PL153724B1

PL153724B1 - Expression processing and secretion of heterologous protein by yeast

Info

Publication number: PL153724B1
Application number: PL1983240927A
Authority: PL
Inventors: Ronald A Hitzeman; David W Leung
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1982-03-08
Filing date: 1983-03-08
Publication date: 1991-05-31
Also published as: CZ282905B6; GB8306285D0; PL240927A1; FR2523152B1; EP0088632B1; DE3382694T2; JPH06181779A; GB2116567A; PH24804A; DK111283D0; IE55743B1; FI830774L; YU55683A; PT76360A; IE830498L; BG46159A3; IL68058A0; FI830774A7; JPH0829111B2; BR8301150A

Description

RZECZPOSPOLITA OPIS PATENTOWY 153 724

POLSKA

Patent dodatkowy do patentu nr-—

Int. CI.' C12N15/20

Zgłoszono: 83 03 08 (P. 240927)

Pierwszeństwo: 82 03 08 Stany Zjednoczone Ameryki .i

URZĄD

PATENTOWY

RP

Zgłoszenie ogłoszono: 83 11 07

Opis patentowy opublikowano: 1992 04 30

Twórcy wynalazku: Ronald A. Hitzeman, David Wai-Hung Leung

Uprawniony z patentu: Genentech Inc.,

South San Francisco (Stany Zjednoczone Ameryki)

Sposób wytwarzania białka heterologicznego, takiego jak ludzki interferon leukocytowy A lub D lub ludzki hormon wzrostu

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania ludzkiego interferonu leukocytowego A lub D lub ludzkiego hormonu wzrostu na drodze genetycznych zmian komórek drożdży.

Organizmy drożdży w naturalny sposób transportują pewne białka homologiczne do, a czasem przez, błonę plazmatyczną, w ramach udziału w zwiększaniu się powierzchni komórki i w jej metabolizmie. Gdy komórka pęcznieje w przypadku reprodukcyjnego przygotowywania się do tworzenia komórki potomnej, to do tworzenia ściany komórkowej, błony plazmatycznej, jak i w metabolizmie, potrzebne są dodatkowe białka. Niektóre z tych białek muszą znaleźć swoją drogą do miejsca działania, czyli uważa się, że istnieje szlak sekrecyjny. Pewna białka homologiczne zaangażowane w powyższych procesach tworzone są przez translację w retikulum endoplazmatycznym. Homologiczne są białka normalnie wytwarzane przez dane gatunki drożdży i niezbędne dla ich żywotności. Raz utworzone, migrują wykorzystując przeniesienie enzymatyczne do aparatu Golgie'ego i stąd w pęcherzykach do błon plazmatycznych, z którymi łączą się lub w pewnym stopniu penetrują do przestrzeni między błoną plazmatyczną a ścianą komórkową. Wygląda na to, że mała ilość białek homologicznych jest eksportowana przez ścianę komórkową, jak czynnik a i toksyna zabijająca.

Poza tym wydaje się, że region pączkowania komórki jest miejscem przyciągającym dla pęcherzyków i przez swoją fuzję z wewnętrzną powierzchnię pączka uczestniczą one w ogólnym wzroście błony komórkowej i przypuszczalnie ściany komórkowej. Teoria ta nie daje dowodu, że sekrecja lub migracja białka (białek) przez błonę rzeczywiście zachodzi. Podobnie, ciągle kontrowersyjne jest to, czy glikozylacja białek może towarzyszyć lub może wiązać się z tak zwanymi procesami sekrecyjnymi. Dalej, z definicji, uważa się, że białka „ulegające sekrecji mają prepeptyd sygnałowy, jak się sądzi związany z procesami transportu i inkorporacji na powierzchni błony. Działania tych modyfikacji dojrzałego białka, jeśli istnieją, w procesach sekrecyjnych i ogólna rola szlaku sekrecyjnego w przyroście powierzchni są spekulacjami nie opartymi na mocnych dowodach.

153 724

Przewidywano, że rekombinantowa technologia DNA może zapewnić cenną pomoc przy udzielaniu odpowiedzi na otwarte pytania dotyczące procesów sekrecyjnych w organizmach drożdży, biorąc pod uwagę jej udowodnioną użyteczność przy nadawaniu tym i innym organizmom zdolności do tworzenia znacznej ilości endogennie heterologicznego produktu polipeptydowego, przez osiągnięcie odpowiedniego manipulowania drożdżami-gospodarzem w celu wywołania sekrecji heterologicznego białka w oddzielnej, dojrzałej postaci.

Znane jest wytwarzanie białka heterologicznego przez drożdże, ale jak dotąd nie opisano możliwości sekrecji takiego białka z drożdży. Dotychczas wytworzone obce białko należało zawsze odzyskiwać z cytoplazmy komórkowej. Odzyskiwanie białka jest procesem trudnym i kosztownym, ponieważ drożdże wraz z białkiem wewnątrzkomórkowym zawierają o wiele więcej zanieczyszczrganizmach drożdży ekspresję, przetwarzanie i sekrecję białka, które jet heterologiczne w stosunku białko wytwarzane wewnątrz błony komórkowej do organizmu drożdży i nie jest niezbędne kową, aminokońcową resztę metionylową. Jeżeli takie białka pojawiały się w pożywce, to tylko jako wynik lizy, której poddano tę pożywkę. W każdym przypadku nie były one w dojrzałej postaci, czyli takiej, której nie towarzyszyłaby niepożądana presekwencja .albo inny artefakt ekspresji.

Stwierdzono, że drożdże mogą przetwarzać białko prekursorowe, zawierające białko sygnałowe, w innych warunkach nieobecne w drożdżach, czyi „heterologiczne białko sygnałowe, dzięki czemu obce białko wytworzone przez drożdże ulega sekrecji do środowiska hodowlanego. Jednocześnie to ulegające sekrecji białko ma normalne zakończenie aminokwasowe bez dodatkowej reszty metionylowej, czyli jet to białko w natywnej postaci, nie związane z niepożądanymi polipeptydami.

Bardziej szczegółowo stwierdzono, że można wywołać w organizmach drożdży ekspresję przetwarzanie i sekrecję białka, które jest heterologiczne w stosunku do organizmu drożdży i nie jest niezbędne dla ich żywotności, przy czym białko to można otrzymać z podłoża podtrzymującego żywe, produkujące komórki drożdży, w postaci oddzielnego produktu, bez towarzyszącej mu, niepożądanej presekwencji polipeptydowej lub innego artefaktu ekspresji. Odpowiednie komórki drożdży w żywej hodowli transformuje się nośnikami ekspresyjnymi zawierającymi DNA kodujący białko heterologiczne i heterologiczny polipeptyd sygnałowy. Po ekspresji białka wraz z heterologicznym peptydem sygnałowym, produkt ekspresji zostaje przetworzony, a dojrzałe białko heterologiczne przeniesione do podłoża hodowli komórek. Produkt wyodrębnia się z podłoża względnie łatwo, bez koniecznoci naruszenia żywych komórek drożdży przez ich rozbijanie, a z drugiej strony odzyskuje się go w natywnej postaci do użycia, bez konieczności usuwania niepożądanej presekwencji lub innych artefaktów ekspresji (np. metioniny przyłączonej do N-końcowego aminokwasu, który w nieobecności metioniny byłby pierwszym, przy czym obecność metioniny jest konsekwencją ekspresji kodonu AUG, translacyjnego sygnału startu). Tak więc, podłoże można otrzymać w postaci zasadniczo wolnej od żywych lub rozbitych (to jest poddanych lizie lub rozbitych w inny sposób) komórek i, jeśli zawiera ono żądany produkt, podłoże to podatne jest na metody oczyszczania łatwiejszego do zastosowania, aniżeli w przypadku, gdy zawiera rozbite komórki. Produkt ten, po oczyszczeniu, przeznacza się do użycia, jak to było przewidziane. Np. produkt w postaci ludzkiego interferonu leukocytowego znajduje zastosowanie jako czynnik przeciwwirusowy i/lub przeciwnowotworowy dla ludzi.

Sposób wytwarzania ludzkiego interferonu leukocytowego A lub D lub ludzkiego hormonu wzrostu, których N-końcowe sekwencje aminokwasowe w postaci dojrzałej są przedstawione na rysunku fig. 13, polega na tym, że do wektora ekspresji typu YEpIPT dokonuje się funkcjonalnej insercji DNA kodującego wytwarzane białko heterologiczne, jak również heterologiczny polipeptyd sygnałowy, taki jak preA, preD, preD/A, prey, pre/J lub preHGH, których sekwencje aminokwasowe są przedstawione na rysunkach fig. 1 i fig. 13, otrzymanym wektorem transformuje się hodowlę komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae, nadając im zdolność uwalniania do pożywki, bez niszczenia komórek ludzkiego interferonu leukocytowego A lub D albo ludzkiego hormonu wzrostu i odzyskuje się białko w jego natywnej postaci, a usuwa się polipeptydy i inne produkty sekrecji.

Przez termin „białko heterologiczne, użyty w niniejszym opisie, rozumie się białko, które nie jest normalnie wytwarzane, lub niezbędne dla żywotności organizmu drożdży. Termin ten przewiduje funkcjonalną insercję DNA kodującego wspomniane białko via rekombinantowa technologia

153 724

DNA, do nośnika ekspresyjnego, użytego z kolei do transformacji organizmu drożdżygospodarza. Funkcjonalna insercja DNA oznacza insercję DNA kodującego białko heterologiczne i presekwencję do wektora ekspresyjnego pod kontrolą układu promotora kierującego ekspresją. Określenia „heterologiczna presekwencja lub „heterologiczny polipeptyd sygnałowy odnoszą się do wspomnianych polipeptydów, które normalnie nie są wytwarzane lub zaangażowane w Saccharomyces cerevisiae i mogą stanowić polipeptyd sygnałowy natywny w stosunku do rozważanego białka heterologicznego, albo inny polipeptyd heterologiczny (sygnałowy) połączony funkcjonalnie z białkiem heterologicznym. Korzystnie polipeptydem sygnałowym jet hybryda natywnego białka i drugiego . polipeptydu heterologicznego. Wśród białek .korzystne jest białko sygnałowe ludzkiego leukocytu A, a zwłaszcza 'hybryda polipeptydu AD leukocytów ludzkich o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na rysunku fig. 1.

Termin „sekrecjy oznacza w niniejszym opisie wydzielenie produktu przez błonę plazmatyczną co najmniej do lub przez ścianę komórkową organizmu drożdży do podłoża podtrzymującego hodowlę komórek. W związku z tym należy rozumieć, że w pewnych przypadkach, „ulegający sekreęji produkt łączy się w pewien sposób ze ścianą komórkową, przypuszczalnie wymagając innej metody oczyszczania lubmodyfikacji budowy i funkcji drożdży-gospodarza. Termin „przetwarzani* oznacza komórkowe odszczepienie polipeptydu sygnałowego od dojrzałego białka tak, że następuje wytwarzanie białka bez towarzyszącego, ubocznego peptydu, czyli w tak zwanej oddzielnej, dojrzałej postaci. Do peptydów ubocznych należą peptydowe artefakty ekspresji, takie, jak metienina. Przetwarzanie dopuszcza mało znaczące odszczepienie polipeptydu sygnałowego w miejscu nie inaktywująco bliskim dokładnie umiejscowionego punktu połączenia polipeptydu sygnałowego z dojrzałym białkiem.

Figura 1 przedstawia sekwencję aminokwasów sygnałowego prepeptydu ludzkiego IFNσΐ/pro D/, INF-a2/pro A/, INF-ćol,2/pro D/A/, INF-y/pro y/oraz INF-j/pro β/. Aminokwasy podkreślone przedstawiają różnice między sekwencjami aminokwasów pro A i pro D. Miejsce Ddel wskazuje połączenie presekwencji D i A przy przygotowywaniu hybrydowej presekwencji D/A, fig. 2 stanowi diagram drożdżowego plazmidu ekspresyjnego YEpIPT stosowanego jako ogólny nośnik używany w celu ekspresji różnych insertów genowych, przedstawiając niektóre miejsca restrykcyjne i różne regiony będące punktami zainteresowania, fig. 3 przedstawia konstrukcję fragmentu EcoBI zawierającego gen pro-plus INF-al w celu bezpośredniej ekspresji INF-al w drożdżach, fig. 4 -konstrukcję fragmentu EcoRI zawierającego dojrzały gen INF-a2 do kierowania ekspresją w drożdżach, fig. 5 - konstrukcję fragmentu EcoRI zawierającego gen pro-plus lNF-a2 z sekwencją kodującą pierwsze 14 aminokwasów w presekwencji pro-lNF-al do bezpośredniej ekspresji INF-a2 w drożdżach, fig. 6 - konstrukcję fragmentu EcoRI zawierającego gen pro-plus INF-y z sekwencją liderową o 70 parach zasad (bp) poprzedzającą kodon inicjacji ATO do ekspresji INF-y w drożdżach, fig. 7 - konstrukcję fragmentu EcoRI zawierającego gen pro-plus INF-y do bezpośredniej ekspresji INF-y w drożdżach, fig. 8 - przedstawia podsumowanie wszystkich konstrukcji użytych w praktycznym zastosowaniu sposobu według wynalazku w ekspresji różnych genów IFN, przetwarzaniu i sekrecji w drożdżach, fig. 9 stanowi krzywą wzrostu a/YEplPT-DilFAl/ pepa-3 i b/YEplPT-proLeIFA53/pop4-3 wyznaczoną przez pomiary AeeonmPodłoża badano dla a/ i b/ pod względem aktywności interferonu za pomocą biotestu. Ozan odnosi się do godzin wzrostu w temperaturze 30°C, fig. 10 A - krzywą wzrostu YeplPTproLeIFA53t/ pop4-3 przy fermentacji prowadzonej w objętości 5 litrów. /O/ oznacza Aeeonm i /O/ milion jednostek aktywności interferonu wewnątrz komóreklitr, fig. 10 B stanowi taką samą krzywą wzrostu jak zdefiniowana w fig. 10 A z wykreśleniem aktywności podłoża, fig. 11 przedstawia profil elucji proD/A LeiF z kolumny z przeciwciałem monoklonalnym, fig. 12 - analizę śladową HPLC piku A puli interferonowej z kolumny z przeciwciałem monoklonalnym, fig. 13 -wyniki analizy sekwencji aminokwasów produktu otrzymanego po oczyszczeniu za pomocą NPLO, fig. 14 - różne konstrukcje zastosowane w celu wytwarzania ludzkiego hormonu wzrostu (HGH) sposobem według wynalazku, fig. A przedstawia schematycznie mapę restrykcyjną insertu Hindlll o 3,1 kilopar zasad (kbp) nośnika pBl, z którego został wyodrębniony promotor PGK. Wskazana jest insercja miejsca EcoBI i miejsca Xbal w 5’-skrajnym DNA genu PGK, fig. B przedstawia 5’-skrajną sekwencję plus początkową sekwencję kodującą genu PGK przed insercją miejsc Xbal i EcoRI, fig. C schematycznie przedstawia metody użyte do włączenia miejscca Xbal w pozycji 8 promotora PGK i do wyodrębnienia fragmentu o 39 bp 5’-skrajnej sekwencji PGK

153 724 zawierającego koniec Xbal i koniec Sau3A, fig. D schematycznie przedstawia konstrukcję fragmentu o 300 bp, zawierającego powyższy fragment o 39 bp, dodatkową 5’-skrajną sekwencję PGK (265 bp) od Pyul do Sau3A (patrz fig. A) i miejsce EcoBI sąsiadujące z Xbal, a fig. E schematycznie przedstawia konstrukcję fragmentu promotora PGK (Hindlll/EcoRI), który zawiera w uzupełnieniu fragmentu skonstruowanego jak na fig. 4, fragment NindIII-Pvul o 1300 bp z 5’-skrajnej sekwencji PGK (patrz fig. A).

Przykład I. Wytwarzanie IFN.

Materiały. Wszystkie enzymy restrykcyjne DNA i metaboliczne otrzymano z New England Biolaba oraz z Zethesda Research Laboratories. Enzymów restrykcyjnych DNA i metabolicznych używa się w warunkach i w buforach opisanch przez odpowiednich wytwórców. ATP i trifisforany dezoksynukleotydów, dATP, dCTP, dOTP i dTTP otrzymano z PL Biochemicals. Łączniki DNA wytwarza się znanymi metodami.

Preparatyka DNA i transformacja. Oczyszczanie kowalencyjnie zamkniętych kolistych DNA z E.coli i transformacji E.coli dokonuje się zgodnie z uprzednio opisanymi metodami. Minisita E.coli jak opisano. Transforamcję drożdży przeprowadza się jak uprzednio opisano, tym niemniej z następującymi modyfikacjami. Używa się 200 ml komórek (2 X 107 komórek/ml) i przemywa 25ml H2O przez wirowanie. Komórki te traktuje się 10ml IM sorbitu, 25mM EDTA (pH 8) i 50 mM dwutiotreitolem w ciągu 10 minut w temperaturze 30°C, a następnie przemywa 10 ml 1 M sorbitu. Osadzone komórki łagodnie zawiesza się w 10 ml SCE(1 M sorbit, 0,1 Mcytrynian sodowy o pH 5,8 i 0,01 M EDTA), po czym zadaje w temperaturze 30°C o 200//g zymolazy 60000 (Kirin Brewery). Tworzenie się sferoplastów następuje do 80% po dodaniu 100pi zawiesiny do 0,9 ml 10% SDS z pomiarem Aeoo nm, używając rozcieńczenie komórek przed dodaniem enzymu za 0% (liza w 10% SDS powoduje obniżenie Aeoo). Następnie komórki przemywa się 3 razy 10 ml IM sorbitu. Można je przechowywać w sorbicie w ciągu kilku dni w temperaturze 0°C. Następnie komórki przemywa się 1 raz 1 M sorbitem, 10 mM CaCk i 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) i zawiesza ponownie w 1 ml tego samego roztworu. Następnie dodaje się 5 do 15 //g plazmidowego oczyszczonego DNA lub 20μ litrów otrzymanego z E.coli minisitowego DNA (2/5 plazmidowego DNA z fazy stacjonarnej hodowli (5 ml) E.coli w LB) do 100 μ\ ponownie zawieszonych komórek i łagodnie miesza w ciągu 15 minut.

Następnie dodaje się, przy łagodnym mieszaniu, w ciągu 15 minut 1 ml roztworu składającego się z glikolu polietylenowego (Baker) do stężenia 20% (wag/obj), CaCl₂ do stężenia 10 mM i Tris-HCl do stężenia 10 mM (pH 7,5). Komórki odwirowuje się i ostrożnie ponownie zawiesza do 200μ1 SOS (1 M sorbit, 33,5% (obj/obj) bulionu YEPD oraz 6,5 mM CaCkk). Inkubację prowadzi się w ciągu 20 minut w temperaturze 30°C. B^O^^litrów otrzymanej zawiesiny umieszcza się następnie na płytce Petri’ego zaierającej 20 ml agaru dolnego (182 g sorbitu, 20 g glukozy, 6,7 g YNB i 30 g agaru Difco/litr H₂O) pokrytego 10 ml agaru górnego (o temperaturze 50°C), takiego samego jak agar dolny, ale z dodatkiem 1 ml adeniny (l,2mg/ml), 1 ml uracylu (2,4mg/ml) i 1 ml mieszaniny beztryptofanowej na 50 ml agaru dolnego. Mieszanina beztryptofanowa zawiera na 100ml wody następujące aminokwasy: 0,2 g Arg, 0,1 gHis, 0,6 gile, 0,6gLeu, 0,4gLys, 0,1 gMet, 0,6gPhe, 0,5gThr). Ta selekcja Trp+ daje w wyniku 10³ - 10⁴ transformantów drożdży ^g plazmidowego DNA.

Plazmidy drożdży otrzymuje się z drożdży za pomocą przeprowadzenia hodowli drożdży o objętości 15 ml do fazy stacjonarnej (Αββϋ = 5-6) w YNB + CAA (patrz p. Szczepy i podłoża, poniżej), utworzenia sferoplastów sposobem wyżej opisanym, osadzenie komórek i wykorzystania metody minisit dotyczącej E.coli (bez lizozymu) jak opisano.

Stabilność plazmidów w drożdżach określa się przez rozrzedzenie zawiesiny komórek podczas selektywnego wzrostu w YNB + CAA i wysianie na nieselektywne płytki YEPD. Po 2 dniach wzrostu w temperaturze 30°C z płytek tych robi się repliki na płytkach YNB + CAA (selekcja Trp+). Procentową wartość odnoszącą się do stabilności plazmidów oblicza się jako ilość kolonii rosnących nieselekty wnie z odjęciem tych kolonii, które nie rosną selektywnie i z podzieleniem przez ilość kolonii rosnących nieselektywnie X 100.

Szczepy i podłoża. Do wszystkich innych transformacji bakteryjnych używa się E.coli K-12 szczep 294 (ATCC 31446). Do transformacji drożdży używa się pep4-3 (20B-12, d trpl pep4-3) i

GM3C-2 (a, leu 2-3, leu 2-112, trp 1-1, his 4-519, cyc 1-1, cyp 3-1). Szczepy drożdży 20B-12 i

153 724

GM3C-2 są zdeponowane i dostępne bez ograniczeń w American Type Culture Cellection pod nr nr odpowiednio, ATCC 20626 i ATCC 20625, oba od 5 marca 1982 r. Stosować można rozmaite szczepy drożdży, patrz Lodder i wsp., The Yeasts, a Taxonomic Study, North-Holland Publ. Co., Amsterdam. Podobnie, można użyć różnych podłoży, patrz Difco Manuał of Dehydrated Culture Media and Reagents for Microbiological and Clinical Laboratory Procedures, wyd. 9, Difco Laboratories, Inc., Detroit, Michigan (1953).

LB stosuje się jak to opisał Miller z dodatkiem 20/zg/ml ampicyliny (Sigma), po czym podłoża wyjaławia się w autoklawie i oziębia. Hodowlę drożdży prowadzi się w następujących podłożach: YEPD zawierające 1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu i 2% glukozy ±3% agaru Difco. YNB + CAA zawiera 6,7 g podstawowego azotu drożdżowego (bez aminokwasów) ' (YNB) (Difco), 10 mg adeniny, 10 mg uracylu, 5 g Difco casamino acids (CAA), 20 g glukozy i ±30 g agaru/litr i używane jest do selekcji Trp*.

Krzywa wzrostu i preparatyka ekstraktu. Prowadzi się hodowlę indywidualnych kolonii drożdży szczepu YEpIPT-preLeIF-A 53 t/pep4-3 i szczepu YEpIPT-A l/^p^e^p>4-3 w ciągu 7 godzin w temperaturze 30°C w 100 ml YNB + CAA do Aeeo około 1,1. 100 ml tych hodowli rozcieńcza się do objętości 1 litra YNB + CAA z otrzymaniem roztworu o Aeeo 0,1. Wzrost w tych 1 litrowych hodowlach prowadzi się następnie w temperaturze 30°C i co pewien czas pobiera się 10milimetrowe próbki do pomiaru gęstości optycznej, wytwarzania interferonu i sekrecji. Do badań każdą 10 ml próbkę wiruje się przy 7Kobr/min w ciągu 15 minut w wirówce Sorval RC3B. Supernatanty (podłoża) bada się bwz rozcieńczania. Komórki zawiesza się ponownie w 0,4 ml 7 M roztworu guanidyna-HCl zawierającego taką samą objętość kulek szklanych, po czym wiruje 2 razy przez 2 minuty przy dużej szybkości. Następnie lizat komórkowy rozcieńcza się PBS/BSA (150 mM NaCl, 20 mM fosforan sodowy o pH 7,9 i 0,5% bydlęca albumina surowicza) do biotestu.

Badanie interferonu. Ekstrakt drożdży bada się pod względem zawartości interferonu przez porównanie ze standardami interferonu w badaniu zahamowania efektu cytopatycznego. Ekstrakty drożdżowe przygotowuje się w następujący sposób: prowadzi się hodowlę w 10 ml YNB + CAA do osiągnięcia Αβ60~ 1-2. Komórki zbiera się przez odwirowanie i zawiesza ponownie w 3 ml 1,2 M sc^i^ł^iti^, 10 mM KH2PO4 o pH 6,,8 i 1% zymolazy €6)000, a następnie inkubuje w ciąąu 30 minut w temperaturze 30°C. Powstaje do 90% sferoplastów, które osadza się przy 3000 X g w ciągu 10 minut, następnie zawiesza w 150 //litrach 7M chlorowodorku guanidyny (GHC1) + 1 mM fenylometylosulf^fluorek (PMSF). Ekstrakty rozcieńcza się 20-100 X buforem PBS/BSA (20 mM NaHzPO4 o pH 7,4, 150mM NaCl, 0,5% BSA) bezpośrednio przed badaniem. Alternatywnie, 10 ml komórek przy tej smaej wartości Aeeo osadza się i ponownie zawiesza w 0,4 ml 7 M CHC1 w

1,5 mi Eppendoora zawierającee okoto 0,4 ml kulek szklanych (0,45 do 0,5 mm, B. Braun,

Melsurgen AG). Probówki te poddaje się wirowaniu 2 razy przez 2 minuty przy najwyższej szybkości wirowania, trzymając na lodzie w międzyczasie. Następnie ekstrakty odwirowuje się w ciągu 0,5 min. w wirówce Eppendorfa i rozcieńcza buforem PBS/BSA jak wyżej. Bioęetęc przeprowadza się z komórkami MDBK dla LelF A, LelF D, i ich pro-postaci, a z komórkami HeLa dla IFN-y i prelFN-y.

Oczyszczanie (pre D/A) LelF A z podłoży. Prowadzi się hodowlę pojedyńczej kolonii drożdży szczepu YEpIPT-preLeIF-A 53t/pep4-3 w 500 ml YNB + CAA w temperaturze 30°C do Aeeo 2,4. 500 ml tej hodowli rozcieńcza się do 5 litrów YNB + CAA do Aeeo 0,21, po czym prowadzi się hodowlę w otrzymanej objętości 5 litrów w temperaturze 30°C do Aeeo 4. W tym czasie zbiera się komórki z 5 litrów hodowli za pomocą wirowania przy 7000 obr/min w ciągu 20 minut. W trakcie fermentacji pobiera się periodycznie 10 ml próbki dla pomiaru gęstości opęccznnj, wytwarzania interferonu i sekregi. Przed badaniem każdą próbkę wiruje się w wirówce laboratoryjnej z chłodzeniem w ciągu 5 minut, w celu oddzielenia komórek od podłoża. Podłoże i komórki bada się w sposób jak wyżej opisano (patrz fig. 9, 10A i DB).

Podłoża zagęszcza się do końcowego stężenia 200 ml i poddaje diafiltracji wobec Tn^^cys /EDTA o pH 8,0 z użyciem membrany uetrafilęracyjnnj 1000 daltonów (O-PS, Odmics) w aparacie ctnnkokαnαłowcm Amicon (TCF 10). 200 ml pozostałości przepuszcza się przez 1,5 ml

153 724 kolumnę immunopowinowactwa zaiwerającą przeciwciało monoklonalne przeciw LelF A związane kowalencyjnie z Affigel 10 (BioRad) przy szybkości przepływu 15ml/godz Ponad 80% aktywności interferonu z roztworu oryginalnego ulega związaniu z kolumną. Przepływ przez kolumnę powtarza się przy szybkości przepływu 40 ml/godzinę. Po drugim naniesieniu stwierdza się w płynie przepływającym około 7% oryginalnej aktywności interferonu. Następnie kolumnę przemywa się 0,2 M NaCl w Tris/cys/EDTA o pH 8,0. Podczas tego przemywania eluuje się około 1,7% aktywności.

Większość aktywności interferonu (około 50% oryginalnej aktywności) eluuje się z kolumny za pomocą 51,5 ml wody dejonizowanej o pH 5,5. Kolumnę przemywa się w końcu 22,5 ml 0,2 M kwasu octowego w celu usunięcia jakiegokolwiek pozostałego białka, przy czym eluuje się około 8% oryginalnej aktywności. Po eluacji kwasem octowym kolumnę ponownie równoważy się Tris/cys/EDTA o pH 8,0. Podczas przemywania wodą, kwasem i Tris/cys/EDTA zbiera się frakcje 2,25 - 4,5 ml. Frakcje o numerach 1 - 7 łączy się i liofilizuje do sucha. Pozostałość rozpuszcza się ponownie w 200 //litrach 0,1% kwasu trójfluorooctowego (TFA) o pH 2,5 i dalej oczyszcza za pomocą HPLC na kolumnie Synchropak RP-P. Kolumnę eluuje się przy szybkości przepływu 1 ml/min przy liniowym gradiencie 0-100% acetonitrylu wO,l%TFAopH2,5.1 ml frakcje zbiera się i bada po rozcieńczeniu PBS/BSA jak wyżej opisano. Jako kontrolę poddaje się także chromatografii 2,5//g próbkę oczyszczonego IFN A (fig. 12). Aktywność interferonu, eluowana z kolumny jako pojedyńczy pik, skupia się wokół frakcji 39. Frakcję tę liofilizuje się do sucha i pozostałość poddaje analizie sekwencji.

Analiza sekwencji. Analiza sekwencji opiera się na degradacji Edmana. Następnie próbkę przenosi się do części wprowadzającej aparatu Beckman 890B spinning cup seąuencer. W części wprowadzającej używa się jako nośnika Polybrene™ (polidwuoctan N, N, Ν’, N’-czterometylo-Ntrójmetylenosześciometylenodwuamoniowy). Aparat do oznaczania sekwencji modyfikuje się przy użyciu wymrażarki i pewnej zmiany programu w celu zmniejszenia tła pików. Stopień czystości stosowanych odczynników: Beckan’s seąuence grade (0,1 M bufor Quadrol, fenyloizotiocyjanian i kwas siedmiofluoromasłowy).

Modyfikacja obejmuje także automatyczną konwersję pochodnych 2-anilino-5-tiazolinowych w miarę ich ekstrahowania z aparatu do analizy sekwencji. 1-chlorobutan zbiera się w Pierce Reacti-Vial™ i suszy w atmosferze azotu. Następnie do pochodnych 2-anilino-5-tiazolinonu dodaje się 25% roztwór wodny kwasu trójfluorooctowego (TFA) i ogrzewa do temperatury 20°C przez 10 minut w celu konwersji do pochodnych 3-fenylo-2-tiohydantoiny (pochodne PTM). PTH-reszta aminokwasowa zostaje następnie automatycznie rozpuszczona w 50% acetonitrylu i wodzie i wstrzykuje się ją do cieczowego chromatografu ciśnieniowego z odwróconymi fazami. Każdy PTH-aminokwas zostaje następnie zidentyfikowany przez porównanie z czasem retencji standardowej mieszaniny aminokwasów wprowadzonej do fiolki do konwersji i potraktowanej w taki sam sposób jak materiał obiegowy z aparatu do analizy sekwencji. Wyniki podsumowuje fig. 3. Są one przedyskutowane poniżej.

Hydrydyzacja metodą Westerna. Białka najpierw poddaje się elektroforezie w żelu poliakryloamidowym zawierającym siarczam sodowo-dodecylowy na płytkach przed elektroforetycznym naniesieniem na bibułę nitrocelulozową (S + S BA 85) i następującą po tym immunologiczną identyfikacją HGH. Aparat do przenoszenia (Electroblot, E. C. Apparatus Corp., St. Petersburg, FI.) znajduje się po części żelowej. Bibułę nitrocelulozową przemywa się krótko buforem do przenoszenia zawierającym Tris do stężenia 25 mM i glicynę do stężenia 192 mM, o pH 8,4. Przenoszenia dokonuje się przy 400 mA w ciągu 1 1/2 godziny, po czym skrawek umieszcza się w 50 mM Tris o pH 7,4, 0,15 M NaCl, 5mM EDTA, 0,25% (wag/obj) żelatynie, 0,05% NP - 40 i miesza łagodnie przez noc. Odpowiednio rozcieńczony roztwór króliczego przeciwciała przeciw ludzkim HGH umieszcza się w plastykowym woreczku ze skrawkiem i buforem NP - 40/żelatyna (typowo 100//lltrów/cm²) i inkubuje w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej z łagodnym kołysaniem. Skrawek przemywa się krótko H2O, a następnie NP - 40/żelatyną w ciągu lgodziny i poddaje reakcji z próbką sondującą z [¹²⁵J] - białkiem A (New England Nuclear) rozcieńczonym buforem NP - 40/żelatyna, w woreczku „Seal-a-Meal w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej z łagodnym kołysaniem. Po kilkakrotnym przemyciu wodą skrawek zawija się w celofan i eksponuje na błonę X-Omat-AR (Kodak) z intensyfikującym ekranem w temperaturze -70°C.

Barwienie żelu. Żele poliakryloamidowe zawierające białko barwi się metodą Oakley’a i wsp.

153 724 • . --- .... __________- _ “z <>. * , . ··

Sekrecyjne sekwencje sygnałowe genów interferonów ssaków. Z niedawnym wyodrębnieniem cDNA zawierających geny interferonów: leukocytowego, fibroblastowego i odpornościowego oraz ostatnio obserwowanym rozwojem stosowania drożdży jako układu ekspresyjnego dla genów heterologicznych stało się możliwe badanie ekspresji w drożdżach genów heterologicznych zawierających regiony kodujące sekwencje peptydu sygnałowego.

Figura 1 przedstawia sekwencje - sygnałowe . pięciu różnych interferonów. Uważa się, że tego rodzaju sekwencje amino-końcowe ułatwiają sekrecję białek interferonowych z komórek ssaków. Podczas przetwarzania sekwencja sygnałowa zostaje usunięta przez swoiste odszczepienie protezą, między pozycją -la. +1, dodając produkt znany jako dojrzała postać interferonu. Sekwencje - te wykazują ogólną charakterystykę 'dotyczącą innych sekwencji sygnałowych. Wszystkie one są hydrofobowe, mniej więcej tej samej długości co inne i mają na lewo od miejsca odszczepienia' aminokwas o niewielkiej cząsteczce. Aczkolwiek jednak i preLelF A i preLelF D i preIFN-y wszystkie one rozszczepiane są między glicyną a cysteiną, nie stanowi to ogólnego prawa dla innych sekwencji sygnałowych, jak to stwierdzono w przypadku preIFNj$.

I rzeczywiście, nie ma zgodności sekwencji sygnałowych w organizmach lub w tym samym organizmie. Nie ma też zgodności sekwencji w punkcie rozszczepienia między sekwencją sygnałową a dojrzałą ' postacią produktu białkowego. Tak więc, wysoce interesujące są wysiłki zmierzające do zrealizowania ekspresji tych preinterferonów w drożdżach w celu ustalenia, czy ' dojdzie do sekrecji przez drożdże tych białek heterologicznych i jaki może być sposób przetwarzania tych białek. Aczkolwiek drożdże są organizmami eukariotycznymi, podobnie do komórek ssaków, i chociaż okazuje się, że drożdże mają szlak sekrecyjny podobny pod wielu względami do występującego w wyższych organizmach eukariotycznych, są one bardzo prymitywhymi organizmami eukariotycznymi i prawidłowa funkcja i przetwarzanie tych produktów gendwych wymagałoby wysokiego stopnia konserwatywności procesu podczas ewolucji od drożdży do komórek ssaków, co nie jest wynikiem całkowicie oczywistym. ,

Konstrukcja plazmidu drożdżowego w celu ekspresji genów’ preinterferonów. Informacje dotyczące konstrukcji plazmidu w celu ekspresji genu heterologicznego w drożdżach została opublikowana. ,

Plazmid użyty do tej pracy przedstwia fig. 2. Plazmid ten zawiera część pBR322 z genem oporności na ampicylinę (Ap^R) i początkiem replikacji z E.coli w cel^ selekcji i stabilnego wzrostu w E.coli (użytym jako pośrednik między konstrukcją in vitro a transformacją drożdży). Plazmid zawiera także gen TRP1 we fragmencie EcoRI-Pstl pochodzący z III chromosomu drożdży. Gen ten pozwala na selekcję drożdży pod względem trp l i można go przez to użyć do selekcji komórek drożdży zawierających ten plazmid oraz do utrzymywania plazmidu. Poza tym, plazmid zawiera ^dro^żdżow^{y p}ocz^ąte^k re^plikajⁱ we fragmenrie o ^{2,0 kbp} z en^do^genn^e^ ^dro^żdżowego 2μ ^plazmⁱdu DNA. Początek ten zezwala DNA na automiczną replikację w drożdżach i utrzymywanie się w charakterze plazmidu. !

Innym z głównych składników jest układ promotora kinazy 3-fosfoglicerynianowej (PGK), który zaczyna transkrypcję blisko jedynego miejsca EcoRI w plazmidzie, gdyż inne miejsce EcoRI usuwa się uprzednio przez uzupełnienie tego miejsca restrykcyjnego za pomocą polimerazy DNA I (fragment Klenowa), a następnie łączenie wolnych końców.

Wyodrębnienie genu kinazy 3-fosfoglicerynianowej (PGK) przedyskutowano gdzie indziej, jak również jako konstrukcję fragmentu promotora o 1,6 kbp (poniżej). Fragment Hindlll/Bglll z regionu drożdżowego genu TRP1 z chromosomu III używa się jako konwertora Hindlll do BgUI, w celu połączenia z miejscem BamHI pBR322, nadając plazmidowi wrażliwość na tetracyklinę (Tc^s). Dalej, należy zauważyć, że fragment o 2,0 kbp z 2μ DNA zapewnia inną funkcję, gdyż zawiera on sygnał zakończenia transkrypcji) poliadenylacji, który zwykle jest sygnałem zakończenia „zdolnego genu w 2μ plazmidzie. Region ten okazuje się zasadniczym dla dobrej ekspresji. Inserty genów jako fragmenty EcoRI w prawidłowej orientacji mogą ulegać ekspresji jako białka, gdy nośnik wprowadzi się do drożdży.

Konstrukcja plazmidów drożdżowych do ekspresji genów różnych interferonów. Drożdżowy ekspresyjny plazmid YEpIPT zaiwera pojedyńcze miejsce restrykcyjne EcoRI. Insercja obcego genu do tego unikalnego miejsca prowadzi do ekspresji tego genu pod kontrolą promotora drożdżowej kinazy fosfoglicerynianowej. Dogodnym sposobem włączenia genów różnych interferonów do miejsca EcoRI w tym plazmidzie drożdżowym jest posiadanie fragmentów DNA z

153 724 miejscami EcoRI skrajnymi w stosunku do kodonu inicjacji i kodonu zakończenia genów różnych interferonów. Opisaliśmy tutaj konstrukcję tych fragmentów EcoRI do ekspresji genów interferonów. Ważne jest użycie konwertorów do EcoRI na 3’-końcu genu tak, aby nie zatrzymywał on transkrypcji, ale pozwalał na transkrypcję do 2μ terminatora.

Uprzednio opisaliśmy konstrukcję miejsca EcoRI bezpośrednio poprzedzającego kodon inicjacji ATP dla genu dojrzałego IFN-al genu dojrzałego IFN-a2, genu dojrzałego IFN-J i genu dojrzałego IFN-y.

Analiza restrykcyjna DNA wskazuje na to, że miejsce EcoRI jest dogodnie umiejscowione w 3’-niekodującym regionie klonu cDNA IFN-al, tak więc trwanie plazmidu pLeIFD3 za pomocą EcoRI tworzy fragment EcoRI o 583bp, zawierający nie naruszony gen IFN-al.

Figura 3 przedstawia konstrukcję fragmentu EcoRI zawierającego gen pre-IFN-al. Miejsce Haelll jest zlokalizowane między pierwszym a drugim aminokwasem pre-IFN-al. Wyodrębnia się fragment o 254 bp częściowo strawiony Haelll, który rozciąga się od wspomnianego miejsca Haelll do miejsca Bglll w środku regionu kodującego. Łączy się samokomplementarny syntetyczny oligonukleotyd 5’-CCATGAATTCATGG-3’ przez wiązanie wolnych końców z fragmentem Haelll-Bgllll o 254 bp w celu wytworzenia miejsca EcoRI poprzedzającego kodon inicjacji ATG. Następnie wyodrębnia się fragment EcoRI-Bglll o 264 bp przez trawienie mieszaniny pochodzącej z łączenia za pomocą EcoRI i Bglll. Ten fragment EcoRI-Bglll zawierający przednią część genu pre-IFN-al, łączy się następnie z dalszą połową genu pre-IFN-αl, fragmentem Bglll-EcoRIbp, wyodrębnionym z klonu cDNA IFN-al po strawieniu Bglll i EcoRI. Fragment EcoRI zawierający nie naruszony gen pre-IFN-al tworzy się następnie przez trawienie mieszaniny pochodzącej z łączenia za pomocą EcoRI i wyodrębnienie fragmentu o 636 bp.

Figura 4 przedstawia konstrukcję fragmentu EcoRI zawierającego gen dojrzałego IFN-a2. Fragment EcoRI-Pstl o 876 bp, zawierający gen dojrzałego IFN-a2, miejsce EcoRI bezpośrednio poprzedzające kodon inicjacji ATG i 3’-nie kodujący region o 400 bp otrzymany z klonu cDNA wyodrębnia się przez trawienie plazmidu pLeIFA25 za pomocą EcoRI i Pstl. Następnie przeprowadza się konwersję końca Pstl wspomnianego fragmentu o 876 bp w miejsce EcoRI za pomocą użycia fragmentu łącznikowego. Ten fragment łącznikowy o 978 bp zawiera wewnętrzne miejsce EcoRI i ma miejsce Pstl na obydwu końcach. 230 bp tego fragmentu rozciągających się od jednego końca Pstl do miejsca EcoRI pochodzi z drożdżowego plazmidu 2μ DNA. 748 bp reszty fragmentu rozciągających się od miejsca EcoRI do innego końca Pstl pochodzi z bakteryjnego plazmidu pBR322 [nie naruszony fragment został otrzymany z YEpl3]. Połączenie wspomnianego fragmentu łącznikowego z fragmentem EcoRI Pstl o 876 bp zawierającym dojrzały gen IFN-y2 z następującym po tym trawieniem EcoRI tworzy fragment o 1096 bp zawierający gen IFN-a2 z miejscami EcoRI na obydwu końcach.

Figura 5 przedstawia konstrukcję fragmentu EcoRI zawierającego gen pre-IFN-a2. Analiza restrykcyjna ujawnia wspólne miejsce Ddel obecne między aminokwasem 14 a 15 w presekwencji obydwóch genów pre-IFN-al i a2. Łącznie fragmentu EcoRI-Ddel o 44bp pochodzącego z fragmentu EcoRI kodującego gen pre-IFN-al i fragmentu Ddel-Pstl o 900 bp pochodzącego z klonu cDNA IFN-a2 z następnym po tym trawieniem EcoRI i Pstl tworzy fragment o 944 bp. Ten fragment EcoRI-Pstl o 944 bp zawiera sekwencję kodującą pierwsze 14 aminokwasów w prepeptydzie pochodzącym z IFN-al, sekwencję kodującą resztę prepeptydu i nie naruszone dojrzałe białko pochodzące z IFN-a2. Koniec Pstl tego fragmentu o 044 bp poddaje się następnie konwersji do miejsca EcoRI z użyciem framgnetu łącznikowego, jak w przypadku konstrukcji fragmentu EcoRI dla dojrzałego IFN-a2.

Figura 6 przedstawia konstrukcję fragmentu EcoRI zawierającego gen pre-IFN-y z sekwencją liderową o 70 bp poprzedzającą kodon inicjacji ATG. Trawienie klonu cDNA IFN-y (30) tworzy fragment Sau3A o 60 bp 5’-skrajnej sekwencji, nie naruszoną sekwencję kodującą pre-IFN-y i 3’-nie dokującą sekwencję o 290 bp. Ten fragment Sau3A klonuje się następnie do nośnika pUC7, strawionego BamHI, plazmidowej kopii jednoniciowego faga M13mp⁷. Plazmid pUC7 otrzymuje się z pBR322 za pomocą, po pierwsze, usunięcia fragmentu EcoRI-PvuII o 2067 bp zawierającego gen oporności na tetracyklinę, a następnie wprowadzenia fragmentu Haell o 425 bp z mP7 pochodnej faga M13 do miejsca Haell powstającego plazmidu w pozycji 2352 (odpowiadającej notacji pBR322). Fragment Haell z mp7 zawiera N-końcowy region kodujący z genu E.coli lacZ, w którym w sekwencji miejsce klonujące dla wielu enzymów restrykcyjnych zostało wprowadzone

153 724 między 4 a 5 resztą aminokwasową B-galaktozydazy. Insercja fragmentu obcego DNA do tych miejsc klonujących przerywa ciągłość między promotorem lac a genem lacZ, przez co zmienia fenotyp JM83 transformowanego plazmidem z lac* do lac. Ponieważ istnieją 2 miejsca EcoRI skrajne w stosunku do miejsc BamHI w miejscu klonującym dla wielu enzymów restrykcyjnym w pUC7, trawienie . plazmidu zawierającego insert Sau3A o 842 bp za pomocą EcoRI dawałoby fragment o 862 bp zawierający nie naruszoną sekwencję pre-IFN-y między miejscami EcoRI.

Trawienie, plazmidu pIFN-ytrp48.za pomocą EcoRI i BgUI tworzy fragment o 689 bp z końcem - EcoRI poprzedzającym kodon inicjacji ATG, nie naruszoną sekwencję kodującą dojrzały IFN-y i 210 bp niekodującej sekwencji. Ten . koniec Bgll poddaje się następnie konwersji do końca EcoRI z łączeniem z fragmentem łącznikowym Bglll-EcoRI o 29 bp pochodzącym z fragmentu EcoRI odnoszącego się do pre-IFN-y uprzednio opisanego. Następujące później trawienie EcoRI tworzyłoby fragment - EcoRI o 718 bp zawierający dojrzały gen IFN-y.

Figura 7 przedstawia konstrukcję fragmentu EcoRI zawierającego gen pre-IFN-σ z końcem EcoRI i sekwencją AAA poprzedzającą kodon inicjacji ATG. Fragment EcoRI zawierający uprzednio opisany gen pre-IFN-y trawi się EcoRI i MboII w celu .wytworzenia fragmentu o 184 bp. Fragment ten, zawierający przednią część genu pre-IFN-y denaturuje się cieplnie i łączy z poddanym działaniu 5’-kinazy syntetycznym . oligonukleotydem 5’-pATGAAATATACA kodującym pierwsze cztery aminokwasy genu pre-IFN-y. Z dolną nicią fragmentu EcoRI-MboII jako matrycą i z oligonukleotydem jako primerem i za pomocą polimerazy - DNA E.coli (fragment Klenowa) syntetyzuje się górną nić i usuwa wystający koniec 3’ z dolnej nici. Powstały fragment o 178 bp z wolnymi końcami, rozciągający się od kodonu inicjacji ATG „w dół“ do pierwszego miejsca MboII łączy się następnie z samokomplementarnym łącznikiem EcoRI 5’-TTTGAATTCAAA-3’. Trawienie mieszaniny pochodzącej z łączenia za pomocą EcoRI i Ddel tworzy fragment EcoRI-Ddel o 165 bp, zawierający przednią część genu prelFN-y. Następnie zapewnia się utworzenie nie naruszonego genu przez przyłączenie fragmentu Ddel-EcoRI o 600 bp, zawierającego dalszą część genu IFN-y z 3’-niekodującym regionem. Mieszaninę z łączenia trawi się następnie EcoRI w celu wytworzenia fragmentu EcoRI o 765 bp zawierającego nie naruszony gen prelFN-y.

Podsumowanie tych wszystkich konstrukcji (Ι-ΙΧ) przedstawiono na fig. 8. Wszystkie te konstrukcje umieszcza się w nośniku YEpIPT (fig. 2) przeznaczonym do eksperymentów dotyczących ekspresji i sekrecji w drożdżach. Poziom ekspresji i sekrecji interferonów przez drożdże zawierające wspomniane plazmidy.

Po włączeniu do YEpIPT (fig. 2) fragmentów genowych EcoRI z Eg. 8 sprawdza się orientację i włącza do drożdży z użyciem komplementacji Trp*. Drożdże zawierające te plazmidy bada się pod względem interferonu używając do badania ekstraktów z uwolnionego materiału ściany komórkowej i podłóż testu zahamowania efektu cytopatycznego (CPE) jako biotestu. Badania intereferonu przeprowadza się dla umiejscowienia w trzech różnych przedziałach w hodowli drożdży. Wyniki tych badań przedstawia tabela.

Tabela

Poziom ekspresji interferonu
Konstnik-			Uwolnienie
cja	Wewnątrz	Procent	po usunięciu	Procent	Zewnątrz	Procent	Końcówka	Procent
genu Fragment EcoRI Drożdże	komórki	białka	ściany	białka	komórki	białka	wartość	aktywnej
nr zawarte w plazmidzie	jedn/titr/	komórko- komórkowej	komórko-	/podłoża/	komórko-	Amod	sekrecji
YEpITP	Amo=1	wego	jedn/litr/	wego	jedn/litr/	wego
			Aeeo		Amo
1 2 3	4	5	6	7	8	9	^!θ	11

I	LelFD	GM3C-2	130X10*	to	0	0	0	0	io	0
II	pre LelF D	GM3C-2	27X10*	03	0,4X10*	0,004	0,8X10*	0,008	1.4	4
III	LelF A	pep4-3	l30Xltf*	to	0	0	0	0	io	0
IV	/pre D/A/ LelF A	pep4-3	19X10*	03	03xl<*	0,005	0,5X10*	0,005	1.0	6
IV	/pre D/A/LelF A	pep4-3	25X10*	03	N.D.	—	2X10*	0,007	3-4	8
IV	/pre D/A/ LelF A	GM3C-2	28X10*	03	0310	0,003	0,5X10*	0,005	13	3
V	IFN-y	pep4-3	0,6X10*	N.D.	N.D.	—	0	0	1.0	0
VI	pre IFN-y + 5* -skrajna sekwencja cDNA	pep4-3	0,2X10*	N.D.	N.D.		0,03X10*	N.D.	13	15

153 724

ι	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
VI	prc IFN-y + 5' -skrajna sekwencja cDNA	GM3C-2	0,38X10®	N.D.	N.D.		0,06X10®	N.D.	0,93	. 16
VII	prc IFN-y	^pep4-3	0,9X10®	N.D.	N.D.	—	0,19X10®	N.D.	1,0	17
VII	pre IFN-y	GM3C-2	1,9X11®	N.D.	N.D.	—	0,19 X 10®	N.D.	0,93	to

W powyższej tabeli użyto następujących oznaczeń:

a) Patrz metody preparatyki ekstraktu. Należy zauważyć, że używa się, w odniesieniu do ekstraktów, dwu metod. Jeżeli komórki przekształcają się w sferoplasty, ilość „wewnątrz komórki odnosi się do materiału rzeczywiście wewnętrznego. Gdy podaje się N.D. (nie oznaczono), ilość „wewnątrz komórki oraz „uwolnienie po usunięciu ściany komórkowej, obydwie stanowią część ilości „wewnątrz komórki - ten typ ekstraktu otrzymuje się z komórek rozbijanych kulkami szklanymi bez usunięcia ściany komórkowej. Należy zauważyć, że ekstrakt rozbijany kulkami szklanymi bez wytwarzania sferoplastów otrzymuje się zawsze dla IFN-y i preIFN-y i że używa się buforu PBS zamiast 7M GHC1.

^b) ^Wyszczególnione aktywności ^wł^aści^wc LdFA o^bydwie uważa si^ę (^do o^blicze^ń) za l<°jedn/mg Hałka. ^Ho^dow^la droż^dży zawfcra o^o 1° m^g Haka w hodowli przy AmoI ·

c) Patrz metody wytwarzania sferoplastów.

d) Wartość A hodowli, którą badano.

e) Procent sekwencji jest to procent „uwolnienia po usunięciu ściany komórkowej plus procent „zewnątrz komórki. Kiedy nie wytwarza się sferoplastów, nie włącza się aktywności sekrecji dotyczącej ściany komórkowej i procent jest niższy (może być 1/2) aniżeli powinien wynosić w rzeczywistości.

Pierwszym przedziałem jet wnętrze komórki. - Pomiar tej frakcji przeprowadza się przez wytworzenie ekstraktu komórkowego po usunięciu -ściany komórkowej i oznaczenie aktywności interferonu nie ulegającego sekrecji. Innymi dwomaprzedziałami są podłoża (materiał całkowicie oddzielny w stosunku do komórek drożdży) i aktywność uwolniona przez komórkę po usunięciu ściany komórkowej zymolazą (materiał wydzielony, ale wychwycony niekowalencyjnie przez ścianę komórkową). Obie frakcje, podłoża i frakcja¹ wydzielona o usunięciu ściany komórkowej, reprezentują całość materiału ulegającego sekrecji! Alternatywnie, gdy ściana komórkowa nie zostanie usunięta (patrz: metody), aktywność wewnątrz komórek obejmuje także aktywność ulegającą sekrecji, wychwyconą przez ścianę komorkową.

Na^le^ży zauwa^żyć w tateh, ^że ^gen /preD/A/ŁHF A jest ^genem dojrzałego LelF A z ^hybrydową peptydową sekwencją sygnałową (patrz fig. 1 r 8). Konstrukcja ta została uprzednio przedyskutowana, ale przegląd dotyczył skonstruowanej $ użyciem miejsca restrykcyjnego Ddel wspólnego dla obydwu: preLelF D i preLelF A. Figura Jprzzdstawia miejsce Ddel przy aminokwasie -10. Podkreślone aminokwasy reprezentują różnicć między sekwencją aminokwasów preLelF D i preLelF A. Hybyda /preD/A/LeIF A jest bardziejjpodobna do preD niż do preA.

Obydwa geny, tak dojrzałego LelF A jak i LelF D (konstrukcja I i III) ulegają ekspresji w drożdżach na poziomie 1,0% całkowitego białka komórkowego (poziom 2,0 także bywa spotykany). Geny te lub pregeny w złej orientacji nici ulegają ekspresji. Sekrecja nie zachodzi w odniesieniu do tych dwóch genów, jak i genu dojrzałego IFN-cr.

Tym niemniej, gdy używa się tych genów z _ presekwencją, wszystkie produkty białkowe znajdowane są w podłożach jako produkty ulegające sekrecji. Poziom odpowiadający /preD/A/ LelF nawet tak wysoki jak 8% całkowitej aktywności obserwuje się w podłożach przy Aeeo 3-4. Należy zauważyć, że wszystkie te plazmidy są w 95% komórek hodowlą rosnącą pod selektywnym naciskiem Trp+, co potwierdza obecność autonomicznie replikującego się plazmidu. Krzywa wzrostu i wytwarzania w podłożach dla drożdży zawierających gen /preD/A/LeIF A.

Dwa szczepy drożdży bada się w celu dalszej charakteryzacji. Są to: YEplPT-preLeIFA53t/pep4-3 oraz YEplPT-LeIFAl/pep4-3. Pierwszy z nich zawiera 2 kopie o konstrukcji IV (fig. 8) w miejscu EcoRI YEplPT, o w wyniku daje aktywność wewnątrz komórki, w ścianie komórkowej i zewnątrz komórki (podłoża). Tego plazmidu, zawierającego dwie kopie genowe (w tandemie -obydwie w orientacji zapewniającej prawidłową ekspresję) używa się zamiast plazmidu zawierającego konstrukcję z kopią pojedyńczą, ponieważ niekiedy daje on wyższy poziom aktywności interferonu w podłożach. Używa się drożdży pep4-3, pónieważ w tym przypadku znacznie zmniejszony jest poziom proteaz wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych, co może być korzystne dla otrzymywania z podłoży białka (interferonu) nie zdegradowanego.

Drugi szczep zawiera konstrukcję III (fig. 8) w YEplPT i wykazuje ekspresję dojrzałego LelF

A wewnątrz komórki, bez sekrecji.

Figura 9 przedstawia krzywą wzrostu tych dwóch szczepów drożdży w YNB + CAA (wzrost selektywny Trp⁺). Faza logarytmiczna dochodzi do Aeet>nm3-4, a następnie zaczyna się faza stacjo i

153 724 narna. Obydwie krzywe są zasadniczo takie same (co sugeruje, że wytwarzanie tych dwóch różnych białek: LelF A i /preD/A/LeIF A nie wpływa na wzrost drożdży lub ich żywotność). Biotesty przeprowadza się z podłożem w różnych okresach w czasie wzrostu komórek, w celu zbadania zależności wytwarzania interferonu od krzywej wzrostu w podłożach dla tych dwóch szczepów. Na podstawie tych wyników staje się widoczne, że presekwencja LelF A, powoduje wydzielenie interferonu do podłoży. Bez tej sekwencji aktywność w zasadzie nie uwalnia się. Jest także widoczne, że aktywność w podłożach osiąga maksimum blisko fazy stacjonarnej.

Oczyszczanie /preD/A/LeIF A z podłoży. W celu zbadania natury procesu sekrecji Zj^ireD/A/LeIF A do podłoży, w których rosną drożdże, niezbędne , jest oczyszczenie produktu białkowego z podłoży. Jeżeli drożdże są zdolne do sekrecji białka, prawdopodobnie przetwarzają w pewien sposób koniec aminowy podczas procesów sekrecji, jak to normalnie czynią komórki ssaków z białkiem preinterferonowym. Przedmiotem dalszych eksperymentów jest określenie natury tego przetwarzania, jak następuje.

A) Fermentacja w objętości 5 litrów. Fig. 10A przedstawia aktywność interferonu w ścianie komórkowej i w komórce w czasie tej samej fermentacji. Ekstrakty przygotowuje się przez osadzenie, z następującym po tym podziałaniu kulkami szklanymi, w 7M GHC1, tak, że ma się tu do czynienia zarówno z , aktywnością wewnątrzkomórkowego materiału jak i wśródściennego. Aktywność' ta osiąga maksimum około 25 X l jedn/litr przy Aeeonm 1,5-2,0, co sugeruje, że wewnątrzkomórkowego wytwarzanie interferonu kończy się w fazie logarytmicznej przed fazą stacjonarną, inaczej niż to zachodzi w przypadku materiału zewnątrzkomórkowego. I tak około 8% aktywności pojawia się w podłożu w wyniku sekrecji w stanie wolnym. Tym niemniej, taka sama aktywność może być w ścianie komórkowej (patrz tabela). Materiał ekstrahowany zawiera głównie interferon wewnątrzkomórkowy i materiał ten podddaje się oczyszczaniu, aby stwierdzić, czy jest on przetworzony, czy nie przetworzony.

Figura 10B przedstwia krzywą wzrostu w fermentacji w objętości 5 litrów YEplPT-preLełFA 53t/pep4-3 w YNB + CAA. Przy końcu fermentacji aktywność interferonu stwierdzona za pomocą badania MDBK wynosi około 2,0 X 10® jedn/litr. Poza tym, maksimum wytwarzania widoczne jest w fazie stacjonarnej. Należy zauważyć, że produkt interferonowy w tych podłożach jet bardzo stabilny, nawet w cigu 24 godzin dodatkowego wstrząsania w temperaturze 30°C po osiągnięciu fazy stacjonarnej. Podłoży tych używa się w dalszych stadiach oczyszczania.

B) Koncentraty podłoży na kolumnie immunopowinowactwa. Podłoża YEplPT-preLeIFA53t/4-3 poddaje się najpierw ultrafiltracji. Koncentrat ten wprowadza się na kolumnę zawierającą monoklonalne przeciwciało przeciw dojrzałemu LelF A. Po przemyciu0,2 M NaCl w Tris/cys/EDTA o pH 8,0 eluuje się interferon H2O o pH 5,5, jak to przedstawiono na fig. 11. Wyeluowany szczyt A (strzałka wskazuje, kiedy zastosowano H2O), uzyskany tą metodą reprezentuje 50% aktywności naniesionej na kolumnę. Frakcje piku A łączy się, jak to uwidoczniono na fig. 11, do dalszego oczyszczania. Elucja 0,2 M kwasem octowym daje pik B (strzałka wskazuje punkt zmiany buforu), a pozycja C reprezentuje punkt, w którym zastosowano oryginalny bufor do przemywania.

C) Stadium HPLC oczyszczania piku aktywności A. Frakcje piku A liofolizuje się do sucha i oczyszcza HPLC (patrz: metody). Fig. 12 przedstawia wyniki tego stadium, 2,5 //g próbkę oczyszczonego LelF A (z E.coli) stosuje się oddzielnie jako kontrolę.

Zarówno standard, jak /preD/A/LeIF A (albo preLełF A) wykazują ten sam czas retencji, co uwidoczniono na fig. Wyniki te wskazują na to, że interferon z podłoży jest interferonem przetworzonym, ponieważ preLełF A wykazuje znacznie różniący się czas retencji. Zacieniowa nej frakcji ze stadium HPLC używa się następnie do analizy sekwencji.

NH2-końcowa sekwencja /preD/A/LeIF A oczyszczonego z podłoży drożdży. Fig. 13 w części wskazuje wyniki analizy sekwencji oczyszczonego interferonu. Grna sekwencja jest sekwencją oczekiwaną dla /preD/A/LeIF A jeżeli nie zachodzi przetwarzanie. Wskazano normalny punkt rozszczepienia tego interferonu, który jest prawdopodobnie rozpoznawany przez komórki ssaków.

Sekwencję białka interpretuje się, przez stwierdzenie, który PTH-aminokwas wzrasta w każdym odpowiadającym cyklu Edmana i po tym maleje w następnym cyklu. PTH-aminokwasy, które normalnie wykazują niskie odzyskanie (Cys, Ser, Thr, Arg, His) pojawiają się gdy nie jest widoczny

153 724 inny PTH-aminokwas. Ilość mg określa się przez porównanie pola interpretowanej reszty z polem standardowej mieszaniny PTH-aminokwasów w tym samym stadium HPLC. W każdym chromatogramie wprowadza się jako wewnętrzny standard norleucynę, w celu upewnienia się, że czasy retencji są odtwarzane.

Figura 13 przedstawia wyniki analizy sekwencji białka otrzymane dla oczyszczonego /pre D/A/LeIF A. Sekwencja ta jest oczekiwana, jeżeli nie zachodziło by przetwarzanie. Wskazane normalny punkt rozszczepienia tego preinterferonu w komórkach ssaków. Przeprowadza się dwa niezależne stadia analizy sekwencji dla dwu różnych oczyszczonych próbek z komórek i podłoży. Fig. 13 wskazuje na to, że większość interferonu w podłożu została prawidłowo przetworzona (64%), lecz inna postać (36%) zawierająca 3 dodatkowe aminokwasy presekwencji jest także obecna. Wewnątrzkomórkowy interferon wykazuje także te dwie postacie, lecz w nieco różnej proporcji, jak również i trzecią postać zawierającą 8 aminokwasów presekwencji. Presekwencji o pełnej długości nigdy nie obserwuje się, co sugeruje, że drożdże w pewien sposób przetwarzają wszystkie prolFN.

Możliwe, że przetworzona postać zawierająca 3 aminokwasy presekwencji wynika z hybrydowej natury sekwencji sygnałowej preD/A. Bada się więc przetwarzanie niehybrydowego /preD/ LeiF D. PreD różni się od preD/A tylko aminokwasem w pozycji -2 (Leu zamiast Val). Gdy bada się przetwarzanie preIFN-α i oczyszczonego z podłoża, obydwie ostacie + 1i -3 są w dalszym ciągu obserwowane (fig. 13). Tym niemniej, w podłożu obecna jest w mniejszej ilości inna postać, -14, której nie obserwuje się w przypadku /preD/A/ LeiF A.

W celu zbadania wydzielania heterologicznych białek z S. cerevisiae, konstruuje się plazmidy do transkrypcji in vivo genów kilku dojrzałych interferonów (IFN) i kilku prelFN. Niezależnie od obecności sekwencji kodującej hydrofobowy peptyd sygnałowy można odzyskać aktywność przeciwwirusową IFN zarówno z komórek-gospodarzy, jak i z podłoża hodowli, podczas gdy wszystkie IFN, których syntezą kierują geny dojrzałego IFN pozostają wewnątrz komórek. Przystąpiliśmy do scharakteryzowania wymagań dla sekwencji przez podjęcie konstrukcji, w których gen interferonowy powinien być zaopatrzony w swoją własną, naturalną sekwencję sygnałową, jak /preD/ LeiF D, albo powinien być zaopatrzony w hybrydową sekwencję sygnałową wyznaczoną jako kompozycja 2 rodzajów IFN-α, jak w przypadku /preD/A/LeIF A. Ogólnie, jeżeli komórki drożdży z tymi konstrukcjami wydzielają IFN do podłoża hodowli, poziom aktywności będzie się różnić dla tych szczepów, a rodzaje oczyszczonego i poddanego analizie sekwencji IFN będą się także różnić.

Trzy postacie nie ulegającego sekrecji interferonu, stanowiące 90% całkowitego interferonu ulegającego ekspresji, oczyszcza się z komórek zawierających gen /preD/A/LeIF A. Jedna postać (33%) jest prawidłowo przetworzona (+ 1, fig. 13), druga (55%) zawiera 3 dodatkowe aminokwasy (-3, fig. 13), a trzecia (11%) zawiera 8 dodatkowych aminokwasów (-8). Tej ostatniej postaci nie obserwuje się w podłożu, podczas IFN z presekwencją pełnej długości nigdy nie obserwuje się w komórkach lub podłożu.

Przetwarzanie /preD/LelF D. Zamiast hodowli w kolbie wstrząsanej używanej dla /preD/A/ LeiF A w drożdżach, drożdże wykazujące ekspresję /preD/LelF D hoduje się w 10-litrowym fermentorze do A550 60.

Kiedy bada się przetwarzanie /preD/LelF D oczyszczonego tak samo, jak /preD/A/LeIF A/ z podłoża, obserwuje się zarówno postać + 1 jak i -3 (fig. 13). Obserwuje się też dodatkowo w podłożu mniejszą ilość postaci -14. Nie ma danych, że w hodowli zachodzi liza komórek, co obserwuje się w elektroforezie w żelu z SDS białka podłoża wobec białek komórkowych. Interesujące jest to, że przy tym wzroście do dużej gęstości, obserwuje się dla LeiF D wysokoprocentową sekrecję (30%). Fermentacja drożdży, wykazujących ekspresję /preD/A/LeIF A, do wysokiej gęstości także wykazuje ten wysoki procent sekrecji.

Okazuje się, że drożdże przetwarzają interferon tak ulegający, jak i nie ulegający sekrecji.

Poziom aktywności ulegający sekrecji różni się w zależności od fazy wzrostu komórek, a w maksymalnym procencie następuje to w fazie stacjonarnej w kolbach wstrząsanych i przy końcu fermentacji do wysokiej gęstości (30% w podłożach). Potwierdzenie składu plazmidów w drożdżach zawierających YEplPT-preLeIFA53t i YEplPT-LelFAl.

153 724

Drożdże zawierające te dwa plazmidy, używane w uprzednich eskperymentach, sprawdza się później za pomocą odzyskiwania plazmidu z drożdży. Przeprowadza się to wyodrębniając plazmidowy DNA z ekstraktów drożdżowych przez transformację E.coli, a następnie preparatykę DNA z użyciem minisit oraz analizę restrykcyjną plazmidowych DNA. Kilka wyodrębnionych za pomocą E.coli plazmidowych DNA chrakteryzuje się dla obydwóch typów drożdży. We wszystkich przypadkach plazmidów, oczekuje się, że sekwencja restrykcyjna potwierdzi obecność presekwencji w plazmidzie zawierającym gen pre/D/A/LeIF A i brak jej w plazmidzie zawierającym gen dojrzałego LelF A.

Mapa restrykcyjna i częściowa analiza sekwencji insertu pBl o 3,1 kbp. 300pg pBl trawi ' się wyczerpująco Hindlll w 500μΐ objętości mieszaniny reakcyjnej, a następnie poddaje elektroforezie w preparatywnym, 1% żelu agarozowym (Sea Kem). Insert Hindlll o 3,1 kbp wycina się z żelu zabarwionego etidium, poddaje elektroelucji, 2 razy ekstrahuje równymi ilościami fenolu nasyconego buforem i chloroformu przed wytrąceniem etanolem. Dzieli się porcje rozpuszczonego ponownie fragmentu DNA i poddaje nacięciom restrykcyjnym przy użyciu grupy rozmaitych enzymów restrykcyjnych z uzyskaniem częściowej mapy restrykcyjnej przedstawionej na fig. A.

30^tg oczyszczonego insertu o 3,1 kbp nacina się za pomocą Sau3 A i poddaje elektroforezie w 6% żelu akryloamidowym. Fragmenty odpowiadające 265 bp i 141 bp oczyszcza się oddzielnie z użyciem elektroelucji, jak wyżej opisano. Każdy fragment DNA poddaje się następnie analizie sekwencji DNA. Część tej sekwencji DNA przedstawia fig. B. Aminokwasy odpowiadające Nkońcowym aminokwasom strukturalnego genu PGK wydrukowane są powyżej sekwencji DNA.

Insercja miejsca restrykcyjnego do regionu 5' promotora PGK. Syntetyzuje się zwykłymi metodami syntetyczny oligonukleotyd o sekwencji 5’ ATTTGTTGTAA 3’/40/. 100 ng tego primera znakuje się na końcu 5’ za pomocą 10 jednostek kinazy polinukleotydowej T4 w mieszaninie reakcyjnej o objętości 20 μΐ zawierającej 200pCi [/“-PjATP. Tego roztworu znakowanego primera używa się w reakcji reparacyjnej związanej z primerem oznaczonej jako pierwszy stopień w wielostopniowym procesie wprowadzania miejsca restrykcyjnego EcoRI, do 5-skrajnego DNA PGK, bezpośrednio poprzedzającego sekwencję strukturalnego genu PGK. Wielostopniowy proces jest objaśniony poniżej.

Stopień 1 (fig. C). Reakcja reparacyjna związana z primerem i klonowanie fragmentu PGK XbaI-Sau3A o 39 bp.

1(0)/rg pBl trawi się całkowicie HaelU, po czym poddaje elektroforezie w 6% żelu poliakryloamidowym. Najwyższe pasmo w żelu zabarwionym etidium (zawierające region promotora PGK) wyodrębnia się za pomocą elektroelucji, jak wyżej opisano. Ten fragment DNA HaelU poddaje się restrykcji za pomocą Hindlll i elektroforezie w 6% żelu akryloamidowym. Pasmo o 650 bp wyodrębnia się za pomocą elektroelucji. Wyodrębnia się 5//g DNA. Ten fragment DNA Haelll-Hindll o 650 bp rozpuszcza się ponownie w 20μΐ dl H_SO, a następnie miesza z 20μ1 roztworu fosforylowanego primera opisanego powyżej. Mieszaninę ekstrahuje się 1 raz układem fenol-chloroform i wytrąca etanolem. Wysuszony DNA zawiesza się ponownie w 50μτ1 H2O i następnie ogrzewa na wrzącej łaźni wodnej w ciągu 7 minut. Roztwór ten szybko oziębia się w łaźni suchy lód-etanol (10-20 sekund) i przenosi do łaźni lód-woda. Do roztworu tego dodaje się 50μ1 roztworu zawierającego 10μ1 10x buforu polimerazy DNA I (Boehringer Mannheim), 10μ1 uprzednio przygotowanego roztworu zawierającego w stężeniu 2,5 mM każdy z trifosforanów dezoksynukleozydów (dATP, dTTP, dGTP i dCTP), 25 μΐ dlHaO i 5 jednostek polimerazy DN A~ (fragment Klenowa). Tę mieszaninę reakcyjną o objętości 100μΐ inkubuje się w ciągu 4 godzin w temperaturze 37°C. Następnie ekstrahuje sięją 1 raz układem fenol-chloroform, wytrąca etanolem, suszy za pomocą liofilizacji i poddaje wyczerpującej restrykcji za pomocą 10 jednostek Sau3A. Roztwór ten poddaje się elektroforezie w 6% żelu poliakryloamidowym. Wycina się z żelu pasmo odpowiadające 39 bp i wyodrębnia je za pomocą elektroelucji jak wyżej opisano. Materiał tego pasma ma jeden koniec wolny i jeden koniec lepki Sau3A. Fragment ten klonuje się do zmodyfikowanego nośnika pFIFtrp69.1(^g pFIFtrp69 przeprowadza się w postać liniową za pomocą Xbal, ekstsrahuje się 1 raz układem fenol/chloroform i wytrąca etanolem. Lepki koniec Xbal uzupełnia się za pomocą polimerazy DNA I (fragment Klenowa) w mieszaninie reakcyjnej o objętości 50μΐ zawierającej 25 μΜ każdego z trifosforanów dezoksynukleozydów. DNA ten nacina się za pomocą BamHI i poddaje elektroforezie w 6% żelu akryloamidowym. Fragment nośnika wyodrębnia się z

153 724 żelu z pomocą elektroelucji i ponownie zawiesza w 20μ1 dl H20.20 ng tego nośnika łączy się z 20 ng fragmentu o 39 bp zsyntetyzowanego powyżej w ciągu 4 godzin w temperaturze pokojowej. 1/5 część mieszaniny pochodzącej z łączenia używa się do transformowania E.coli szczep 294 z uzyskaniem oporności na ampicylinę (na płytkach z LB + 20pg/ml ampicyliny). Plazmidy z tych transformantów bada się za pomocą szybkiej metody z użyciem sit. Jeden plazmid, pPGK-39 (fig. C) selekcjonuje się w celu analizy sekwencji. 20pg tego plazmidu trawi się Xbal, wytrąca etanolem i poddaje działaniu 1000 jednostek bakteryjnej fosfatazy alkalicznej w ciągu 45 minut w temperaturze 68°C. Następnie DNA ekstrahuje się 3 razy układem fenol/chloroform i wytrąca etanolem. Następnie defosforylowane końce znakuje się w mieszaninie reakcyjnej o objętości 20μ1 zawierającej 200pCi [y³²-P] ATP i 10 jednostek kinazy polinukleotydowej T4. Plazmid nacina się Sali i poddaje elektroforezie w 6% żelu akryloamidowym.

Następnie pasmo ze znakowanym insertem wyodrębnia się z żelu i oddaje analizie sekwencji metodą degradacji chemicznej. Sekwencja DNA na końcu 3’jest taką, jakiej oczekiwano w tym fragmencie promotora.

Stopień 2 (fig. D). Konstrukcja fragmentu promotora PGK Pvul-EcoRI o 312 bp. 25//g pPGK-39 (fig. C) trawi się jednocześnie Sal I i Xbal (5 jednostek każdej) i poddaje elektroforezie w 6% żelu. Pasmo o 390 bp zawierające fragment promotora o 39 bp wyodrębnia się za pomocą elektroelucji. Ponownie zawieszony DNA poddaje się restrykcji za pomocą Sau3A, a następnie elektroforezie w 8% żelu akryloamidowym. Pasmo zawierające fragment promotora PGK o 39 bp wyodrębnia się za , pomocą elektroelucji. Ten DNA zawiera 39 bp na końcu 5’ promotora PGK we fragmencie Sau3A-XbaI.

pg pB 1 poddaje się restrykcji za pomocą Pvul i Kpul, a następnie elektroforezie w 6% żelu. Pasmo DNA o 0,8 kbp wyodrębnia się za pomocą elektroelucji, poddaje restrykcji Sau3A i elektroforezie w 6% żelu. Pasmo o 265 bp z promotora PGK (fig. A) wyodrębnia się za pomocą elektroelucji.

Ten DNA łączy się następnie z fragmentem promotora o 39 bp, wyżej otrzymanym, w ciągu 2 godzin w w temperaturze pokojowej. Następnie mieszaninę reakcyjną poddaje się restrykcji 'za pomocą Xbal i Pvul i elektroforezie w 6% żelu akryloamidowym. Fragment restrykcyjny XbalPvul wyodrębnia się za pomocą elektroelucji, dodaje do mieszaniny do łączenia zawierającej 200 ng pBR322 (33) (uprzednio wyodrębnionego, bez fragmentu restrykcyjnego Pvul-Pstl o 162 bp) i 200 ng cDNA genu LelF A Xbal-Pstl wyodrębnionego z 20/yg pLelFtrpA. Tej trójczynnikowej mieszaniny pochodzącej z łączenia używa się do transformowania E.coli szczep 294 z uzyskaniem oporności na ampicylinę. Kolonie transformantów bada się z zastosowaniem minisit i jedną z tych kolonii, pPGK-300 wyodrębnia jako posiadającą 5’-skrajny DNA PGK o 304 bp przyłączony do genu LelF A w nośniku na bazie pBR322. Koniec 5’ genu LelF A ma następującą sekwencję: 5’-CTAGAAATTC 3’, tak więc połączenie miejsca Xbal z fragmentu promotora PGK z tą sekwencją pozwala na dodanie do miejsca Xbal miejsca EcoRI. Tak więc pPGK-300 zawiera część promotora PGK wyodrębnionego we fragmencie Pvul-EcoRI.

Stopień 4. Konstrukcja fragmentu promotora PGK EcoRI-EcoRI o 1500 bp. 10pgpBl trawi się Pvul i EcoRI i poddaje elektroforezie w 6% żelu akryloamidowym. Pasmo DNA z 5-skrajnego DNA PGK PvuI-EcoRI o 1,3 kbp wyodrębnia się za pomocą elektroelucji. 10μ pPGK-300 trawi się za pomocą EcoRI i Pvul i fragment promotora o 312 bp wyodrębnia za pomocą elektroelucji po elektroforezie mieszaniny pochodzącej z trawienia w 6% żelu. 5pg pFRL4 nacina się EcoRI, wytrąca etanolem i poddaje działaniu baktryjnej fosfatazy alkalicznej w ciągu 45 minut w 68”. Po trzykrotnym potraktowaniu DNA układem fenol/chloroform, wytrąceniu etanolem i ponownym zawieszeniu w 20 ml dl H20,200 ng nośnika łączy się ze 100 ng pPGK EcoRI-PvuI o 312 bp i 100 ng DNA z pB 1 EcoRI-PvuI. Mieszaniny pochodzącej z łączenia używa się do transformowania E.coli szczep 294 z uzyskaniem oporności na ampicylinę. Z jednej z kolonii Ap^R otrzymuje się pPGR1500. Plazmid ten zawiera fragment promotora PGK o 1500 bp jako fragment DNA EcoRI-EcoRI lub HindllI-EcoRI.

Przykład II. Wytwarzanie HGH. Konstrukcja plazmidu wykazującego ekspresję dojrzałego HGH (ludzki hormon wzrostu) i preHGH.

Konstrukcję A-E na fig. 14 przeprowadza się na nośnikach z dogodnymi miejscami. W konstrukcji A powoduje się zdublowanie syntetycznym DNA sekwencji DNA na początku cDNA

153 724 preHGH od miejsca Hpall z utworzeniem miejsca EcoRI przed sygnałem startu translacji ATG. W tym przykładzie stosuje się więc peptyd sygnałowy preHGH sygnałowej sekwencji przedstawionej na fig. 13 na rysunku. Fragment Hpall-Pstl otrzymuje się z CDNA preHGH i ten fragment z syntetycznym DNA łączy się z fragmentem nonika. EcoRI do Pstl [pHGH 207-1 z usuniętym fragmentem EcoRI-Pstl zawierającym część genu Ap^R i obydwoma miejscami połączonymi ponownie po uzupełnieniu (Klenow) w celu usunięcia obu miejsc] zawierającym cDNA HGH od miejsca Pstl do Smal w celu wytworzenia konstrukcji A. Konstukcję B wytwarza się z plazmidu zawierającego gen dojrzałego HGH, który został uprzednio włączony w celu bezpośredniej ekspresji i zawiera syntetyczną sekwencję kodującą 23 aminokwasy końca -NH2. Plazmid zawierający ten gen nacina się PvuII w genie HGH i BamHI w genie TcR. Duży fragment zawierający większość genu łączy się następnie z syntetycznym DNA, który duplikuje koniec genu HGH (TAG) i tworzy miejsce Hindlll. To miejsce Hindlll łączy się z fragmentem Hindlll/BamHI z pBR322 jako trzecim czynnikiem z trzyczynnikowego łączenia w celu wytworzenia plazmidu zawierającego konstrukcję B.

A i B łączy się następnie jak pokazano na fig. 14 z wytworzenie konstrukcji C. C dalej modyfikuje się z wytworzeniem D, w której miejsce Hindlll uległo przekształceniu do miejsca EcoRI (lub EcoRI). Tak otrzymany fragment EcoRI lokuje się w miejscu EcoRI w drożdżowym plazmidzie ekspresyjnym YEpIPT do ekspresji genu HGH w drożdżach. Konstrukcję E także przygotowuje się z zastosowaniem konwertora użytego w D do wytworzenia genu dojrzałego interferonu (bez sekwencji sygnału sekrecji) we fragmencie EcoRI do ekspresji w YEpIPT.

Ekspresja dojrzałego HGH i preHGH w drożdżach. Konstrukcję mHGH (E) w YEpIPT wprowadza się do szczepu pep4-3trpl (20B-12) i przygotowuje ekstrakty z użyciem kulek szklanych, jak opisano w metodach. Tak więc, kulki szklane dodaje się do 10 ml osadzonych komórek z 0,5 ml 0,1% SDS. Rozcieńczeń dokonuje się z użyciem osocza końskiego i przeprowadza RIA jak uprzednio opisano.

Na podstawie RIA można stwierdzić, że HGH ulega ekspresji w około 0,5% całkowitego białka drożdży przy Αββο 1,0 (0,5 mg) litr/Aeeo). Nie wykrywa się HGH w podłożu.

Konstrukcję preHGH (D) w YEpIPT wprowadza się także do drożdży i bada komórki i podłoże pod względem HGH. Ekspresję wykrywa się w komórkach na niskim poziomie (0,08 mg/li^i7^6f^o), albo około 0,08% całkowitego białka drożdży. Tak więc poziom osiąga 1/6 poziomu ekspresji dojrzałego HGH, co jest bardzo podobne do wyników dla interferonu leukocytowego. Jednakże, nie można prawidłowo porównywać tych danych, ponieważ użycie kodonów dojrzałego HGH różni się pod względem 23 aminokwasów przy tych samych aminokwasach dla preHGH. Ta różnica może rzutować na różnice w poziomie ekspresji tych dwóch produktów. 10% lub 8 //g/litr/A₆6o = 1 poziom ekspresji w komórkach znaleziono w podłożu drożdży wykazujących ekspresję preHGH. W 10-litrowym fermentorze przy Asso85 także występuje około 10% sekrecji z 1 mg/litr HGH w podłożach.

Natura ekspresji preHGH. Porównanie ekspresji białka HGH w komórce z występującą zewnątrz komórki przeprowadza się za pomocą hybrydyzacji metodą Westerna jak wyżej opisano. Wyniki daje podłoże z fermentacji do dużej gęstości (A55085) drożdży wykazujących ekspresję preHGH. Obecne jest pojedyńcze pasmo odpowiadające wielkości cząsteczki dojrzałego HGH. Pasmo to odpowiada 1-2% drożdżowych białek podłoża.

W przypadku oczyszczania tego HGH z podłoża za pomocą chromatografii powinowactwa do przeciwciała (Hybritech Ab) używa się HPLC jak w przypadku interferonów. Analiza sekwencji końca NH2 wykazuje, że blisko 100% HGH stanowi dojrzały HGH analizę sekwencji przeprowadza się dla 10 aminokwasów, jak to przedstawiono, częściowo, na fig. 13. Tak więc, cały HGH podłoża jest przetworzony dokładnie tak, jak to czynią komórki ludzkie.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania białka heterologicznego, takiego jak ludzki interferon leukocytowy A lub D lub ludzki hormon wzrostu, których N-końcowe sekwencje aminokwasowe w postaci dojrzałej są przedstawione na rysunku fig. 13, znamienny tym, że do wektora ekspresji typu YEpIPT

153 724 dokonuje się funkcjonalnej insercji DNA kodującego wytwarzane białko heterologiczne, jak również heterologiczny polipeptyd sygnałowy, taki jak preA, preD, preD/A, prey, pre/J lub preHGH, których sekwencje aminokwasowe są przedstawione na rysunkach fig. 1 i fig. 13 otrzymanym wektorem transformuje się hodowlę komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae, nadając im zdolność uwalniania do pożywki, bez niszczenia komórek, ludzkiego interferonu leukocytowego A lub D albo ludzkiego hormonu wzrostu i odzyskuje się wytwarzane białko w jego natywnej postaci, a usuwa się niepożądane polipeptydy i inne produkty sekrecji.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się insercję DNA kodującą heterologiczny polipeptyd sygnałowy w postaci hybrydy natywnego białka i kodującą drugi polipeptyd heterologiczny, będący w przypadku ludzkiego interferonu leukocytowego A hybrydą polipeptydu AD 'leukocytów ludzkich o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na rysunku fig. 1.
3. Sposób według 1 albo 2, znamienny tym, że hoduje się komórki drożdży zawierające żywe komórki Saccharomyces cereisiae transformowane wektorami ekspresji nadającymi im zdolność wytwarzania heterologicznego białka w pożywce hodowlanej zawierającej białko heterologiczne.

CM

I

o.

I οι I o s|-v·

CM

T a- s< < t/ (Z)

O o

Ol l/<

IZ) IZ) -Je

2? 2? S o o </>

£^| 3^1 3 3 fej φ <ΰ aj <l uo «

IZ) <z>

<z> ω

ΙΖ ΙΖ)

Λ & -2-2$ 5 31 $| «Ζ» >> — CJ o

Λ

-S _0 _0 — Q_ ω « .>> >

ο οι χ:

CL

II I ο = .3 23 ιη

Τ £|

3 3 w 3 £1 — ο 21 > 2 3 Λ Ć

Ο fc «Λ α .c >>

-S .S < <

¥

CM

7* m

cm <

αι

-C

CL ο

Ο.

Λ ο

<

ς:

ΙΖ» <

ΙΛ <

ο >- αχ £ £ £

2 £

153 724

AATTCArGGCC A

G

CTTAA ^GATCJ ^MŚ«M

U ONA EcoRI

Hem B1H

636 bp

EcoRI

Pre-IFN-«1 RI

EcoRI

153 724

153 724

Pre-IFN-~1

Fig.5.

u ^===^

RI I Ontel Eco

Pstl_ ι-J.

IFN-««2 cONA

Pstl

EgdRI Ddl

E«»RI

EroRI

EcoRI

Ecc^f^I. Ddel 44 bp

Γ“Γ Del Ddel

Odo l, Pst I

900 bp

Odl

T
4 DNA EcoRI, Pstl

944 bp

Ddl

Ή

Pstl

EcoRI

IFN-7cCWA

Del

JPstl

230bp

2p 740 bp

DNA pDR322 0NA

Pstl EroRI

Pstl

T4 DNA EcoRI

1174 bp

Prt-IFN-«2 RI

Pstl EroRI

Fig.6.

Ή

Sou 3A

Sau3A Sou 3 A —I—

Sou 3A

Sau 3A

842 bp

P

Sau3A _gl Ί

Sou 3A

AATTTCCCCGATC—r GGGOCCTAi—

H ONA

EcoRI pONA 862 bp EcoRI

EcoRI

862 bp pUC7

Bat I —I-GATCCGGGG -CTAOGCCCCTTAA

Prn-IFN- 7 RI

70 bp

153 724

Fig.8.

099y

Fig.lOb.

I I I_I_I-L-1-1-L
5
6
7 β 9 10 11 12 13 (M/n^-ou

153 724

Fig.1 3.

-23 -22 -21 -20 -19 -18 -17 -16 -15 -14 -13 -12 -11 -10 -9 -β -7

Met Ala Ser Pro Phe Ala Leu Leu Met Ala Len tal Wil Leu Ser Cys Lys t

(W/o)-ΝΟΝΕ (90%)

111%

-1- LelF A

-6-5-4-3^-1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys Asp Lu Pro Gn Thr His Ser leu Gly ί t

36% 64%

55% 33%

- ---1- LelF .O “ «. „ o ^LLp „ „ γ, „ γ, ^{H s} (30%)-8% 45% 47%

- -1Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu Cy Leu Pro Trp leu Gin Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe (1%)-100%

AATWGGCIACAGGCTCC UxiH

TAOGATGTCCGAGGGC ~

DNA ¹⁸¹-» mi ^{m| HB,lWł} tą»
8 &»RI ATG

PsH pHGH 20*7-1) | Hmn

ΡνυΠ CTGTGGCTTCT^-AAGCTT ' GACACCGAAGAICCIICGAA

ΡνυΠ

H&n cDNA

C EcoW ATG

HMin

D EcoRI* ATG

E EcoRI ATG

Psi i —ł—

MI —f—

PsH

Fig.A.

Pvul

HindOI AGCTGAATTC ' CTTAAGTCGA

HindOI EcoRI mm £CoRI 1

HityflD Pvul | 1M)0tip|

HI bp H——H $qu3A HincH I «g| Sa3* £coM-Xbel

ΗβΒ

PGK —rc BgiH ίHndlD

J

153 724

-40 -30 -20 -10 -1 MET SER LEU SER SER LYS LEU LEU VAL

-GATCATAAGGAAGTAATTATCTACTTTTTACAACAAATATAAAACA ATG TCT TTA TCT TCA AAG TTG CTC GTC

EcoRI

Xba I

KLENOW Pol. !♦ 4dNTP's

Hoe ΙΠ Pyul Sou 3A Hinc U

PGK

ATG — 3¹- 5' Sou 3A u 39 bp

AAATGTTGTTTA TTTACAACAAAT pPGK-39

5 -ATTTGTTGTAAA

KLENOW Pol. I*

Sou BA _υ 4 dNTP's

AAATGTTGTTTA-5¹TTTACAACAAAT-3¹

Fig.E.

pf>GK-1OO

ZOkład Wydawnictw UP RP. Nakład 100 eg.. Cena 3000 zł