JPH01202292A - ビアラホス生産菌のアラニル化能欠損変異株を用いるｌ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフイニル）−酪酸及びそのｎ−アセチル体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は除草剤として有用な含燐アミノ酸であるＬ−２
−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−酪
酸（Ｌ−ＡＭＰＢと略称されることもある）及びそのＮ
−アセチル体であるＮ−アセチル−Ｌ−ＡＭＰＢの製造
法に関する。

（従来の技術と解決しようとする課題）ストレプトミセ
ス・バイグロスコピカス５Ｆ−１２９３株（微工研条寄
ＢＰ−１３０号）によって生産されるＳＦ−１２９３物
質（特公昭５１−６３９号公報及び米国特許第４．３０
９．２０８号明細書参照）は、別名がビアラホスであり
、除草剤として有用であり、Ｌ−２−アミノ−４−（ヒ
ドロキシメチルホスフィニル）−ブチリル−Ｌ−アラニ
ル−アラニンと同定されている（例えば特開昭４８−８
５５３８号公報参照）。他方、Ｌ−２−アミノ−４−（
ヒドロキシメチルホスフィニル）−酪酸は、これも除草
活性を有する化合物であり、Ｌ−ＡＭＰＲと略称されて
除草剤として有用である（特公昭６１−５６２１０号公
報及び米国特許第４，２６５，８５４号明細書参照）。

Ｌ−八ＭＰＨの製造法としては、ストレプトミセス属に
属するＬ−ＡＭＰＢ生産菌を培養し、その培養液から直
接にＬ−ＡＭＰＢを採取する方法が本発明者らによって
報告されている（特開昭５７−４７４８５号公報参照）
が、ここでＬ−ＡＭＰＢ生産菌として具体的に使用され
るストレプトミセス・バイグロスコピカス５Ｆ−１２９
３株は、ビアラホス生産菌でもあるから、ビアラホスを
も培養液中に生産、蓄積させる。

更に、本発明者らの研究によると、ビアラホス生産菌に
よるビアラホス生合成の経路は次の通りであると認めら
れる。

経路（Ａ）ニー 糖、アミノ酸、燐の諸成分 ↓ Ｈる） ■ れる） ↓ ０　　　　　　　　　　　（Ｎ−アセチル１０１↓ （アラニル化、Ａｌａｎｙｌａｔｉｏｎ）↓ ↓ ｏ　　　　　　　　　　　　（Ｎ−アセチルビアＩ ビアラホスの生合成は、次の経路を経ることもある。

経路（Ｂ）；− Ｎ−アセチル１０１ ↓　　　　　　　　　　　（Ｌ−ＡＭＰＢ）ビアラホス しかしながら、上記の特開昭５７−４７４８５号公報に
開示されであるような、ビアラホス生産菌を用いてＬ−
八ＭＰＨを生産する方法では、ビアラホスを副成するた
めに、Ｌ−ＡＭＰＢの生産量を向上させることは困難で
あった。また、Ｌ−八ＭＰＢを精製する際にも、多量の
ビアラホスとの分離が必要であり工程が長くなり、製造
コストも高価にならざるをえなかった。

（課題を解決するための手段） そこで、ビアラホスを副成しないＬ−ＡＭＰＢ生産菌を
収得又は創製できれば、これを培養することによりＬ−
ＡＭＰＢを簡便に且つ高収率で製造、採取、精製できる
であろうことを本発明者らは着想した。

上記の問題点を解決するために、ビアラホス生産菌に変
異処理を施し、得られた各種の変異株の中から、ビアラ
ホスを生産せず、Ｌ−八ＭＰＢ、または、そのＮ−アセ
チル体であるＮ−アセチル−Ｌ−ＡＭＰＢを生産する特
殊な菌株の選別を試みた。Ｌ−ＡＭＰＨはビアラホスの
構成成分であるため、ビアラホスを生産せず、　Ｌ−Ａ
ＭＰＢ、またはＮ−アセチル−Ｌ−ＡＭＰＢを生産する
菌株を収得するためには多大の時間と労力を要したが、
ついに本発明者の目的に適なう菌株を収得し、本発明を
完成するに至った。

本発明者は、Ｌ−ＡＭＰＢの製造に使用されるビアラホ
ス生産菌変異株は、ビアラホスを生産しない（あるいは
、殆ど生産しない）変異株のうちで、前記のビアラホス
生合成経路図の中に示したアラニル化段階（ａｌａｎｙ
ｌａｔｉｏｎ　５ｔｅｐ）をコードする遺伝子が欠損し
た結果、アラニル化能が欠損している変異株であるのが
良いことを知見した。

従って、第１の本発明によると、ストレプトミセス属に
属するビアラホス生産菌の変異処理により得られた変異
株であって、アラニル化能の欠損によりビアラホス生産
能力が消失されたがし−２−アミノ−４−（ヒドロキシ
メチルホスフィニル）−酪酸及びＮ−アセチル−Ｌ−２
−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−酪
酸を生産する能力を保有する菌株を、培地中で好気的条
件下で培養することを特徴とする、Ｌ−２−アミノ−４
−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−酪酸及び（又は
）Ｎ−アセチル−Ｌ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメ
チルホスフィニル）−酪酸の製造法が提供される。

ビアラホス生産菌の変異処理によって本発明者らが収得
したアラニル化能を欠損したＬ−ＡＭＰＢ生産菌株の例
としては、ストレプトミセス・バイグロスコピカス５Ｆ
−１２９３ＮＰ−６１株、ＮＰ−１７株及びＮＰ−１８
株があるが、そのうちＮＰ−６１株は、ストレプトミセ
ス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈ
ｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ＳＦ−１２９３ＮＰ−６１
株（徹工研菌寄９８３３号）として昭和６３年１月以来
、微工研に寄託しである。

前記のストレプトミセス・バイグロスコピカス５Ｆ−１
２９３ＮＰ−６１株、同ＮＰ−１７株及び同ＮＰ−１８
株は、その菌学的性質が特公昭５１−６３９号公報に示
されるストレプトミセス・バイグロスコピカス５Ｆ−１
２９３株それ自体と同じであるがアラニル化能を欠損し
且つＳＦ−１２９３物質の生合成能を欠損している点で
遺伝形質が異なる。

第１の本発明の方法は、何等の生合成中間体を加えるこ
となく、デノボ（ｄｅ　ｎｏｖｏ）合成でＬ−ＡＭＰＢ
及びＮ−アセチル−Ｌ−ＡＭＰＢが生産及び蓄積される
事に特徴がある。

第１の本発明の方法では、アラニル化能を欠損されたＬ
−ＡＭＰＢ生産菌株を、通常の微生物が利用し得る栄養
物を含有する培地で培養する。栄養源としては、従来ス
トレプトミセス属の菌の培養に利用されている公知のも
のが使用できる。例えば炭素源として、グルコース、澱
粉、グリセリン、シュクロース、水あめ、糖蜜等を使用
しうる。また窒素源として、大豆粉、小麦胚芽、肉エキ
ス、ペプトン、乾燥酵母、コーンスチーブリカー、硫酸
アンモニウム、硝酸ナトリウム等を使用しつる。その他
必要に応じて炭酸カルシウム、食塩、塩化カリウム、燐
酸塩等の無機塩類を添加するほか、菌の発育を助け、Ｌ
−ＡＭＰＢ及び（又は）Ｎ−アセチル−し−ＡＭＰＢの
生産を促進する有機及び無機物を適当に添加することが
出来る。培養法としては、一般の抗生物質生産の方法と
同じく、液体培養法、特に深部培養法が最も適している
。培養は好気的条件下で行われ、培養に適当な温度は２
５−３５℃であるが、多くの場合、２８℃付近で培養す
る。本菌の生育は３日で最大に達するが、Ｌ−ＡＭＰＢ
の生産は振どう培養、タンク培養共に５−８日で最高に
達する。

本発明の方法においては、Ｌ−ＡＭＰＢ及びＮ−アセチ
ル−Ｌ−ＡＭＰＢは、Ｎ−アセチル１０１と同時に蓄積
されるので、この物質と共に分離し、これからの単離を
含めた精製が必要となる。また両者を別々に単離したい
場合には、それら相互の分離も必要となる０通常は、そ
の培養ろ液を使い、陽または陰イオン交換樹脂、薄層ク
ロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ダイ
ヤイオン）ＩＰ−２０等の多孔性樹脂によるクロマトグ
ラフィーを組み合わせることによりＬ−八ＭＰＢまたは
Ｎ−アセチル−Ｌ−ＡＭＰＢが採取できる。

し−ＡＭＰＢ及びＮ−アセチル−し−ＡＭＰＢは水溶性
の両性物質であるので、培養液からの抽出にあたっては
、アンバーライトＩＲ−１２０、ダウエックス５０Ｗ等
の陽イオン交換樹脂もしくはアンバーライトＩＲ＾−４
００、ＩＲ−４５、ＩＲ−４８等の陰イオン交換樹脂を
使用して吸着させ、これを、適当な酸、アルカリもしく
は塩溶液、を用いて溶出することが出来る。例えばＬ−
ＡＭＰＢの場合には、培養ろ液を陽イオン交換樹脂ダウ
エックス５０Ｗ（Ｈ型）の樹脂塔を通過させ、有効成分
を樹脂部に吸着させ、これをアンモニア水で溶出する方
法は有効な抽出手段である。このとき混在するＮ−アセ
チル−Ｌ−ＡＭＰＢは全く吸着されることなく溶出され
る。

このような方法で得られたＬ−ＡＭＰＢまたは（及び）
Ｎ−アセチル−Ｌ−ＡＭＰＢを含む粗粉末はダウエック
ス１×２樹脂又はセルロース、シリカゲル、アルミナ乃
至はセファデックスを使用するクロマトグラフィーにか
けると、Ｎ−アセチルＭＰ１０１と分離できる。また同
様の方法で相互の分離も出来る。このように分離された
し一へＭＰＢまたはＮ−アセチル−Ｌ−ＡＭＰＢは、更
にセファデックスＧ−１０、ダウエックス１×２樹脂を
用いるクロマトグラフィーにより、また非イオン性吸着
樹脂によるクロマトグラフィー、セルロース薄層クロマ
トグラフィー及び高速液体クロマトグラフィーを組み合
わせて単離、精製することができる。

第１の本発明の方法では、ビアラホスを副生するＬ−Ａ
ＭＰＢ生産菌を用いる場合に比べてＬ−ＡＭＰＢの生産
収量が向上され、また副生されたビアラホスの分離、除
去の手間が省略できるのでＬ−ＡＭＰＢの採取、精製が
容易になる利点がある。

更に、本発明者らは、上記のアラニル化能を欠損された
Ｌ−ＡＭＰＢ生産菌を培養するに当って、ビアラホス生
合成経路の生合生中間体であるα−ケトＭＰＩＯＩ　（
又は０ＰＢ）、ＭＰＩＯＩ及びＮ−アセチル１０１の１
種又は数種を培地に添加（フィード）して培養を実施す
ると、添加しない場合に比べて培地中のＬ−ＡＭＰＢ及
びＮ−アセチル−Ｌ−八ＭＰＢの生産量が増加でき且つ
高い収率で採取できることを知見した。

従って、第２の本発明によると、ストレプトミセス属に
属するビアラホス生産菌の変異処理により得られた変異
株であって、アラニル化能の欠損によりビアラホス生産
能力が消失されたがＬ−２−アミノ−４−（ヒドロキシ
メチルホスフィニル）−酪酸及びＮ−アセチル−Ｌ−２
−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−酪
酸を生産する能力を保有する菌株を、添加された４−（
ヒドロキシホスフィニル）−２−オキソ−酪酸、４−（
ヒドロキシホスフィニル）−２−アミノ−酪酸及び４−
（ヒドロキシホスフィニル）−２−アセチルアミノ−酪
酸のうちの少なくとも１つを含有する培地中で好気的条
件下で培養することを特徴とする、Ｌ−２−アミノ−４
−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−酪酸及び（又は
）Ｎ−アセチル−Ｌ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメ
チルホスフィニル）−酪酸の製造法が提供される。

第２の本発明の方法においても、使用されるし一＾ＭＰ
Ｂ生産菌の培養は第１の本発明の場合と全く同様に実施
できる。添加（フィード）すべきα−ケトＭＰＩＯＩ、
　ＭＰＩＯＩ、等のフィード量及びフィード時期は簡単
な試験により最適に決定できる。また、目的のＬ−ＡＭ
ＰＢ及びＮ−アセチル−し−ＡＭＰＢの採取及び精製も
、第１の本発明の場合と全く同様に実施できる。

第２の本発明の方法においては、第１の本発明の方法の
場合に比べてＬ−八ＭＰＢの収量を増大できる利点があ
る。

次に第１の本発明を下記の実施例１によって、また第２
の本発明を実施例２〜４によって具体的に説明する。

実施例１ （イ）ストレプトミセス・ハイグロスコピカス５Ｆ−１
２９３変異株、ＮＰ−６１株（微工研菌寄第９８３３号
）を澱粉２．０％、ペプトン１．０％、肉エキス０．３
％、燐酸２カリウム０．０５％、　ｐＨ７，０の液体培
地１５Ｌに接種し、２８℃で２４時間通気攪拌培養し、
これを種母とする。

グルコース３．０％、水あめ１．０％、小麦胚芽２．５
％、ソリューブル・ベジタブル・プロティン０．５％、
大豆油０．１％、酵母エキス０．１％、硫酸第一鉄０．
００１％、塩化ニッケル０．０００１％、塩化コバルト
０．０００１％、ｐＨ７，０の液体培地２００Ｌに前記
種母を接種し、２８℃で１４０時間通気攪拌培養した。

培養液をｐＨ３で濾過し、培養濾液１５０　Ｌを得る（
Ｌ−ＡＭＰＢ含有量２０ｍｃｇ／ｍＬ、Ｎ−アセチル−
Ｌ−ＡＭＰＢ含有量２００ｍｃｇ／ｍＬ）。培養濾液中
には、ビアラホスの蓄積が全く認められなかった。濾液
は活性炭を充填した塔（７，５Ｌ）を通過させ、引き続
き３０Ｌの水で洗浄する。通過液及び水洗液を合併しく
１８０Ｌ）、ダウエックス５０ＷＸ　２　（５０−１０
０メツシユ）（Ｈ型）９Ｌの樹脂塔にかけＬ−ＡＭＰＢ
を吸着する。Ｎ−アセチル−Ｌ−ＡＭＰＢとＮ−アセチ
ルＭＰＩＯＩは吸着せず、そのまま溶出される。樹脂塔
を水洗後、Ｌ−ＡＭＰＢを０．０５Ｎアンモニア水で溶
離する。Ｌ−ＡＭＰＢ画分（４５Ｌ）は、減圧濃縮する
ことにより淡黄色の粗粉末１ｏｏ　ｇ　（Ｌ−へＭＰＢ
含有量２ｇ）が得られる。またＮ−アセチル−Ｌ−ＡＭ
ＰＢとＮ−アセチルＭＰＩＯＩを含む両分（２００Ｌ）
は減圧濃縮せず、そのまま次の精製工程に移される。

（ロ）　Ｌ−ＡＭＰＢを含む粗粉末１００ｇを水３００
ｍＬに溶解し、ダウエックス１ｘ２（酢酸型）ＩＬを充
填したカラムに通過させて目的物質を吸着させ、３Ｌの
水でカラムを洗浄した０次いで０．５　Ｎ　ＨＣＩで溶
出するとＬ−ＡＭＰＢが溶出される。これを濃縮乾固し
Ｌ−ＡＭＰＢの白色粉末０．５ｇを得た。

（八）Ｎ−アセチル−Ｌ−ＡＭＰＢとＮ−アセチルＭＰ
１０１を含む画分２００Ｌをダウエックス１×２（酢酸
型）５Ｌを充填したカラムに通過させて目的物質を吸着
させ、２ＯＬの水でカラムを洗浄した０次いでＯ−０，
５Ｎ　ＨＣＩで溶出（ｓｔｅｐｗｉｓｅ）するとＮ−ア
セチルＬ−ＡＭＰＢ％Ｎ−アセチルＭＰＩＯＩの順で溶
出される。Ｎ−アセチルＬ−ＡＭＰＢ画分を濃縮乾固し
白色粉末２５ｇを得た。

夫ｉ■ユ、　　　ａ−ケト−ＭＰＩＯＩをフィードする
場合 培養方法は、α−ケト−ＭＰＩＯＩをフィードしたこと
以外は実施例１と同じである。フィード量は下記の第１
表に示す。フィード時期は実施例１、（イ）の場合で種
母を接種して通気培養を開始してから４８時間目に相当
する時期であった。第１表は、α−ケト−ＭＰＩＯＩを
フィード量とＬ−ＡＭＰＢ及びＮ−アセチル−し−へＭ
ＰＢ蓄積量との関係を示す。

第　　　　１　　　　表 因ＪＬ医３　　ＭＰＩＯＩをフィードする場合培養方法
は、ＭＰＩＯＩをフィードした事を除き実施例１と同じ
である。フィード量は第２表に示し、フィード時期は、
実施例２の場合と同様である。第２表は、ＭＰＩＯＩ　
フィード量とＬ−ＡＭＰＢ及びＮ−アセチル−Ｌ−ＡＭ
ＰＢ蓄積量との関係を示す。

第　　　２　　　表 実施例４　Ｎ−アセチル１０１をフィードする場合培養
方法は、Ｎ−アセチル１０１をフィードしたことを除き
実施例１と同じである。フィード量は第３表に示す、フ
ィード時期は、実施例２の場合と同じである。第３表は
、Ｎ−アセチル１０１フイード量とＬ−ＡＭＰＢ及びＮ
−アセチル−Ｌ−ＡＭＰＢ蓄積置との関係を示す。

第　　　　３　　　　表

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ストレプトミセス属に属するビアラホス生産菌の変
   異処理により得られた変異株であって、アラニル化能の
   欠損によりビアラホス生産能力が消失されたがＬ−２−
   アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−酪酸
   及びＮ−アセチル−Ｌ−２−アミノ−４−（ヒドロキシ
   メチルホスフイニル）−酪酸を生産する能力を保有する
   菌株を、培地中で好気的条件下で培養することを特徴と
   する、Ｌ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフ
   ィニル）−酪酸及び（又は）Ｎ−アセチル−Ｌ−２−ア
   ミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−酪酸の
   製造法。 ２、ストレプトミセス属に属するビアラホス生産菌の変
   異処理により得られた変異株であって、アラニル化能の
   欠損によりビアラホス生産能力が消失されたがＬ−２−
   アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−酪酸
   及びＮ−アセチル上−２−アミノ−４−（ヒドロキシメ
   チルホスフィニル）−酪酸を生産する能力を保有する菌
   株を、添加された４−（ヒドロキシホスフィニル）−２
   −オキソ−酪酸、４−（ヒドロキシホスフィニル）−２
   −アミノ−酪酸及び４−（ヒドロキシホスフィニル）−
   ２−アセチルアミノ−酪酸のうちの少なくとも１つを含
   有する培地中で好気的条件下で培養することを特徴とす
   る、Ｌ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフイ
   ニル）−酪酸及び（又は）Ｎ−アセチル−Ｌ−２−アミ
   ノ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−酪酸の製
   造法。