05 og 0,5 mm ved at regulere omdrejningshastigheden. Udbyttet er i nærheden af 90%.

25

Reaktionen kan ligeledes gennemføres i vand i stedet for phosphatbuffer.

Man opnår let natriumsaltene af syre-harpikserne ved at 30 vaske de polymere med 0,5 molære natriumhydroxidopløsninger. Man anvender 30 ml natriumhydroxidopløsning pr. ml opkvældet syre-harpiks. Overskud af natriumhydroxid fjernes ved vask med vand indtil neutralitet.

35 De polymeres opsvulmningsgrad måles i vand og i forskellige organiske opløsningsmidler. Disse målinger blev gennemført på formalede harpikser. (Tabellerne 1 og 2).

19

DK 162651 B

^ i I rT~Ϊ J -“s I ~ •s O ^ "s -> I ___—' _

c v -> «3 o«* C

c tN o o > ^—"T . « < < — v_ s» d) dj «η M -i ............................r^7 *· ** ;..................... u ω Ό + o co -N >-n rr-N*?-stO-s d) H *0 . * O «o · s co « % i h rs. sO ‘ft _i ,_j r*

ft. <TS <N CO-,CS. Γ, <N I C, ^ . v, Ij JjS

*£ _ <N NV. <Nj N: <W X i — X — X — X rH +* »U

< X ^ '“id -P

• ^ ρω —ti------"~X^ o ω Ά <5 .c ^ ^ <0 p ω

» -s ^ rQ Ό P

+ 5 o ο-** o —s o -s o o °^'c,r^^ <-· 2 .¾

ft- - -s »O S c> S O N «Λ S ' o * V , ηί __J

> Λ ίο ΙΛ ¢/ SI (X O fN d) *r| dl i I

u -,¾ -,¾ - X - X | - X Ά — X g UTfCU

=- - - x g · >s g -h

< I (3 £ Η Η -P

-—-i---x-----——=>- 03 iK σ> H

§ „ »"i v - , -s ____.o hi (u Έ c. s. s <n s co s. os o(rt r ^ (Q g

D <N cft ^ *>* Qj Η H

t. «Ν X N X ο* χ \,—— <-· Su fil C* S -i M i

ω ·. ^ ....................V.....- ·· -* f..................... d) rH OP S

+ O On Q>-s o -s rs. ci o —. O —s O ft-*. , Φ ^ i t-s-Hf' ^ oci— o·· ^ v. ill Ti Z U Ω ^ <3 £ Sa , ,8 £ « . S. S 144 44 _< ___i___,_4-) nJ Φ •η n I ——^ , ω ω £

2- m o -» o -s m -s .__C φ 4-) H

“ ? - s" s: s: -J < > P $Q *d

Qa u - λ ..................V.....^ ^r. —- .♦ ^ ^ g y m

jt + a tc, c\-s!“?ch o cn l-\ l-. i rv. m <o~s <λγν ,—1 i—1 -H CD

m ^ ° 1 « si -ϊ i -i i o ai =: e‘ ·; >? o £ +} «η λ < l £ i χ-'*;-'* ·'*!"·* i ’i’S id ^ - - i --1 - - ff T! G -ri tn

tn <_i_I-!-i--H os u X

<-. -s I -s i 's * i / li tI 4-J (ϋ H

H c' >A ” I S-, 2 Ά ( i C C? I Cj o 1 s' X fil ® 'P R4 . ir - o - o -. c. 0·χί^ χ / COHOro

^ ^ - I — v 1 - j s' HH Hj-I -G

id 2 d i i i / h Q 4J >i ..

ui .. a ...................................;....... f............. 4-) 4-> U) 0)

tn *— -,ί-, 37 —, *a HHQH

c - s v h0. ’ - si “'ll«? - “ " o J2 2 -g & ^ < & " “i hi - i = - I - i =£β£^^|·ρ

& 3. I _t ___ > U4 tn Λ< G

(V r ^-, _ tn MH ti

rf - ' λ S > O c -P

CM Ό -* O ON CO ^ H ^ fS m < < CN, Γ>» —. X ^ Λμ . Φ 5 ** X X ^ >1 >1 t w *< *“ ^—Γ^Γ\. .......... ............ i—I *· i—I d) t—1

+ *·£ .............. *·β·Λ' .....A - - -s o p O Ό -H

*3 fN O ~s -- t-Ί r-4 Ci O ^ U-, rv O Ch *n φ ^5 cn cnci -yvo-^io 04 un « Q cTnXp ^P l'iJO Λ ii £ x x x * * * i dl gH dj C- - - - ____X. 0) O 0) <d 0)

---—c__ _____" tn G tn . S

c x -- ___— HH HH

k -s <s >ς- ®r- - s-i — 0) S 0) O -

κ « ri «s 2 cT “ «ί «Ϊ 4J B f Η H

S J ...........£.....: .....£ ^rTL··................... 5 S 43 + ;· O x ? ^ “irv*" ,,° 0K 0¾¾¾¾

^ a, t- e 0- - ,0 I "1 rC ^ · "s «? 6-(3 & H Q

ο — — ~,χ-,χ—χ —_χ— X X

___—__—___~~ I___i1_.--- x x . tn / Η X / Ή / H ft.· / _ _,=: = <s ti fl) H/S-H O o o — — ?! 3/5h G si O o •9 x/ H e ro -Τ' ~a4 =T s ~sa Ψ.

V ^Ε-ι>ΰο o υ o o

DK 162651 B

2n ¢3 O f-% Q Cy -x. __ Λ *7 IN ^ in

< < Ά X V X <N X

β Ui ^ < + ·· ** -* ·· ·· · .· t« ·· .· .» ·· ·» .» · .. .U"·· ·* ** M «· .· .. .. .. ,. .. .. „ .. ..

tC ZZ —X —X "X —V

qoo -x -x o - o o -x < · x *7 93 V Ό o —« O— 4Λ ΙΛ ra »n cy ry r-> <n —,

— X X X X X X X

< N_ x- n- X_ x_ «1 ^ __ ^ O cN V· cy __ ,V* V3 V3 N VO ? f^T ' <0 fy -x fj U *. i * + ................................-<r............................

u zz ~s ΛΟ fN O -x -χ -x "'i* <N CN —« O -χ Cy -x

< * χ χ *7 w% u~i χ —» V — V ·? V O

O- *? O —« -«O O O «Λ a — X«NX fN x *Λ x -3» x —« X fy χ o ·>·— x_ — N- V- >.

U

-__^______ ______ yi fy <N \C> O Wl ^ q x * o χ χ · χ χ _ I — «Λ -x —. Γχ «Α 93 ΓΝ \2 .3 iA / s ^ ea ^ ^ ______· -r-i U <..... ........................^riT.

t M

2:000 93 O -χ « -χ cy -χ

M < x v -x -x . -v - -v O χ “χ % <N

H<3 ry O O <-> fx c*·) O O O —« 93—« —, ( <—> fy —« fj ry cy «^j O. < xxxxxxx ^ ^ ^ «w 2 -* S --5” Ί----J- ^ v -» O -χ «Λ -x >-n c. fx 9j s. cjj «. m w a rv vc. irj o X ·.-» x **\ x _J' < u <w >_ «w W < m + ......... ..................... ..............................

^ 21 O *·**. -—N «Ί -V «Ο -V -X -s. -x c*. -x < χ 'i «. t*3 * r,\ o O O x C\

1_ *7 O r~) r-] Γχ ΓΧ Πχ Q

O' a —^ x —« x —« x fj x ci x fy x *rx (—· U '— S. S, ^ N_ V_ g 3 ε —4--1--- S O —« O —> o rs.

D ^--- *> ά *-> fy o ors. — < < O o-, rv ,—^

XXX

< t ♦·_·♦ ........... — · ·. ·. ........J-<r .. ., .. ., ,. ., ». ............ ., 3: δ

O»o<->cy —. —* —« tA

< % S ·> S -N «* —^ O * -S -fc—V x—V

ti cy o pn. ^ o oc\0\*>«vac\ 00 τ·ν> h fytycycycyey^ < _X £ £ ^X £ _x £ ** ^____^__ _______ __^__„™. ._ ____ -5 -v ——-—^ 5' -x *n «λ - - ΙΛ O cy x -x C. x o —. x rv vo a f-» «Α o —. ---

<0 X fy x fy X

3 i --- ^ - t ·· *· · ·* ·* · -* ·· *· · ·· ·- ·· ·* ·· ·· -· -· ·· ·· ............ ·· ·· . ». ·· «.

2: δ

Q X

·< ί. —« *Λ —x O —x fs. -x 0% -x O —v O 0\—x a x χ»Α X fA X rx x C\ X 93 x —« xCv u «-η ‘-'i -xfs.v *χ • —* X <N x fy x fy x cy χ <^j χ fy χ N -------- 0) Qi /s -P T5 — o —^ i= π D/*-3S-i Co iAO υ ^ 'ti 2 / *H -S S «η -χ x ts f0 J2/ rr^ S* κ~ X ry = d: tn ^ & *y »> o 000 o o _aj__}_ I _ __ 21

DK 162651 B

De således fremstillede polyacrylamider afprøves som kat-ionbyttere ved kationbytnings-kromatografi på 3 substrater: 5 to peptidblandinger, en blanding af basiske proteiner (histoner stammende fra kalvens thymus).

Peptidblandingerne er sammensat af 2 peptider med samme 10 sekvens, som udelukkende adskiller sig ved ladningen:

Ac Gly Lys Ala Leu Arg Val 0 Me 2 ladninger > 0

Ac Gly Lys Ala Leu Arg Val OH 1 ladning > 0 15 Ac Gly Lys Leu Arg Val 0 Me 2 ladninger > 0

Ac Gly Lys Leu Arg Val OH 1 ladning > 0

Adskillelserne blev gennemført med en natriumchlorid-gra- _2 dient ved pH på konstant værdi (pH 5,0, 10 M natrium-20 acetat), idet man anvendte sigtede harpikser svarende til følgende copolymere: - AP + MEBA + A /> Ala 0 Na - AP + EBA + A e Cap 0 Na 25 - AP + EBA + A (L) Pro 0 Na - AP + EBA + A Gly 0 Na

Partikelstørrelsen er på mellem 0,1 og 0,25 mm. Carboxyl-syregruppeladningen er i nærheden af 0,8 milliækvivalen-30 ter/g på den tørre harpiks. De efterfølgende kromatogram-mer på figurerne 1 og 2 viser en meget god adskillelse mellem komponenterne i de analyserede blandinger.

Histonerne fra kalvens thymus blev ligeledes kromatogra-35 feret på en natriumchloridgradient (0 - 2 M) (fig. 3).

Man iagttager en opløsning i de forskellige komponenter med en meget kort analysetid (5 timer), en hurtig strøm- 22

DK 162651 B

ningshastighed (80 ml/time) og en buffer (NaCl), der er bedre egnet til analyse ved ultraviolet lys.

For en tilsvarende opløsning gennemfører man kromatogra-5 feringer ved ionbytning af histoner på gradienter af omhyggeligt udarbejdede former for guanidiumchlorid med meget langsomme strømningshastigheder og med analysetider, som kan variere mellem 12 timer og adskillige dage. (J.

BONNER et Coll., "Method in Enzymology", bind 126, 10 GROSSMAN L. og MALDAVE K. redaktører, Academic Press, New York, 1968).

Harpikserne ifølge opfindelsen er således forenelige med proteiner og tillader en let gennemførelse af gode ad-15 skillelser. Det skal yderligere bemærkes, at de her beskrevne bærestoffer tillader meget høje strømningshastigheder. Det er muligt at bearbejde op til 300 ml/time med en søjle på 1 x 25 cm.

20 25 30 35

DK 162651B

23 På disse fire delfigurer λ = 210 nm, er elueringsopløs-ningen 0,2 M med hensyn til NaCl, tallene, der er vist på abscissen, angiver numrene på opsamlede fraktioner, og cifrene på ordinaten angiver den optiske tæthed i fuld skala.

5 inds. s. 22 øv.

kromatografering af: ^ /] Ac Gly Lys Ala Leu

Arg Val OMI + Ac Gly j .X Lys Ala Leu Arg Val OH på en kolonne af n acrylylpyrrolidin, methylen-bis-acryl- 1 ^X amid, acrylyl-Ø-ala- >X^ nin. Strømningshas- ^X tighed 89 ml/h. Frak- I ^X tioner 15 min.

JA .

i-r -te \ lQ 4°_/v^w—s_ 15 ------ 5. / kromatografering af: ! /

Ac Gly Lys Leu Arg Val OMI / + Ac Gly Lys Leu Arg Val / OH på en kolonne af acryl- '·' / ylpyrrolidin, ethylen-bis- / 20 acrylamid og acrylyl-b- / | alanin. Strømningshastighed Ψ \

80 ml/h. Fraktioner 15 min. Υ\ I

β _I W_A.

io V ·* / 25 / Kromatografering af: X Ac Gly Lys Leu Arg X Val OMI + Ac Gly Lys / Leu Arg Val OH på en ! / kolonne af acrylyl- ·»· X pyrrolidin, methylen- / I bis-acrylamid og X lj acryl yl-e-aminoca- / 1 pronsyre. Strømnings- / I /\A hastighed 80 ml/h.

' \_ Fraktioner 15 min.

35 24

DK 162651 B

i kromatografering af:

Ac Gly Lys Leu Arg Val OMI + Ac Gly Lys Leu Arg Val OH på en kolonne af acrylyl- ‘ pyrrolidin, ethylen-bis-acrylamid og acrylylprolin. j

5 Strømningshastighed 50 ml/h. I

Fraktioner 15 min. i

ΛΧ I

FIGUR 1 Pi

Lru w JL·.

to to Xo **<> S° to <

15 6S

20 I ^ 25 FIGUR 2

Kromatografering af: Ac Gly Lys Leu Arg Val OMI + Ac Gly Lys Leu Arg Val OH på en kolonne af acrylylpyrrolidin, ethylen-bis-acrylamid og acrylylglycin. Strømningshastig-hed 80 ml/h. - Varighed 8 timer, λ = 220 nm.

Som abscisse er anført fraktionerne og som ordinat den optiske tæthed i fuld målestok. Elueringsopløsningen er 0,2 M med hensyn til NaCl.

35 25

DK 162651 B

H, Λ / ί o S ' H2A+H2B j |\ 15 A/^ 20 FIGUR 3

Kromatografering af en blanding af histoner på en kolonne 25 af acrylylpyrrolidin, ethylen-bis-acrylamid og acrylyl-Æ-alanin. Strømningshastighed 80 ml/h. - Varighed 5 timer, λ = 210 nm.

Som abscisse er anført fraktioner og som ordinat den optiske tæthed i fuld målestok. Elueringsopløsningen er 0,2 M med hensyn til NaCl.

30 35

Claims

10 CH0 = C - C - N - (CH_) _ - C - 0Rq (4) Δ I i i z no i o r1 o h o hvori R^ = H eller -CH3 Rq = H eller -CH0 15 3 3 n^ = 1, 2, 3 eller 5, eller en asymmetrisk N-acrylaminosyre eller -ester tilhørende L-serien med formlen: 20 * CH0 = C - C - NH - CH - C - 0Ro (5) 2. i I i 3

0 R4 0 25 hvori R1 = H eller -CH3 R3 har den ovenfor anførte betydning r4 = -ch3, -ch(ch3)2, -ch2-ch=(ch3)2, 30 _CH2'{0) / -CH2^)-0H, -CH2-CH2-S-CH3 eller -(ch2)4-nh2, eller N-acrylyl(L)prolin eller dennes methylester med formlen: 35 DK 162651 B ch = c - c - vr ' (6) ** I il Rx O 5 hvori R^ = H eller -CH^, idet R^ har den ovenfor anførte betydning, som blandes i nærvær af en radikalpolymerisa-tionsinitiator, idet man som initiator anvender Ν,Ν,Ν',N'-tetramethylendiamin (TMEDA) plus alkalisk persulfat, ammoniumpersulfat eller azoisobutyronitril, idet 10 polymerisationen gennemføres i vandig opløsning ved en temperatur på 0-50 °C, fortrinsvis i masse eller i emulsion i en organisk væskefase, som ikke er blandbar med vand. 15 20 25 30 35