JPS6377892A - 抗性物質ａ／４０９２６複合体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗生物質Ａ　４０９２６はアクチノマデユラ（ΔＣｔｉ
ｎｏｍａｄｕｒｕ）、即ら、アクチ／マデュラーエスビ
−Ａ′ｒＣＣ３９７２７の培５ｉｌｌ！物カｌｌｓ、９
．されたグリコベプチド系抗生物質である。このものは
複合体であり、その因子は因子Ａ、因子−１３、囚１’
−１１、、因子ＰＡ及び因子Ｐ［−３と命名されている
。これはヨーロッパ特許出願（ＩＥＰ−Δ）第１７７８
１１２号に記載されている。

この抗生’［［びにその単一因子はＤ−７ラニルーＤ−
アラニン末端オリゴペプチドに結合し、主にグラム陽性
バクテリア及びナイセリア［（Ｎｅｉ！１ｓｃｒｉａｅ
）に対して活性である。

本発明は、所望の抗生物質因子の適当な１宵駆物質を抗
生物質Ａ４０９２６産生培養物に発酵中に加えることか
らなる、抗生物ｆｌ　Ａ　４０９２６の因、７−　Ａ及
び／または１３．の生成を選択的に商めてこれらの１１
ｔ−成分を良好なｊ反牢で単離するか、または詠複合体
を上記成分の１種もしくは双方に富まきる方法に関する
。

本発明の方法に従えば、例えば工業的大規模発酵におい
て、抗生物質Ａ４０９２Ｇ複合体の単一・の大部分の成
分の比を実際に調節することが可能である。従って、本
方法は標準仕様を固守するために最終生成物の組成を調
節する有用な手段を表をンす。

更に、本発明の方法に従えば、産生菌株の発酵塊から直
接、抗生物質Ａ４０９２６因子ＡまたはＢｏに極めて富
んだ粗製の生成物を得ることができ、次にこのものを高
収率及び短期間」二枚で純粋な状態において単離するこ
とができる。

更に本発明の目的はＡ４０９２６因子１）　Ａ及び／ま
たはＰＢの生成を１１〕Ｊめる方法である。ヨーロッパ
特許出Ｍ（ＥＰ−Ａ）第１７７８８２号により、これら
の２１ｆｌＬの因子はそれぞれ抗生物質Δ４０５３２６
因子Ａ及びＢｏの天然の［前駆物質１であることが既知
である。従って、限定されｒ：、塩基性条件にさらして
抗生物質を回収することにより、因子Ａ及Ｖ／またはＢ
。の代りに因子ＰＡ及Ｖ／またはＰＢに富んだ複合体が
得られる。更に特定的には、抗生物質Ａ４０９２６囚子
ＰＡの生成を高める適当な前駆物質は抗生物質Δ４０９
２６囚子Ａに対するものと同一であり、そして因子１）
　Ｂに対する適当な前駆物質は抗生物質Ａ４０９２６因
子Ｂ０に対するものと同一である。

抗生物質Ａ　４０９２　Ｇ複合体における因子Ｉ３゜の
比を増加させるだめの適当な前駆物質はバリン、産生微
生物に無毒性である酸及び塩基とのその塩、α−ケト−
イソ吉蔗酸、産生微生物に無毒性である塩基とのその塩
、モノ−及びポリヒドロキシ低級アルカノールとのその
ニスデル、イソ酪ＩＷ、産生微生物に無毒性である塩ノ
１（どのその塩、モノ−及びポリヒドロキシ低級アルカ
７−ルとのそのエステル、イソブタノール及び産生微生
物に無毒性である酸とのそのエステルから選ばれる。

抗生物質Ａ４０９２６複合体における因子Ａの比を増加
させるための適当な前駆物質はｎ−プロパノール及Ｖｆ
Ｒ生微生物に対してｊｊｌｌｊ５性であるそのエステル
、プロピオン酸、産生微生物に対して無毒性である塩基
とのその塩、モノ−またはポリヒドロキシ低級アルカノ
ールとのそのエステル、イソロイシン、産生微生物に対
して無＋ｊＪ性である酸及び塩基とのその塩、α−ケト
−βメチル吉’；ＬＩ’１２、産生微生物に対して無毒
性である塩基とのその塩、モノ−及びポリヒドロキシ低
級アルカノールとのそのエステル、２−メチル酪酸、産
生微生物に対して無毒性である塩基とのその塩、モノ−
及びポリヒドロキシｆ氏級アルカノールとのそのエステ
ル、２−メチルブタノール及び産生微生物に対して無防
性である酸とのそのエステル、並Ｖに発酵条件下でプロ
ピオニル−補酵素Δに変換され得る他の物質から選ばれ
る。

微生物に対して無毒性である塩基との塩は、与えたカチ
オンのタイプ及び濃度が、発酵塊に用いた濃度で顕著な
程度に微生物培養物の増殖または所望の抗生物質の産生
をそこなわぬような塩て゛ある。該カチオンの例はアル
カリ土類金属及びアルカリ土類金属、例えばナトリウム
、カリウム、カルシウムまたはマグネシウムによるカチ
オン、−４１フブ（こアミン、例えばアンモニウム、ｍ
−１第二または第）：、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルアンモ
ニウム及びヒドロキシ（ＣＩ＝Ｃ，）７ルキルアンモニ オンである。好ましい塩はナトリウム、カリウムまたは
アンモニウムイオンによる塩である。

産生微生物に対してｊ；（（毒性である酸による塩、即
ち、発酵塊中に存在する濃度で、微生物培養物の増殖ま
たは所望の抗生物質の産生を顕者にそこなわぬ酸による
塩の例は好ましくはに酸、例えば塩酸であり、ある場合
には、また有弐酸が存在していてもよい。

モノー及Ｖポリヒドロキシ低級アルカノールとの上に定
義した如き適当な前駆物質のエステルは１号子当り１．
２．３．４．５または６個のヒＶロキシ官能基を６つ（
Ｃ，〜Ｃ６）アルカノールとのエステルである。（Ｃ２
〜Ｃ４）アルカノールを用いる場合、双方の因子の相件
う増加を望よ一部ならば、該アルコールは他の抗生物質
因子（μＩＩち、インブタ／−ルまたはイン７ミルアル
コール）に対する前駆物質として作用するものとは異な
らなけ昨ばならない。

ポリヒドロキシフルカ／−ルの好ましい例はグリセリン
及乙′フ゛ロビレングリフールである。

本明細書において、低級アルカノールが異なるエナンチ
オマー及びエピマー型で存在し得る場合、別個の各ｔ…
−型並びにあらゆる割合における該Ｑ）−型の混合物を
意ズする。

微生物に対して無毒性であるーＩ−に定義した如き適当
なヒドロキシ含有前駆物質のエステルは（Ｃ２〜Ｃ２、
）アルカノイルエステルであり、その際に、発＃媒質中
のフルカッイル部分のタイプ及び濃度は微生物培養液の
増殖または所望の抗生物質の生成を顕著な程度にそこな
わぬようなものである。

一般に、直鎖状（Ｃ７・−〇、）アルカノールが好まし
い。

抗生物！ｔＡ４０９２６産生培養物は、培養した際に抗
生物１Ａ４０９２６の回収可能な、耽を生成し得る７ク
チノマデユラ・エスピーＡ　ＴＣＣ３９７２７様の菌株
或いはその突然変異体または変種の培養物である。

本発明の方法には、一般にストレブトミセタ１／ス（Ｓ
　ＬｒｅｐＬｏ＋ａｙｃｅＬａｌｅｓ）の培養に月して
、そして殊にＡ　４０９２４”＋産生工＆支物に公知の
ｆ’ｆ　、ＩＬＱの条件下で（上記引用のヨーロッパ特
許出項第１７７８２号参照）、同化可能な炭素源、同化
可能な窒素源、及び無機塩を含有する栄養培養媒質中で
抗生物質Ａ４０９２６）ｉ生培養物で培養し、そして抗
生物質Ａ　４０９２　Ｇ因子Ａ及び／主たは因子１）。

の産生を選択的に高めるために適′ｔな前駆物質の有効
量を加えることが？￥まれる。

適当な前駆物質を発酵中に発酵液に連続的または回分式
に加えるか、或いは発酵１１ηに培養媒質に加えること
ができる。該前駆物質を、発酵【温度で適当な液体であ
る場合、直接加えることができるか、或いは溶液、懸濁
液または乳液として加えることができ、そして好ましく
は懸濁液の水溶液である。

適当な前駆物質の１有効犠１とは、発酵液に加えた場合
、産生微生物の増殖培養物に毒性効果をもたらすことな
く、抗生ｇ！Ｊ質ＡＩ、　０９２６の特定の因子の選択
的増加を６たらすために十分な選択的前駆物質の濃度を
与えるＪ−に定義した如き前駆物質の邪二を意味する。

前駆物質の添加摺合は、発酵に毒性作用を与えることな
く、′Ｊ！を著なまたは最適な程度に所望の因子の収率
を高めるために十分に大きくなけｔしばならない。

一般に、発酵の開始時、または生成段階中に適当な前駆
物質の有効量を連続的または一部づつ供給することが有
利である。

ある場合には、培養において最少の１ガ性、１作Ｊｆｌ
−二よって最大の結果を得るために、ある因子の前駆物
質の一部または全ての混合物を供給する、二とが有利で
ある。

発酵に続いて、必要に応じて、抗生物質Ａ４０９２（）
複合体或いはｑｔ−因子Ａまたは１３゜、Ｐ　Ａまたは
ＰＢを公知の方法またはその明白な変法ｌ二従って回収
することができる。

本発明のｌｊ法に使用し得るＡ４０９２６Ｍ・生菌株の
発酵に適する栄養発酵媒質は通常次のものを含有する：
例えば糖（例えばグルコース、スクロース、マルトース
）、多糖類（例えば、殿粉、デＡストラン）、ポリアル
コール（例えばグリセリン、プロピレングリコール）か
ら選ぶことができる？Ｌ当な炭＾源：例えばアンモニウ
ム塩、アスパラギン、落花生粉、大Ｖ粉、肉エキス、ト
リゾ）ン、酵は氷解物、酵母エキス及びトウモロコシ処
理液から選ばれる適当な室索源；４１；びに無機塩。培
葺媒質に混合し得る無機塩の中には、ナトリウム、カリ
ウム、鉄、亜鉛、コバルト、マグネシウム、カルシ１ン
ム、アンモニウム、クロライド、カルボ、本−ト、スル
フェート、ホスフェート、ナイトレート等のイオンを与
え得る一？Ｈ＋りの６ｆ溶性塩がある。

通常、抗生物質−産生菌株を振盪フラスコ中で前培養し
、次にこの培養物を用いて、抗生物質の実質的な量を生
成するためのジャー発酵器に接種する。前培養に用いる
媒質は多量の発酵に用いるものと同一であることができ
るが、しかし、また他の媒質を用いることもできる。

発酵は２５°Ｃ乃至３５℃間、好ましくは２７℃乃１ｊ
　：（３℃間の１ＨＡ度て゛水中に沈めた好気作条ｆ１
−ドで５０〜１５０時間の範囲で行われる。、適当な前
駆物質の３８択的有効電を産生菌株の接抑萌に発酵媒質
に添加するか、または発酵開始後、２４〜４８時間目に
添加することができる。添加を１回に、また１を数回に
分けて、或いは連続的に行・）ことができる。

本発明を具体化する典型的な実験によれば、オートミー
ル寒天斜面に保持されたＡ　４０９２　Ｇ産生菌株の培
養物を植物性媒質１００ｚＺを含むフラスコ中に接種す
る。約７２時ｌｆｆ１後、培養物の試料（５１１１）を
用いて、発酵媒質１００ｄを含む一連の発酵用フラスコ
に接種し、これに？＋１ｗＡ物質の選択的有効量を適当
に加える。Ａ４０９２６複合体の２種の因子の相伴う増
加を望む場合には、同一発酵フラスコに２ＭＩの適当な
前駆物質を加える。発酵を更に６０〜１５０時間続け、
発酵を時々１１））Ｌ　Ｃによって監視し、次に発酵ケ
ーキを除去し、汁試料を１１　Ｆ’　Ｌ　Ｃによって分
析する。

抗生物質の回収は当社分野において公知の方法及びヨー
ロッパ特許出項第１７７８８２号に記載された方法によ
って行うことができる。

１次医薬として適用するためには、全体の発酵ケーキま
たは濃縮した汁を用いることができる。

発酵液に前！に物質の添加は、該物質がその萌もって決
められたｐＨ値範囲に顕著に影＋、ｑを及ぼさぬように
して什われる。かくして、例えばＮ　Ｍ　Ｆ’１前駆Ｉ
＃Ｊ質を媒質に：α接加える場合、媒質を緩衝するか、
または微生物に対して無毒性の塩基で直ちに中和するこ
とによって、　！−１値を調節下で保持する。

加える前駆物質がアミノ酸である場合、このものを産生
微／Ｌ物に対して無？Ｉｊ性である酸または塩基とのそ
の塩、例えばｊ５人酸塩及びすトリウム塩の水溶液とし
て発酵液に供給することができ、多くの例があるにして
も、アミ７醇を１分子内塩−１の溶液として有利に加え
ることができる。１１１ｊ駆物質として、２セミ混合物
及び光学的活性異性体の双方を用いることができる。

しかしながら、−殻にＬ−型の添加により、対応するＤ
−型よＩ）も高い収率が得られる。

従って、本発明の方法の好ましい具体例は、抗生物質Ａ
４０９２６複介体の因子Ｂ。またはＰＩ３（Ｌ、−バリ
ン、その塩またはエステル）及び／または因子Ａまたは
Ｉ）　Ｂ　（Ｌ、−イソロイシン、その塩またはエステ
ル）の濃度を高めるために、アミノ酸前駆物質のｌ−５
−望の使用を表わす。この好ましい具体例によれば、ま
た腹合体の８０％以」：に、発酵生成物における因子Ａ
またはＢｏの６分）！（を増加させることができる。

低級アルカン酸萌駆物貿（２−メチル酪酸、イン酪酸、
ａ−ケトーイソ占草酸及びα−ケト−β−メナル吉ｒ：
Ｌ酸）を用いて、添期Ｉを無毒性の塩基によるその塩の
水溶液として行うことができる；通常、アンモニウム及
びナトリウム塩が好ましい。

モノヒドロキシ低級アルカノールによる上記低級アルカ
ン酸及び不飽和＋１ｆｆ肋酸のエステルを前駆物質とし
て用いる場合、該エステルは通常／り７−ル、エタノー
ル及びプロパツールから３導されるが、またＣ１〜Ｃ６
アルカ７−ルによるエステルを用いることもできるにの
場合、１１机の因子の相イ°１°う増加を望まぬならば
、Ｃ１〜〈バノルカノールは他の因子に対して＋ｔｉＴ
駆物質と（７て作）月り、　４！ｉ−るｌ。

のとは異ならなければならない（イソブタノール、２−
メチルブタ７−ルまたはプロパノール）。

アルカノールｎｉｆ　？ｌ物質、例ズーばイソブタノー
ル、２−メチルブタ７−ル及びｎ−プロパ７−ルを通常
発酵液にそのまま加える。しかしながら、また、−れら
のものを微生物に幻して無毒性である酸のエステルとし
て供給することもできる。これらの酸は、他の因子の相
伴う増加を望まぬならば、肋のＡ４０９２Ｇ因子に対す
る前駆物質として作用し得るものとは異ならなければな
らない。通常、直鎖状（Ｃ２〜Ｃ１）アルカン酸、例え
ば酢酸、プロピオン酸及び酪酸によるエステルが好まし
い。

本発明による発Ｍ媒賀に加える］選択的有効量−１はｊ
ｌ「駆動室のタイプに依存する。通常、低級アルカン酸
（イソ酪酸、２−メチル酪酸）によっては、発酵媒質中
に酸の濃度０．１ｇ／Ｖ乃至５．／ｌ開のｍ　Ｉ用ヲ与
エフ１　ｆｉｔ　ヲ用’ｔ’、０　、１　ｇｌ　ｌ乃至
１　ｇｌ　＆／ｌｌｌの範囲が好ましい。低級アルカノ
ール（イソブタノール、２−メチルブタノール、ロープ
ロバノール）または微生物に対して無毒性である酸によ
るそのエステルによって、通常０．５ｇ／ｌ乃至５ｇ／
ｌ間のアルコール濃度範囲を与える量を用い、１ｇ／ｌ
乃至２ｇ／ｌ間の範囲が好ましい。

アミノ酸（バリン、インロイシン）及びケト−酸（α−
ケト−イソ吉草酸、α−ケト−β−メチル吉Ｊｙｉ￥２
）または酸及び塩基とのその塩によっては、通常、発Ｍ
Ｗ質に加える「選択的有効量」は０．２１？／ｌ乃至５
ｇ／ｌ間、好ましくは０．５ｇ／ｌ乃至４ｇ１１間の範
囲であり；最も好ましくは２乃至４ｇ／ｌ間の範囲であ
る。

低級アルカン酸（例えばイソ酪酸、２−メチル酪酸）、
またはその塩を発酵媒質に直接加える場合、１選択的有
効量」は通常、０．１ｇ／ｌ’乃至２，５．／／ｌ間の
範囲であり、０，３．／Ｎ乃至１．５ｇ／ｌ間の範囲が
好ましい。

上に示したよりも高い濃度がＡ４０９２Ｇ因子の１つの
相対的百分率を高める際に有効であるが、しかし、一般
に全体の収率は培養液におけろ毒性作用のために抑制さ
れる。

実施例１ 次の媒質１００ｚｆを含む容量５００ｚＺのエルレンマ
イヤーフラスコに接種するために、寒天斜面上の７クチ
ノマデユラ・エスピーＡＴＣＣ３９７２７の培養物を用
い： 肉エキス　　　　　　　　　　　　５Ｒ自己融解した酵
母　　　　　　　　５ｇペプトン　　　　　　　　　　
　　５ｇ加水分解したカゼイン　　　　　　５「グルコ
ース　　　　　　　　　　　２０Ｉ（ＮｒｓＣ（１１，
５１？ Ｃａ　ＣＯ＊　　　　　　　　　　　　　　４　ｇ蒸留
水、１０００ｚｊ！にするために　十分な量回転振速成
にて２００　ｒｐｍでフラスコを２８°Ｃで約７２時間
培養し、次に菌糸体を遠心分離によって捕集し、無菌の
脱イオン水で２回洗浄し、無菌の脱イオン水１００ｚｆ
ｆｉに懸濁させた。この懸濁９２ｘｌを用いて、上記の
媒質１００＋ｆを含む容量ｌＩのエルレンマイヤーフラ
スコに接種し、ｊＡ当な前駆物質を加えた。抗生物質生
成を、試験細菌として最少媒１ｅＩ上の枯路菌（Ｂ、５
ｕｔｒｔｉ／ｌｓ：）を；［ｊいて、ペーパーディスク
寒天拡散法によって監視した。

回転振速成にて２００　ｒｐｍで７２時間の培′！！後
、発酵ケーキを濾別し、１ｆｆ（ｉをセファロース−イ
プシロン−アミ７カブロイルーＤ−アラニル−［）−ア
ラニン（Ｓ　ｅｐｂａｒｏｓｅ−１：Ｊｐｓｉ　ｌｏ＋
＋−ａｍｉｎｏｃｕｐｒｏｙｌ　−Ｄ　−Ａ　１ａｎｙ
ｌ　−Ｄ　−Ａ　Ｉａｎｉｎｅ）カラムニ通しく汁３　
ｘｉ　当Ｑ　樹／ｌｔ？Ｏ，Ｓ１）、１％（ｕＩ／ｖ）
アンモニア水和物で溶離した。抗生物′！！ＩＡ　４０
９２６わ含む７ラクシヨンをプールし、室温で１目放置
し、次の方法に従って１−Ｉ　Ｐ　Ｊ、　Ｃによって分
析した：カラム：シラン処理したシリカゲル・ウルトラ
スフェア（Ｕ　Ｉｔｒａｓｐｈｅｒｅ）ＯＤ　Ｓ　（５
ｆｉ　＋ｏ）アルテックス（Ａｌｔｅｘ）Ｌベックマン
（ｔ３　ｃｃｋＩＩＩａｎ　）　１４　、６　ｍｍ（内
径）９　Ｘ　’ｌ　ｂ　０ｍｍプレーカラム：シラン処
理したシリカゾル・ブラウンリー・ラボラトリーズ（１
３ｒｏｗｎｌｒ、ｅｌ、ｎｔｒｓ）ＲＰ　１８（５Ｊｉ
ｍ） 調節した 溶離：溶離剤人中の溶離剤Ｂの５％から６０％までの直
線グラジェント、４０分間 流速：１．８ＩＩＬ１／分 ＵＶ検出器：２５４ｒ＋ｍ 内部基帛：テイコプラニンＡ、成分２、Ｒｔ＝２０．３
　　分（Ｇｒｕｐｐｏ　　　ＬｅｐｅｔｉｔＳ、Ｐ、Ａ
、） 相対保持時間１八４０９２　Ｇ因子Ａ　　１．１２Ａ　
４０９２６因子＋３ｏ１．２２ Ａ　　４　０　９　２　６　　因子−）３，１．２　　
°ンＡ４０９２６因子ＰＡｉ、１５ Ａ　４０９２６因）ＰＩ３１，２°７ ６分率分布 成分を上記方法によって分触し、その相対分布を、面積
百分率法によって、２本のピークの合計の％として得た
。代表的な実験結果を以下に示す。

本質的に上記の方法に従い、但し、２４時間放１ｒｔす
る代りに、アンモニア性溶胤液を運やかに中和すること
により、それぞれ因子Ａ及び因子Ｂ１゜の代りに抗ｔＰ
、物質Ａ　４０９２　ｆｉ因子Ｐ　Ａ及び／またはＰ　
Ｂが得られた。

百分率及び結果は実質的に」１記の因子Ａ及ＩＢ、に討
して示した如きものであった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アクチノマデュラ・エスピー（Ａｃｔｉｎｏｍａｄ
   ｕｒａ　ｓｐ．）ＡＴＣＣ３９７２７または抗生物質Ａ
   ４０９２６を産生するその突然変異体の培養物に適当な
   前駆物質の選択的有効量を加えることからなり、その際
   に、抗生物質Ａ／４０９２６複合体における因子Ａまた
   はＰＡの比を増加させるための適当な前駆物質がｎ−プ
   ロパノール及び該産生微生物に対して無毒性であるその
   エステル、プロピオン酸、該産生微生物に対して無毒性
   である塩基とのその塩、モノ−またはポリヒドロキシ低
   級アルカノールとのそのエステル、イソロイシン、該産
   生微生物に対して無毒性である酸及び塩基とのその塩、
   α−ケト−β−メチル吉草酸、該産生微生物に対して無
   毒性である塩基とのその塩、モノ−及びポリヒドロキシ
   低級アルカノールとのそのエステル、２−メチル酪酸、
   該産生微生物に対して無毒性である塩基とのその塩、モ
   ノ−及びポリヒドロキシ低級アルカノールとのそのエス
   テル、２−メチルブタノール及び該産生微生物に対して
   無毒性である酸とのそのエステル、並びに発酵条件下に
   プロピオニル−補酵素Ａに変換され得る他の物質から選
   ばれ、そして抗生物質Ａ４０９２６複合体における因子
   Ｂ＿０またはＰＢの比を増加させるための適当な前駆物
   質がバリン、該生産微生物に対して無毒性である酸及び
   塩基とのその塩、α−ケト−イソ吉草酸、該産生微生物
   に対して無毒性である塩基とのその塩、モノ−及びポリ
   ヒドロキシ低級アルカノールとのそのエステル、イソ酪
   酸、該産生微生物に対して無毒性である塩基とのその塩
   、モノ−及びポリヒドロキシ低級アルカノールとのその
   エステル、イソブタノール及び該産生微生物に対して無
   毒性である酸とのそのエステルから選ばれることを特徴
   とするその因子Ａ及び／またはＢ＿０、或いはＰＡ及び
   ／またはＰＢに富んだ抗生物質Ａ４０９２６複合体の製
   造方法。 ２、加える適当な前駆物質がバリンまたは微生物に対し
   て無毒性の酸及び塩基とのその塩であり、そしてそれぞ
   れの選択的有効量が０．２ｇ／ｌ乃至５ｇ／ｌ間、好ま
   しくは０．５ｇ／ｌ乃至４ｇ／ｌ間である特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ３、加える適当な前駆物質がイソ酪酸または微生物に対
   して無毒性の塩基とのその塩であり、そしてそれぞれの
   選択的有効量が０．１ｇ／ｌ乃至２．５ｇ／ｌ間、好ま
   しくは０．３ｇ／ｌ乃至１．５ｇ／ｌ間の範囲である特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、加える適当な前駆物質がイソ酪酸のモノ−またはポ
   リヒドロキシ低級アルカノールとのエステルであり、そ
   してそれぞれの選択的有効量が０．１ｇ／ｌ乃至５ｇ／
   ｌ間、好ましくは０．１ｇ／ｌ乃至１ｇ／ｌ間である特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、加える適当な前駆物質がイソブタノールまたは微生
   物に対して無毒性の酸とのそのエステルであり、そして
   それぞれの選択的有効量が０．５ｇ／ｌ乃至５ｇ／ｌ間
   、好ましくは１ｇ／ｌ乃至２ｇ／ｌ間である特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ６、加える適当な前駆物質がロイシンまたは微生物に対
   して無毒性の酸及び塩基とのその塩であり、そしてそれ
   ぞれの選択的有効量が０．２８ｇ／ｌ乃至５ｇ／ｌ間、
   好ましくは０．５ｇ／ｌ乃至４ｇ／ｌ間である特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ７、加える適当な前駆物質が２−メチル酪酸または微生
   物に対して無毒性の塩基とのその塩であり、そしてそれ
   ぞれの選択的有効量が０．１ｇ／ｌ乃至２．５ｇ／ｌ間
   、好ましくは０．３ｇ／ｌ乃至１．５ｇ／ｌ間である特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ８、加える適当な前駆物質が２−メチル酪酸のモノ−ま
   たはポリヒドロキシ低級アルカノールとのそのエステル
   であり、そしてそれぞれの選択的有効量が０．１ｇ／ｌ
   乃至５ｇ／ｌ間、好ましくは０．１ｇ／ｌ乃至１ｇ／ｌ
   間である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９、加える適当な前駆物質が２−メチルブタノール、ｎ
   −プロパノールまたは微生物に対して無毒性の酸とのそ
   のエステルであり、そしてそれぞれの選択的有効量が０
   ．５ｇ／ｌ乃至５ｇ／ｌ間、好ましくは１ｇ／ｌ乃至２
   ｇ／ｌ間である特許請求の範囲第１項３記載の方法。 １０、加える適当な前駆物質がα−ケト−β−メチル吉
   草酸または微生物に対して無毒性の塩基とのその塩、ま
   たはモノ−またはポリヒドロキシ低級アルカノールとの
   そのエステルであり、そしてそれぞれの選択的有効量が
   ０．２ｇ／ｌ乃至５ｇ／ｌ間、好ましくは２ｇ／ｌ乃至
   ４ｇ／ｌ間である特許請求の範囲第１項記載の方法。 １１、微生物に対して無毒性の塩基との塩がナトリウム
   塩またはアンモニウム塩である特許請求の範囲第１項、
   第２項、第３項、第６項、第７項、または第１０項記載
   の方法。 １２、エステルが次のアルカノール：メタノール、エタ
   ノール、プロパノール、エチレングリコール及びグリセ
   リンの１つとのエステルである特許請求の範囲第１項、
   第４項、第８項または第１０項記載の方法。 １３、アミノ酸がＬ−型である特許請求の範囲第１項、
   第２項または第６項記載の方法。 １４、微生物に対して無毒性の酸との塩が塩酸塩または
   硫酸塩である特許請求の範囲第１項、第２項または第６
   項記載の方法。 １５、微生物に対して無毒性の酸とのエステルが次の酸
   ：酢酸、プロピオン酸及び酪酸の１つとのエステルであ
   る特許請求の範囲第１項、第５項または第９項のいずれ
   かに記載の方法。 １６、菌株がアクチノマデュラ・エスピーＡＴＣＣ３９
   ７２７である上記特許請求の範囲のいずれかに記載の方
   法。 １７、発酵を２５℃乃至３５℃間、好ましくは２７℃乃
   至３３℃間の温度で行う上記特許請求の範囲のいずれか
   に記載の方法。 １８、適当な前駆物質の添加を前培養物中に、発酵開始
   時に、または発酵開始後２４〜４８時間に行う上記特許
   請求の範囲のいずれかに記載の方法。