DK163936B - Fremgangsmaade til udvinding af alfa-amylase - Google Patents
Fremgangsmaade til udvinding af alfa-amylase Download PDFInfo
- Publication number
- DK163936B DK163936B DK087286A DK87286A DK163936B DK 163936 B DK163936 B DK 163936B DK 087286 A DK087286 A DK 087286A DK 87286 A DK87286 A DK 87286A DK 163936 B DK163936 B DK 163936B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- approx
- amylase
- enzyme
- volume
- solution
- Prior art date
Links
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title description 2
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 title 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 title 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 title 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 title 1
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 26
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 claims description 22
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims description 22
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 claims description 22
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 20
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 19
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 18
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 15
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 claims description 15
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 11
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 7
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 claims description 6
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 6
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 39
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 39
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 38
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 16
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 15
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 7
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 6
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 Amino Acid Nucleic Acid Chemical class 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005572 Cathepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108010059081 Cathepsin A Proteins 0.000 description 1
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- JLNTWVDSQRNWFU-UHFFFAOYSA-N OOOOOOO Chemical compound OOOOOOO JLNTWVDSQRNWFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L calcium chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940052299 calcium chloride dihydrate Drugs 0.000 description 1
- 108010089934 carbohydrase Proteins 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 108010029444 creatinine deiminase Proteins 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000012263 liquid product Substances 0.000 description 1
- 239000002075 main ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000007738 vacuum evaporation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
- Y10S435/836—Bacillus licheniformis
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
DK 163936B
i opfindelsen angår en særlig fremgangsmåde til udvinding af a-amylase i form af rene krystaller, nærmere betegnet en fremgangsmåde til udvinding af α-amylase udskilt under reguleret fermentering af en bakterie af arten Bacil-5 lus licheniformis i et egnet vandigt dyrkningsmedium til dannelse af en α-amylase-opløsning indeholdende biomasse og lavmolekylære urenheder fra dyrkningen af bakterien.
Enzymer virker som biokatalysatorer, idet de regulerer mange af de kemiske reaktioner, der naturligt 10 forekommer i levende organismer. Når enzymerne er isolerede, har de også mange industrielle anvendelser samt medicinske anvendelser. Eksempelvis anvendes enzymer i garvnings-, næringsmiddel- og detergent-industrien.
Der er blevet udført megen forskning vedrørende 15 metoder til fældning af enzymer. Eksempelvis beskrives det af Chiang, Alter og Sternberg, "Purification and Characterization of a Thermostable Alpha-Amylase from Bacillus licheniformis", Starke, Vol 31, nr. 3, side 86-92 (1979), at der kan udføres ammoniumsulfat-fældning 20 af TAKA-THERM®, et varemærke for Miles Laboratories, Inc-, Elkhart, Indiana, for carbohydrase-enzymer. I det nævnte litteratursted er den anvendte TAKA-THERM® alpha-amylase isoleret fra Bacillus licheniformis BLM 1777. Fældningen efterfølges af rensning ved hjælp af cellulosechromato-25 grafi. Dernæst kombineres der fraktioner og koncentreres ved ultrafiltrering. Enzymkoncentratet dialyseres dernæst, hvorpå der tilsættes ammoniumsulfat, indtil der fremkommer uklarhed (begyndelse af fældning).
Dixon et al., "Enzymes", Academic Press, 3. udga-30 ve, side 1-40 (1979), diskuterer ammoniumsulfat-krystal-lisation af enzymer og en variation af denne metode, der omfatter ekstraktion af en ringe mængde af det fældede enzym med kold, fortyndet ammoniumsulfatopløsning.
I Yokoyama et al., "Production and Crystalliza-35 tion of Acid Carboxypeptidase of Penicillium janthinel-
DK 163936 B
2 lum and Mode of Action on Peptides and Proteins/ and Anti-Inflammatory Activities of the Enzyme", Amino Acid Nucleic Acid, bind 35, side 64-75 (1977) diskuteres der kombination af søjlechromatografi med ammoniumsufat-fæld-5 ning til udvinding af sur carboxypeptidase.
Uwajima et al., "Production, Purification and Crystallization of Creatinine Deiminase of Corynebacte-rium lilium", Studies on Creatinine Metabolism by Microorganisms, Part II, Tokyo Research Laboratory, 10 Kyowa Hakko Kogyo Company, Ltd., Machida-shi, Tokyo,
Agric. Biol. Chem., 41(2) (1977), side 339-344, beskriver en fremgangsmåde til opnåelse af krystalliseret creatinin-deiminase, bestående af ammoniumsulfat-frak-tionering, protamin-behandling og cellulosechromatogra-15 fi.
Uwajima et al., "Production, Purification and Crystallization of III Alpha-Hydroxysteroid Dehydrogenase of Pseudomonas Putida", Tokyo Research Laboratory, Kyowa Hakko Kogyo Company, Ltd., Machida-shi, Tokyo, Agric.
20 Biol. Chem., bind 42, nr. 8, side 1577-1583 (1978) beskriver en metode til opnåelse af dehydrogenase omfattende fraktionering med ammoniumsulfat og søjlechromatografi på DEAE-cellulose, Sephadex G-100 og hydroxylapatit.
McCary beskriver i US patentskrift nr. 3.642.582 25 en fremgangsmåde til opnåelse af α-amylase, og denne fremgangsmåde omfatter først fjernelse af polyvalente anioner fra α-amylase-præparater, hvorefter præparaterne bringes i kontakt med fibrøst aluminiumoxid.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig 30 ved, at den i det væsentlige består af følgende trin: (a) udsættelse af det vandige dyrkningsmedium for væske/fast stof-adskillelsesteknik til adskillelse af biomassen fra væskefasen, (b) udsættelse af væskefasen for ultrafiltrering ved 35 en temperatur fra 5 til 15°C, indtil dens rum fang udgør ca. 10 til ca. 50% af begyndelses- 3
DK 163936 B
rumfanget, til fjernelse af lavmolekylære urerheder, og, uden yderligere rensning, (c) inddampning af væskefasen under vakuum ved er temperatur mellem 25 og 39*C under opretholdelse 5 af en pH-værdi mellem 6,8 og 8,1, indtil kon centratets rumfang udgør fra ca. 10 til ca.
20% af, hvad det var efter ultrafiltreringer, til fældning af α-amylasen i form af rene krystaller.
10 Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en enkel fremgangsmåde til udvinding af a--amylase på krystallinsk form. Fremgangsmåden udgør en forenkling i forhold til kendte metoder til opnåelse af enzymkrystaller derved, at den enzymholdige opløsning fcrtd 15 for induktionen af krystallisation ikke nødvendigvis skal være rea, dvs. fri for i det væsentligt alle opløselige faste stoffer. Endvidere indføres der ifølge den kendte teknik salte eller organiske opløsningsmidler til induktion af krystallisation af enzymer, og dette kan om ønsket gøres, 20 men er ikke nødvendigt i forbindelse med fremgangsmåden ifølge åen foreliggende opfindelse. Når salte og/eller organiske opløsningsmidler anvendes ved fremgangsmåderne ifølge åen kendte teknik til induktion af fældning af et. enzymkospieks, anvendes fældningen ofte ikke som slutprc-25 dukt, men blot som et trin i en samlet proces, der resulterer i et flydende slutprodukt. Overmætnings-metoden ifølge den foreliggende opfindelse eliminerer således mange problemer, fler er forbundet med de typiske flydende produkter indeholdende industrielle enzymer, f.eks. produkt stabilitet, 30 mikrobiel forurening, lav aktivitet, stort rumfang og høge transportomkostninger.
Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes cer ultrafiltrering til nedsættelse af indhold af de opløselige faste stoffer således, at der ved inddampning kan nås er 35 tilstand over overmætning. Den kendte teknik angiver ikke og indeholder ingen antydning om muligheden for at udvinds
DK 163936 B
4 rent, krystallinsk a-amylaseenzym ud fra et urent præparat ved anvendelse af den omhandlede teknik. Det er kendt, at urenheder i en enzymopløsning kan interferere med dannelsen af enzymkrystaller eller kan udfældes sammen med enzymet.
5 Man har således ment, at det til effektiv krystallisation af et enzym fra en opløsning var nødvendigt at fjerne alle urenheder fra opløsningen, f.eks. ved søjlechromatografi.
Den foreliggende opfindelse viser, at den rå fermenteringsvæske kan behandles ved væske/fast stof-separationsteknik, 10 f.eks. centrifugering, til fjernelse af biomassen, hvorpå væsken ultrafiltreres til understøtning af evnen til fordampning for at bringe opløsningen op over dens overmætningspunkt således, at enzymet kan fældes ved formindskelse af mediets volumen ved inddampning.
15 På tegningen vises der en grafisk afbildning af en udførelsesform for opfindelsen, hvor enzymet er a-amylase (TAKA-THERM®). På tegningen er Brix-værdien og procentværdien for krystallisation sammenlignet med et multiplum af koncentrationen.
20 Ifølge den foreliggende opfindelse går man ud fra en a-amylaseholdig opløsning, og enhver af de forskellige kendte væske/fast stof-separtionsmetoder til fjernelse af biomassen, cellefragmenter, uopløselige faste stoffer og lignende, kan anvendes.
25 Centrifugering kan f.eks. anvendes til fjernelse af biomassen, hvorved der tilvejebringes en opløsning, der er et cellefrit filtrat indeholdende enzymet.
Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse omfatter desuden anvendelsen af overmætnings-teknik ved 30 koncentrering af den enzymholdige opløsning. Om ønsket kan den enzymholdige opløsning først fortyndes med vand, og fortyndingen kan efterfølges af anvendelsen af overmætnings-metoder ved koncentrering af opløsningen. En overmættet opløsning er en sådan, der indeholder en 35 større mængde opløst stof, end det normalt er muligt for den mættede opløsning ved den pågældende tempera- 5
DK 163936 B
tur, og sådanne overmættede opløsninger er instabile.
Et pludseligt chok, støvpartikler eller skrabning på den indre overflade af beholderen indeholdende opløsningen kan virke som et centrum, hvor krystallisationen kan 5 begynde. Der må således drages omsorg for at opretholde den overmættede tilstand, indtil det er ønskeligt, at krystallisationen skal begynde, jvf. Pierce, Sawyer og Haenisch, "Quantitative Analysis", 4. udgave, side 349 (januar 1961).
10 Overmætningen opnås ved hjælp af en kombination af ultrafiltrering (UF) og inddampning. UF udføres ved fra 5 til 15’C, indtil rumfanget er fra ca. 10 til ca. 50% af rumfanget af den oprindelige, enzymholdige opløsning.
Inddampningen udføres under vakuum ved en temperatur 15 mellem 25 og 39*C, indtil koncentratet er overmættet. Ved den foretrukne fremgangsmåde gennemføres fordampningen under et vakuum ved 32*C og ved et trykdifferentiale på fra ca. 500 til ca. 760 mm Hg. Fordampningen under vakuum fortsættes, indtil rumfanget af koncentratet er ca. 10 til 20 ca. 20% af rumfanget efter ultrafiltrering.
Koncentreringen tilvejebringer en overmættet tilstand i opløsningen, i hvilken Brix-værdi-aflæsningen bør ligge på fra ca. 8 til ca. 60% ved 22 eC. Brix-værdien angiver mængden af opløselige faste stoffer i opløsning i 25 relation til sucrose som standard. I en udførelsesform ligger Brix-værdien mellem ca. 30 og ca. 40% ved 22*C.
Ved en foretrukken udførelsesform påbegyndes koncentreringen ved UF til ca. 25 til ca. 50% af rumfanget af den oprindelige, enzymholdige opløsning, og der fortsættes 30 dernæst ved inddampning.
pH-værdien skal befinde sig mellem 6,8 og 8,1, dvs. ved et niveau nær enzymets isoelektriske punkt. Forud for koncentreringen til overmætning kan pH-værdien af den oprindelige, a-amylaseholdige opløsning allerede ligge i det 35 ønskede område nær ved enzymets isoelektriske punkt. Yderligere pH-indstilling kan således være unødvendig. Såfremt 6
DK 163936 B
på den anden side pH-værdien ikke allerede befinder sig i det ønskede område nær ved enzymets isoelektriske punkt, må pH-værdien på et eller andet tidspunkt under eller efter koncentreringen indstilles på et punkt inden for det ønskede 5 område. Selv om pH-værdien allerede kan være i det ønskede område, kan den imidlertid også indstilles enten nærmere eller endog fjernere fra det isoelektriske punkt, så længe der er tale om et punkt inden for det ønskede område. Det isoelektriske punkt for a-amylase er ca. 7,2, og der anven-10 des typisk ammoniak eller kaliumhydroxid til pH-indstilling.
Efter koncentreringen fremkaldes der krystallisation. Til tider er bevægelsen under UF og inddampningen tilstrækkelig til at forårsage, at krystallisationen begynder spontant, når koncentreringen afsluttes. Sædvanligvis 15 opnås fremkaldelsen af krystallisation imidlertid ved hjælp af f.eks. podning, lydpåvirkning, omrøring eller skrabning af beholderens indre overflade. Typisk omrøres koncentratet med et omrørerorgan af propeltypen i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til at bevirke krystallisation af enzymet 20 ved den herskende temperatur. Omrøring som her anvendt skal omfatte alle metoder til at give opløsningen bevægelse og omfatter, men er ikke begrænset til langsom omrøring, agitation (hurtig omrøring) og omrystning, samt den strømmende bevægelse af opløsningen under UF og inddampning.
25 Almindeligvis udføres omrøringen med et blad af propeltypen, der roterer med fra 50 til 400 omdrejninger pr. minut i 24 til 120 timer og ved en temperatur fra 5 til 60°C. Fortrinsvis udføres omrøringen ved en temperatur over stuetemperatur. En typisk temperatur ligger fra 30 23 til 32°C. En temperatur omkring 25°C og et tidsrum omkring 72 timer er mest ønskeligt for α-amylase. Krystallerne udfældes og kan dernæst udvindes ved hjælp af enhver kendt væske-faststof-adskillelsesmetode, f.eks. centrifugering med dekantering eller filtrering.
35 7
DK 163936 B
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nærmere i de følgende eksempler.
Varmestabil α-amylase kan fås på følgende måde: Et nae-ringsmedium, der er egnet til fermentering af a-amylase/ 5 kan fremstilles ved tilsætning af følgende bestanddele til en 1000 liter gæringsbeholder:
Calciumchlorid-dihydrat 0,2-1,0 kg
Mono- og dikaliumphosphat 15-24 kg
Ammoniumsulfat 2-7 kg 10 Natriumcitrat 0-5 kg
En sukkerart 100-200 kg
Bomuldsfrømel 25-40 kg
Sojamedier 30-50 kg
Antiskummiddel 8-13 liter 15 Vand til 1000 liter
Mediet podes med levedygtige celler af Bacillus licheniformis og får lov at fermentere i 70 til 90 timer ved 40 til 45°C/ idet ρΗ-værdien holdes omkring neutral-20 punktet. Efter denne fermentering flokkuleres mediet med SEP ARAN® AP-30® til hjælp ved biomassefjernelse. SEPARAN® AP-30® er et flokkuleringsmiddel, hvis hovedbestanddel er anionisk polyacrylamid, og dette produkt leveres af Dow Chemical Company. Biomassen fjernes ved centrifugering, 25 og centratet renses ved gennemløb gennem Dicalite® FW-6 (en diatoméjord, der leveres af Eagle Pitcher Company), for-overtrukket på et vakuumtromlefilterapparat, hvorved der fås 1000 liter af et cellefrit filtrat med en aktivitet på 50.000 MWU pr. ml som bestemt ved "Manual 30 Liquefying Alpha-Amylase Assay", der er en modifikation af den metode, der er beskrevet af Wohlgemuth i Biochem., 29,1 (1908).
35
DK 163936 B
8
O
Eksempel 1
Koncentrering ved ultrafiltrering af TAKA-THERM ® “ -α-amylase-cellefrit filtrat med en aktivitet på 50.000 MWU pr. ml udføres i et Romicon HF-4-filterapparat med en 5 adskillelsesmembran med en molekylvægt på 10.000 ved 10°C til opnåelse af et koncentrat med et rumfang på 300 liter og en aktivitet på 150.000 MWU pr. ml.
Koncentreringen fortsættes under inddampning under vakuum i en flash-inddamper (Buffalo enkelttrinsfor-10 ceret cirkulationsvakuuminddamper), med trykdifferentialet indstillet på 500 til 760 mm Hg ved 32°C, indtil rumfanget af koncentratet er nedbragt til 50 liter med en aktivitet på 900.000 MWU pr. ml.
Der fås herved et overmættet koncentrat. Koncen-15 tråtets pH-værdi indstilles på 7,6 under anvendelse af 20%'s kaliumhydroxidopløsning, og der omrøres derpå ved 300 omdrejninger pr. minut med et omrørerorgan af propeltypen i 72 timer ved 25°C, hvorved der dannes enzymkrystaller. De fremkomne enzymkrystaller udvindes ved 20 centrifugering, og overskuddet af væske dekanteres fra. Enzymudbyttet i krystallerne er 92% af det inddampede koncentrats totale aktivitet. De tørre krystaller ifølge dette eksempel har en aktivitet på 8.000.000 MWU pr. gram tørt materiale og 12.000.000 MWU pr. gram protein.
25
Eksempel 2
Et TAKA-THERM ©-filtrat på 1000 liter fås fra en fermentering svarende til den, der anvendes i eksempel 1 til fremstilling af α-amylase-krystaller ved fermentering 30 af Bacillus licheniformis. Filtratet på 1000 liter koncentreres til forskellige værdier fra 2 til 20 ganges koncentrering ved UF ved 10°C under anvendelse af et Romicon-fil-terapparat med en adskillelsesmembran med en molekylvægt på 10.000. De ultrafiltrerede koncentrater koncentreres yderligere ved inddampning pa en roterende flash-inddamper (Brinkman-Buchi Rotovapor-R) ved en temperatur på 32°C, 35 * . 9
DK 163936 B
O
således at alle koncentraterne har en gennemsnitlig indledende koncentrataktivitet på ca. 650.000 MWU pr. ml, dvs. i området fra 565.000 til 738.000 MWU pr. ml. Dette resulterer i et overmættet koncentrat. Koncentraternes 5 pH-værdier indstilles på 7,6 med 20%'s kaliumhydroxidopløsning efter vægt pr. rumfangsenhed. Koncentraterne omrøres ved 300 omdrejninger pr. minut med en motordrevet blander i 72 timer ved stuetemperatur (22°C). Krystallerne og den ovenstående væske adskilles ved cen-10 trifugering og dekantering. Aktiviteterne i krystallerne og i den ovenstående væske bestemmes ved hjælp af Modified Wohlgemuth-bestemmelsesmetoden (MWU) , og de er angivet sammen med den indledende koncentrataktivitet i den følgende tabel.
15 De prøver med et rumfang på hver 20 ml, der ind samles, og som er angivet i tabellens søjle nr. 2, er medtaget, eftersom de anvendes som basis ved bestemmelse af den procentvise udvinding, dvs. disse indledende værdier betegnes som 100%. Rumfangene i søjle nr. 4 er de 20 tilbageblivende rumfang af den ovenstående væske, efter at enzymkrystallerne er fjernet. Enzymaktiviteten i søjle nr. 5 er således aktiviteten i MWU pr. ml, der er tilbage i den ovenstående væske, efter at krystallerne er fjernet, og ud fra disse værdier beregnes den procentvise enzymak-25 tivitetudvinding i den ovenstående væske i søjle nr. 6.
Rumfangene i søjle nr. 7 er de totale rumfang, der anvendes efter opløsning af enzymkrystallerne i H20, hvorved man således får enzymaktiviteten af krystallerne i MWU pr. ml i søjle nr. 8. Dernæst beregnes den procentvise udvinding 30 af krystallerne i søjle nr. 9 efter den sædvanlige metode under anvendelse af den formel, der angivet under tabellen.
35 10
DK 163936 B
tn
C
•H
Ό σιΙ ^αο^ω^Οι-Ηοι •Hint'~r-æcococ'j > Ό a jj 0)
+>1-10000000 , -HEOOOOOOO
co >\ooomn^)o HD······· tH -PsmæHincNino
m .yscoiNminininin -P
-P < H H g & 3 P ·— I g * a * § w s P o
Di 0 0 .c-P.-io.-ia) o om vo
MietnHr'-ær-.H'd'cnvo >h tø. (O CN CN i—1 lo S ·-* -P jj 3 & ro -g «ο $ •Η tn > C *rl
•H -P
• v ·% vol di=ct^ o n ^ <n æ ro
.H-q’f^CNHHi-lt' S
<u ^ S
s , § si I x
0 -P
0 -P OOOOOOO ’jj-y .-I -c , -Hi-IOOOOOOO > g
0 cm >50000000 -Ji H
η φ -H \ *····· * ti +J
rø .(¾ jjDvom^æinæin
r i jj 7¾ lO CO ΓΟ <N i—I ίΟ <U
& o åiSSHHHHVO I O
1 s 5
O ® W
roHuiirovor-vor'cn xro
^•l ilEHiHrlHrlrlH
c D> D> § c c δ ro ro s s 3 3 HOOOOOOO c! Pi
l-PSOOOOOOO
H0\0 0 0 00 00 I! fol *P 4J D · · · · * * * +:-H3mvOCOVOCDCDCD &
f£>Svocnmoi<vimn C
in vo vo vo Γ' vo Γ' -rj 4J *3 ro 5 p Dl ~ ·ζ P C p D> ,2 c ro ø c x
ø Ή -P -P O
O S C
C §00)0000000 &> o oil n - E ^ ni <N OJOJOJO) a: ro ro ω
0 ·& η* 'O
0 PEG
i—1 O) ' ' *P
0 T3 c >1
tn ro P
0 0 0 ffl Dl *> C Ή ro o „ Λ
Oi— o m o o r- o o ,-tl H'ticsmoinvooo ro ϋ D H nj
•P c c o < X
11
Også ved en gennemsnitlig begyndelseskoncentrataktivitet på 600.000 MWU pr. ml er resultaterne opsummeret grafisk på tegningen. Ud fra kurven kan det ses, at en gennemsnitlig aktivitet på 600.000 MWU pr. ml med en 6,7 gan-5 ges koncentrering ved ultrafiltrering resulterer i, at fra ca. 85 til ca. 86% af enzymet er på krystalliseret form. Yderligere ultrafiltrering ud over 6,7 ganges koncentrering forøger ikke krystaldannelsen, men krystallisationen nedsættes derimod drastisk, efterhånden som 10 Brix-værdien ved 22°C formindskes. Ved en 2 ganges koncentrering ved UF med 600.000 MWU pr. ml er ca. 52 til ca. 53% af enzymet på krystallinsk form.
Brix-værdien viser mængden af opløselige faste stoffer, der er til stede i opløsningen, i relation til 15 sucrose som en standard. Kurven viser derfor, at der ved ultrafiltrering fjernes opløselige faste stoffer, som interfererer med krystallisationen. Såfremt tilstrækkeligt af de opløselige faste stoffer ikke fjernes, kan TAKA-THERM®--filtratet ikke inddampes til en koncentration, der er høj 20 nok til, at krystallisation kan forekomme. I stedet vil opløsningen blive så viskos, at yderligere inddampning ikke kan udføres. Brix-værdierne på kurven viser det punkt, ved hvilket en tilstrækkelig mængde opløselige faste stoffer er fjernet, således at inddampningen kan fort-25 sættes tilstrækkelig langt til opnåelse af overmætning til krystallisation som anvendt i dette eksempel.
30 35
Claims (1)
- DK 163936 B Patentkrav. Fremgangsmåde til udvinding af a-amylase udskilt under reguleret fermentering af en bakterie af arten Bacillus licheniformis i et egnet vandigt dyrkningsmedium til 5 dannelse af en α-amylase-opløsning indeholdende biomasse og lavmolekylære urenheder fra dyrkningen af bakterien, kendetegnet ved, at denne fremgangsmåde i det væsentlige består af følgende trin: (a) udsættelse af det vandige dyrkningsmedium for 10 væske/fast stof-adskillelsesteknik til adskil lelse af biomassen fra væskefasen, (b) udsættelse af væskefasen for ultrafiltrering ved en temperatur fra 5 til 15*C, indtil dens rumfang udgør ca. 10 til ca. 50% af begyndelses- 15 rumfanget, til fjernelse af lavmolekylære uren heder, og, uden yderligere rensning, (c) inddampning af væskefasen under vakuum ved en temperatur mellem 25 og 39°C under opretholdelse af en pH-værdi mellem 6,8 og 8,1, indtil kon- 20 centratets rumfang udgør fra ca. 10 til ca. 20% af, hvad det var efter ultrafiltreringen, til fældning af a-amylasen i form af rene krystaller.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US70555685A | 1985-02-26 | 1985-02-26 | |
| US70555685 | 1985-02-26 | ||
| US73597185 | 1985-05-20 | ||
| US06/735,971 US4659667A (en) | 1985-02-26 | 1985-05-20 | Process to recover crystalline enzymes and crystalline enzymes produced thereby |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK87286D0 DK87286D0 (da) | 1986-02-25 |
| DK87286A DK87286A (da) | 1986-08-27 |
| DK163936B true DK163936B (da) | 1992-04-21 |
| DK163936C DK163936C (da) | 1992-09-21 |
Family
ID=27107530
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK087286A DK163936C (da) | 1985-02-26 | 1986-02-25 | Fremgangsmaade til udvinding af alfa-amylase |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4659667A (da) |
| EP (1) | EP0193046B1 (da) |
| AR (1) | AR241546A1 (da) |
| CA (1) | CA1262878C (da) |
| DE (1) | DE3682411D1 (da) |
| DK (1) | DK163936C (da) |
| MX (1) | MX163250B (da) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988008031A1 (en) * | 1987-04-08 | 1988-10-20 | Genetics Institute, Inc. | Process for preparing cyclodextrins |
| EP0322082A1 (en) * | 1987-12-23 | 1989-06-28 | Gist-Brocades N.V. | Purified industrial enzyme and a process for the preparation thereof |
| US5120650A (en) * | 1989-10-13 | 1992-06-09 | Stabra Ag | Method for producing crystalline glucose isomerase |
| DK173590D0 (da) * | 1990-06-06 | 1990-07-19 | Novo Nordisk As | Rekombinante terapeutiske lipaser |
| US5281526A (en) * | 1992-10-20 | 1994-01-25 | Solvay Enzymes, Inc. | Method of purification of amylase by precipitation with a metal halide and 4-hydroxybenzic acid or a derivative thereof |
| DK39693D0 (da) * | 1993-04-02 | 1993-04-02 | Novo Nordisk As | Enzym |
| NZ295735A (en) * | 1994-12-28 | 1999-06-29 | Genencor International Indiana | Method for stabilizing enzymes in liquid compositions comprising forming an enzyme in an insoluble form and combining with an agent |
| US6207437B1 (en) | 1996-03-11 | 2001-03-27 | Genencor International, Inc. | Crystalline protease and method for producing same |
| US5861295A (en) | 1997-01-02 | 1999-01-19 | Life Technologies, Inc. | Nucleic acid-free thermostable enzymes and methods of production thereof |
| US6140475A (en) * | 1997-04-11 | 2000-10-31 | Altus Biologics Inc. | Controlled dissolution crosslinked protein crystals |
| DE59814359D1 (de) * | 1997-09-26 | 2009-05-28 | Sphere Medical Ltd | Mikrostrukturierter biosensor, verwendung des biosensors und verfahren zur immobilisierung von biokatalysatoren |
| CA2361507C (en) * | 1999-03-05 | 2014-05-06 | Genencor International, Inc. | Method for rapidly obtaining crystals with desirable morphologies |
| US20010046493A1 (en) * | 2000-02-24 | 2001-11-29 | Alex Margolin | Lipase-containing composition and methods of use thereof |
| US7118891B2 (en) * | 2001-12-11 | 2006-10-10 | Novozymes A/S | Crystal harvest from fermentation broth |
| EP1456361B1 (en) * | 2001-12-11 | 2012-02-29 | Novozymes A/S | Process for harvesting crystalline particles from fermentation broth |
| PT1809320E (pt) * | 2004-10-14 | 2010-10-25 | Altus Pharmaceuticals Inc | Composições contendo lipase, protease e amilase para o tratamento de insuficiência pancreática |
| US20100196344A1 (en) * | 2005-10-14 | 2010-08-05 | Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for treating pancreatic insufficiency |
| WO2011019686A1 (en) * | 2009-08-10 | 2011-02-17 | Danisco Us Inc. | Cross-flow membrane filtration-based process for protein recovery |
| WO2018115520A1 (en) * | 2016-12-23 | 2018-06-28 | Arla Foods Amba | Production of novel beta-lactoglobulin preparations and related methods, uses, and food products |
| WO2020002426A1 (en) | 2018-06-27 | 2020-01-02 | Arla Foods Amba | Process for producing beta-lactoglobulin isolates and related methods and uses |
-
1985
- 1985-05-20 US US06/735,971 patent/US4659667A/en not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-01-31 CA CA500838A patent/CA1262878C/en not_active Expired
- 1986-02-14 DE DE8686101884T patent/DE3682411D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-02-14 EP EP86101884A patent/EP0193046B1/en not_active Expired
- 1986-02-19 AR AR86303178A patent/AR241546A1/es active
- 1986-02-24 MX MX1636A patent/MX163250B/es unknown
- 1986-02-25 DK DK087286A patent/DK163936C/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK163936C (da) | 1992-09-21 |
| CA1262878A (en) | 1989-11-14 |
| CA1262878C (en) | 1989-11-14 |
| DK87286D0 (da) | 1986-02-25 |
| EP0193046B1 (en) | 1991-11-13 |
| EP0193046A2 (en) | 1986-09-03 |
| EP0193046A3 (en) | 1988-07-20 |
| US4659667A (en) | 1987-04-21 |
| MX163250B (es) | 1992-03-24 |
| AR241546A1 (es) | 1992-08-31 |
| DK87286A (da) | 1986-08-27 |
| DE3682411D1 (de) | 1991-12-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK163936B (da) | Fremgangsmaade til udvinding af alfa-amylase | |
| EP1149160A1 (en) | Recovery of a protein at high ph | |
| Slack et al. | Inhibition by hordein of starch degradation | |
| Dixon et al. | On the further purification of the xanthine oxidase | |
| GB1589581A (en) | Process for the separation of enzymes | |
| CA1113615A (en) | Process for the enzymatic treatment of waste water of wheat starch plants | |
| DE2701890C2 (de) | Peptielischer Glycosidhydrolase-Inhibitor aus einem Streptomyceten und seine Verwendung | |
| JPH02171185A (ja) | 生理活性物質の調製方法 | |
| DK161188B (da) | Fremgangsmaade til koncentrering af polysaccharidoploesninger | |
| US2967804A (en) | Method of making dextrose using purified amyloglucosidase | |
| CN109385414B (zh) | 菠萝蛋白酶的纯化方法 | |
| DE60027877T2 (de) | Verfahren zur schnellen herstellung von crystallen mit wünschenswerter morphologie | |
| DK145601B (da) | Fremgangsmaade til rensning og fraktionering af vandoploeste,fortrinsvis enzymatisk aktive proteiner | |
| DE2228038A1 (de) | Leichtvergärbare Würze bzw. leichtvergärbarer Sirup, ihre Herstellung und Verwendung | |
| RU2039819C1 (ru) | Способ получения коллагеназы | |
| CA1251750A (en) | Ultrafiltration purification of glucose isomerase | |
| JPS58165743A (ja) | 精製タマリンドガムの製造法 | |
| JPS6222590A (ja) | 高分子加水分解酵素含有乾燥組成物及びその製造方法 | |
| NO138451B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av rensede enzymloesninger | |
| Sitkey et al. | Application of flocculation for extracellular proteinases recovery | |
| JP2793158B2 (ja) | フィブロインからチロシンを分離する方法 | |
| JPH01153098A (ja) | 濾過性の増加を目的とする、多糖類を含む醗酵液の処理方法および石油の二次回収におけるこの液の使用 | |
| JPS61181394A (ja) | リボ核酸の単離取得方法 | |
| JPS61219393A (ja) | 高分子有機物の酵素による加水分解方法 | |
| JPS5876089A (ja) | 酵素もしくは微生物の固定化方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |
Country of ref document: DK |