DK163176B - Ugiftig konjugatvaccine mod infektioner af pseudomonas aeruginosa- og escherichia coli- bakterier, fremgangsmaade til fremstilling heraf og anvendelse af vaccinen - Google Patents

Description

i

DK 163176 B

Den foreliggende opfindelse angår ugiftige konjugatvacciner mod infektioner forårsaget af Pseudomonas aeruginosa- eller Escherichia coli-bakterier, en fremgangsmåde til fremstilling af en konjugatvac-cine, en konjugatvaccine, en polyvalent vaccine og anvendelse af 5 konjugatvacciner til fremstilling af hyperimmunsera, som på deres side anvendes ved fremstilling af immunoglobulin.

Infektioner forårsaget af Pseudomonas aeruginosa eller Escherichia coli optræder især hos hospitalspatienter, brandsårspatienter og kræftpatienter, der behandles med immunosuppressiva. De er en af 10 hovedårsagerne til livstruende nosokomiale infektioner, der forekommer, når flere mennesker er anbragt (hospitaliserede) i et lille værelse. H.Y. Reynolds et al., "Pseudomonas aeruginosa infections: persisting problems and current research to find new therapies",

Annals Inter nal Medicine 82, 1975, s. 819-831. Hyppigheden af sådan-15 ne infektioner er tiltaget drastisk i de sidste 30 år parallelt med den udbredte anvendelse af antibiotika.

Pseudomonas aeruginosa og Escherichia coli er også hyppigt årsag til urinvejsinfektioner, otitis, sinusitis og meningitis.

Antistoffer mod en række somatiske antigener fra Pseudomonas aeru-20 ginosa (jfr. fx H.E. Gilleland et al., "Use of Pseudomonas aeruginosa as a protective vaccine in mice", Infection Immunity 44, 1984, s. 49-54) og mod ekstracellulært protein (O.R. Pavlovskis et al., "Protection against experimental Pseudomonas aeruginosa infection in mice by active immunization with exotoxin A toxoids", Infection Immu nity 32, 25 1981, s. 681-689) har i dyreforsøg vist sig at være virksomme som beskyttelse mod infektion.

Toxin A er det giftigste stofskifteprodukt fra Pseudomonas aeruginosa (P.a.). Det forhindrer den eukaryote proteinsyntese. Mutanter af P.a. med specifikt toxin A-mangel er mindre virulente end deres forældre-30 stammer (D.E. Ohman et al., "Corneal infections in mice with toxin A og elastase mutants of P.a.," J. Infectious Diseases 142, 1980, s. 547-555). Passivt indgivne eller ved aktiv vaccination fremkaldte antitoxin A-antistoffer udøver en påviselig beskyttelse mod eksperimentelt fremkaldte P.a. infektioner (jfr. O.R. Pavlovskis et al., 2

DK 163176 B

loc. cit. og Infection Immunity 18, 1977, s. 596-602). Videre undersøgelser har vist en direkte sammenhæng mellem indhold af antitoxin-antistoffer og overlevelsesrate hos patienter, som lider af P.a.-infektion (M.S. Pollack et al., "Protective activity of antibodies to 5 exotoxin A and lipopolysaccharide at the onset of P.a. septicemia in man," J. Clinical Investigation 63, 1979, s. 276-286).

Virulensen af P.a. hos forbrændingstraumatiserede mus afhænger af tilstedeværelsen af et fuldstændigt "smooth-type" lipopolysaccharid-molekyle (S.J. Cryz et al., Infection Immunity 44, 1984, s. 508-513).

10 Beskyttelsesvirkningen af serotypespecifikke anti-lipopolysaccharid-antistoffer mod eksperimentelle P.a.-infektioner er tilstrækkeligt dokumenteret (jfr. fx S.J. Cryz et al., Infection Immunity 43, 1984, s. 795-799).

Forhøjede anti-lipopolysaccharid-antistoftitre forøger betydeligt 15 overlevelsestiden hos patienter, der lider af P.a.-sepsis (A.S. Cross et al., J. Infectious Diseases 14-2, 1980, s. 538-546). Kliniske forsøg med vacciner på basis af P.a.-lipopolysaccharid gav meget lovende resultater (J.W. Alexander et al., J. Infectious Diseases 130 (Suppl.) 1974, s. S152-S158). Selv om P.a.-lipopolysaccharid (LPS) 20 indeholder beskyttende serotypespecifikke antigen-determinanter, egner det sig ikke i den praktiske anvendelse til parenteral vaccine som følge af dets for høje toxicitet for mennesker (J.E. Pennington, J. Infectious Diseases 130 (Suppl.), 1974, s. S159-S162; M.D. Haghbin et al., Cancer 32, 1973, s. 761-762).

25 P.a.'s serotypespecifikke antigen-determinanter findes i LPS-moleky lets O-polysaccharid (PS)-del (O-polysaccharid: oxideret polysac-charid). Polysaccharidet (PS) kan adskilles fra lipopolysaccharidets (LPS) toxiske lipid-A-halvdel og isoleres. Selv om PS'et indeholder antigendeterminanterne, kan PS ikke anvendes som vaccine, da PS ikke 30 er immunogent. (G.B. Pier et al., Infection Immunity 22, 1978, s 919-925).

Hidtil har der ikke fandtes nogen virksom vaccine til beskyttelse mod

DK 163176 B

3 P.a.-infektioner og infektioner forårsaget af lignende gramnegative bakterier såsom Escherichia coli (E.c).

I betragtning af den relative hyppighed af infektioner forårsaget af P.a. eller E.c. og deres farlighed er dette en betydelig mangel.

5 Bortset fra nødvendigheden af at fremstille en virksom vaccine til aktiv immunisering mod sådanne infektioner er der også et stort behov for immunoglobuliner fremstillet ud fra specifikke hyperimmunsera, der indeholder et højt antistoftiter mod gramnegative bakterier, især P.a. og E.c.. Disse sera eller immunoglobuliner alene kan i tilfælde 10 af bakterieinfektioner eller sepsis bringe redning.

Antibiotika svigter ofte som følge af resistens hos bakterierne.

Et formål med den foreliggende opfindelse er at lukke disse graverende laktiner i den medicinske behandling af infektionssygdomme.

Dette er tydeligvis kun muligt med en konjugatvaccine. Konjugatvac-15 ciner, der især er fremstillet ved kovalent binding og lipopolysac-charider med menneskeligt serumalbumin, kendes fx fra USA patent-skrift nr. 4.185.090.

Virkningseffektiviteten af de hidtil kendte konjugatvacciner er beskeden og er ikke afprøvet klinisk.

20 Fremgangsmåder til kovalent binding af artsspecifikke polysaccharider med artspecifikke proteiner er velkendte og udbredt.

Patentskrift EP-A-0.118.831 beskriver vacciner, der som proteiner udelukkende anvender membranproteiner fra den ydre membran fra gramnegative bakterier. I modsætning hertil anvendes der ved den fore-25 liggende opfindelse som protein udelukkende exotoxiner, nemlig toxin A fra en Pseudomonas aeruginosa stamme, et tetanustoxoid eller et difteritoxoid.

Ifølge EP-A-O.118.831 kobles endoproteiner altid kovalent med polysaccharider fra den samme bakterieart, medens ved den foreliggende 30 opfindelse et O-polysaccharid fra een bakterieart også kobles med 4

DK 163176 B

exoproteinet (toxin eller toxoid) fra en anden bakterieart, jf. exemplerne nedenfor. Derved rettes virkningen hos konj ugatvaccinen ifølge opfindelsen såvel mod bakterie som mod de toxiske exoproduk-ter. Disse toxiske exoprodukter spiller en vigtig rolle som patogene 5 faktorer. Et særligt kendetegn ved konjugatvaccinen ifølge opfindelsen i forhold til kendte vacciner er således, at vaccinerne ifølge opfindelsen har et bredere virknings spektrum.

I US patentskrift nr. 4.356.170 benyttes kapsel-polysaccharider (det vil sige bestanddele af den ydre membran fra en bakterie) fra Haemo-10 philus influenzae, pneumokokker, beta-hæmolytiske streptokokker og Eschichia coli, medens der ifølge den foreliggende opfindelse som polysaccharid anvendes O-polysaccharidet, der stammer fra lipopoly-sacchariderne fra Pseudomonas aeruginosa og Escherichia coli, hvor de toxiske lipid-A-dele fraspaltes og fraskilles.

15 Ifølge US patentskrift nr. 4.356.170 bindes polysaccharidet kovalent ved hjælp af en reducende sukkerdel såsom for eksempel N-acetyl-mannosaminitol, medens den kovalente binding ifølge den foreliggende opfindelse effektueres ved reduktiv aminering, hovedsagligt af den oxiderede sukkerart glukose og ramnose, med den på proteinet bundne 20 adipinsyredihydrazids frie hydrazid gruppe.

I Seid et al., J. Biol. 258, 7305-7310 benyttes lipopolysaccharider, der er blevet afgiftet ved behandlig med natriumhydroxid. I modsætning hertil anvendes der ved den foreliggende opfindelse et 0-poly-saccharid, som er blevet spaltet fra lipopolysaccharidet ved sur 25 hydrolyse, hvorved den uopløselige toxiske lipid-A-del er blevet skilt fra ved centrifugering.

Det har nu vist sig, at der kan fås ugiftige og samtidig højaktive konjugatvacciner, når LPS isoleret fra P.a. omdannes til PS og kobles kovalent til et exoprotein bestående enten af et P.a. toxin A, et 30 tetanustoxoid eller et difteritoxoid. De vundne PS-toxin A-, PS-te-tanustoxoid- og PS-difteritoxoid-konjugatvacciner har vist sig at være ugiftige og immunogene. De fremkalder en aktiv beskyttelse mod eksperimentelle P.a.-infektioner.

DK 163176 B

5

Det har endvidere vist sig, at det nye princip med kovalent binding af PS til exoproteiner kan generaliseres og derved udnyttes til fremstilling af vacciner også mod infektioner forårsaget af andre gramnegative bakterier, især Escherichia coli (E.c)-infektioner.

5 Opfindelsen angår således en ugiftig konjugatvaccine mod infektioner forårsaget af Pseudomonas aeruginosa- eller Escherichia coli-bakterier, hvilken vaccine består af et arts- og serotypespecifikt lipid A-frit polysaccharid eller O-polysaccharid fra endotoxinet fra Pseudomonas aeruginosa eller Escherichia coli og et protein, som er 10 forbundet kovalent med hinanden, idet vaccinen er karakteriseret ved, at proteinet er et bakterielt exoprotein eller exotoxoid bestående af toxin A fra Pseudomonas aeruginosa eller et tetanus- eller difteri-toxoid.

Fremgangsmåden til fremstilling af den hidtil ukendte konjugatvaccine 15 ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at et lipid A-frit O-polysaccharid fra endotoxinet fra Pseudomonas aeruginosa eller Escherichia coli bindes kovalent til et exoprotein bestående af toxin A fra Pseudomonas aeruginosa eller af et tetanus- eller difteritoxoid.

Opfindelsen angår endvidere en konjugatvaccine bestående af en bland-20 ing af 3-15 konjugater dannet ud fra 3-15 serotypespecifikke lipid A-frie O-polysaccharider fra endotoxinet fra forskellige stammer af Pseudomonas aeruginosa eller Escherichia coli, som hver for sig er kovalent bundet til et exoprotein eller exotoxoid bestående af toxin A fra Pseudomonas aeruginosa eller af et tetanus- eller difteritoxo-25 id.

Opfindelsen angår endvidere en polyvalent vaccine, der består af en blanding, som indeholder flere konjugater af serotype-specifikke 0-polysaccharider fra Pseudomonas aeruginosa og fra Escherichia coli sammen med et exoprotein bestående af toxin A fra Pseudomonas aerugi-30 nosa eller af et tetanustoxoid eller difteritoxoid, og at den fremkalder antistoffer med de tilsvarende serotyper af Pseudomonas aeruginosa og Escherichia coll.

6

DK 163176 B

Opfindelsen angår endvidere anvendelsen af de hidtil ukendte konju-gatvacciner til fremstilling af hyperimmunsera, der på deres side anvendes ved fremstilling af immunoglobulin til intravenøs eller intra-muskulær indgift.

5 Beskrivelse af vaccinefremstilling med en Pseudomonas aeruginosa-vaccine som eksempel.

Fremstilling af endotoxin (PS):

Til fremstilling af vaccinen ifølge opfindelsen mod P.a. anvendes en ganske bestemt serotype af P.a. som kilde til fremstilling af endo-10 toxinet. Lipopolysaccharidet (LPS) udvindes fra bakterierne fx ved phenol/vand-ekstraktion som beskrevet af 0. Westphal et al., ZeiC schr. Naturforschung 1952, s. 148-155. Det vundne LPS indeholder mindre end 1 vægtprocent protein og nucleinsyrer. O-Polysaccharidet (PS) frigives fra LPS ved hydrolyse med fortyndet eddikesyre ved 15 100°C som beskrevet af I.R. Chester et al., J. General Microbiology 78, 1973, s. 305-318. Den uopløselige, toxiske lipid A-del fraskilles ved centrifugering. Supernatanten ekstraheres med en chloroform/-methanolopløsning for at fjerne rester af lipid A. Den vandige fase, som indeholder PS, koncentreres i vakuum og oprenses derefter chroma-20 tografisk, hvorved polysaccharid (PS) med en molekylvægt på 10.000-75.000 indsamles og lyofiliseres.

Oxidation af PS:

Det vundne polysaccharid (PS) oxideres i vand ved tilsætning af na-triumperiodat ved stuetemperatur, hvorved der opstår koblingsdygtige 25 aldehydgrupper. Efter tilsætning af ethylenglycol oprenses materialet ved dialyse og lyofiliseres derefter.

Fremstilling af exoprotein (toxin A):

Toxin A med et indhold på over 95% fremstilles ud fra en Pseudomonas aeruginosa-stamme, der danner særlig meget toxin A, som beskrevet af 30 S.J. Cryz et al., Infection Immunity 43, 1984, s. 795-799.

DK 163176 B

7

Syntese af toxin A-kobling:

Til fortyndet toxin A sættes et aliphatisk dicarboxylsyredihydrazid og et carbodiimid som fx 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodi-imid. Ved denne operation kobles frie carboxylgrupper på toxin A med 5 dicarboxylsyredihydrazidet. Det vundne produkt kan omtrent vises ved følgende formel: (toxin Aj-CO-NH-NH-CCKCl·^ 6-CO-NH-NH2

Syntese af Pseudomonas-polysaccharid- toxin A-konjugat:

Den vundne toxin A-kobling forbindes med det oxiderede PS, der inde-10 holder aldehydgrupper, idet ækvivalente mængder af toxin A-kobling og oxideret PS blandes, og den vundne Schiff'ske base (hydrazon) reduceres med et alkalimetalborhydrid, fx natriumborhydrid eller NaBI^CN.

Derved dannes et stabilt konjugat, hvis uopklarede struktur bl.a. kan vises skematisk omtrent som følger: 15 (toxin A)-C0-NH-NH-C0-(CH2)1_6-C0-NH-NH-(polysaccharid)

Konjugatet renses ved dialyse, uopløseligt materiale fraskilles ved centrifugering, og den vundne blanding separeres ved chromatografi på en agarosesøjle. Materiale med en molekylvægt på over 350.000, der tydeligvis overstiger molekylvægten af PS og toxin A, og som udgør 20 PS-toxin A-konjugatet, skilles fra og lyofiliseres.

Syntese af polysaccharid-tetanustoxoid-konjugat

Tetanustoxoid

Et tetanustoxoid, der er bestemt for anvendelse til mennesker, fx TE Anatoxin^ fra Schweiz. Serum- und Impfinstitut, oprenses ved ion-25 bytningschromatografi på cellulose og gelfiltrering på agarose, således at det består af 90% tetanustoxoid.

8

DK 163176 B

Kobling

Denne udføres her fx ved den af Jerker Porath, Methods in Enzymo logy Vol. 34, s. 21 ff, beskrevne generelle metode. Polysaccharid (PS), som vindes ud fra LPS ved hydrolyse, oxideres ikke til denne kobling, 5 men omsættes i vandig opløsning på i og for sig kendt måde i et basisk miljø med bromcyanid ved stuetemperatur. Bromcyanid (BrCN) reagerer derved med frie -OH-grupper på polysaccharidet, hvilket i det følgende er vist skematisk som (PS)-OH. De således vundne aktiverede polysaccharider lades reagere med et alkylendicarboxylsyredi-10 hydrazid (fx H2NNHC0-(CH2)^ g-C0NH-NH2), som fx adipinsyredihydrazid (ADH). Derved bindes dihydrazidet kovalent med polysaccharidet. De reaktioner, der foregår tander koblingen, kan bl.a. vises fx som følger: (PS)-OH + BrCN + (PS)-O-C^N + H2N-NHCO-(CH2)1_6-CO-NH-NH2 -*· 15 (PS)-0-C(NH)-NH-NH-C0-(CH2)1_6-C0-NH-NH2 + H20 + (PS)-0-C0-NH-NH-C0-(CH2)16-C0-NH-NH2

Det derved vundne PS-dihydrazid-konjugat renses ved grundig dialyse.

Ved tilsætning af en fortyndet mineralsyre syrnes opløsningen svagt, der tilsættes en ækvivalent mængde tetanustoxoid og et carbodiimid, 20 og der omrøres i nogle timer ved stuetemperatur. Ved omsætningen med toxoidet (skematisk formuleret som H0C0-(toxoid)) i nærværelse af carbodiimid, hvorved frie carboxylgrupper på toxoidet kondenseres med frie hydraz idgrupper på PS -dihydrazid-konj ugatet, fås det ønskede PS-dihydrazid-toxoid-konjugat, hvis uopklarede struktur kan frem-25 stilles skematisk omtrent som følger: (PS) -0-C0-NH-NH-C0-(CH2)16-C0-NH-NH-C0-(toxoid)

Den vundne blanding dialyseres mod en phosphatpuffer og chromato-graferes over en agarosesøjle. Materiale med en molekylvægt på over 350.000, der tydeligt overstiger molekylvægten af udgangskomponen-30 terne, skilles fra og lyofiliseres.

I den ovenstående syntese kan tetanustoxoidet erstattes med difteri-toxoid.

9

DK 163176B

På analog måde som beskrevet ovenfor kan også fremstilles vacciner mod andre gramnegative bakterier som fx mod infektioner forårsaget af Escherichia col i.

Påvisning af sikkerheden og aktiviteten af konjugatvaccinerne ifølge 5 opfindelsen

Egenskaber ved Pseudomonas (PS-toxin A)-, (PS-tetanustoxoid)- og (PS-difteritoxoid)-konjugater ifølge opfindelsen

Af de i tabel I viste data fremgår det, at konjugaterne har en molekylvægt på over 350.000, og at de derved langt overstiger udgangs-10 materialernes molekylvægt. Ved den kovalente binding af toxin A, afgiftes dette stærkt giftige reagens. Den letale dosis stiger derved mindst 1000 gange fra 0,2 /tg/mus til over 200 /ig/mus. Pyrogeniciteten er praktisk talt forsvundet fra konjugaterne sammenlignet med py-rogeniciteten af naturligt Pseudomonas aeruginosa PA 220 LPS 15 (0,7 /ig/ml/kg legemsvægt).

Konjugaterne inducerer specifikke antistofreaktioner såvel mod poly-saccharidet som mod proteinbæreren, dvs. mod toxin A, tetanustoxin eller difteritoxin. Ved den kovalente binding af toxin A til poly-saccharidet detoxificeres toxin A fuldstændigt uden derved at miste 20 sin immunogene aktivitet.

(PS-toxin A)-konjugatet = (PS-toxin A)-konjugatvaccinens evne til at beskytte mus mod dødelige forgiftninger med oprenset toxin A kunne fx påvises på følgende måde:

Grupper af mus modtog intramuskulært ved forsøgets begyndelse og den 25 14. forsøgsdag enten 10 pg protein i form af tilsvarende mængder af (PS-toxin A)-konjugat eller en puffer (kontrolgruppe). På den 28. forsøgsdag fik musene gradvis stigende doser af toxin A. Den gennemsnitlige letale dosis for kontroldyrene var 0,2 /ig, hvorimod den gennemsnitlige letale dosis for dyr, der forinden var blevet behand-30 let md (PS-toxin A)-konjugat, var 4,7 jug/mus.

10

DK 163176 B

Tabel I

Pseudomonas (PS-toxin A)- og (PS-tetanustoxoid)-konjugatets egenskaber PS Tetanus- Toxin A PS-toxin A PS-teta- 5 toxoid konjugat nustoxoid- konjugat

Molekyl vægt1^ <70.000 150.000 66.000 >350.000 >350.000 2) 10 Toxicitet ugiftig ugiftig 0,2 /zg ugiftig ugiftig

Pyrogenici 3) tet ' 50 /zg 50 /zg - 50 /zg 85 /zg

Immunoge 4) nicitet ikke-immu- immunogen immunogen immunogen immunogen 15 nogen (anti-te- (anti-to- (anti-PS (anti-PS- tanus IgG) xin A IgG) og anti- og antitoxin A tetanus-

IgG) toxin IgG) ^ ^ Bestemt ved gelfiltrering på en AcA34-søjle.

2)

Bestemt ved intraperitoneal injektion i hunmus med en vægt på 18-20 g, udtrykt som den gennemsnitlige dødelige dosis pr. mus. Ugiftig betyder, at et minimum på 50 /zg intraperitonealt indgivet antigen ikke forårsager nogen dødsfald.

25 3) _ . . ... .... ...

Den højeste antigendosis, som er indgivet intravenøst i kaniner, hvilken dosis forårsager en stigning i legemstemperaturen på højst 0,3°C, udtrykt som μg/ml/kg legemsvægt.

4) 11

DK 163176 B

Bestemt ved immunisering af grupper på hver 3 kaniner med 50 μg antigen pr. kanin. Dyrenes sera blev analyseret for tilstedeværende specifikt IgG (immunoglobulin)-antistof ved hjælp af den enzymbundne immunosorbent-assayteknik (ELISA).

5 (PS-Tetanustoxoid)- og (PS-toxin A)-konjugaternes aktivitet som vaccine

Evnen hos nativt lipopolysaccharid (LPS fra Pseudomonas aeruginosa), (PS-tetanustoxoid)-konjugat og (PS-toxin A)-konjugat til at beskytte forsøgsdyr mod eksperimentelt fremkaldt Pseudomonas aeruginosa-10 brandsårssepsis er vist i tabel II.

Tabel II

Beskyttelse mod dødelig brandsårssepsis forårsaget af Pseudomonas aeruginosa PA 220 ved immunisering med LPS fra PA 220, (PS-tetanus-toxoid)-konjugat og (PS-toxin A)-konjugat 15 _

Immunogen1^

Intet (kontroller) 20 LPS 106 20 PS-tetanustoxoid-konjugat 10^ PS-toxin A-konjugat 10^ ^ Mus fik 1 4g intramuskulært før forsøgets begyndelse og på den 14. forsøgsdag. De blev derefter underkastet et forbrændings-25 traume (som beskrevet i I.A. Holder et al., Infection Immunity 35, 1982, s. 276-280) og blev på den 28. dag inficeret med stigende doser P. aeruginosa PA 220.

2) LD^q «= den gennemsnitlige letale dosis af P. aeruginosa PS 220, beregnet ved den af L.J. Reed og H.A. Muench, American J.

30 Hygiene 27, 1938, s. 493-497 beskrevne metode.

12

DK 163176B

Disse data viser, at inununiseringen med LPS, (PS-tetanustoxoid)-kon-jugat og (PS-toxin A)-konjugat udviser en omtrent lige stærk beskyttelsesvirkning mod fatal P.a. sepsis. Den letale dosis for P. aeruginosa PA 220 forhøjes derved 50.000 gange i forhold til den ikke 5 immuniserede kontrolgruppe.

(PS-tetanustoxoid)-konjugatvaccinens sikkerhed og immunogenicitet hos mennesker

Sunde 16-59 årige voksne frivillige forsøgspersoner af begge køn fik ved forsøgets begyndelse og efter 14 dage indgivet 100 μg af konju-10 gatvaccinen i 0,5 ml subcutant i overarmen.

Alle reaktioner fra forsøgspersonerne blev registreret. Bivirkninger var sjældne, svage og forbigående.

Prøver af veneblod blev taget ved forsøgets begyndelse og 14 og 28 dage efter vaccinationen. De sera, der blev vundet fra blodprøverne, 15 blev samlet og opbevaret ved -20°C. Immunoglobulin G (IgG)-antistof-titeret blev bestemt.

Immuniseringen med (PS-tetanustoxoid) -konjugat førte til en signifikant stigning af det gennemsnitlige anti-PA220 LPS IgG-titer efter 14 og 28 dage efter vaccinationen sammenlignet med udgangs ti teret, jfr.

20 tabel III nedenfor.

Over 80% af forsøgspersonerne reagerede med et fire gange eller derover forhøjet antistof titer. Immuniseringen med denne konjugatvaccine førte også til et tetanustoxinneutraliserende anti-tetanus-antistof-titer.

DK 163176 B

13

Tabel III

Anti-PA220 LPS IgG-antistofreaktion efter immunisering med (PS-teta-nustoxoid)-konjugat 5 Gennemsnitligt ELISA titerområde 1) 2)

Præ-immun Post-immun > 4 gang forhøjet 3) 14 dage 28 dage titer ' % 10 43 (14-28) 652 (39-3.200)4) 823 (47-4.400)4) 13/16 (82) ^ Præ-immun = op til tidspunktet for immunisering.

2)

Post-immun = 14 eller 28 dage efter immunisering.

15 3)

Kvotient af post- og præ-immunt]ter 4)

Det gennemsnitlige post-immuntiter var signifikant forhøjet (p<0,01).

Serumpuljer fås ved kombination af en ækvivalent mængde serum fra hver forsøgsperson ved forsøgets begyndelse (præ-immunpulje) og efter 20 28 dage (immunpulje).

Præ-immunpuljen indeholdt 2,7 internationale tetanustoxinneutralise-rende enheder pr. ml, hvorimod immunpuljen udviste 6,2 enheder pr. ml.

Anti-PA220-LPS-IgG-antistoffer, som blev fremstillet ved vaccination 25 af mennesker med (PS-tetanustoxoid)-konjugatet ifølge opfindelsen, viste sig at være særdeles virksomme mod fatal eksperimentel fremkaldt sepsis forårsaget af P. aeruginosa. Passivt overført post-immun IgG var signifikant mere effektiv til forebyggelse af dødsfald end passivt overført præ-immun-IgG. Den målte beskyttelse korrelerer med 30 anti-PA220 LPS IgG-titeret i IgG-præparaterne. Resultaterne er vist i tabel IV.

14

DK 163176B

Tabel IV

Passivt overført IgG's evne til at beskytte mus mod fatal P. aerugi-no sa PA 220-brandsårssepsis 5 Overført IgG ^ Anti-LPS ^*50

IgG ELISA titer

Intet ^ - 1,3 x 10^

Præ-immun ^ 73 1,3 x 10^ 10 Post-immun ^ 1065 6,7 x 10^ ^ Hver mus fik intravenøst indgivet ca. 160 μ% humant IgG i 0,2 ml 24 timer før infektion med P. aeruginosa PA 220.

2)

Kontrollerne indeholdt 0,2 ml steril saltopløsning.

15 3)

Fremstillet ud fra alikvote dele af sera fra alle frivillige forsøgspersoner før immunisering.

4)

Fremstillet ud fra alikvote dele af sera fra alle frivillige forsøgspersoner 28 dage efter immunisering.

(PS-tetanustoxoid)-konjugat er således en vaccine, der kan anvendes 20 til mennesker uden risiko, og som udviser et signifikant forhøjet anti-PA220-LPS-IgG-titer hos mere end 80% af de vaccinerede personer.

Det herved i mennesker frembragte anti-PA220-LPS-immunoglobulin viste sig at være særdeles virksomt mod fatal P. aeruginosa-sepsis.

Analoge resultater blev også opnået med 25 P.a.(PS)-toxin A-, P.a.(PS)-difteritoxoid-, E.c.(PS)-toxin A-, E.c.(PS)-tetanustoxoid- og E.c. (PS)-difteritoxoid-konjugatvaccinerne ifølge opfindelsen.

15

DK 163176B

(PS-tetanustoxoid)-, (PS-difteritoxoid)- og (PS-toxin A)-konjugat-vacciner

Disse konjugater viste sig i talrige tests at være ugiftige, ikke-pyrogene og højaktive vacciner. Denne type vacciner er hidtil ukend-5 te. Til den praktiske anvendelse er det ønskeligt at kunne tilbyde en vaccine, der udviser en bredspektret virkning mod infektioner forårsaget af forskellige se rotyper af fx Pseudomonas aeruginosa.

Det viste sig, at denne bredspektrede virkning kan opnås, når der anvendes et præparat af (PS-tetanustoxoid)-, (PS-difteritoxoid)-10 eller (PS-toxin A)-konjugater, hvis PS (polysaccharid)-del stammer fra flere af de serotyper af Pseudomonas aeruginosa (P.a), der hovedsageligt optræder ved infektioner. Dertil kræves 3-15 forskellige serotyper af Pseudomonas aeruginosa.

Koblingen af polysaccharidet (PS) fra de forskellige serotyper til 15 PS-proteinkonjugat skal udføres separat for at opnå brugbare præparater. Dette betyder, at de enkelte LPS'er isoleres fra 3-15 rene stammer af P.a., og at PS'et og de enkelte PS'er individuelt bindes kovalent til proteindelen (toxin A, tetanustoxoid eller difteritoxo-id), de vundne konjugater afprøves for deres tolerabilitet og aktivi-20 tet, og at de 3-15 enkeltkonjugater blandes sammen til det færdige kombinationspræparat.

Den samme procedure anvendes også til fremstilling af kombinations-vacciner mod infektioner forårsaget af andre gramnegative bakterier som fx Escherichia coli.

25 Vacciner, der er aktive mod infektioner forårsaget af forskellige gramnegative bakteriearter

Det er særdeles ønskeligt at kunne fremkalde antistoffer mod forskellige gramnegative bakteriearter ved hjælp af en enkelt vaccination.

Dette er især vigtigt, når antistofferne høstes og oparbejdes til 30 specifikke immunoglobuliner, som er aktive mod infektion forårsaget af gramnegative bakterier.

DK 163176 B

16

Det har vist sig, at dette mål kan nås, når en vaccine, som er specifik over for en bakterieart, blandes med én eller flere konjugat-vacciner, som er specifikke over for andre bakteriearter.

Anvendelsen af konjugatvacciner ifølge opfindelsen til fremstilling 5 af specifikke immunoglobuliner

Som vist ovenfor fremkalder konjugatvaccinerne ifølge opfindelsen hos mennesker dannelsen af specifikke antistoffer mod den pågældende bakterieart. Den antis tof titer, der på denne måde fremkaldes i serum hos frivillige vaccinerede personer, er så højt, at disse sera kan 10 anvendes som udgangsmateriale til fremstilling af specifikke immuno -globuliner. Derved har lægen et middel til sin rådighed, hvormed han med held kan behandle ikke-vaccinerede patienter, der lider af den tilsvarende bakterieinfektion.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler.

15 EKSEMPEL 1

Pseudomonas aeruginosa-vaccine: PS-toxin A-konjugat A. Isolering af LPS (IT-5 = Håbs 10) 500 ml 3%'s trypticase-sojavæske (TSB) (Becton, Dickinson and Company, USA) indeholdende 1% glycerin blev podet med en lyo-20 filiseret kultur af Pseudomonas aeruginosa (IT-5 = Håbs 10) og inkuberet ved 37°C og 150 omdrejninger pr. minut. 50 liter 3%'s TSB-medium indeholdende 1% glycerin blev podet med denne forkultur og inkuberet i en fermenter i 16 timer ved 37°C.

Cellerne blev skilt fra ved hjælp af en gennemløbscentrifuge 25 (fx fra Westfalia) og vasket to gange med Tris-NaCl-puffer, pH

9. Cellerne blev derefter suspenderet i Tris-NaCl-puffer, pH 9, og åbnet mekanisk, fx ved hjælp af glaskugler (Dyno-Mill, W.A. Bachhofer AG, Basel, Schweiz). Cellevæggene skilles fra ved centrifugering af cytoplasma, som kasseres. Cellevæggene 30 opslæmmes på ny i Tris-NaCl-puffer og sedimenteres i en køle-

DK 163176 B

17 centrifuge ved 23.500 x g i 30 minutter. Cellevæggene suspenderes derefter i 1000 ml vand, hvortil sættes 1280 ml 80%'s phenol som beskrevet i O.Westphal, Z. Naturforsch. 7, 1952, s. 148-155. Blandingen opvarmes til 68-70°C og omrøres i 5 5 minutter ved denne temperatur. Derefter afkøles ekstraktions- blandingen i isbad til 4-10°C og centrifugeres derefter til adskillelse af faserne i 15 minutter ved 23.500 x g i en kølecentrifuge. Den øverste fase udgør vandfasen og indeholder lipopolysaccharidet (LPS). Vandfasen adskilles omhyggeligt fra 10 phenolfasen, hvortil der på ny sættes 1 liter destilleret vand, og det hele på ny omrøres ved 68-70°C i 5 minutter. Der afkøles igen i isbad til 4-10°C, og faserne adskilles som ovenfor beskrevet. De vandige faser kombineres og dialyseres med vand, til de er fri for phenol. Phenolfaserne kasseres. De 15 vandige faser centrifugeres derefter i ultracentrifugen til sedimentering af LPS ved 100.000 x g i 3 timer. Sedimentet opløses i 0,05M tris-puffer, pH 7,2, der indeholder 0,05M NaCl, og behandles med RNAse, DNAse og pronase (Boehringer,

Mannheim, Vesttyskland) som følger: Der tilsættes RNAse til en 20 s lutkoncentration på 20 /xg/ml og inkuberes i 3 timer ved 37°C.

Derefter tilføjes DNAse til en s lutkoncentration på 20 /ig/ml og magnesiumsulfat til en s lutkoncentration på 0,1M, og der inkuberes ligeledes i 3 timer ved 37°C. Derefter tilsættes pronase til en koncentration på 200 /ig/ml, der inkuberes i 2-3 25 timer ved 37®C og dialyseres derpå mod vand ved 4®C natten over. LPS'et oprenses yderligere ved to ganges ultracentrifu-gering og lyofiliseres derefter. Det således oprensede LPS indeholder mindre end 1% nucleinsyrer og protein som forurening.

30 B. Isolering af det serotypespecifikke polysaccharid

Det oprensede LPS suspenderes i en koncentration på 3 mg/ml i 1%'s eddikesyre og hydrolyseres i 30 minutter ved 100°C som beskrevet af G. Schmidt et al., Eur. J. Biochem. 10, 1969, s. 501-510. Herved adskilles polysacchariddelen fra den toxi-35 ske lipiddel (lipid A). Lipid A er uopløseligt og fjernes ved centrifugering fra det opløselige polysaccharid. Den vandige 18

DK 163176B

polysaccharidopløsning ekstraheres til fjernelse af spor af lipid A tre gange med et lige så stort volumen chloroform/-methanol (3:1) og koncentreres i vandstrålevakuum. Den koncentrerede PS-opløsning chromatograferes på en agarosegel, fx 5 ACA34-gel (LKB-produkter AB, Bromma, Sverige; søjle 5 x 40 cm, gennemløbshastighed 1,7 ml/minut, fraktions s tørrelse 17 ml). Polysaccharid bestemmes i enkelte fraktioner. Fraktionerne, der indeholder PS med en molekylvagt på 10.000-75.000, samles i puljer og lyofiliseres.

10 C. Oxidation af PS

De lyofiliserede PS'er blev opløst i destilleret vand i en koncentration på 5 mg/ml. Dertil sættes NaI04 (natriumperio-dat) til en slutkoncentration på 0,1M. Opløsningen lades henstå i mørke i 2 timer ved stuetemperatur. Overskydende 15 oxidationsmiddel inaktiveres ved tilsætning af ethylenglycol til en koncentration på 0,2M. De oxiderede PS'er dialyseres grundigt mod vand og lyof iliseres.

D. Toxin A

Toxin A isoleres fra supernatanten af P. aeruginosa stamme PA 20 103 (fået fra Dr. B. Wretlind, Karolinska Institute, Stock holm, Sverige) ved følgende kendte metode: Ultrafiltrering, DEAE-cellulose-chromatografi, hydroxylapatit-chromatografi (beskrevet af Cryz et al., Infect. Immun. 39, 1983, s. 1072-1079). Renheden af det således isolerede toxin A er over 95%.

25 E. Fremstilling af toxin A-ADH (ADH = adipinsyredihydrazid) ADH som "spacer"-molekyle og til indføring af reaktionsdygtige aminogrupper kobles kovalent med toxin A som følger: rent toxin A indstilles til en koncentration på 5 mg/ml i 0,05N Na-phosphatpuffer, pH 7,2. Der tilsættes ADH (adipinsyredihydra-30 zid) og 1- ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid i fast form til en koncentration på 10 mg/ml af hver. pH-Værdien indstilles til 4,8 med fortyndet saltsyre. Opløsningen omrøres 19

DK 163176B

forsigtigt i 2 timer ved 22eC, og pH-værdien holdes konstant ved 4,8 ved tilsætning af yderligere IN saltsyre. Efter endt reaktion dialyseres blandingen grundigt mod 0,05M Na-phosphat-puffer, pH 8,0, ved 4eC. Uopløseligt materiale fjernes ved 5 centrifugering. Toxin A-ADH-opløsningen indstilles til en koncentration på 5 mg/ml.

F. Fremstilling af polysaccharid-toxin A-konjugat

Toxin A-ADH-opløsningen dialyseres i 2 timer ved stuetemperatur mod 0,5M Na-phosphatpuffer, og toxin A-ADH-opløsningen 10 indstilles til en koncentration på 5 mg/ml. Til denne opløs ning sættes et lige så stort volumen af en opløsning af 5 mg/ml oxideret PS, der ligeledes er opløst i 0,5M Na-phosphat-puffer, pH 8,0. Opløsningen lades henstå i 6 timer ved stuetemperatur, hvorefter der tilsættes NaBH^CN fra en 10 gange 15 koncentreret (0,5M) opløsning til en koncentration på 0,05M.

Blandingen lades derefter henstå i 5-7 dage ved stuetemperatur. Derefter dialyseres der grundigt mod phosphatpuffer (PBS) pH 7,4, der indeholder 0,02% merthiolat.

Uopløseligt materiale fjernes ved centrifugering, og den 20 opløste reaktionsblanding chromatograferes over en agarosegel, fx AcA34-gel. Af fraktionerne måles absorptionen ved 280 og 220 nm. Materiale, som elueres med dødvolumenet (vQ), og derfor har en molekylvægt på over 350.000, hvilket ligger langt over reaktionspartnemes molekylvægte, indsamles og 25 sterilfiltreres. Materialet fortyndes således, at 0,5 ml svarer til en human dosis, og således at den færdige opløsning indeholdt 5% lactose i 50% PBS og 0,01% merthiolat, og lyofi-liseres derefter.

Vaccinen blev underkastet følgende analyser:

DK 163176 B

20

Analyse Metode

Polysaccharidindhold phenol - svovlsyre-'- under anvendelse 5 af det rene udgangs-PS som standard

Proteinindhold Lowry et al.^ under anvendelse af bovint serumalbumin som standard

Sterilitet

Pyrogenicitet Kaniner 10 Tolerabilitet 2 humandoser intraperitonealt på hver 2 marsvin og 1 humando s is på hver 5 mus.

Toxicitet 200 /ig (protein) i 0,5 ml intraperi tonealt i 6 mus.

15 _

Resultaterne fremgår af tabel I.

1 M. Dubois et al., "Colorimetric method for determination of sugars and related substances", Anal. Chem. 28, s. 350-356.

20 2 O. H. Lowry et al., "Protein measurement with the Folin-phenol reagent", J. Biol. Chem. 193, 1951, s. 265-275.

EKSEMPEL 2

Pseudomonas aeruginosa-vaccine: PS-tetanustoxoid-konjugat 100 mg PS, der er fremstillet som beskrevet i eksempel 1 A/B, opløses 25 i 9,2 ml destilleret vand. Dertil sættes forsigtigt 0,44 ml af en opløsning af bromcyanid. pH-Værdien indstilles til 10,5 i løbet af 6 minutter med IN NaOH. Derefter sænkes pH-værdien til 8,6 ved tilsætning af fast NaHCOj. Der tilsættes 0,4 g adipinsyredihydrazid (ADH), og opløsningen omrøres forsigtigt i 16 timer ved 4°C. Efter 30 grundig dialyse mod vand tilsættes 100 mg koncentreret eller lyofili-seret tetanustoxoid, der fx er oprenset ved ionbytnings- og gelchro-matografi, og 3,3 ml l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid- 21

DK 163176B

opløsning (20 mg/ml). pH-Værdien indstilles til 4,8 med 0,1N saltsyre, og holdes konstant i 4 timer ved stuetemperatur under let omrøring. Reaktionsblandingen dialyseres derefter grundigt mod PBS-mer-thiolat 0,02%. Derefter chromatograferes blandingen på en agarosegel 5 (søjle 5 x 40 cm, gennemløbshastighed 1,1 ml pr. minut) med PBS- merthiolat-puffer. Der indsamles fraktioner på 11 ml, og protein- og PS-indholdet bestemmes. Materiale, der blev elueret med dødvolumenet og derfor har en molekylvægt på over 350.000, samles i pulje og lyofiliseres som beskrevet i eksempel 1. PS-tetanus-konjugatet analy-10 seres analogt med PS-toxin A-konjugatet (jfr. eksempel 1).

EKSEMPEL 3

Pseudomonas aeruginosa-vaccine: PS-difteritoxoid-konjugat

Som beskrevet i eksempel 2 forbindes polysaccharidet, der indeholder de serotypespecifikke determinanter, kovalent med et oprenset og 15 koncentreret eller lyofiliseret difteritoxoid.

Den vundne vaccine er ugiftig og fremkalder serotypespecifikke antistoffer mod Pseudomonas aeruginosa samt antitoxiske antistoffer mod difteritoxoid.

EKSEMPEL 4 20 Escherichia coli - PS-toxin A-konjugatvaccine

Som beskrevet i eksempel 1 isoleres polysaccharidet, der indeholder de serotypespecifikke determinanter, fra endotoxinet fra E. coli-fer-mentorkulturer. Som beskrevet i eksempel 1 oxideres polysaccharidet med natriumperiodat og bindes kovalent med toxin A ved hjælp af 25 "spacer"-molekylet adipinsyredihydrazid. Konjugatvaccinen lyofiliseres og analyseres. Den er ugiftig, har en god tolerabilitet og inducerer dannelsen af serotypespecifikke antistoffer mod E. coli.

DK 163176 B

22 EKSEMPEL 5

Escherichia, coli: PS-tetanustoxoid-konjugatvaccine E. coli-polysaccharid, der indeholder de serotypespecifikke determinanter, aktiveres med bromcyanid og bindes kovalent med spacermole-5 kylet adipinsyredihydrazid (ADH) analogt med eksempel 2. Polysac-charid-ADH'et bindes kovalent ved hjælp af et vandopløseligt carbo-diimid med tetanustoxoidets carboxylgrupper.

Den vundne vaccine er ugiftig, har en god tolerabilitet og inducerer dannelsen af serotypespecifikke antistoffer mod E. coli samt anti-10 toxiske antistoffer mod tetanustoxoid.

EKSEMPEL 6-8

Polyvalente Pseudomonas aeruginosa-konjugatvacciner 6. 8-valent P. aeruginosa-?.a. toxin A-vaccine 50-100 μg af hver af 9 serotypespecifikke enkeltkonjugater pr.

15 dosis forenes ved blanding til en polyvalent Pseudomonas aeruginosa - konj ugatvaccine.

Konjugatets polysaccharidkomponenter blev først isoleret enkeltvis ud fra endotoxinet af følgende 8 Pseudomonas aeruginosa- stammer: 20 PA 220 (Håbs serotype 6d); 8505 (Håbs serotype 3); 6511 (Håbs serotype 4); IT-2 (Håbs serotype 11); E 576 (Håbs Serotype 2ab), PA 53 (Håbs serotype 1); W 18 (Håbs serotype 10); IT 6 (Håbs serotype 8).

De 8 forskellige PS'er bindes derefter kovalent enkeltvis med 25 proteindelen af Pseudomonas aeruginosa exotoxin A ifølge eksempel 1, og de 8 konjugater blandes derpå til den 8-valente vaccine.

DK 163176 B

23

Den vundne 8-valente vaccine har følgende egenskaber: 1) Den er ugiftig for dyr og ikke-pyrogen for kaniner.

2) Dens molekylvægt overstiger 350.000.

3) Vaccinen beskytter mod et bredt spektrum af P. aeruginosa- 5 · infektioner.

7. 8-valent P. aeruginosa-tetanustoxoidvaccine

Fremstillingen foregår analogt med eksempel 6.

De 8 forskellige PS'er bindes enkeltvis kovalent med humant tetanustoxoid ifølge eksempel 2 og blandes derefter til en 10 polyvalent vaccine.

Den vundne vaccine inducerer dannelsen af serotypespecifikke antistoffer mod P. aeruginosa samt antitoxiske antistoffer mod tetanustoxin.

8. 8-valent P. aeruginosa -difte ri toxoid-vacc ine 15 De 8 PS'er, der er angivet i eksempel 6, blev enkeltvis bundet kovalent med difteritoxoid ifølge eksempel 3 og derefter blandet til en polyvalent vaccine.

Den vundne vaccine inducerer dannelsen af serotypespecifikke antistoffer mod P. aeruginosa samt antitoxiske antistoffer mod 20 difteritoxin.

EKSEMPEL 9-13

Polyvalente Escherichia col i-konjugatvacciner 9. 13-valent E. coli-Έ.a.-toxinvaccine 50-100 pg af hver af 14 enkeltkonjugater, hvis polysaccharid-25 del stammer fra endotoxinet af E. coli- sero typerne 1, 2, 4, 6, 24

DK 163176B

7, 8, 11, 16, 18, 22, 25, 62, 75 og deres proteindel fra exotoxin A fra Pseudomonas aeruginosa (P.a.), blandes.

Den vundne vaccine inducerer dannelsen af serotypespecifikke antistoffer mod Escherichia coli samt antitoxiske antistoffer 5 mod P.a.-toxin.

10. 13-valent E. coli-tetanustoxoid-vaccine 13 enkeltkonjugater af de i eksempel 9 nævnte E. coli-PS'er og humant tetanustoxoid blev fremstillet analogt med eksempel 1-3 og blandet analogt med eksempel 6 og 7. Den vundne vaccine 10 inducerer dannelsen af specifikke antistoffer mod E. coli og antitoxiske antistoffer mod tetanustoxin.

11. 13-valent E. coli-difteritoxoid-konjugatvaccine 13 enkeltkonjugater af de i eksempel 9 nævnte E. coli-PS'er og difteritoxoid blev fremstillet analogt med eksempel 1-3 og 15 blandet analogt med eksempel 6 og 7.

Den vundne vaccine inducerer dannelsen af specifikke antistoffer mod E. coli og antitoxiske antistoffer mod difteri-toxin.

12. 10-valent E. coli-konjugatvaccine 20 50-100 μζ pr. dosis af hver af 10 enkeltkonjugater, hvis polysacchariddel stammer fra endotoxin af 0-sero typen 1, 2, 4, 6, 7, 8, 18, 22, 25, 75 og hvis proteindel stammer fra exo-toxin A fra P. aeruginosa eller fra et humant tetanustoxoid, blandes.

25 13. 3-valent E. coli-konjugatvaccine 50-100 μg pr. dosis af hver af 3 enkeltkonjugater, hvis polysacchariddel stammer fra endotoxin af 0-serotypen a) 1, b) 2 og c) 4, og hvis proteindel stammer fra a) exotoxin A fra P.

DK 163176 B

25 aerugino sa, b) humant tetanustoxoid eller c) difteritoxoid, blandes.

EKSEMPEL 14

Polyvalent konjugatvaccine mod P. aeruginosa og E. coli-infektioner 5 Denne vaccine fås ved blanding af 8 enkeltkonjugater (50-100 μζ), hvis polysacchariddel stammer fra Pseudomonas aeruginosa endotoxin, samt 13 enkeltkonjugater, hvis polysacchariddel stammer fra E. coli-endotoxin. Enkeltkonjugaternes proteindel stammer i hvert tilfælde enten fra exotoxin A fra P. aeruginosa eller et humant tetanustoxoid.

10 Den vundne vaccine er i stand til at inducere stereotypespecifikke antistoffer mod P. aeruginosa samt E. coli. Endvidere inducerer denne vaccine også antitoxiske antistoffer, der er rettet mod såvel exo-toxin A som tetanustoxin.

EKSEMPEL 15 15 Anvendelse af den polyvalente konjugatvaccine til fremstilling af specifikt immunoglobulin

Frivillige forsøgspersoner blev immuniseret med den polyvalente vaccine ifølge eksempel 14 i deltamusklen. 4 uger efter følger en forstærket vaccination med den samme vaccine og dosering i deltamusklen.

20 1 uge senere tages der en blodprøve fra de frivillige forsøgsperso ners armvene, og antistoftiteret bestemt mod serotyper (af P. aeruginosa og E. coli), som er indeholdt i vaccinen, samt mod exo toxin A og tetanustoxin. Hvis titertilvæksten mod alle de nævnte antigener som følge af vaccinationerne er 4 gange eller mere, tages der ca. 240 ml 25 blod fra de vaccinerede personer. Seraene samles i pulje, og der fremstilles et gammaglobulinpræparat til intravenøs anvendelse (IVIG) ved følgende kendte trin, fx som beskrevet i europæisk offentliggørelsesskrift nr. 85.747: fraktioneret alkoholudfældning ved Cohn's metode, ionbytningschromatografi, ultrafiltrering og diafiltrering.

Claims (7)

1. Ugiftig konjugatvaccine mod infektioner forårsaget af Pseudomonas 5 aeruginosa- eller Escherichia coli-bakterier, hvilken vaccine består af et arts- og serotypespecifikt lipid A-frit polysaccharid eller 0-polysaccharid fra endotoxinet fra Pseudomonas aeruginosa eller Escherichia coli og et protein, som er forbundet kovalent med hinanden, kendetegnet ved, at proteinet er et bakterielt exoprotein 10 eller exotoxoid bestående af toxin A fra Pseudomonas aeruginosa eller et tetanus- eller difteritoxoid.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af en konjugatvaccine ifølge krav 1. kendetegnet ved, at et lipid A-frit O-polysaccharid fra 15 endotoxinet fra Pseudomonas aeruginosa eller Escherichia coli bindes kovalent til et exoprotein bestående af toxin A fra Pseudomonas aeruginosa eller af et tetanus- eller difteritoxoid.

3. Konjugatvaccine ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den består af en blanding af 3-15 20 konjugater dannet ud fra 3-15 serotypespecifikke lipid A-frie 0-polysaccharider fra endotoxinet fra forskellige stammer af Pseudomonas aeruginosa eller Escherichia coli, som hver for sig er kovalent bundet til et exoprotein eller exotoxoid bestående af toxin A fra Pseudomonas aeruginosa eller af et tetanus- eller difteritoxoid.

4. Konjugatvaccine ifølge krav 3, kendetegnet ved, at der til dens fremstilling er anvendt O-polysacchariderne fra i det mindste serotyperne PA 220 (Håbs serotype 6d); E 576 (Håbs Serotype 2ab); 6511 (Håbs serotype 4); W 18 (Håbs serotype 10); IT 2 (Håbs serotype 11); 8505 (Håbs serotype 3);

30 PA 53 (Håbs serotype 1); og IT 6 (Håbs serotype 8) fra Pseudomonas aeruginosa. DK 163176 B

5. Konjugatvaccine ifølge krav 3, kendetegnet ved, at der til dens fremstilling er anvendt O-polysaccharider fra i det mindste O-serotyperne 1,2,4,6,7,8,11,16, 18,22,25,62 og 75 fra Escherichia coli.

6. Polyvalent vaccine ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den består af en blanding, som indeholder flere konjugater af serotype-specifikke O-polysaccharider fra Pseudomonas aeruginosa og fra Escherichia coli sammen med et exopro-tein bestående af toxin A fra Pseudomonas aeruginosa eller af et 10 tetanustoxoid eller difteritoxoid, og at den fremkalder antistoffer med de tilsvarende serotyper af Pseudomonas aeruginosa og Escherichia coli.

7. Anvendelse af konjugatvacciner ifølge et hvilket som helst af kravene 1,3,4, 5 og 6 til fremstilling af hyperimmune sera, som på 15 deres side anvendes til fremstilling af immunoglobulin, der kan administreres intravenøst eller intramuskulært.