DK163932B - Fremgangsmaade til fremstilling af et pattedyrprotein, som er heterologt for en gaerorganisme, som produkt af gaerudtrykkelse -forarbejdning og -sekretion samt gaerorganisme-cellekultur, dyrkningsmedium af cellekulturen og gaerudtrykkelsesmedium - Google Patents

Description

i

DK 163932 B

Denne opfindelse angår alment rekombinant-DNA-teknologi under udnyttelse af gærværtssystemer og udtrykkelses-medier, der udtrykker, forarbejder og secernerer heterologt protein som særskilt produkt uden ledsagelse af 5 uønsket præsekvens eller andet kunstigt udtrykkelses-produkt.

Den erkendelse, hvorpå denne opfindelse er baseret, er det første tilfælde, hvor et protein, som normalt er heterologt for en gærvært, kan udvindes i nyttige mæng-10 der fra mediet, der opretholder gærkulturen, efter at det er blevet udtrykt, forarbejdet og secerneret af gær-organismen på en måde, som efterligner dets produktion i nativt cellemiljø. Således er denne opfindelse resultatet af den heldige manipulation af udtrykkelses-15 medier og gærvært til at dirigere syntesen af protein, som ikke normalt syntetiseres af gærværten, og især til at regulere gærværten således, at proteinet kommer under direktion af dens sekretoriske vej.

^ I overensstemmelse hermed angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af nyttige mængder af et pattedyr-protein ud fra dyrkningsmediet af en gærkultur af levedygtige celler, der indeholder udtrykkelsesmedier indeholdende DNA, som koder for proteinet. Af stor fordel ^ er det, at det ved denne opfindelse er muligt at opnå et nyttigt, særskilt proteinprodukt i cellekulturmediet, så man ikke behøver at gribe til cellelyse for at udvinde det produkt, som hidtil kun har været tilgængeligt fra celleindholdet, ofte i en anden form end den modne.

30 De publikationer og andre skriftlige materialer, som der,~henvises til i denne beskrivelse for at belyse opfindelsens baggrund og i særlige tilfælde for at give yderligere detaljer med hensyn til dens udøvelse, er af

DK 163932B

2 nemheds grunde samlet i den vedføjede bibliografi, til hvis numre der henvises i det følgende.

Opfindelsens baggrund Gærorganismer transporterer naturligt et lille antal 5 af visse homologe proteiner hen til og somme tider igennem plasmamembranen som en vigtig hjælp til celleoverfladens vækst og cellemetabolismen. Når cellen danner knop som et led i formeringen forud for dannelsen af en dattercelle, kræves yderligere proteiner til 10 dannelse af cellevæg og plasmamembran såvel som til metabolismen. Nogle af disse proteiner må finde deres vej til funktionsstedet; derfor antages der at eksistere en sekretorisk vej (1). Visse homologe proteiner, som er involveret i det ovennævnte processer, dannes ved trans-' 15 lation i det endoplasmatiske reticulum. Homologe proteiner er dem, der normalt produceres af gærarten og kræves for dens levedygtighed. Når de først er dannet, vandrer de ved enzymatisk overførsel til Golgi-apparatet og derfra inden i vesicler til plasmamembraner, hvor nog-20 le forbindes med eller i nogen grad trænger ind i rummet mellem plasmamembranen og cellevæggen. Et lille antal homologe proteiner synes at eksporteres fuldstændigt igennem cellevæggen, såkaldt a-.faktor- og dræber-toxin (2, 3).

25 Igen synes cellens knopområde at være stedet for tiltrækning af vesiclerne, og ved deres sammensmeltning med knoppens indre overflade medvirker de til plasma-membranens og antageligvis cellevæggens samlede vækst (4, 5, 6). Denne teori giver intet bevis for, at der 30 faktisk sker sekretion eller vandring af proteinet el- le-T'-proteinerne igennem membranen. Ligeledes er det stadig' kontroversielt om glycosylering af proteinet eventuelt hjælper med til eller er impliceret i den såkaldte sekre- 3

DK 163932 B

toriske proces. Endvidere antages "secernerede" proteiner pr. definition at have et signal-præpeptid, som postuleres at være forbundet med transport- eller inkorporeringsprocessen ved membranoverfladen. Den eventuelle funktion af sådanne modifikationer af det 5 modne protein i den sekretoriske proces og den samlede rolle af den sekretoriske vej ved over fladevæksten er spekulationer, som ikke er begrundet i fast bevis.

10 Roggenkamp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 78 (1981), side 4466 - 4470, beskriver transformation af en gærcelle med DNA, som koder for en bakterielβ-lactamase, og udtrykkeisen og forarbejdningen afjb-lactamasen i gær. Imidlertid angives ikke noget om sekretion fra gær, 15 og derfor blev det bakterielle protein ikke udvundet fra det medium, hvori gæren var dyrket. Der var ikke inden for den kendte teknik nogen forventning om, at hvis en gærvært blev transformet med DNA, som koder for et pattedyrprotein, der er heterologt for gærorganismen, ville 20 pattedyrproteinet blive secerneret til mediet, således at det direkte kunne udvindes fra mediet. Af Roggenkamp et al.'s artikel kunne kun udledes, at det ville være nødvendigt at lysere værtsgærcellen og udvinde det udtrykte protein fra cellelysatet.

25

Opfinderne i denne sag forestillede sig, at rekombinant-DNA-teknologi kunne yde værdifuld hjælp til besvarelse af de åbne spørgsmål om den sekretoriske proces i gær-organismer og dermed til at gøre det muligt for sådanne 2q organismer at producere rigelige mængder af heterologe polypeptidprodukter endogent (se f.eks. 7-17) ved opnåelse af passende manipulation af gærværten til at dirigere sekretionen af heterologt protein i særskilt, maden form.

35

DK 163932 B

Sammenfatning af opfinde lu e ni

Opfindelsen er baseret på den erkendelse, ni. rja; r o rejon i nme r kan bringes til at udtrykke, fora ri) ej de og secernere protein, som normalt er heterologt for gærorgairLsmen og 5 ikke nødvendigt for dens levedygtighed, således at proteinet kan opnås ud fra det medium, der understøtter de levedygtige producerende gærceller, i særskilt form uden ledsagelse af uønsket po1ypeptid-præsekvens eller andet kunstigt udtrykkelsesprodukt. Egnede gærceller i en leve- 10 dygtig kultur transformeres med udtrykkelsesmedier, som indeholder DNA, der koder for et heterologt protein og et heterologt signalpolypeptid. Efter udtrykkelse af proteinet sammen med det heterologe signalpolypeptid forarbejdes udtrykkelsesproduktet, og det modne heterologe 15 protein eksporteres til mediet for cellekul turen. Produktet udvindes relativt let fra mediet uden behov for at nedbryde de levedygtige gærceller og fås i i øvrigt nativ form til anvendelse uden behov for at fjerne uønsket præsekvens eller andre kunstige udtrykkelses-produkter (f.eks. det methionin, som er knyttet til den ellers første N-terminale aminosyre, og som er en konse-kvens af udtrykkeisen af AUG-translations-startsignal-codonen). Således kan mediet opnås i en form, der er i det væsentlige fri for levedygtige eller nedbrudte (dvs. lyserede eller på anden måde brudte) celler og kan, fordi det indeholder det ønskede produkt, underkastes lettere anvendelig rensningsteknik. Et sådant produkt er efter rensning klart til brug efter sit formål. F.eks. finder humant leukocyt-interferon- 30 produkt anvendelse som humant antiviralt og/eller antitumor-middel (se alment 7-17).

SamTirénfattende omfatter den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fremstilling af et pattedyrprotein, som er heterologt for en gærorganisme og ikke er nødvendigt

DK 163932 B

o fur dens levedygtighed. sær nk i L i !π:.ι·: ud en in.-lnane i so ai” pni y pep r. .i. d-p r ær> ek vone eller andet kun:; L i cj L udtrykke!-s e s produkt, s o in produkt ; · f g æ r u d I r y k k e len, -forarht: j d -ning og -sekretion, og net særegne vod Γrcmqangsmåden er angivet i krav 1. 1 s kennel· egnende del. Endvidere tilveje-5 bringer opfindelsen en gærorgan .i sine-ne ί l eku l tu r . som er L stand til at producere et sådant, protein, og som er særegen ved det, der er angivet i krav 3's kendetegnende del, et dyrkningsmedium af en sådan gærorganisme-ce 1 lekul tur , for hvilket det særegne er angivet i krav 12's kende-10 tegnende del, og et gærudtrykkelscsmedium, for hvilket det særegne er angivet i krav 13's kendetegnende del.

Ued betegnelsen "heterologt protein" skal forstås protein, som ikke normalt produceres af eller er nødven-15 digt for levedygtigheden af en gærorgan isme. Denne betegnelse omfatter den funktionelle indsætning af DNA, der koder for et sådant protein, via rekombinant-DNA-teknologi i et udtrykkel sesmedium, der igen anvendes til at transformere en gærorganismevært. Funktionel indsæt- 20 ning af DNA betyder indsætningen af DNA, som koder for det heterologe protein og præsekvensen, i en udtryk-kelsesvektor under kontrol af udtrykkelsesdirige-rende promotorsystemer. Eksempler på sådant hetero-2g logt protein er hormoner, f.eks. humant væksthormon, okse-væksthormon osv., lymphokiner, enzymer, interferoner, f.eks. humane fibroblast-, humane immun- og humane og hybride leukocyt-interferoner osv., virale antigener eller immunogener, f.eks. mund- og klovsyge-antigener, influenza-antiyenisk protein, hepatitis-

Ov kerne- og -overfladeantigener osv., og forskellige andre polypeptider, f.eks. humant serumalbumin, humant insulin, forskellige glycoproteiner osv. "Heterolog præ-s-ekvens" eller "heterologt signal-polypeptid" henfører til sådanne polypeptider, der ikke normalt pro-35 duceres eller anvendes af et gærsystem, og kan udvælges 6

DK 163932 B

blandt det signal-polypeptid, som er nativt for det pågældende heterologe protein, eller andet heterologt (signal) polypeptid, som er funktionelt forbundet med det pågældende heterologe protein.

"Sekretion" betyder i denne beskrivelse eksport af produkt igennem plasmamembranen og mindst ind i eller igennem gærorganismens cellevæg til det medium, som under- . støtter cellekulturen. I denne forbindelse vil det forstås, at "secerneret" produkt i nogle tilfælde forbin-^ des på en eller anden måde med cellevæggen, hvilket måske nødvendiggør en anden rensningsprocedure eller en modifikation af gærværtens struktur og funktion. "Forarbejdning" betyder den cellulære spaltning af signalpoly-peptidet fra det modne protein til dannelse af proteinet uden ledsagelse af fremmed peptid i såkaldt særskilt, moden form. Ved fremmed peptid skal også forstås kunstige peptidudtrykkelsesprodukter, såsom methionin, som anført ovenfor. Forarbejdning tillader inkonsekvent spaltning af signalpolypeptidet ved et locus, som ikke er inak-tiverende nær ved det præcise punkt for signalpolypep-tidets forening med modent protein.

25 30 35

DK 163932B

7

Kort beskrivelse af tegningerne

Fig. 1 viser en sammenligning af aminosyresekvensen af signal-præpeptidet af humant IFN-al (præ-D), IFN-a2 (præ-A), IFN-otl,2 (præ-D/A), IFN-Y (præ-tø") og IFN —13 5 (præ-β). De understregede aminosyrer repræsenterer forskelle mellem aminosyresekvenserne af præ-A og præ-D. Ddel-stedet indicerer forbindelsen mellem D-og A-præsekvenserne ved fremstilling af den hybride præ-D/A-sekvens.

10 Fig. 2 er et diagram over gærudtrykkelsesplasmidet YEplPT, der anvendes her som et alment medium for ud-trykkelse af forskellige genindsætninger, og viser nogle af dets restriktionssteder og forskellige områder af interesse.

15 Fig. 3 viser konstruktionen af et EcoRI-fragment indeholdende præ-plus-IFN-al-genet til direkte udtrykkelse af IFN-al i gær.

Fig. 4 viser konstruktionen af et EcoRI-fragment indeholdende det modne IFN-a2-gen til direkte udtrykkelse 20 i gær.

Fig. 5 viser konstruktionen af EcoRI-fragment indeholdende præ-plus-IFN-a2-genet med kodningssekvensen for de første 14 aminosyrer i præsekvensen af præ-IFN-al til direkte udtrykkelse af IFN-a2 i gær.

25 Fig. 6 viser konstruktionen af et EcoRI-fragment indeholdende præ-plus -IFN-)f-genet med 70 bp af ledersekvensen forud for start-ATG-codonen til udtrykkelse af IFN-tø" i .gær.

DK 163932B

8

Fig. 7 viser konstruktionen af et EcoRI-fragment indeholdende præ-plus-IFN-^-genet til direkte udtrykkelse af IFN-y i gær.

Fig. 8 giver en sammenfatning af alle de konstruktioner, 5 som er anvendt til udøvelse af den foreliggende opfindelse ved udtrykkeisen, forarbejdningen, og sekretionen af de forskellige IFN-gener i gær.

Fig. 9 er en vækstkurve af a) YEplPT-LeIFA_l/pep4-3 og b) YEplPT-preLeIFA53t/pep4-3 målt som absorbansen ved 10 660 nm (A^g). Medier blev prøvet for interferonakti vitet for a) og for b) under anvendelse af en bioprøvning. Tiden henfører til timers vækst ved 30 °C.

Fig. 10a er en vækstkurve for en 5 liters gæring af YEplPT-preLeIFA53t/pep4-3. (·) er absorbansen ved 660 nm 15 ^660^’ milli°ner enheder af interferonaktivitet pr. liter inden i cellerne.

Fig. 10b er den samme vækstkurve som defineret i fig.

10a, der angiver aktiviteten fra mediet.

Fig. 11 er en elueringsprofil af medie-præ-D/A-LeIF fra 20 en monoklonal antistofsøjle.

Fig. 12 er HPLC-sporingen af den maksimale A-interferon-sammenhældning fra den monoklonale antistofsøjle.

Fig. 13 er resultatet af aminosyre-sekvensbestemmelse på produktet opnået efter HPLC-rensning.

25 Fig. 14 viser de forskellige konstruktioner anvendt til at'-fremstille humant væksthormon (HGH) ifølge opfindelsen".

DK 163932 B

9

Fig. 15 viser skematisk restriktionskortet af 3,1 kbp HindiII-indsætningen i vektor pBl, hvorfra PGK-pro-motoren blev isoleret. Vist er indsætningen af et EcoRI-sted og et Xbal-sted i den 51-flankerende DNA 5 af PGK-genet.

Fig. 16 viser den 5'-flankerende sekvens plus den begyndende kodningssekvens for PGK-genet før indsætning af et Xbal-sted og et EcoRI-sted.

Fig. 17 viser skematisk den teknik, som er anvendt til 10 at indsætte et Xbal-sted ved position -8 i PGK-pro-motoren og at isolere et 39bp fragment af den 5'-flankerende sekvens af PGK indeholdende denne Xbal-ende og en Sau3A-ende.

Fig. 18 viser skematisk konstruktionen af et 300 bp frag-15 ment indeholdende det ovennævnte 39 bp fragment, yderligere 51-flankerende PGK-sekvens (265 bp) fra Pvul til Sau3A (se fig. 15) og et EcoRi-sted op til Xbal-stedet.

Fig. 19 viser skematisk konstruktionen af 1500 bp PGK-promotor-fragmentet (HindiII/EcoRi), som foruden det 20 i fig. 4 konstruerede fragment indeholder et 1300 bp Hindlll til Pvul-fragment fra den 5'-flankerende PGK-sekvens (se fig. 15).

Materialer

Alle DNA-restriktions- og metaboliske enzymer blev købt 25 fra New England Biolabs og fra Bethesda Research Laboratories. DNA-restriktionsenzymer og metaboliske enzymer blev anvendt under betingelser og i puffere som beskre-vet-af deres respektive producenter. ATP og deoxynucleo-tidtriphosphaterne dATP, dGTP, dCTP og dTTP blev købt 30 fra PL Biochemicals. DNA-linkere blev fremstillet ved standardmetoder.

DK 163932B

10 DNA-fremstillinq og transformation

Rensning af kovalent lukkede cirkulære plasmid-DNA1 er fra E. coli (18) og transformation af E. coli (19) blev udført i overensstemmelse med tidligere beskrevne 5 procedurer. E. coli miniscreens var som beskrevet i (20). Transformation af gær blev udført som tidligere beskrevet (21), men med de følgende modifikationer. 200 ml celler blev anvendt i en koncentration på 2 x 10^ celler/ml og vasket med 25 ml vand ved cen-10 trifugering. Disse celler blev behandlet med 10 ml 1M sorbitol, 25 mM EDTA (pH - 8) og 50 mM dithiothreitol i 10 minutter ved 30 °C efterfulgt af en vaskning med 10 ml 1M sorbitol. Pelleterede celler blev derpå forsigtigt gensuspenderet i 10 ml SCE (1M sorbitol, 0,1M 15 natriumcitrat, pH = 5,8, og 0,01M EDTA) og behandlet ved 30 °C med 200 ^ug zymolase 60 000 (Kirin Brewery). Sfæ-roplast-dannelse blev fulgt til 80?0 ved tilsætning af . 100 ^ul af suspensionen til 0,9 ml 10?0 SDS og måling af a'bsorbansen ved 800 nm under anvendelse af en for-20 tynding af celler før tilsætning af enzymet som 0 % (lyse i de 10 % SDS resulterer i et fald i AgQQ). Cellerne blev derpå vasket tre gange med 10 ml 1M sorbitol.

Celler kan opbevares flere dage ved 0 °C i sorbitolet.

Cellerne blev derpå vasket en gang med 1M sorbitol, 25 10 mM CaC^ og 10 mM "Tris"-HCl (pH 7,4) og derpå gen- suspenderet i 1 ml af det samme. 5-15 ^ug renset plasmid-DNA eller 20 ^ul miniscreen-DNA fra E. coli (2/5 af plasmid-DNA'en fra en 5 ml stationær kultur af E. coli dyrket i LB) tilsattes derpå og blev forsigtigt blandet 50 med 100 ml af de gensuspenderede celler i 15 minutter.

Derpå tilsattes 1 ml af en opløsning indeholdende 20 % (vægt/vol.) polyethylenglycol 4000 (Baker), 10 mM CaC^ og 1.0 mM "Tris"-HCl (pH 7,5) under forsigtig blanding i 15 -minutter. Cellerne blev derpå centrifugeret ned og 55 forsigtigt gensuspenderet i 200 ^ul SOS (1M sorbitol,

DK 163932B

11 33,5 i/ol.S YEPD-væske og 6,5 mM CaC^) og inkuberet ved 30 °C i 20 minutter. 100 yul af denne suspension blev derefter anbragt på en Petri-plade indeholdende 20 ml bundagar (182 g sorbitol, 20 g glucose, 6,7 g YNB og 5 30 g Difco-agar pr. liter vand), som blev dækket med 10 ml 50 °C topagar (samme som bundagar, men med 1 ml adenin (1,2 mg/ml), 1 ml uracil (2,4 mg/ml) og 1 ml -trp ".drop-out"-blanding pr. 50 ml bundagar [-trp "drop-out"-blanding indeholder disse aminosyrer pr.

10 100 ml vand: 0,2 g arg, 0,1 g his, 0,6 g ile, 0,6 g leu, 0,4 g lys, 0,1 g met, 0,6 g phe, 0,5 g thr]). Denne + 3 4

Trp -selektion resulterer i 10 - 10 gærtransformanter pr. yug plasmid-DNA.

Gærplasmid blev opnået fra gær ved dyrkning af 15 ml 15 gær til stationær fase (A^g = 5-6) i YNB+CAA (se 'Stammer og Medier" nedenfor) ved sfæroplast-dannelse som ved den ovenstående procedure, ved pelletering af celler og ved anvendelse af E. coli miniscreen-proceduren (uden lysozym) som beskrevet i (20).

20 Stabiliteten af plasmider i gær blev bestemt ved fortynding af celler under selektiv vækst i YNB+CAA og ud-pladning på YEPB-plader (ikke selektive). Efter 2 dages vækst ved 30 °C blev disse plader replica-udpladet på YNB+CAA-plader (Trp+-selektion). Procent plasmid-25 stabilitet blev udregnet ved antallet af kolonier, som vokser ikke-selektivt minus dem, der ikke vokser selektivt, divideret med antallet af kolonier dyrket ikke-selektivt gange 100.

Stammer og medier 30 E. c.oli K-12 stamme 294 (ATCC nr. 31446) (22) blev an-vendt til al anden bakterietransformation. Gærstammerne pep4-3 (20B-12, d trpl pep4-3) (23) og GM3C-2- (a, leu

DK 163932B

12 2-3, leu 2-112, trp 1-1, his 4-319, cyc 1-1, cyp 3-1) (24) blev anvendt til gærtransformationer. Gærstammerne 20B-12 og GM3C-2 er blevet deponeret uden begrænsning i the American Type Culture Collection under ATCC nr.

5 20 626 og 20 625, begge den 5. marts 1982. Forskellige gærstammer kan anvendes; se Lodder et al., The Yeasts, a Taxonomic Study, North-Holland Publ. Co., Amsterdam.

På lignende måde kan der anvendes forskellige medier Difco Manual of Dehydrated Culture Media and Reagents 10 for Microbiological and Clinical Laboratory Procedures, 9th Ed., Difco Laboratories, Inc., Detroit, Michigan, U.S.A. (1953).

LB var som beskrevet af Miller (25) med tilsætning af 20 ^,ug/ml ampicillin (Sigma) efter at mediet er autokla-15 veret og afkølet. Gær blev dyrket på de følgende medier: YEPD indeholdt 1 % gærekstrakt, 2 % pepton, 2 % glucose og omkring 3 % Difco-agar. YNB+CAA indeholdt 6,7 g gær-nitrogenbase (uden aminosyrer) (YNB, Difco), 10 mg adenin, 10 mg uracil, 5 g Difco-casaminosyrer (CAA), 20 20 g glucose og omkring 30 g agar pr. liter (anvendt til T rp+-selektion).

Vækstkurve og ekstraktfremstilling

Individuelle kolonier af gærstammerne YEplPT-preLelF-A 53t/pep4-3 og YEpiPT-LeIF-A l/pep4-3 blev dyrket i 7 timer 25 ved 30 °C i 100 ml YNB+CAA til en A^g på omkring 1,1.

100 ml af disse kulturer blev fortyndet til 1 liter med YNB+CAA til opnåelse af en opløsning med A,,n = 0,1. Dis-se en-liter kulturer blev derpå dyrket ved 30 °C, og der blev med mellemrum udtaget 10 ml aliquoter til måling af 30 optisk tæthed, interferonproduktion og sekretion. Til prøjjfJiing blev hver 10 ml aliquot centrifugeret ved 7 000 omdr./min i 15 minutter i en "Sorval RC3B". Supernatanten (mediet) blev prøvet uden fortynding. Cellerne blev gen-

DK 163932B

13 suspenderet i O,A ml 7M guanidin-HCl indeholdende et lige så stort volumen glasperler og blev centrifugeret to gange i 2 minutter ved høj hastighed. Cellelysatet blev derpå fortyndet i PBS/BSA (150 mM NaCl, 20 mM 5 natriumphosphat (pH = 7,9) og 0,5 % okseserumalbumin) til bioprøvning.

Interferonprøvninqer

Ekstrakter af gær blev prøvet for interferon ved sammenligning med interferon-standarder ved prøvningen 10 for inhibering af den cytopathiske effekt (CPE) (26). Gærekstrakter blev fremstillet som følger: 10 ml kulturer blev dyrket i YNB+CAA, indtil de nåede en A^g på fra omkring 1 til omkring 2. Cellerne blev opsamlet ved centrifugering og derpå gensuspenderet i 3 ml 1,2M 15 sorbitol, 10 mM KH^PO^, pH = 6,8 og 1 % zymolyase 60 000 og derefter inkuberet ved 30 °C i 30 minutter (til 90 % sfæroplastdannelse). Sfæroplasterne blev pelleteret ved 3000 x gn i 10 minutter og derpå gensuspenderet i 150 ^ul 7 M guanidin-hydrochlorid (G*HC1) plus 1 mM phenylmethyl-20 .· sulfonylfluorid (PMSF). Ekstrakter blev fortyndet 20 - 100 gange i PBS/BSA-puffer (20 mM NaH^PO^, pH = 7,4, 150 mM NaCl, 0,5 % BSA) umiddelbart før prøvningen. Alternativt blev 10 ml celler ved den samme A^g pelleteret og gensuspenderet i 0,4 ml 7 M G*HC1 i et Eppendorf-glas 25 (1,5 ml) indeholdende omkring 0,4 ml glasperler (0,45- 0,5 mm, B. Braun Melsurgen AG). Disse glas blev centrifugeret to gange i 2 minutter ved højeste hastighed, idet de holdtes på is imellem. Ekstrakterne blev centrifugeret 0,5 minutter i Eppendorf-centrifuge og fortyndet i PBS/BSA-30 puffer som ovenfor. Bioprøvninger blev gennemført med MDBK-celler (26) for LeIF A, LeIF D og præ-formerne; men med ,HeLa-celler (26) for IFN-J' og præIFN-)f.

DK 163932B

14

Rensning af (præ-D/A) LeIF A fra mediet

En enkelt koloni af gærstammen YEplPT-præLelF-A _53t/pep4-3 blev dyrket ved 30 °C i 500 ml YNB+CAA til en Aggg på 2,4. 500 ml af denne kultur blev for-5 tyndet til 5 liter med YNB+CAA til opnåelse af en ^660 P® 0,21; den resulterende 5 liters kultur blev dyrket ved 30 °C, indtil var 4. På dette tids punkt blev 5 liters kulturen høstet ved centrifugering ved 7 000 omdr./min. i 10 minutter. 10 ml aliquoter 10 blev udtaget med mellemrum under gæringen for at måle optisk tæthed, interferonproduktion og sekretion. Før prøvningen blev hver aliquot centrifugeret i 5 minutter i en lille laboratoriecentrifuge med afkøling for at adskille cellerne fra mediet. Mediet og cellerne 15 blev prøvet som beskrevet ovenfor (se Fig. 9, 10a, 10b).

Mediet blev koncentreret til et slutvolumen på 200 ml og derpå diafiltreret over for tris/cys/EDTA, pH 8,0 på en 1000 dalton ultrafiltreringsmembran (0-PS,

Osmonics) i et Amicon tyndkanalsapparat (TCF 10). Re-20 tentatet (200 ml) sendtes over en 1,5 ml immunoaffinitet-søjle indeholdende et monoklonalt antistof for LeIF-A kovalent bundet til "Affigel 10" (BioRad) ved en strømningshastighed på 15 ml/time. Mere end 80 % af interferonaktiviteten i den oprindelige opløsning blev bun-25 det til søjlen. Gennemstrømningen blev derpå genoptaget med en strømningshastighed på 40 ml/time. Efter den anden påføring fandtes omkring 7 ?ό af den oprindelige interferonaktivitet i gennemstrømningen. Søjlen blev derpå vasket med 0,2M NaCl i tris/cys/EDTA, pH 8,0. Omkring 30 1,7 % af aktiviteten blev elueret under denne vaskning.

Hovedparten af interferonaktiviteten (omkring 50 % af den oprindelige aktivitet) blev derpå elueret fra søjlen med 51,5 ml deioniseret vand med pH 5,5. Søjlen blev en

DK 163932B

15 delig vasket med 22,5 ml 0,2 M eddikesyre for at eluere alt resterende protein; ca. 8 % af den oprindelige aktivitet blev elueret. Efter eddikesyreeluering blev søjlen genækvilibreret med tris/cys/EDTA, pH 8,0.

5 Fraktioner på 2,25 - 4,5 ml blev opsamlet under vask- ningerne med vand, eddikesyre og tris/cys/EDTA (Fig. 11). Fraktionerne nr. 1-7 blev hældt sammen og lyophiliseret til tørhed. Remanensen blev genopløst i 200 ^ul 0,1 % trifluoreddikesyre (TFA), pH 2,5 og yderligere renset 10 ved HPLC på en Synchropak RP-P søjle. Søjlen blev elueret med en strømningshastighed på 1 ml/minut med en lineær gradient på 0 - 100 % acetonitril i 0,1 % TFA, pH 2,5. Der blev opsamlet 1 ml fraktioner, som blev prøvet efter fortynding i PBS/BSA som beskrevet ovenfor.

15 En 2,5 yug prøve af renset IFN-A blev også chromatogra-feret som kontrol (Fig. 12). Interferonaktiviteten blev elueret fra søjlen som et enkelt maksimum centreret omkring fraktion 39. Denne fraktion blev lyophiliseret til tørhed, og remanensen sekvensbestemt.

20 Sekvensanalyse

Sekvensanalyse blev baseret på Edman-nedbrydningen (27).

Prøven blev indført i bægeret på en Beckman 890B "spinning cup"-sekvensanalysator. "Polybrene " poly- > (N,N,N^N^-tetramethy1-N-trimethylenhexamethylendiam-25 moniumdiacetat) blev anvendt som bærer i bægeret (28).

Sekvensanalysatoren blev modificeret med en kold fælde og nogle programændringer for at reducere baggrundsmaksima. Reagenserne var Beckman's sekvensbestemmelseskvalitet 0,1 molær "Quadrol"-puffer, phenylisothiocyanat og 30 heptafluorsmørsyre.

En-nrodifikation inkluderede også automatisk omdannelse af *2-anilino-5-thiazolinon-derivaterne, efterhånden som de blev ekstraheret fra sekvensanalysatoren. 1-chlorbu-

DK 163932 B

16

TM

tanet blev opsamlet 1 en "Pierce Reacti-Vial " og tørret under nitrogen. Derpå sattes 25 % trifluor-eddikesyre (TFA) i vand til 2-anilino-5-thiazolinonet, og blandingen blev opvarmet til 20 °C i 10 minutter 5 for at omdanne det til 3-phenyl-2-thiohydantoin (PTH-derivat) (29). PTH-aminosyreresten blev derpå automatisk opløst i 50 % acetonitril og vand og injiceret i en revers-fase højtryksvæskechromatograf. Hver PTH-aminosyre blev derpå identificeret ved sammenligning 10 med tilbageholdelsestiderne for en standardblanding af PTH-aminosyrer, som blev indført i omdannelsesampullen og behandlet på samme måde som en cyklus fra sekvens-analysatoren. Resultaterne er sammenfattet i fig. 13 og omtalt nedenfor.

15 Western-dupninqsproceduren

Proteiner blev først underkastet elektrophorese på en polyacrylamid-pladegel i nærvær af natriumdodecylsulfat (46, 47) før elektroforetisk overførsel til nitrocellulosepapir (S + S BA 85) og efterfølgende immunologisk 20 identifikation af HGH. Overførselsapparatet (Electroblot, E»C. Apperatus Corp., St. Petersburg, FL.) blev samlet, efter at gelen og nitrocellulosepapiret var blevet vasket kort med en overførselspuffer indeholdende 25 mM "Tris", 192 mM glycin, pH 8,4. Overførslen blev udført 25 ved 400 mA i 1,5 timer, hvorefter afdupningen blev anbragt i 50 mM "Tris" pH 7,4, 0,15 M NaCl, 5 mM EDTA, 0,25 % gelatine (vægt/vol), 0,05 % NP-40 og omrørt forsigtigt natten over. En passende fortynding af kanin-anti-HGH-antiserum blev anbragt i en plasticpose med af-30 dupningen og NP-40/gelatine-puffer (typisk 100 ^ul/cm ) og inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur under forsigtig rokning. Afdupningen blev vasket kort med vand efterfulgt af NP-40/gelatine i 1 time og sonderet med 125 [ I] Protein A (Neu/ England Nuclear) fortyndet i

DK 163932 B

17 NP-40/gelatine-puffer i en "Seal-a-Meal"-pose i 1 time ved stuetemperatur under forsigtig rokning. Efter vask-ning flere gange med vand blev dupningen svøbt ind i cellofan og anbragt i en kassette natten over med 5 "X-Omat-AR" film (Kodak) med en intensiveringsskærm ved -70 °C.

Gelfarvninq

Polyacrylamidgeler indeholdende protein blev farvet ved den metode, der er beskrevet af Oakley et al (41).

10 Sekretionssiqnalsekvenser af pattedyrinterferonqener

Med den nylige isolering af cDNA'er indeholdende generne for leukocyt- (7), fibroblast- (10) og immun- (30) interferoner og den nylige udvikling af gær som et ud-trykkelsessystem for heterologe gener (14) blev det ,15 muligt at prøve udtrykkeisen af heterologe gener indeholdende kodningsområder for signalpeptidsekvenser i gær.

Fig. 1 viser signalsekvenserne for fem forskellige interferoner. Disse aminoterminale sekvenser antages at lette sekretionen af interferonproteiner fra pattedyr-20 celler. Under processen fjernes signalsekvensen ved specifik proteasespaltning mellem position -1 og +1 til dannelse af hvad der kendes som den modne form af interferonet. Disse sekvenser har almene karakteristika fra andre sekretionssignalsekvenser (31). De er alle meget 25 hydrofobe, af omkring samme længde som andre signaler og har en lille aminosyre til venstre for spaltningsste det. Selv om præLelFA, præLelFD og præIFN-Jf alle spalter mellem glycin og cystein, er dette ikke en almindelig regel for andre pattedyrsignaler som vist ved præIFN-Ø.

DK 163932 B

18

Faktisk er der ingen overensstemmelsessignalsekvens blandt organismer eller inden for den samme organisme.

Der er heller ingen overensstemmelsessekvens ved spaltningspunktet mellem signalsekvensen og den modne 5 form af proteinproduktet.

Derfor var det af stor interesse at forsøge udtrykkeisen af disse præ-interferoner i gær for at bestemme, om disse heterologe proteiner ville secerneres fra gær, og af hvad art bearbejdningen af disse proteiner kunne 10 være. Selv om gær er en eukaryotisk organisme ligesom pattedyrceller, og selv om gær viser sig at have en sekretionsvej, der i mange henseender er mage til højere eukaryoters (1, 32), er det en meget primitiv eukaryot, og den rette funktion og bearbejdning af disse genpro-15 dukter ville kræve en stor bevarelse af processen mellem gær og pattedyrceller under udviklingen, hvoraf re-sultaterne ikke altid er indlysende.

Konstruktion af et gærplasmid til udtrykkelse af præ-• ‘ - interferon-generne____ 20 Information vedrørende konstruktionen af et plasmid til udtrykkelse af et heterologt gen i gær er blevet publiceret (14).

Plasmidet, som anvendtes i dette arbejde, er vist i fig.

2. Dette plasmid indeholder en portion af pBR322 (33) 25 med ampicillin-resistens-(Ap )genet og E. coli replicer ingsoriginet for selektion og stabil vækst i E. coli (anvendt som mellemprodukt mellem in vitro konstruktion og transformation af gær). Plasmidet indeholder også TRP1-genet på et EcoRI til PstI fragmentet, som stammer fra 30 ch’romosom III i gær (34-36). Dette gen muliggør selektion i trplw gær og kan således anvendes til at isolere gærceller indeholdende plasmidet og til opretholdelse af

DK 163932 B

19 plasmidet. Endvidere indeholder plasmidet et gær-repliceringsorigin på et 2,0 kbp fragment fra endogent gær-2^u-plasmid-DNA (37). Dette origin tillader DNA'en at repliceres autonomt i gær og opretholdes som plas-3 mid.

Den anden hovedkomponent i systemet er gær-3-phospho-glycerat-kinase (PGK)-promotorfragmentet, som origine-rer transcription nær ved det eneste EcoRI-sted i plasmidet (det andet EcoRI-sted blev fjernet ved ud-10 fyldning af det restriktionsspaltede sted under anvendelse af E. coli DNA-polymerase I (Klenow) efterfulgt af stump-ende-ligering).

Isoleringen af 3-phosphoglyceratkinase (PGK)-genet er blevet omtalt andetsteds (37a) såvel som konstruktionen 15 af 1,6 kpb promotorfragmentet (nedenfor). Et Hind III/Bgl II fragment fra gær-TRP 1 genområdet (34-36) Λ

i chromosom III blev anvendt som omdanner af Hind III

til Bgl II til ligering med BamHI-stedet i pBR322,

S

hvilket gør plasmidet tetracyclinfølsomt (Tc ). Endvi-20 dere bør det nævnes, at 2,0 kbp fragmentet fra 2 ^u DNA udøver en anden funktion ved, at det indeholder et tran-scriptionsafslutnings/polyadenylerings-signal, som normalt er afslutningssignalet for "Able"-genet i 2 plasmid (37). Et sådant område viser sig at være nødvendigt 25 for god udtrykkelse. Gen indsætninger som EcoRI-fragmen-ter i den rette orientering kan derpå udtrykkes som protein, når vektoren indføres i gær.

Konstruktion af gærplasmider til udtrykkelse af de forskellige interferonqener_ 30 Gærudtrykkelsesplasmidet YEplPT indeholder et enkelt EcoRI-restriktionssted. Indsætning af et fremmed gen i dette eneste EcoRI-sted fører til udtrykkeisen af

DK 163932 B

20 dette gen under kontrol af gær-phosphoglyceratkinase (PGK)-promotoren. En hensigtsmæssig måde at indsætte de forskellige interferongener i EcoRI-stedet af dette gærplasmid er at have DNA-fragmenter med 5 EcoRI-steder flankerende startcodonen og afslut- ningscodonen af de forskellige interferongener. Vi beskriver her konstruktionen af sådanne EcoRI-frag-menter til udtrykkelse af interferongener. Det er vigtigt at anvende omdannere til EcoRI ved genets 3'-ende, 10 således at de ikke afslutter transcription, men tillader transcription igennem 2 yU-terminatoren.

Vi har tidligere beskrevet konstruktionen af et EcoRI-sted lige før ATG-startcodonen for det modne IFN-al-gen (14, 17), det modne IFN-a2-gen (7), det modne '15 IFN-Ø-gen (10) og det modne IFN-^-gen (30).

l-DNA-restriktionsanalyse viser, at der er et EcoRI-sted : hensigtsmæssigt lokaliseret i det ikke-kodende 3'- område af cDNA-klonen af IFN-al (8), således at nedbrydning af plasmidet pLeIFD3 (17) med EcoRI skaber et 20 583 bp EcoRI-fragment, som indeholder hele IFN-al- genet.

Fig. 3 viser konstruktionen af et EcoRI-fragment indeholdende præ-IFN-oil-genet. Et Haelll-sted er lokaliseret mellem den første og den anden aminosyre af præ-IFN-al 25 (8). Et delvis Haelll-nedbrudt 254 bp fragment, som strækker sig fra dette Haelll-sted til Bglll-stedet i midten af kodningsområdet, blev isoleret. Et selv-komplementært syntetisk oligonucleotid, 5'-CCATGAATTCATGG-3', blev stump-ende-ligeret til 254 bp Haelll-BgIII frag-30 mentet for at skabe et EcoRI-sted forud for ATG-start-codonen. Et 264 bp EcoRI-BgIII fragment blev derpå isoleret ved nedbrydning af ligeringsblandingen med EcoRI og Bglll. Dette EcoRI-BgIII fragment, som indeholder den

DK 163932 B

21 forreste halvdel af præ-IFN-al-genet, blev derpå ligeret til den bageste halvdel af præ-IFN-al-genet, et 372 bp Bglll-EcoRI fragment isoleret fra nedbrydning af IFN-al-cDNA-fclonen med Bglll og EcoRI.

5 EcoRI-fragmentet indeholdende hele præ-IFN-al- genet blev derpå dannet ved nedbrydning af ligeringsblandingen med EcoRI og isolering af et 636 bp fragment .

Fig. 4 viser konstruktionen af et EcoRI-fragment inde-10 holdende det modne IFN-a2-gen. Et 876 bp EcoRI-PstI fragment, der indeholder det modne IFN-a2-gen med et EcoRI-sted lige foran ATG-startcodonen og med 400 bp ikke-kodende 3'-område afledt fra cDNA-klonen blev iso-·. >. leret ved nedbrydning af plasmidet pLeIFA25 (7) med 13 EcoRI og Pstl. Pstl-enden af dette 876 bp fragment blev derpå omdannet til et EcoRI-sted ved anvendelse af et ·' f' . „ adaptor-fragment. Dette 978 bp adaptor-fragment inde-V· holder .et indre EcoRI-sted og har Pstl-steder ved begge ender. 230 bp af dette fragment, som strækker sig fra • , 20 . den ene Pst-ende til EcoRI-stedet, afledes fra gærplas- mid-2^u-DNA (37). 748 bp af resten af fragmentet, som strækker sig fra EcoRI-stedet til den anden Pstl-ende, afledes fra bakterieplasmidet pBR322 (hele fragmentet afledes fra YEpl3 (37b)). Ligering af dette adaptor-25 fragment til 876 bp EcoRI-Pstl-fragmentet indeholdende det modne IFN-a2-gen efterfulgt af nedbrydning med EcoRI skaber et 1096 bp fragment indeholdende det modne IFN-a2-gen med EcoRI-steder ved begge ender.

Fig. 5 viser konstruktionen af et EcoRI-fragment inde-30 holdende præ-IFN-a2-genet. Restriktionsanalyse viser, at der findes et fælles Ddel-sted mellem den 14. og den 15. aminosyre i præsekvensen af både præ-IFN-al-og -a2-genet. Ligering af 44 bp EcoRI-Ddel fragmentet afledt fra EcoRI-fragmentet, der koder for præ-IFISI-al-

DK 163932B

22 genet, og 900 bp Ddel-Pstl-fragmentet afledt fra cDNA-klonen af IFN-a2 efterfulgt af nedbrydning med EcoRI og PstI skaber et 944 bp fragment. Dette 944 bp EcoRI-Pstl-fragment indeholder kodningssekvensen af de 5 første 14 aminosyrer i præpeptidet afledt fra IFN-al, kodningssekvensen af resten af præpeptidet og hele det modne protein afledt fra IFN-a2. Pstl-enden af dette 944 bp fragment blev derpå omdannet til et EcoRI-sted under anvendelse af adaptor-fragmentet som ved 10 konstruktionen af et EcoRI-fragment for modent IFN-a2.

Fig. 6 viser konstruktionen af et EcoRI-fragment indeholdende præ-IFN-^-genet med 70 bp ledersekvens forud for ATG-startcodonen. Nedbrydning af IFN-'^cDNA-klonen (30) skaber et 842 bp Sau3A-fragment med 60 bp 5'-15 flankerende sekvens, hele kodningssekvensen for præ-IFN-Jf og 290 bp ikke-kodende 3'-sekvens. Dette Sau3A-fragment blev derpå klonet ind i en BamHI-nedbrudt vektor pUC7, et plasmid-modstykke til den enkeltstrengede fag M13mp^ (38). Plasmidet pUC7 blev afledt fra pBR322 20 ved først at fjerne 2067 bp EcoRI-PvuII-fragmentet indeholdende tetracyclinresistens-genet, derpå indsætte et 425 bp Haell-fragment fra fag-M13-derivatet mp7 (38) ind i Haell-stedet af det resulterende plasmid ved position 2352 (i forhold til pBR322-notationen). Haell-25 fragmentet fra mp7 indeholder det N-terminale kodningsområde af E. coli lacZ-genet, hvori et multi-restriktions-enzym-kloningssted af sekvensen er blevet indsat mellem den 4. og 5. aminosyrerest af β-galactosidase. Indsætning af et fremmed DNA-fragment i disse kloningssteder 30 afbryder kontinuiteten mellem lac-promotoren og lacZ- genet, hvilket ændrer fænotypen af en JM83 transformeret med plasmidet fra lac+ til lac-. Da der er to EcoRI-steder, som flankerer BamHI-stederne i multi-restrikti-ons-kloningsstedet i pUC7, ville nedbrydning af plasmidet 35 indeholdende 842 bp Sau3A-indsætningen med EcoRI give et

DK 163932B

23 862 bp fragment indeholdende hele præ-IFN-Jf-sekvensen flankeret af EcoRI-steder.

Nedbrydning af plasmidet pIFN-)ftrp48 (30) med EcoRI og Bgll skaber et 689 bp fragment med en EcoRI-5 ende foran ATG-startcodonen, hele kodningssekvensen

af modent IFN-Jf og 210 bp ikke-kodende sekvens. Bgll-enden blev derpå omdannet til en EcoRI-ende ved ligering til en 29 bp Bgll-EcoRI adaptor afledt fra det tidligere beskrevne præ-IFN-J^EcoRI-fragment. Efterføl-10 gende nedbrydning af ligeringsblandingen med EcoRI

ville derpå danne et 718 bp EcoRI-fragment indeholdende det modne IFN-^f-gen.

Fig. 7 viser konstruktionen af et EcoRI-fragment indeholdende præ-IFN-)f-genet med en EcoRI-ende og sekvensen 15 AAA foran ATG-startcodonen. Det tidligere beskrevne

EcoRI-fragment indeholdende præ-IFN-^genet blev nedbrudt med EcoRI og MboII til dannelse af et 184 bp fragment. Dette fragment, indeholdende den forreste del af præ-IFN-^T-genet, blev varmedenatureret og sammensmel-20 tet (10) med et 5 1-kinase-behandlet syntetisk oligo- nucleotid 5'-pATGAAATATACA, der koder for de første fire aminosyrer af præ-IFN-iT-genet. Med den nedre streng af EcoRI-MboII-fragmentet som skabelon og oligonucleotidet som primer blev Klenow-fragmentet af E. coli DNA-25 polymerase anvendt til at syntetisere den øvre streng og fjerne den 3'-udragende ende fra den nedre streng.

Det resulterende 178 bp stump-endede fragment, som strækker sig fra ATG-startcodonen til det første MboII-sted nedenfor, blev derpå ligeret til en selvkomplementær 30 5'-TTTGAATTCAAA-3' EcoRI-linker. Nedbrydning af lige ringsblandingen med EcoRI og Ddel skaber et 165 bp EcoRI-Ddel fragment, som indeholder den forreste del af præ-IFN-^-genet. Hele genet blev derpå samlet ved ligering med 600 bp Ddel-EcoRI fragmentet, som indeholder den

DK 163932B

24 bageste del af IFN-^-genet og det ikke-kodende 3'-område. Ligeringsblandingen blev derpå nedbrudt med EcoRI til dannelse af et 765 bp EcoRI-fragment indeholdende hele præ-IFN-ν'-genet.

5 En sammenfatning af alle disse EcoRI-fragment-konstruk-tioner (I — IX) er vist i fig. 8. Alle disse konstruktioner blev anbragt i vektoren YEplPT (fig. 2) til udtrykkelses- og sekretionsforsøg under anvendelse af gær.

10 Udtrykkelses- og sekretionsniveauer af interferoner med gær indeholdende disse plasmider_

Efter at EcoRI-fragment-generne fra fig. 8 var indsat i YEplPT (fig. 2), undersøgt for orientering og indført i gær under anvendelse af Trp+-komplementering, blev 15 gæren indeholdende disse plasmider prøvet for interferon under anvendelse af prøvningen for cytopatisk effekt (CPE) (26) (bioprøvning) på ekstrakter, frigjort cellevægmateriale og medie. Interferonprøvninger blev udført på tre adskilte rumligt afgrænsede steder 20 i gærkulturen. Resultaterne af sådanne prøvninger er vist i tabel 1.

DK 163932 B

lllJJ I JJ . 0 0 -P 0

_p O P -P -P □ ·ί O Ό 05 ΙΛ O cPi Ό Is O

O 0 0 Di -H

1(1) C 10 > i·3 ro ro 05-0 o o^oo^rfno CM cno^ t

XJ CH Ό —I —1 r-4 ΓΟ —I r-I —I O^O i , i | JJ

/* 0) CD 4J C I Ό I 0

ω -I ^ £ p -P 0 C O' C -P

U_ θ'-feu 0 05-Ήσ1 _ 0 0 ’Ό-Ρ P > P Ό>·Η x t ouc o c id n-Hr-i 92 cn-D -H ro Q. co jO = -u jj J ^ o o °-o °°-°-o -°. .5 .5 £ £ £ p u c%l £Sa ° °°D -H π^Γοιΰ £ · “-p? °*ϋα· ·ρ o' en ø ή c ω

• jJ-HO JJ *5 C 0 P C

0) 1—1 0 Π3 CD -Hil o <13 05 u a ε ø c a ω o ex n ^~S S 03 Di 03 S^DC σ' -P o t-> u £ m vo -JO CO M3 CO CO LO CO uChO-UHO O CO 0- 0

3 O O O o O O O 1..HCTEH P Ό O C

ω id 5· —i —no r-ι —< 'd 'd 'd > c ø £ - a.< ø ø ø CHUN x X O X x X X * _i 5 r 5 V» 3 ti) •Søi\ CT- S §22 ^CECO^ Die -

33 o^x o o o o cm o o 0- 0-0~0- *»_ ® . jf ^εω aoN

u σ> 0 0"-J 3 Ό =0—1

0 CH I æ S 03 O' O

r “θ£ϋ—f > p co > fijoø ,.H oEøcøao > p øø <r tn co iii jjøø—i —ic øjicn . 2 Jj o o i o i I ø= ό —i σ> 0 -i-»ro ajr-io o o o i eø-r-icnøo ø p ^ ε ^ d ? O -O -1-1 I 111 = _ co Cl 3 øuw £ S a oao o-H c β ie β-p ® ® u “ 4j ø ø g o_ i => —i pø

, OXJØZ31*-ØP

l ^ ø c= Lt -pd* cox ø «I, ·η fl) -Η *H Q) 0) HH CO Ό > +J CO CH VO ^c= 0)’H η

O ^ ><V° 'o §3 ØØtiøØO D5C —IC

§ § .5..... Πβϋ2“· ?« øc,HS

ti ? ij 2 «3- LO -O CO -C J3 J3J3J3 C0-H--HØJJ J04J-ØP-

P -H 4J —I -l\ .. - · -..... _ _ r, O = -P 0 0 C

0 tiU-003 οοσο-ηο-ι -Η ·ο·Η.·Η u *" 4j c O- q copøp-ocoø

3 u. 0 c O ØtnEØ <-* 0 Q. 0 S P- —I -P

«, X 0 0 X C X O' —|C*- ØC

® _ 4JCø3øcnø"OPCø

.2 , Ξ Jj - 0 ·Η X +JEC30CU

d 1 H . fflPØ-OlsCC-PØO

C J3 0 0 o CO O CM ro CO ^ ^ ixijO øjj ø ØO ø CU--D P

« ‘ ^ - *\d* · _T " “ . . ... v +3 lp p -Η O X 0 0 -P O.

0 σωΞ -H O-Η O O O ,H ,H .H -H -H UØØØØXI QHJJ O' « . £ £ s n Kto^'HU.racjJøa' —I -Η O. O Q. EHJC-ICiO μΟ10·ΗΡ<-ΙΟ w ØQ.-HØØ-HØC—ICOQ.

, . v n o^u ajJ j'H a>oo »

y·? _ UØ-IPOSCJ'PJJ

S u Ti · £y = c ro ø * p p -h b ø 5 d _ r-, M3 end- ·0Ή -IOE£BQ.P1*--i-) 3 H S o o o o o o g o p°o .h .0 øx< m -o s >

Z. —< —< —i —I —I —· —j pj X-Tlci _li—I ·Η on: -l«LtP ø 0 *H

2 !s>; IkISsS”- "Λ* 33= S’i £“ «-S - I i 5 S

• IsS 3 3 ° ° °°- ^.-s^MSS-'t^jeSs ^ H u J eo)q= ø Ό o-x:pxøcpc

0 C <*- O'-Η 4JP000 ϋ Ό O

c CM cy co ro CO cy ro co cmcocm £ “ “ΐ S£ u c o c 2 o o «s· «r «· o «3· ^ O-^O i u øo—i ø—ijjøaøø u ro co a. o. c.ro cl O. ro C.co jj e p -i a4J oj 0 p JC p £ Σ Σ <u v V Σ & <U Σ ΟΣ ^oørHd-OØØPSreP^:^ ffi 00 aa Q-CD o- o. <3 rt 9) O U Ό JJ O c jJØ-HØ U 00 OPPOBØ-P-P·-1 m C C jj d) ø QiC- ® ® 0-JT3U_CØØ-H30^CØØ« 5v 0-H 4JJCO4JT35 _ ^ ___ 0^0 ØØP —IC—I-ICPCU-C 0 3 < < < < 0.5 0 0-0 0X10 ØB^ØØP·-1

^ S 'λ _j ρ·ΜΓΤ3ί-ι CP O«C0 H

222 u.do.g *hp^—10300 C 0 oz ø

Sr^p ωωω Ί§ c' *> -ø c β) x: o^cøcp u· _t i —I + 0'+ 0 ZøCØCP-^CLiJPØQ.· ø ^®°“ O P^.Pv.^ p EP-oor-H 3D«: øp

O.X o -p ——·—' 3- 0 ^ 0 d d) . m .p Q. U- . Ό P C 0 C B

-I UJ C Lp < < < . 4 c z: C 525 25 -Q p .«“ p +» I -H 0 0 O O —1 C 3> rTrøp ncetooQ u. <e t*. w lp u. oøøcpøJccnacoø-H—10 O ejenupu ^LP __ lx. ---_ _ 43 43 ρ p CO 03 0 P O -O -P 0 X 0 ’n-nenr? Lp p I ® 8 i ^”01«. 0^fflPØPQ.Q.ØPØØO 1-1 - 2 2 ϋΒ — Eps-zB « Eø-pø>-p ø en a p 0-< 0 c p ώ p a aa cllp i. - p - P p ppjj-høø c cjc pji 3 >- .p -o ep _| a. O'—a-cn CL m c.— mijoi-o^ø 0-p 0 0 ω odcdc (Oøo 0 > 04JC3 cinOLOd-.p ø ^ »r—v /—> «τ-> ca J3 u -O 0)

-X

r 2 e . V-.—*“· —

DK 163932B

26

Den første rumlige afgrænsning er inden i cellen. Denne fraktion måles ved fremstilling af en celleekstrakt, efter at cellevæggen er fjernet, og definerer interferonaktivitet, som ikke secerneres. De andre to 5 rumlige afgrænsninger er mediet (materiale fuldstændigt adskilt fra gærcellen) og den aktivitet, der frigøres fra cellerne efter cellevægfjernelse under anvendelse af zymolyase (secerneret materiale, men indfanget ikke-kovalent i cellevæggen). Både mediefrak-10 tionen og fraktionen frigjort efter fjernelse af cellevæg repræsenterer det totale secernerede materiale. Alternativt, hvis cellevæggene ikke blev fjernet (se "Metoder"), inkluderer "inden i celle" aktiviteten også den secernerede aktivitet fanget i cellevæggen.

15 Det bør bemærkes i tabel 1, at (præD/A)LeIFA er et modent LeIFA-gen med en hybrid signalpeptidsekvens (se fig. 1 og 8). Denne konstruktion er tidligere blevet omtalt; men det erindres, at den blev konstrueret ved anvendelse af Ddel-restriktionsstedet fælles for både 20 præLelFD og præLelFA. Fig. 1 viser dette Ddel-sted ved aminosyre -10. De understregede aminosyrer repræsenterer forskelle mellem aminosyresekvensen af præLelFD og præLelFA. Den hybride (præD/A)LeIFA ligner mere præD end præA.

25 Begge de modne LeIFA- og LeIFD-gener (konstruktionerne I og III) udtrykkes i gæren i niveauer på 1,0¾ af det totale celleprotein (niveauer på 2,0¾ er også set). De forkerte orienteringer af disse gener eller præ-generne udtrykkes ikke. For disse to gener såvel som det modne 30 IFN-a-gen sker der ingen sekretion. Hvis der imidlertid anvendes præsekvenser på disse gener, findes alle tre pr-o-teinprodukter i medierne som secernerede produkter.

Niveauer så høje som 8¾ af den totale aktivitet er blevet iagttaget i mediet for (præD/A)LeIFA ved en Aggg =

DK 163932B

27 3-4. Det bør bemærkes, at alle disse plasmider er i 95 % af cellerne af en kultur, der vokser under TRP+-selektivt tryk, hvilket bekræfter tilstedeværelsen af et autonomt replicerende plasmid.

5 Vækstkurve og produktion i mediet fra en gær inde-holdende (præD/A)LeIFA-qenet_

To interferonproducerende gærstammer blev undersøgt ved yderligere karakterisering. Disse var YEplPT-præ-LeIFA53t/pep4-3 og YEplPT-LeIFAl/pep4-3. Den først-10 nævnte indeholder to kopier af konstruktion IV (fig. 8) i EcoRI-stedet af ΥΈρΙΡΤ og resulterer i aktivitet inden i cellen, i cellevæggen og uden for cellen (medie). Dette to-kopi-gen- (i fortsættelse af hinanden -begge i orientering til rigtig udtrykkelse) holdige 15 plasmid blev anvendt i stedet for enkelt-kopi-konstruk-tionen, da det sommetider gav højere niveauer af interferonaktivitet i mediet. Pep 4-3 gær blev anvendt, da den har stærkt reducerede intracellulære og ekstra-cellulære proteaseniveauer (23), hvilket kan være en 20 fordel med henblik på opnåelse af unedbrudt protein (interferon) fra mediet.

Den sidstnævnte indeholder konstruktion III (fig. 8) i YEplPT og udtrykker modent LeIFA inden i cellen, men secernerer ikke.

25 Fig. 9 belyser en vækstkurve for disse to gærstammer i YNB+CAA (Trp+-selektiv vækst). Log-fasen fortsætter til en absorbans ved 660 nm på 3-4, og derpå begynder den stationære fase. Begge kurver er i hovedsagen identiske (hvilket tyder på, at produktionen af disse to forskel-30 lige-proteiner [LeIFA og (præD/A)LeIFAj ikke påvirker gær-vækst eller levedygtigheden). Bioprøvninger udførtes på mediet ved forskellige tider under cellevæksten for

DK 163932 B

28 at undersøge vækstkurvens afhængighed af disse to stammers produktion af interferon i mediet. Det er klart ud fra disse resultater, at præsekvensen på LeIFA frembringer en frigørelse af interferonaktivitet i 5 mediet. Uden denne sekvens frigøres i hovedsagen ingen aktivitet. Det er også klart, at aktivitetsniveauerne i mediet når et maksimum nær ved den stationære fase.

Rensning af (præD/A)Le!FA fra mediet 10 For at bestemme arten af sekretionsprocessen for (præD/A)-LelFA i gæringsmediet var det nødvendigt at rense proteinproduktet fra mediet. Hvis gæren er i stand til at secernere proteinet, forarbejder den sandsynligvis den aminoterminale ende på en eller anden måde under se-15 kretionsprocessen, som pattedyrceller normalt gør med et præ-interferon-protein. Formålet med yderligere forsøg var at bestemme arten af denne forarbejdning som følger : A) 5 liter gæring 20 Fig. 10a viser interferonaktiviteten inden i cellevæggen og i cellen under den samme gæring. Disse ekstrakter blev opnået ved pelletering efterfulgt af glaskuglebe-handling i 7M G’HCl, således at denne aktivitet omfatter både intracellulært og intracellevæg-materiale. Denne 25 aktivitet nåede et maksimum på omkring 25 x 10^ U/l ved en Aggg på 1,5 - 2,0, hvilket tyder på at den intracel-lulære interferonproduktion ender i log-fasen før den stationære fase til forskel fra ekstracellulært materiale. Således secerneres omkring 8?ό af aktiviteten frit 30 ti.l„.4nediet. Imidlertid kan der være lige så megen aktivitet i cellevæggen (se tabel 1). Ekstraktmaterialet indeholder mest intracellulært interferon, og dette mate-

DK 163932B

29 riale renses herefter for at se, om det er forarbejdet eller uforarbejdet.

Fig. 10b viser en vækstkurve for en 5 liter gæring af YEplPT-præLelFA 53t/pep4-3 i YNB+CAA. Ved gæringens 5 afslutning var der omkring 2,0 x 10^ U/l interferon-aktivitet ved MDBK-prøvninger. Igen ses den maksimale produktion ved stationær fase. Det bør bemærkes, at interferonproduktet i dette medium er meget stabilt, selv med 24 timers yderligere rystning ved 30 °C, efter 10 at den stationære fase er nået. Dette medium blev anvendt til yderligere rensningstrin.

B) Mediekoncentrat på immunoaffinitetssøjle

Mediet fra YEplPT-præLeIFA53t/pep4-3 blev først ultra-filtreret. Dette koncentrat blev sat på en søjle in-15 deholdende et monoklonalt antistof til modent LeIFA.

Efter vaskning med 0,2 M NaCl i "tris"/cys/EDTA, pH = 8,0 blev interferonet elueret med vand (pH = 5,5) som vist i fig. 11. Det eluerede maksimum A (pilen repræsenterer da der blev påført vand) blev opnået ved denne 20 procedure og repræsenterer 50 % af den aktivitet, som blev sat på søjlen. Maksimum A blev hældt sammen, som vist med klamme, og anvendt til yderligere rensning. Elu-ering med 0,2 M eddikesyre resulterede i maksimum B (pilen repræsenterer punktet for pufferændring), og po-25 sition C repræsenterer punktet for påføring af oprindelig vaskepuffer.

C) HPLC-forløb af maksimum A aktivitet

Maksimum A fraktioner blev lyophiliseret til tørhed og de-r-prå ført på HPLC (se "Metoder"). Fig. 12 belyser re-30 sulrtaterne af dette forløb. En 2,5 ^ug prøve af renset LeIFA (fra E. coli) blev kørt separat som kontrol.

DK 163932 B

30 Både standarden og (præD/A)LeIFA (eller præLelFA) havde identiske tilbageholdelsestider, som det ses i figuren. Disse resultater viser, at interferonet fra mediet er forarbejdet, da præLelFA har en me-5 get forskellig tilbageholdelsestid. Den skyggelagte fraktion fra dette HPLC-forløb blev derpå anvendt til proteinsekvensbestemmelse.

Nf-^-terminal-sekvens af (præD/A)LeIFA renset fra qærmedie_ 10 Fig. 13 viser delvis resultaterne af sekvensbestemmelse af det rensede interferon. Den øvre sekvens er den, der forventes for (præD/A)LeIFA, hvis der ikke sker nogen forarbejdning. Det normale spaltningspunkt for dette interferon, der sandsynligvis genkendes af pattedyr-15 celler, er vist.

Proteinsekvensen blev fortolket ved notering af, hvilken PTH-aminosyre, der blev forøget i hver tilsvarende Edman-cyklus og derpå formindsket i den følgende cyklus. PTH-aminosyre, der normalt giver lave genvindinger (cys, 20 ser, thr, arg, his), blev antaget, når der ikke sås forøgelse i nogen anden PTH-aminosyre. Mængden i mg blev bestemt ved sammenligning af arealerne af den fortolkede rest med arealet fra en standardblanding af PTH-aminosyrer kørt på den samme HPLC. En indre standard 25 af norleucin blev indført i hvert chromatogram for at sikre, at tilbageholdelsestiderne var reproducerbare.

Fig. 13 viser de opnåede proteinsekvensbestemmelsesre-sultater for det rensede (præD/A)LeIFA. Den sekvens, der måtte forventes, hvis der ikke skete nogen forarbejdning, 30 og d.et normale spaltningspunkt for dette præinterferon i p^ttedyrceller er også vist. To uafhængige sekvensbestemmelser blev gennemført på to forskellige rensede

DK 163932 B

31 prøver fra celler og medie. Fig. 13 viser, at det meste af interferonet i mediet blev forarbejdet rigtigt (64 S), men en anden form (36 %) indeholdende tre yderligere aminosyrer af præsekvensen var også til 5 stede. Det intracellulære interferon indholdt også disse to former,'men i lidt forskellige mængdeforhold såvel som en tredje form indeholdende 8 aminosyrer af præsekvensen. Den fulde længde af præsekvensen blev aldrig iagttaget, hvilket tyder på, at gær forarbejder al 10 præ-IFN på en eller anden måde.

Det er muligt, at den forarbejdede form indeholdende tre aminosyrer af præsekvensen var et resultat af præ-D/A-signalsekvensens hybride art. Derfor blev forarbejdningen af den ikke-hybride (præD)LelFD også un-15 dersøgt. PræD er kun forskellig fra præD/A ved amino-syrepositionen -2 (leu i stedet for val). Når forarbejdningen af præ-IFN-al renset fra mediet blev undersøgt, iagttoges igen både +1 og -3 formerne (fig. 13). Imidlertid var en mindre betydende art også til stede 20 i mediet som en -14 form, som ikke blev set for (præD/A)-LelFA.

For at undersøge sekretionen af heterologe proteiner fra S. cerevisiae har vi konstrueret plasmider til in vivo transcription af generne for flere modne interfe-25 roner (IFN'er) og flere præ-IFN'er. Når som helst kodningssekvenserne for hydrofobe signalpeptider var til stede, kunne antiviral IFN-aktivitet udvindes både fra værtscellerne og fra dyrkningsmediet, medens alt det IFN, hvis syntese var dirigeret af modne IFN-gener, for-30 blev inden i cellerne. Vi har forsøgt at karakterisere kravene til sekretion ved at foretage konstruktioner, hvari interferongenet ville være forsynet med dets egne naturlige signalsekvenser, som i (præD)LelFD, eller ville være forsynet med en hybrid signalsekvens udformet som en

DK 163932 B

32 sammensætning af to IFN-a-arter, som i (præD/A)LeIFA.

Selv om gærcellerne, som indeholdt disse konstruktioner, i almindelighed secernerede IFN til dyrkningsmediet, varierede mængden af aktivitet mellem stam-5 merne, og de rensede og sekvensbestemte IFN-arter varierede også.

Tre former af ikke-secerneret interferon, som udgjorde 90 % af det totale udtrykte interferon, blev renset s fra celler indeholdende (præD/A)LeIFA-genet. En form 10 (33 SS) blev rigtigt forarbejdet (+1, fig. 13), en an den form (55 So) indeholdt tre yderligere aminosyrer (-3, fig. 13), og en tredje form (11 %) indeholdt otte yderligere aminosyrer (-8). Den sidste form blev ikke set i mediet, medens IFN med en præsekvens i fuld læng-15 de aldrig blev iagttaget i cellerne eller mediet.

Forarbejdning af (præD)LelFD

I stedet for den rystekolbevækst, som blev anvendt for (præD/A)LeIFA-gær blev (præD)LelFD-udtrykkende gær dyrket i en 10 liters fermentor til en A^q = 60.

20 Når forarbejdningen af (præD)LelFD renset fra mediet (rensningen var den samme som for præD/ALelFA) blev undersøgt, iagttoges både +1 og -3 formerne (fig. 13).

En yderligere, mindre betydende art var også til stede i mediet som en -14 form. Der var ingen tegn på, at der 25 skete cellelyse i kulturen, når den blev undersøgt ved SDS-gel-elektroforese af medieprotein over for cellulære proteiner. Interessant nok blev der ved denne høje vækstdensitet iagttaget en meget høj procent sekretion (30 %) i mediet for LeIFD. Højdensitetsgæringer af (præD/A)LeIFA-30 udtr.y.kkende gær viser også denne højere procent sekretion.

DK 163932B

33 Gær viser sig at forarbejde både det secernerede og ikke-secernerede interferon. Den secernerede mængde aktivitet varierer afhængigt af cellernes vækststadium, således at der forekommer maksimale procenter 5 ved stationær fase i rystekolber og ved afslutningen af højdensitetsgæringer (30 % i mediet).

Bekræftelse af sammensætningen af plasmiderne i YEplPT-præLeIFA53t- og YEplPT-LelFAl-holdiq gær Gæren indeholdende disse to plasmider og anvendt til 10 de forudgående forsøg blev yderligere undersøgt ved genvinding af plasmiderne fra gæren. Dette blev gjort ved isolering af plasmid-DNA'en fra gærekstrakt ved transformation af E. coli efterfulgt af miniscreen-DNA-præparation og restriktionsanalyse af plasmid-DNA'erne.

15 Flere E. coli isolerede plasmid-DNA1 er blev karakteriseret for begge typer gær. I alle tilfælde indeholdte plasmiderne den forventede restriktionssekvens, hvilket bekræfter tilstedeværelsen af præsekvensen på det (præD/A)LeIFA-holdige plasmid og manglen af den på 20 det modent-LelFA-holdige plasmid.

Restriktionskort og delvis sekvensbestemmelse af 3,1 kb indsætning i pBl_ 300 ^ug pBl (37a) blev fuldstændigt nedbrudt med HindlH i et 500 ^,ul reaktionsvolumen og derpå elektroforeret 25 på en præparativ agarosegel (Sea Kern) indeholdende 1 % agarose. 3,1 kb Hindlll indsætningen blev udskåret fra den ethidiumfarvede gel, elektroelueret (39), ekstraheret to gange med lige store volumener puffermættet phenol og chloroform før ethanol fældning. Portioner af det 30 gens.uspenderede DNA-fragment blev opdelt og underkastet res-triktionsklipninger med en gruppe forskellige restriktionsenzymer for at give det i fig. 15 viste delvise restriktionskort.

DK 163932 B

34 30 ^ug af den rensede 3,1 kb indsætning blev klippet med Sau3A og derpå kørt på en 6 % acrylamidgel. Fragmenter svarende til de 265 bp og 141 bp blev separat renset ved elektroeluering som beskrevet ovenfor.

5 Hvert DNA-fragment blev derpå underkastet DNA-sekvens-analyse (39).

En portion af denne DNA-sekvens er vist i fig. 16. Aminosyrer svarende til de N-terminale aminosyrer i PGK-strukturgenet er trykt over DNA-sekvensen.

10 Indsætning af et restriktionssted i PGK-5'-promotor-området_

Et syntetisk oligonucleotid med sekvensen 5'ATTTGTTGTAAA3' blev syntetiseret ved standardmetoder (40). 100 ng af denne primer blev mærket ved 5'-enden under anvendelse 15 af 10 enheder T.-polynucleotidkinase i en 20 /ul reak- h 32 tion, der også indeholdt 200 ^uCi [tf- P] ATP. Denne mærkede primeropløsning blev anvendt i en primer-reparations-reaktion udformet til at være det første trin i en flertrins-proces til at indføre et EcoRI-20 restriktionssted i den 5'-flankerende PGK-DNA lige før PGK-strukturgen-sekvensen. Denne flertrins-proces er forklaret nedenfor:

Trin 1 (fig. 17)

Primer-reparations-reaktioner og kloning af et 39bp 25 XbaI-til-Sau3A-stykke.

100 yug pBl blev fuldstændigt nedbrudt med Haelll og derpå kørt på en 6 % polyacrylamidgel. Det øverste bånd på..den ethidiumfarvede gel (indeholdende PGK-promotor-område) blev isoleret ved elektroeluering som beskrevet 30 ovenfor. Dette 1200 bp HaellI-stykke DNA blev restrikti- 35 onsbehandlet med Hindll og derpå kørt på en 6 % acryl-amidgel. 650 bp båndet blev isoleret ved elektroelue-ring. Der blev isoleret 5 ^ug DNA. Dette 650 bp HaeIII.-til-HindII-stykke DNA blev gensuspenderet i 5 20 ^-ul deioniseret vand og derpå blandet med de 20 ^ul af den ovenfor beskrevne phosphorylerede primeropløsning. Denne blanding blev ekstraheret en gang med phenol/chloroform og derpå ethanolfældet. Den tørrede DNA blev gensuspenderet i 50 ^ul vand og derpå opvarmet 10 i et kogende vandbad i 7 minutter. Denne opløsning blev derpå hurtigt afkølet i et tøris/ethanol-bad (10-20 sekunder) og derpå overført til et is-vand-bad. Til denne opløsning sattes 50 ^ul af en opløsning indeholdende 10 ^,ul 10X DNA-polymerase I-puffer (Boehringer 15 Mannheim), 10 yul af en i forvejen fremstillet opløsning, som var 2,5 mM med hensyn til hvert deoxynucleosidtri-phosphat (dATP, dTTP, dGTP og dCTP), 25 ^ul deioniseret vand og 5 enheder DNA-polymerase I, Klenow-fragment.

Denne 100 ^ul reaktionsblanding blev inkuberet ved 37 °C 20 i 4 timer. Opløsningen blev derpå ekstraheret 1 gang med phenol/chloroform, ethanolfældet, tørret ved lyo-philisering og derpå restriktionsbehandlet helt ud med 10 enheder Sau3A. Denne opløsning blev derpå kørt på en 6 % acrylamidgel. Båndet svarende til 39 bp i stør-25 relse blev udskåret fra gelen og derpå isoleret ved elek-troeluering som beskrevet ovenfor. Dette 30 bp fragment har en stump ende og en Sau3A-kohæsiv ende. Dette fragment blev klonet ind i en modificeret pFIFtrp69-vektor (10). 10 ^ug pFIFtrp69 blev lineariseret med Xbal, 30 ekstraheret en gang med phenol/chloroform og derpå ethanolfældet. Den Xbal-kohæsive ende blev fyldt ud under anvendelse af DNA-polymerase I-Kleno\i/-fragment i en 50 ^ul reaktionsblanding, som var 250 ^uM med hensyn til hvert nucleosidtriphosphat. Denne DNA blev klippet med BamHI 35 og derpå kørt på en 6 ?ό acrylamidgel. Vektor fragmentet blev isoleret fra gelen ved elektroeluering og derpå gen-

DK 163932 B

36 suspenderet i 20 ^ul deioniseret vand. 20 ng af denne vektor blev ligeret med 20 ng af det ovenfor syntetiserede 39bp fragment i 4 timer ved stuetemperatur.

En femtedel af denne ligeringsblanding blev anvendt 5 til at transformere E. coli stamme 294 til ampicillin-resistens (på LB + 20 ^ug/ml amp-plader). Plasmider fra transformanterne blev undersøgt ved en h'urtig oversigtsprocedure (20). Et plasmid, pPGK-39 (fig. 17) blev udvalgt til sekvensanalyse. 20 ^ug af dette plas-10 mid blev nedbrudt med Xbal, ethanol fældet og derpå behandlet med 1000 enheder bakteriel alkalisk phosphatase ved 68 °C i 45 minutter. DNA'en blev ekstraheret tre gange med phenol-chloroform og derpå ethanolfældet.

De dephosphorylerede ender blev derpå mærket i en 20 /ul 3 7 15 reaktionsblanding indeholdende 200 ^uCi P] ATP og 10 enheder T^-polynucleotidkinase. Plasmidet blev klippet med Sall og kørt på en 6 ?i acrylamidgel.

Båndet med den mærkede indsætning blev isoleret fra gelen og sekvensbestemt ved den kemiske nedbrydningsmetode 20 (39). DNA-sekvensen ved 3'-enden af dette promotorstyk ke var som forventet.

Trin 2 (fig. 18)

Konstruktion af et 312 bp Pvul-til-EcoRI PGK-promotor-fragment.

25 25 ^ug pPGK-39 (fig. 17) blev samtidigt nedbrudt med Sall og Xbal (fem enheder hver) og derpå elektroforeret på en 6 /¾ gel. 390 bp båndet indeholdende 39 bp promotor-stykket blev isoleret ved elektroeluering. Den gensuspenderede DNA blev restriktionsbehandlet med Sau3A og 30 derpå elektroforeret på en 8 % acrylamidgel. 39 bp PGK-promotorbåndet blev isoleret ved elektroeluering. Denne DNA indeholdt 39 bp af 5'-enden af PGK-promotoren på et Sau3A-til-XbaI fragment.

37 25 yug pBl blev restriktionsbehandlet med Pvul og Kpnl og derpå elektroforeret på en 6 % gel. 0,8 kbp båndet af DNA blev isoleret ved elektroeluering og derpå restriktionsbehandlet med Sau3A og elektrofo-5 reret på en 6 S gel. 265 bp båndet fra PGK-promo-toren (fig. 15) blev isoleret ved elektroeluering.

Denne DNA blev derpå ligeret med det ovenfor fremstillede 39 bp promotorfragment i 2 timer ved stuetemperatur. Ligeringsblandingen blev restriktionsbehandlet 10 med Xbal og Pvul og derpå elektroforeret på en 6 X

acrylamidgel. 312 bp Xbal-til-PvuI restriktionsfragmentet blev isoleret ved elektroeluering og derpå sat til en ligeringsblanding indeholdende 200 ng pBR322 (33) [i forvejen isoleret uden 162 bp Pvul-til-PstI 15 restriktionsfragmentet] og 200 ng af Xbal-til-PstI LeIFA-cDNA-genet, som i forvejen var isoleret fra 20 yug pLelFtrpA. Denne 3-faktor-ligeringsblanding blev anvendt til at transformere E. coli stamme 294 til tetracyclinresistens. Transformantkolonier blev mini-20 screenet, og en af kolonierne, pPGK-300, blev isoleret som havende 304 bp PGK-5'-flankerende DNA sammensmeltet med LeIFA-genet i en pBR322-baseret vektor. 5'-enden af LeIFA-genet har den følgende sekvens: 51-CTAGAAATTC-3', således at tilknytning af Xbal-stedet fra PGK-promotor-25 fragmentet til denne sekvens muliggør tilføjelsen af et EcoRI-sted til Xbal-stedet. pPGK-300 indeholder således en del af PGK-promotoren isoleret i et Pvul-til-EcoRI fragment.

Trin 4 (fig. 19) 30 Konstruktion af et 1500 bp EcoRI-til-EcoRI PGK-promotor-fra^ment.

10 ^ug pBl blev nedbrudt med Pvul og EcoRI og kørt på en 6 % acrylamidgel. 1,3 kbp Pvul-til-EcoRI DNA-båndet fra

DK 163932B

38 den PGK-5'-flankerende DNA blev isoleret ved elektro-eluering. 10 ^,ug pPGK-300 blev nedbrudt med EcoRI og Pvul, og 312 bp promotorfragmentet blev isoleret ved elektroeluering efter elektroforering af nedbrydnings-5 blandingen på en 6 % gel. 5 yug pFRL4 blev klippet med EcoRI, ethanol fældet og derpå behandlet med bakteriel alkalisk phosphatase ved 68 °C i 45 minutter.

Efter tre gange behandling af DNA'en med phenol/chlo-roform, ethanolfældning og gensuspension i 20 ml de-10 ioniseret vand blev 200 ng af vektoren ligeret med 100 ng 312 bp EcoRI-til-PvuI DNA fra pPGK-300 og 100 ng EcoRI-til-PvuI DNA fra pBl. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli stamme 294 til am-picillinresistens. Fra en af de ampicillinresistente 15 kolonier blev opnået pPGK-1500. Dette plasmid indeholder 1500 bp PGK-promotorfragmentet som et EcoRI-til-EcoRI eller HindIII-til-EcoRI DNA-stykke.

Konstruktion af modent-HGH-(humant væksthormon) og præHGH-udtrykkelsespiasmider_ 20 Konstruktionerne A-E i fig. 14 blev konstrueret i vektorer med hensigtsmæssige restriktionssteder. I konstruktion A blev der fremstillet en syntetisk DNA til at duplikere DNA-sekvensen ved begyndelsen af præHGH-cDNA'en (42) fra Hpall-stedet med dannelse af et EcoRI-25 sted foran ATG-translationsstartcodonen. Hpall-til-

Pstl fragmentet blev opnået ud fra præHGH-cDNA'en (42), og dette fragment med den syntetiske DNA blev ligeret med en EcoRI-til-PstI vektor (pHGH 207-1 med EcoRI-til-

D

PstI fragmentet indeholdende en del af Ap -genet fjernet 30 og begge steder genligeret efter Klenou/-udfyldning for at fjerne begge restriktionssteder) indeholdende Pstl-til-SmaX fragmentet af HGH-cDNA'en (43) til opnåelse af kon-str-uktion A. Konstruktion B blev fremstillet ud fra et plasmid indeholdende det modne HGH-gen, som i forvejen

DK 163932 B

39 var blevet hængt på til direkte udtrykkelse indeholdende 23 aminosyrer af en syntetisk kodningssekvens ved den Nl^-terminale ende (44). Et plasmid indeholdende dette gen blev klippet med PvuII i HGH-genet og BamHI i 5 Tc -genet. Det store fragment indeholdende det meste af genet blev derpå ligeret med syntetisk DNA, som duplikerer enden af HGH-genet (TAG) og skaber et Hindlll-sted. Dette Hindlll-sted blev ligeret med HindIII-til-BamHI fragmentet af pBR322 som den tredje faktor af en 10 3-faktor-ligering til opnåelse af et plasmid indehol dende konstruktion B.

A og B blev derpå kombineret som vist i fig. 14 til dannelse af konstruktion C. C blev yderligere modificeret til dannelse af D, hvor Hindlll-stedet var omdannet 15 til et EcoRI- (eller EcoRI)-sted. Det således opnåede EcoRI-stykke blev anbragt i EcoRI-stedet af gærudtryk-kelsesplasmidet YEplPT til udtrykkelse af præHGH-genet i gær. Konstruktion E blev også fremstillet under anvendelse af den i D anvendte omdanner til opnåelse af 20 et modent interferon-gen (uden sekretionssignalsekvensen) på et EcoRI-fragment til udtrykkelse i YEplPT.

Udtrykkelse af modent HGH og præ-HGH i gær

Modent-HGH-konstruktionen (E) i YEplPT blev anbragt i stamme pep4-3 trpl (20B-12), og der blev fremstillet 25 ekstrakter under anvendelse af glaskugler som beskrevet under "Metoder". Imidlertid sattes glaskugler til 10 ml pelleterede celler med 0,5 ml 0,1 % SDS. Der blev foretaget fortyndinger i hesteserum og udførtes RIA-prøvnin-ger som tidligere beskrevet (44).

30 Ved'RIA blev HGH udtrykt som omkring 0,5 % af det totale gærprotein ved en A66Q på 1,0 (0,5 mg/l/A^g). Intet HGH blev sporet i mediet.

DK 163932 B

40

Præ-HGH-konstruktionen (D) i YEplPT blev også indført i gær, og celler og medium blev prøvet for HGH. Der blev sporet et lavere niveau af udtrykkelse i cellen (0,08 mg/l/Aggg) eller omkring 0,08 % af det totale 5 gærprotein. Således er niveauet omkring 1/6. af niveauet for modent-HGH-udtrykkelse, hvilket meget ligner leukocyt-interferon-resultaterne. Imidlertid behøver dette ikke at være en fair sammenligning, da codonforbruget til modent HGH (44) er forskelligt for 10 23 aminosyrer i forhold til præ-HGH. En sådan forskel kan resultere i forskelle i udtrykkelsesniveauet af disse to produkter (45). 10 % eller 8 ^,ug/l/(Aggg = 1) af det i cellen udtrykte niveau fandtes i mediet for den præ-HGH-udtrykkende gær. I en 10 liters fermentor 15 ved en A^g = 85 var der igen omkring 10 % sekretion med 1 mg/1 HGH i mediet.

Arten af prs-HGH-udtrykkelse

En sammenligning af HGH-protein i cellen i forhold til uden for cellen blev udført ved anvendelse af en Western-20 dupningsprocedure som beskrevet ovenfor. Resultaterne viser medium fra en højdensitetsgæring (A^g = 85) af præ-HGH-udtrykkende gær. Der findes et enkelt bånd svarende til modent HGH i størrelse. Dette bånd svarer til 1 - 2 % af gærmedieproteinet.

25 Når dette medie-HGH blev renset ved antistof-affinitets-chromatografi (Hybritech Ab) og HPLC som anvendt for interferonerne, viste NH2-terminalsekvensanalyse, at næsten 100 % af HGH'et var modent HGH (sekvensanalyse udførtes for 10 rester) som vist delvis i fig. 13. Såle-30 des forarbejdes al medie-HGH'et pålideligt, som det gøres af humane celler.

DK 163932 B

41

BIBLIOGRAFI

1. Novick, P., Field, C., and Schekman, Cell 21, 205-215 (1980).

2. Duntze, aj·» Science 168, 1472 (1970).

3. Woods, e_t jil_., J. Gen. Microbiol. 51, 115 (1968).

4. Cabib, et aj_., <3. Bacteriology 124, 1586 (1975).

5. Farkas, Microbiol. Rev 43, 117 (1979).

6. Moor, Arch. Mikrobiol. 57, 135 (1967).

7. Goeddel, et aj_., Nature 287, 411 (1980).

8. Goeddel, et a_l., Nature 290, 20 (1981).

9. Yelverton, et a_l_., Nucleic Acids Research 9, 731 (1981).

10. Goeddel, _et jH., Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980).

11. Wetzel, American Scientist 68, 664 (1980).

12. Wetzel, ej; aj.., Biochemistry 19, 6096 (1980).

13. Davis, £t jf[., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78, 5376 (1981).

14. Hitzeman, et jn., Nature 293, 717 (1981).

15. Kleid, et a]_., Science 214, 1125 (1981).

16. Lawn, et jU·» Nucleic Acids Res. 9, 6103 (1981).

17. Week, £t_ aK, Nucleic Acids Res. £, 6153 (1981).

18. Clarke, L. and Carbon, J. Cell 9, 91-99 (1976).

19. Clarke, L. and Carbon, J. PNAS 72, 4361-4365 (1975).

20. Birnboim, H.C., and Doly, J. Nucleic Acids Res. 7_, 1513-1523 (1979).

2Γ. Hinnen, A,, Hicks, J.B., and Fink, F.R. Proc. Natl. Acad. Sci . USA 75, 1929-1933 (1978).

DK 163932 B

42 22. Backman, K., Ptashne, M., and Gilbert, W., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 73, 4174-4178 (1976).

23. Jones, E. Genetics 85, 23 (1976).

24·. Faye, G., Leung, D.W., Tachell, K., Hall, B.D., and

Smith, m. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2258-2262 (1981).

25. Miller, J.H., Experiments in Molecular Genetics, pp. 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

26. Stewart, W.E. II The Inteferon System (Springer,· New York, 1979).

27. P. Edman, G. Begg, "A Protein Sequencer" Eur. J.

Biochem., 1, 80-91 (1967).

28. Tarr, G.E., Beecher, J.F. Bell, M. and McKean, D.J. Anal. Biochem. 84, 622-627, (1978).

29. Wittmann-Liebold, B., Graffunder, H., and Kohls, H. Anal. Biochem. 75, 621-633 (1976).

30. Gray, P.W., jet a3·, Nature 295, 503-508 (1982).

31. Emr, S.D., et aK, Nature 285, 82-85 (1980).

32. Novick, P. and Schekman. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1858-1862 (1979).

33. Bolivar, F., Rodriguez, R.L, Green, P.Y., Betlach, M.C., Heyneker, H.L., Boyer, H.W., Crosa, Y.H., and Falkow, S. Gene 2, 95-113 (1977).

34. Stinchcomb, D.T., Struhl, K., and Davis, R.W. Nature 282, 39-43 (1979).

35". Kingsman, A.J., Clarke, L. , Mortimer, R., and Carbon, J.

43

Gene 7, 141-153 (1979).

36. Tschumper, G., and Carbon, J. Gene 10, (1980).

37. Hartley, O.L. and Donelson, J.E. Nature 286, 860-865 (1980).

37a. Hitzeman, R.A., Clarke, L. , and Carbon, J. Biol.

Chem. 255, 12073 (1980).

37b. Broach et a_k , Gene 8, 121 (1979).

38. Messing, et aj_., Nucleic Acids Research 9, 309 (1981).

39. Maxam, A.M., and Gilbert, W. Methods in Enzymol. 65, 490-565 (1980).

40. Crea, R. and Horn, T. Nucleic Acids Res. 8, 2331-2348.

41. Oakley, B.R. £t aJU, Anal. Biochem. 105, 361 (1980).

42. Goodman, H.M., et^ a]_. in Specific Eukaryotic Genes (Eds. Engberg, J., Klenow, H., and Leick, V.) 179-190 (Munskagaard, Copenhagen, 1979).

43. DeBoer, H., _et . in Promoters; Structure and Function (eds. Prayer) pp. 468-481 (1982).

44. Goeddel, D.V. et al., Nature 281, 544 (1979).

45. Bennetzen, J.L., and Hall, B.D., J. Biol. Chem. 257, 3026 (1982).

46. Ames, G.F.-L., J. Biol. Chem. 249, 634 (1974).

47. Towbin, H. et aj_., Proc. Natl. Acad. Sci. 76, 4350 (1979).

Claims (13)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et pattedyrprotein, 5 som er heterologt for en gærorganisme, som produkt af gær-udtrykkelse, -forarbejdning og -sekretion, kendetegnet ved, at der foretages dyrkning af levedygtige gærceller transformeret med et udtrykkelsesmedium, som funktionelt indeholder DNA, der koder for det nævnte 10 pattedyrprotein sammen med et heterologt signalpolypeptid, hvilket heterologe signalpolypeptid er heterologt for gæren og ikke normalt produceres eller anvendes af den nævnte gærorganisme, hvilken dyrkning resulterer i sekretion af det nævnte pattedyrprotein til dyrkningsmediet, og det 15 nævnte pattedyrprotein udvindes fra dyrkningsmediet.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det heterologe signalpolypeptid er nativt for det heterologe pattedyrprotein. 20

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det nævnte protein er et humant interferon .

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at proteinet er et humant leukocytinterferon.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at proteinet er humant leukocytinterferon A eller D. 30

6. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-5, kendetegnet ved, at det udvundne secernerede protein er e.t glycoprotein.

7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-6, kende tegnet ved, at det heterologe signalpolypeptid er den DK 163932 B N-terminale portion af ét signalpolypeptid og den C-ter-minale portion af et andet signalpolypeptid, hvor det ene af disse signalpolypeptider er nativt for det nævnte protein. 5 8. Gærorganisme-cellekultur, kendetegnet ved, at den omfatter (1) levedygtige gærceller transformeret med et udtrykkelsesmedium, som funktionelt indeholder DNA, der koder for et pattedyrprotein, som er heterologt for de nævnte gærceller, sammen med et heterologt signalpoiy-20 peptid, hvilket heterologe signalpolypeptid ikke normalt produ ceres eller anvendes af den nævnte gærorganisme, og (2) et medium til understøttelse af cellekulturen, hvilket medium indeholder det nævnte pattedyrprotein som et produkt af gærorganismens udtrykkelse, forarbejdning og se-kretion.

9. Cellekultur ifølge krav 8, kendetegnet ved, at det heterologe signalpolypeptid er den N-terminale portion af ét signalpolypeptid og den C-terminale portion 20 af et andet signalpolypeptid, hvor det ene af disse sig nalpolypeptider er nativt for det nævnte protein.

10. Cellekultur ifølge krav 8 eller 9, kendetegnet ved, at gærorganismen er Saccharomyces cerevisiae. 25

11. Cellekultur ifølge ethvert af kravene 8-10, kendetegnet ved, at proteinet er et glycoprotein fremstillet ifølge ethvert af kravene 1-7. QQ

12. Dyrkningsmedium af en gærorganisme-cellekultur ifølge ethvert af kravene 8-11, kendetegnet ved, at det er i det væsentlige frit for levedygtige eller brudte gærceller og indeholder et glycoprotein fremstillet ifølge ethvert af kravene 1-6. 35 » DK 163932

13. Gærudtrykkelsesmedium, kendetegnet ved, at det funktionelt indeholder DNA, som koder for et protein, der er heterologt for en gærorganisme, og et heterologt signalpolypeptid i translationsaflæsningsramme med den DNA, der koder for det nævnte heterologe protein, hvil- 5 ket heterologe signalpolypeptid er den N-terminale portion af ét signalpolypeptid og den C-terminale portion af et andet signalpolypeptid, hvor det ene af disse sig-nalpolypeptider er nativt for det nævnte protein. ^ 14. Gærudtrykkelsesmedium ifølge krav 13, kendeteg net ved, at det er i stand til i en gærvært at secernere et glycoprotein.

13. Gærudtrykkelsesmedium, kendetegnet ved, 15 at det funktionelt indeholder DNA, som koder for humant leukocyt-D/A-signalpolypeptid i translationsaflæsningsramme med humant leukocyt-A-protein. 20 25 30 35