DK165375B - Fremgangsmaade til selektivt at foroege andelen af faktor a og/eller b0 eller pa og/eller pb i et antibiotikum a 40926-kompleks - Google Patents

Description

DK 165375B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af antibiotikum A 40926-kompleks, beriget med hensyn til dets faktorer A og/eller Bq, eller PA og/eller PB, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav 1's 5 kendetegnende del angivne.

Antibiotikum A 40926 er et glykopeptidisk antibiotikum som er blevet isoleret fra en kultur af Actinomadu-ra betegnet Actinomadura sp. ATCC 39727. Det er et kompleks hvis faktorer er blevet benævnt faktor A, faktor B, fak-10 tor Bq, faktor PA og faktor PB. Det er beskrevet i beskrivelsen til EP-skrift A 177882.

Dette antibiotiske kompleks såvel som de enkelte faktorer deraf binder sig til D-alanyl-D-alanin-termine-rende oligopeptider og er hovedsaligt virksom mod gram-15 positive bakterier og arter af Neisseria.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er det faktisk muligt fx at påvirke mængdeforholdet af de enkelte hovedkomponenter af antibiotikum A 40926-kompleks ved industriel gæring i stor målestok. Denne fremgangsmåde repræsente-20 rer derfor et nyttigt værktøj til regulering af sammensætningen af slutproduktet så den svarer til standardspecifikationer.

Desuden er det ved at gå frem i henhold til fremgangsmåden ifølge opfindelsen også muligt direkte ud fra 25 gæringsmassen af den producerende stamme at opnå-et råprodukt som er meget rigt med hensyn til antibiotikum A 40926 faktor A eller Bq, der derefter kan isoleres i ren form med højere udbytter og ved mindre tidsrøvende trin end ellers.

30 Det er specielt den foreliggende opfindelses formål at tilvejebringe en fremgangsmåde til at forøge produktionen af faktorerne PA og/eller PB i A 40926. Det er kendt fra EP-skrift nr. A-177882 at disse to faktorer er naturlige "forløbere" eller "prækursorer" for antibiotikum A 40926, 35 henholdsvis faktorerne A og Bq. Ved at gennemføre udvindingen af de antibiotiske stoffer mens man i begrænset 2

DK 165375B

grad udsætter dem for basiske betingelser, vil der derfor . blive vundet et kompleks son er beriget med hensyn til faktor PA og/eller PB i stedet for faktor A og/eller faktor Bq. Nærmere betegnet er den særlige prækursor som forøger pro-5 duktionen af antibiotikum A 40926 faktor PA den samme som den der forøger andelen af antibiotikum 40926 faktor A, og den prækursor som svarer til faktor PB er den samme som den der svarer til antibiotikum A 40926 faktor Bq.

Den prækursor som giver en forøgelse af andelen 10 af faktor Bq i antibiotikum A 40926 er udvalgt blandt va-lin, salte deraf med syrer og baser som er ugiftige for den producerende mikroorganisme, α-keto-isovalerianesyre, salte deraf med baser som er ugiftige for den producerende mikroorganisme, estere deraf med lavere mono- og polyhydro-15 xyalkanoler, isosmørsyre, salte deraf med baser som er ugiftige for den producerende mikroorganisme, estere deraf med lavere mono- og polyhydroxyalkanoler, isobutanol og estere deraf med syrer som er ugiftige for den producerende mikroorganisme .

20 Den prækursor som giver en forøgelse af andelen af faktor A i antibiotikum A 40926 kompleks er udvalgt blandt n-propanol og estere deraf som er ugiftige for den producerende mikroorganisme, propionsyre, salte deraf med baser som er ugiftige for den producerende mikro-25 organisme, estere deraf med lavere mono- og polyhydroxyalkanoler, isoleucin, salte deraf med syrer og baser som er ugiftige for den producerende mikroorganisme, a-keto-β-metylvalerianesyre, salte deraf med baser som er ugiftige for den producerende mikroorganisme, estere deraf 30 med lavere mono- og polyhydroxyalkanoler, 2-metylsmør-syre, salte deraf med baser som er ugiftige for den producerende mikroorganisme, estere deraf med lavere mono-og polyhydroxyalkanoler, 2-metylbutanol og estere deraf med syrer som er ugiftige for den producerende mikro-35 organisme.

Salte med baser som er ugiftige for mikroorganismen er salte hvor typen og koncentrationen af den givne kation er en sådan at den ikke forringer væksten af 3

DK 165375B

mikroorganismekulturen eller produktionen af det ønskede antibiotiske stof i betragtelig grad ved den koncentration der bruges i gæringsmassen. Eksempler på disse kationer er dem der stammer fra alkalimetaller og jord-5 alkalimetaller såsom natrium, kalium, kalcium og magnesium såvel som dem der stammer fra aminer såsom ammonium, primære, sekundære eller tertiære _4-alkylammonium-og hydroxy-C^_^-alkylammoniumioner. Foretrukne salte er de salte som indeholder natrium-, kalium- eller ammoni-10 umioner.

Eksempler på syrer som er ugiftige for den producerende mikroorganisme, dvs. salte med syrer som ikke i væsentlig grad forringer enten væksten af mikroorganismekulturen eller produktionen af det ønskede antibio-15 tiske stof, ved den koncentration ved hvilken de er til stede i gæringsmassen, er fortrinsvis uorganiske syrer såsom saltsyre, selv om der også i nogle tilfælde kan være organiske syrer til stede.

Estere af en egnet prækursor som defineret oven-20 for med lavere mono- og polyhydroxyalkanoler er estere med C^_galkanoler med 1, 2, 3, 4, 5 eller 6 hydroxyfunk-tioner pr. molekyle. Når der bruges C1_4alkanoler må de være forskellige fra dem der virker som prækursorer for den anden antibiotiske faktor (dvs. butanol eller 2-me-25 tylbutanol), med mindre der ønskes samtidig forøgelse af begge faktorer.

Foretrukne eksempler på polyhydroxyalkanoler er glycerol og propylenglykol.

Når den lavere alkanol kan foreligge i forskel-30 lige enantiomere og epimere former sigtes der i nærværende beskrivelse med tilhørende krav til hver enkelt form for sig såvel som blandinger af hvilke som helst af de enkelte former i hvilket som helst mængdeforhold.

Estere af en valgt hydroxyholdig prækursor som 35 defineret ovenfor, der er ugiftig for mikroorganismen, er C2_22alkanoylestere hvor typen og koncentrationen af alkanoyldelen i gæringsmediet er en sådan at de ikke forringer væksten af mikroorganismekulturen eller pro- 4

DK 165375B

duktionen af det ønskede antibiotiske stof i væsentligt omfang. I almindelighed foretrækkes ligekædede C2_^al-kanoler.

Den anvendte antibiotikum A 40926-producerende 5 kultur er en kultur af Actinomadura sp. ATCC 39727 eller en mutant deraf med væsentligt samme egenskaber.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen indbefatter dyrkning af en antibiotikum A 40926-producerende kultur i et vandigt næringskulturmedium indeholdende en assimi-10 lerbar kilde til kulstof, en assimilerbar kilde til·nitrogen og uorganiske salte under de sædvanlige betingelser som kendes til dyrkning af streptomyceter i almindelighed og for den A 40926-producerende stamme i særdeleshed (se også ovennævnte EP-A-177882), i det der til-15 sættes en effektiv mængde af den valgte prækursor for selektivt at forøge produktionen af antibiotikum A 40926 faktor A og/eller faktor Bq.

Den valgte prækursor kan sættes til gæringsmediet på kontinuerlig eller diskontinuerlig måde under gærin-20 gen, eller i en for-kultur, eller den kan sættes til dyrkningsmediet fer gæringen. Den kan tilsættes direkte hvis den er passende flydende ved gæringstemperaturen, eller den kan tilsættes som en opløsning, suspension eller emulsion og fortrinsvis i form af en vandig opløs-25 ning eller suspension.

En "effektiv mængde" af den valgte prækursor er en mængde af en prækursor som defineret foran, der ved tilsætning til gæringen giver en koncentration af en selektiv prækursor som er tilstrækkelig høj til at frem-30 bringe den selektive forøgelse af den specifikke faktor af antibiotikum A 40926 uden at bevirke toxiske virkninger på den i vækst værende kultur af den producerende mikroorganisme.

Graden af tilsætning af prækursoren må være til-35 strækkelig høj til at forøge udbyttet af den ønskede faktor i væsentlig eller optimal grad uden dog at fremkalde en toxisk virkning på gæringen.

DK 165375 B

5 I almindelighed kan det være nyttigt at tilføre en effektiv mængde af den valgte prækursor på kontinuerlig eller portionsvis måde fra begyndelsen, eller under gæringens produktionsstadium.

5 I nogle tilfælde kan det være hensigtsmæssigt at tilføre en blanding af nogle af prækursorerne for en given faktor eller dem alle for at opnå et maksimalt resultat med minimale "toxiske" virkninger på kulturen.

Efter gæringen kan man om ønsket udvinde antibio-10 tikum A 40926-kompleks eller de enkelte faktorer A eller Bq, PA eller PB, ved kendte fremgangsmåder eller indlysende modifikationer deraf.

Nærings-gæringsmedier som egner til sig til gæring af den A 40926-producerende stamme, som kan bruges 15 ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, indeholder sædvanligvis: en passende kulstofkilde der fx kan være udvalgt blandt sukkerarter (fx glukose, sakkarose, maltose), polysakkarider (fx stivelse, dextran), polyalkoho-ler (fx glycerol, propylenglykol); passende nitrogenkil-20 der der fx kan være udvalgt blandt ammoniumsalte, aspara-gin, jordnøddemel, soyamel, kødekstrakt, trypton, pepton, gærhydrolysat, gærekstrakt og majsstøbevand; og u-organiske salte. Blandt de uorganiske salte som kan inkorporeres i dyrkningsmedier kan nævnes de sædvanlige 25 opløselige salte med evne til at frembringe natrium-, kalium-, jern-, zink-, kobolt-, magnesium-, kalcium-, ammonium-, klorid-, karbonat-, sulfat-, fosfat-, nitrat-og lignende ioner.

I almindelighed for-dyrkes den antibiotikumpro-30 ducerende stamme i en rystekolbe hvorpå kulturen bruges til podning af krukkefermentorer til produktion af væsentlige mængder af de antibiotiske stoffer. Det medium der bruges til forkulturen kan være det samme som det der bruges til større gæringer, men der kan også bruges 35 andre medier.

Gæringen udføres gennem et tidsrum som varierer mellem 50 og 150 timer under submerse, aerobe betingel-

DK 165375 B

6 ser og ved en temperatur mellem 25-35°C, fortrinsvis mellem 27-33°C. Tilsætning af den selektivt effektive mængde af vedkommende prækursorer kan ske til gæringsmedierne før podningen med den producerende stamme, eller 5 24-48 timer efter at gæringen er sat igang. Tilsætningen kan ske i en eller flere portioner eller på kontinuerlig måde.

Ved et typisk forsøg med fremgangsmåden ifølge opfindelsen podes en kultur af den A 40926-producerende 10 stamme der holdes i havremels-agar-skråkultur, i en kolbe indeholdende 100 ml af et vegetativt medium. Efter ca. 72 timer bruges prøver af kulturen (5 ml) til podning af et antal gæringskolber indeholdende hver 100 ml gæringsmedium, hvortil der sættes en selektivt effektiv mæng-15 de prækursor efter behov. Hvis der ønskes samtidig forøgelse af de to faktorer af A 40926-kompleks, sættes vedkommende prækursorer til samme gæringskolbe. Gæringen fortsættes i yderligere 60-150 timer og overvåges ved mellemrum ved HPLC, hvorefter gæringskagen fjernes og 20 prøver af gæringssuppen analyseres ved HPLC.

Udvinding af de antibiotiske stoffer kan udføres på i og for sig kendt måde og som beskrevet udførligt i EP-A-177882.

Til veterinær anvendelse kan man bruge hele gæ-25 ringskagen eller en koncentreret gæringssuppe.

Tilsætning af prækursoren til gæringen er en sådan at den ikke i væsentlig grad påvirker dens forudbestemte pH-område. Når der således sættes prækursorer i form af fri syre direkte til mediet, holdes pH under 30 kontrol ved pufring af mediet eller ved øjeblikkelig neutralisering med baser som er ugiftige for mikroorganismen.

Når den prækursor som skal tilsættes er en aminosyre kan den føres til gæringen som en vandig opløsning 35 af salte deraf med syrer eller baser som er ugiftige for den producerende mikroorganisme, fx hydroklorider og natriumsalte, selv om man i mange tilfælde hensigtsmæssigt 7

DK 165375B

kan tilsætte aminosyre i form af en opløsning af det "indre salt". Der kan bruges racemiske blandinger og optisk aktive isomerer som prækursorer.

I almindelighed opnås der imidlertid højere ud-5 bytter ved tilsætning af L-formen end med den tilsvarende D-form.

En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen består derfor i man bruger L-formen af aminosyre-prækursoren til at forøge koncentrationen 10 af faktor Bq eller PB (L-valin eller et salt eller en ester deraf), og/eller faktor A eller PA (L-isoleucin eller et salt eller en ester deraf) af antibiotikum A 40926-kompleks. I henhold til denne foretrukne udførelsesform er det også muligt at forøge procentandelen af 15 faktor A eller Bq i gæringsproduktet til over 80% af komplekset.

Når man bruger lavere alkansyre-prækursorer (2-metylsmørsyre, isosmørsyre, α-keto-isovalerianesyre eller a-keto-Ø-metylvalerianesyre) kan tilsætningen ske 20 ved hjælp af en vandig opløsning af salte deraf med u-giftige baser; i almindelighed foretrækkes ammoniumsalte og natriumsalte.

Når der bruges estere af ovennævnte lavere alkan-syrer og umættede fedtsyrer med lavere monohydroxyalka-25 noler som prækursorer, er disse estere i almindelighed afledet af metanol, ætanol eller propanol om end der også kan bruges estere med C4_galkanoler. I dette tilfælde må vedkommende C. ^alkanol være en anden end den 4-6 8

DK 165375B

der kan virke som prækursor for den anden faktor (isobu-tanol, 2-metylbutanol eller propanol), med mindre der ønskes samtidig forøgelse af den anden faktor.

Alkanol-prækursorer såsom isobutanol, 2-metylbu-5 tanol og n-propanol føres sædvanligvis som sådanne til gæringen. De kan imidlertid også tilføres som estere med syrer som er ugiftige for mikroorganismen. Disse syrer må være forskellige fra dem der kan virke som præ-kursorer for den anden A 40926-faktor med mindre der øn-10 skes samtidig forøgelse også af den anden faktor. Som regel foretrækkes estere med ligekædede C2_^alkansyrer såsom eddikesyre, propionsyre og smørsyre.

Den "selektivt effektive mængde" som skal sættes til mediet ifølge den foreliggende opfindelse afhænger 15 af prækursortypen. Med esterne af de lavere alkansyrer (isosmørsyre, 2-metylsmørsyre) bruges der som regel mængder der giver en koncentration af syren i gæringsmediet mellem 0,1 g/1 og 5 g/1, idet området mellem 0,1 g/1 og 1 g/1 foretrækkes. Med de lavtkogende alkanoler (isobuta-20 nol, 2-metylbutanol, n-propanol) eller deres estere med syrer som er ugiftige for mikroorganismen bruges som regel mængder der giver en koncentration af alkoholen mellem 0,5 g/1 og 5 g/1, hvorved området mellem 1 g/1· og 2 g/1 foretrækkes.

25 Med aminosyrerne (valin, isoleucin) og ketosy- rerne (α-keto-isovalerianesyre, a-keto-Ø-metylvaleriane-syre) eller deres salte med baser ligger den selektivt effektive mængde, der sættes til gæringsmediet, som regel mellem 0,2 g/1 og 5 g/1, fortrinsvis mellem 0,5 g/1 30 og 4 g/1; det mest foretrukne område er mellem 2 og 4 g/1.

I tilfælde hvor de lavere alkansyrer (fx isosmør-syre eller 2-metylsmørsyre) eller salte deraf sættes direkte til gæringsmediet, ligger den selektivt effektive 35 mængde i almindelighed mellem 0,1 g/1 og 2,5 g/1/ hvorved området mellem 0,3 g/1 og 1,5 g/1 foretrækkes.

9

DK 165375B

Koncentrationer som er højere end de ovenfor angivne kan stadig være effektive til at forøge den relative procentandel af en af faktorerne af A 40926, men i almindelighed går totaludbyttet ned på grund af toxiske 5 virkninger på kulturen.

Eksempel 1

En kultur af Actinomadura sp. ATCC 39727 på en agar-skrå plade bruges til podning af en 500 ml stor Er-lenmeyer-kolbe indeholdende 100 ml af følgende medium: Kødekstrakt 5 g

Autolyseret gær 5 g ^Pepton 5 g

Hydrolyseret kasein 3 g

Glukose 20 g

NaCl 1,5 g

CaC03 4 2Q Destilleret vand indtil 1000 ml

Kolben inkuberes ved 28°C på en roterende ryster ved 200 opm i ca. 72 timer hvorpå myceliet opsamles ved centrifugering, vaskes to gange med sterilt deioniseret 25 vand og suspenderes i 100 ml sterilt deioniseret vand.

2 ml af denne suspension bruges til podning af en 500 ml stor Erlenmeyer-kolbe indeholdende 100 ml af ovennævnte medium, hvorpå den valgte prækursor tilsættes. Antibiotikumproduktionen overvåges ved papirskive-agar-3Q diffusionsmetoden under anvendelse af Bacillus subtilis på et minimalt medium som testorganisme.

Efter 72 timers dyrkning på en roterende ryster ved 200 opm fjernes gæringskagen ved filtrering og fil-tratet føres gennem en "Sepharose'^-Epsilon-aminokapro-35 yl-D-alanyl-D-alaninkolonne (0,5 ml harpiks/0,3 ml suppe) og elueres med 1%s v/r (vægt/rumfang, dvs. forholdet mellem enheder af fast stof og væske som mellem gram og

DK 165375B

ίο ml) ammoniakvand. De fraktioner som indeholder antibiotikum A 40926 forenes og henstår én dag ved stuetemperatur, hvorpå de analyseres ved HPLC i henhold til følgende fremgangsmåde: 5 kolonne: silaniseret silicagel "Ultrasphere" ODS (5 pm) "Altex"® ("Beckman'®) 4,6 mm (indvendig diameter) x 250 mm for-kolonne: silaniseret silicagel "Brownlee Labs" 10 RP 18 (5 μιη) elueringsmiddel A: CH^CN 10%O reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%i til pH 6,0 elueringsmiddel B: CH^CN 70%o reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%^ til pH 6,0 15 eluering: lineær gradient fra 5% til 60% eluerings middel B i elueringsmiddel A, i 40 minutter strømningshastighed: 1,8 ml/min.

U.V.-detektor: 254 nm intern standard: Teicoplanin A2 komponent 2, 20 Rt = 20,3 min. (Gruppo Lepetit S.p.A.) relative retentionstider: A 40926 faktor A 1,12 A 40926 faktor Bg 1,22 A 40926 faktor B^ 1,27 A 40926 faktor PA 1,15 25 A 40926 faktor PB 1,27 ?£2S§Styis_fordelin2

Komponenterne adskilles ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde og den relative fordeling findes som 30 en procentdel af det samlede areal af de to toppe ved arealprocentmetoden. Resultaterne for repræsentative forsøg fremgår af nedenstående tabel.

DK 165375B

1 1

Tilsat præ- Samlet Faktor A Faktor Bq kursor, nM koncen- %-%- tration, Faktor A+Faktor Bq Faktor A+Faktor Bq 5 rø/ml

Ingen (-) 24-60 22-36 78-64 L-valin 10 8 24 5 95 L-isoleucin 8 13 59 41

Isobutanol 5 30-57 3-18 97-81 15 n-Propanol 5 34 51 48 2-Metyl-1-butanol 5 34 47 53 20 Ved i det væsentlige at følge den ovenfor be skrevne fremgangsmåde, men ved hurtigt at neutralisere de ammoniakalske eluater i stedet for at lade dem stå i 24 timer, vindes antibiotikum A 40926 faktor PA og/ eller PB i stedet for henholdsvis faktor A og faktor 25 Bq.

De procentvise mængder og resultaterne er i det væsentlige som angivet ovenfor med hensyn til faktorerne A og Bq.

Claims (16)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et antibiotikum A 40926-kompleks beriget med hensyn til dets faktorer A og/eller Bq, eller PA og/eller PB, kendetegnet ved at man under dyrkning af en kultur af Actinomadura 5 sp. ATCC 39727 eller en mutant deraf med væsentligt samme egenskaber, fortrinsvis Actinomadura sp. ACET 39727, i et gæringsmedie, sætter en selektivt effektiv mængde af en fornøden prækursor hvor den fornødne prækursor til forøgelse af en forholdsmæssig andel af 10 faktor A eller PA i antibiotikum A 40926-kompleks er udvalgt blandt n-propanol og estere deraf som er ugiftige for den producerende mikroorganisme, propionsyre, salte deraf med baser som er ugiftige for den producerende mikroorganisme, estere deraf med lavere mono- el-15 ler polyhydroxyalkanoler, isoleucin, fortrinsvis i L-formen, salte deraf med syrer og baser som er ugiftige for den producerende mikroorganisme, a-keto-Ø-metylva-rianesyre, salte deraf med baser som er ugiftige for den producerende mikroorganisme, estere deraf med lave-20 re mono- og polyhydroxyalkanoler, 2-metylsmørsyre, salte deraf med baser som er ugiftige for den producerende mikroorganisme, estere deraf lavere mono- og'polyhydroxyalkanoler, 2-metylbutanol og estere deraf med syrer som er ugiftige for den producerende mikroorganisme, mens·.· 25 den fornødne prækursor til forøgelse af andelen af faktor Bq eller PB i antibiotikum A 40926-kompleks er udvalgt blandt valin, fortrinsvis i L-form, salte deraf med syrer og baser som er ugiftige for den producerende mikroorganisme, α-keto-isovalerianesyre, salte deraf med 30 baser som er ugiftige for den producerende mikroorganisme, estere deraf med lavere mono- og polyhydroxyalkanoler, isosmørsyre, salte deraf med baser som er ugiftige for den producerende mikroorganisme, estere deraf med lavere mono- og polyhydroxyalkanoler og isobutanol DK 165375B og estere deraf med syrer som er ugiftigé for den producerende mikroorganisme.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at den tilsatte prækursor er valinf fortrins-5 vis i L-formen, eller et eller flere salte deraf med syrer og/eller baser som er ugiftige for den producerende mikroorganisme, hvorved den selektivt effektive mængde er mellem 0,2 g/1 og 5 g/1, fortrinsvis mellem 0,5 g/1 og 4 g/1.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved at der som prækursor tilsættes isosmørsyre eller et eller flere salte deraf med baser som er ugiftige for mikroorganismen, hvorved den selektivt effektive mængde er mellem 0,1 g/1 og 2,5 g/1, fortrinsvis 15 mellem 0,3 g/1 og 1,5 g/1.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at der som prækursor tilsættes en ester af isosmørsyre med en lavere mono- eller polyhydroxyalka-nol, hvorved den selektivt effektive mængde er mellem 20 0,1 g/1 og 5 g/1, fortrinsvis mellem 0,1 g/1 og 1 g/1.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at der som prækursor tilsættes isobutanol eller et eller flere estere deraf med syrer som er ugiftige for mikroorganismen, hvorved den selektivt effek- 25 tive mængde er mellem 0,5 g/1 og 5 g/1, fortrinsvis mellem 1 g/1 og 2 g/1.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at der som prækursor tilsættes isoleucin, fortrinsvis i L-form, eller et eller flere salte deraf 30 med syrer, fortrinsvis hydroklorid eller sulfat og/eller baser som er ugiftige for mikroorganismen, hvorved en selektivt effektiv mængde er mellem 0,2 g/1 og 5 g/1, fortrinsvis mellem 0,5 g/1 og 4 g/1.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at der som prækursor tilsættes 2-metylsmør- 35 syre eller et eller flere salte deraf med baser som er ugiftige for mikroorganismen, hvorved den selektivt effektive mængde er mellem 0,1 g/1 og 2,5 g/1, fortrins- DK 165375 B vis mellem 0,3 g/1 og 1,5 g/1.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at der som prækursor tilsættes en ester af 2-metylsmørsyre med en lavere mono- eller polyhydroxy- 5 alkanol, hvorved den selektivt effektive mængde er mellem 0,1 g/1 og 5 g/1, fortrinsvis mellem 0,1 g/1 og 1 g/1.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at der som prækursor tilsættes 2-metylbuta- 10 nol, n-propanol eller en eller flere estere deraf med syrer som er ugiftige for mikroorganismen, hvorved den selektivt effektive mængde er mellem 0,5 g/1 og 5 g/1, fortrinsvis mellem 1 g/1 og 2 g/1.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendete g-15 net ved at der som prækursor tilsættes a-keto-|3-me- tylvalerianesyre eller et eller flere salte deraf med baser som er ugiftige for mikroorganismen og/eller en eller flere estere deraf med lavere mono- eller polyhydro-xyalkanoler, hvorved den selektivt effektive mængde er 20 mellem 0,2 g/1 og 5 g/1, fortrinsvis mellem 2 g/1 og 4 g/1.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 2, 3, 6, 7 eller 10, kendetegnet ved at salte med baser som er u-giftige for mikroorganismen er natriumsalte eller am- 25 moniumsalte.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 4, 8 eller 10, k e n-detegnet ved at esteren er en ester med en af følgende alkanoler: metanol, ætanol, propanol, ætylen-glykol og glycerol.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 2 eller 6, ken detegnet ved at saltet med en syre som er ugiftig for mikroorganismen er et hydroklorid eller et sulfat.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 5 eller 9, k e n-35 detegnet ved at esteren med en syre som er u- giftig for mikroorganismen er en ester med en af følgende syrer: eddikesyre, propionsyre og smørsyre. DK 165375B

15. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved at gæringen udføres ved en temperatur mellem 25°C og 35°C, fortrinsvis mellem 27°C og 33°C.

16. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved at tilsætning af den eller de valgte prækursorer udføres i forkulturen, ved begyndelsen af gæringen eller 24-48 timer efter at gæringen er gået i gang. 4