DK165702B - Varmeresistent adenylatkinase og fremgangsmaade til fremstilling heraf, samt stabilt, immobiliseret adenylatkinase-kombinationsprodukt og fremgangsmaade til fremstilling heraf - Google Patents

Description

DK 165702 B

•1

Opfindelsen angår en hidtil ukendt varmeresistent adenylatkinase og en fremgangsmåde til fremstilling heraf. Opfindelsen angår desuden et stabilt, immobili-seret adenylatkinase-kombinationsprodukt og en frem-5 gangsmåde til fremstilling heraf.

I den seneste tid er enzymer i udbredt grad blevet anvendt som industrielle katalysatorer på grund af deres substratspecificitet, reaktionsspecificitet og stereokemiske specificitet samt milde reaktionsbetingel-10 ser. Sådanne enzymatiske katalysatorer er imidlertid begrænset til hydrolaser, som ikke kræver nogen energikilde, såsom amylase, der hydrolyserer stivelse til saccha-rider, og L-aminosyreacylase, der omdanner N-acyl-L-ami-nosyrer til L-aminosyrer.

15 Biosynteser in vivo udføres ved hjælp af synte- tase, der hovedsageligt udnytter adenosin-5'-triphosphat (ATP) som energikilde, dvs. en kemisk energi, der frigøres, når ATP hydrolyseres til adenosin-5'-diphosphat (ADP) og orthophosphorsyre eller adenosin-5'-monophos-20 phat (AMP) og pyrophosphorsyre. Med henblik på at udbrede den industrielle anvendelse af enzymer er det derfor blevet forsøgt at udvikle et nyt fremstillingssystem, i almindelighed kaldet en "bioreaktor", i hvilken de samme biosynteser som in vivo udføres in vitro, ved at man 25 binder en sådan syntetase eller oxidoreduktase og tilsætter ATP og lignende. I bioreaktorsystemet kræves der en stor mængde ATP som energikilde, og det er endvidere nødvendigt at gendanne ATP'et fra ADP'et eller AMP'et.

Til gendannelsen af ATP fra ADP eller AMP kendes en 30 fremgangsmåde, som udnytter et enzym, nemlig adenylatkinase, der katalyserer den følgende reaktion, som beskrevet i f.eks. Enzyme Engineering, vol. 2, side 209 og 217 (1974).

AMP + ATP Adenylatkinase 2 ADP (1) 35 -> ADP + acetylphosphat Acetatkinase ATP + eddike- -> syre U) 2

DK 165702B

Fra (1) + (2) x 2 .bliver den følgende ligning mulig.

AMP + 2 acetylphosphat —> ATP + 2 eddikesyre (3)

Det vil sige, at selv om ATP omdannes til ADP’el-5 ler AMP i bioreaktorsystemet, bliver gendannelsen af ATP

mulig ved kombinationen (ligning (2) eller (3)) af disse enzymer.

Ved den praktiske udnyttelse af sådanne reaktioner kræves det, at disse enzymer er stabile og tilstrække-10 ligt holdbare til industrielle anvendelser. Den hidtil kendte adenylatkinase er imidlertid et meget ustabilt enzym, som opnås fra gær og fra dyremuskler. Som det eneste eksempel er det beskrevet i "Computer Abstract of English Translation from Doklady Akademii Nauk SSSR 15 Ser Biokhim", Vol. 203 (1-6), 1204-6 (1972), at adenylatkinase opnået fra frømuskel fra frøen Rana ridi-bunda har fortrinlig varmeresistens. Der er imidlertid ikke hidtil blevet opnået adenylatkinase med god varme-resistens fra mikroorganismer, der er til rådighed til 20 industriel anvendelse som følge af høj produktionseffektivitet. Acetatkinasen, som kan opnås fra Escherichia coli, ér også meget ustabil, hvilket længe har været kendt.

Imidlertid er det for nylig blevet offentliggjort 25 i japansk patentansøgning (OPI) nr. 25088/77 (den heri anvendte betegnelse "OPI" henviser til en "offentliggjort ikke-forundersøgt japansk patentansøgning"), at der kan opsamles varmeresistent acetatkinase fra en termofil Bacillus stearothermophilus. Det har således været øn-30 sket at opnå adenylatkinase med høj stabilitet, såsom den der forefindes hos den i japansk patentansøgning (OPI) nr. 25088/77 beskrevne acetatkinase.

Ved den kommercielle syntetisering af forbindelser under anvendelse af disse enzymer er det i praksis 35 meget vanskeligt at genvinde enzymet efter reaktionen til genanvendelse deraf og til at bevirke en kontinuerlig enzymatisk reaktion. Med henblik på at overvinde sådanne ulemper er der udført forskellige undersøgelser, og der 3

DK 165702B

er blevet fremsat flere forslag. Et sådant forslag er at binde et enzym til en vanduopløselig bærer ved en passende fremgangsmåde for at gøre enzymet vanduopløseligt, således at det kan anvendes gentagne gange. F.eks. giver 5 "Immobilized Enzyme" af Oskar Zaborsky, CRC Press (1973) og "Koteika Koso" ("immobilized Enzyme") af Ichiro Chiba-ta, Kodansha (1975) eksempler på immobilisering af amino-acylase med ionbytterharpiks ved adsorption, immobilisering af dextranase med cellulose ved covalent binding og 10 immobilisering af aspartase med polyacrylamidgel ved indeslutning. En sådan immobilisering af enzymer er en typisk fremgangsmåde, som muliggør en gentagen og kontinuerlig anvendelse af enzymer.

Det er f.eks. blevet foreslået at foretage immo-15 bilisering til den kommercielle udnyttelse af acetatki-nase (se "Hakko to Kogyo" ("Fermentation and Industry"), vol. 35, nr. 1, side 3-10 (1977)). Det har imidlertid vist sig, at når et coliformt enzym immobiliseres med cyanobromid ifølge Whitesides et al., "Enzyme Enginee-20 ring", vol. 2, side 217 (1974), redigeret af E. Kendall et al., Plenum Press, er restaktiviteten (udtrykt som %) kun adskillige % i fraværelse af en stabilisator, langtidsstabiliteten er meget ringe, og det immobiliserede enzym er overhovedet ikke egnet til den kommercielle ud-25 nyttelse deraf.

Blandt de faktorer, der hæmmer den kommercielle udnyttelse af enzymer, kan nævnes det forhold, at næsten alle enzymer er meget ustabile, samt problemet med vand-opløselighed. Selv om der kendes eksempler, i hvilke im-30 mobiliseringen forøger stabiliteten af den katalytiske funktion, kendes der også eksempler, i hvilke stabiliteten af den katalytiske funktion nedsættes. F.eks. konkluderede I. Chibata, som et resultat af sammenlignende undersøgelser af enzymstabiliteten før og efter immobili-35 seringen, at der ikke kunne findes nogen regelbundethed mellem en immobiliseringsfremgangsmåde og stabiliteten af det immobiliserede enzym, og at det derfor et meget vanskeligt at forudsige, hvilken fremgangsmåde der kan for- 4

DK 165702B

øge enzymstabiliteten (se I. Chibata, "Koteika Koso" ("Immobilized Enzyme") , side 107, Kodansha, Tokyo (1975)) .

Det vides også, at de egenskaber, som et enzym oprindeligt har før immobiliseringen, i visse tilfælde går tabt 5 ved immobiliseringen, og specificiteten ændres ved immobiliseringen (se "Hakko to Kogyo" ("Fermentation and Industry"), vol. 35, side 7 (1977)).

Et enzyms egenskaber hidrører fra dets komplicerede og højere ordens struktur. Enzymets højere ordens 10 struktur påvirkes naturligvis af immobiliseringen. Med henblik på at vide, om der kan opnås et stabilt immobi-liseret enzym ved immobiliseringen, er det derfor nødvendigt at bestemme dette ved at prøve sig frem med hvert enzym.

15 Enzymets molelylære struktur varierer afhængigt af den type mikroorganisme, der danner enzymet, og endvidere ændres denne komplicerede molekylære struktur let afhængigt af de betingelser, under hvilke det enzymatiske protein anbringes. Det er derfor vanskeligt for fag-20 manden at forudsige de egenskaber, såsom specificitet, katalytisk aktivitet og langtidsstabilitet, som enzymet har efter immobilisering ud fra de egenskaber, som enzymet har inden immobilisering. Når immobilisering udføres under anvendelse af et enzym af en anden art, har l i

25 det derfor ikke været muligt at anvende immobiliserings- I

fremgangsmåden og -betingelserne på enzymet af den anden j art, selv om enzymet falder ind under den samme kategori.

Med henblik på at opnå et immobiliseret enzym med en [ i høj restaktivitet og langtidsstabilitet, har det derfor 30 været nødvendigt at udføre undersøgelser ved at prøve sig frem med hvert enzym. På denne baggrund har det længe været ønsket at udvikle en fremgangsmåde, der muliggør bestemmelsen af en passende immobiliseringsfremgangsmåde og passende immobiliseringsbetingelser uden at væ-35 re afhængig af at skulle prøve sig frem.

I tilfælde af adenylatkinase har det desuden vist sig, at når det skal immobiliseres til den kommercielle udnyttelse deraf, må immobiliseringsfremgangsmåden og 5

DK 165702B

immobiliseringsbetingelserne også bestemmes ved, at man prøver sig frem. Dette har hæmmet immobiliseringen af adenylatkinase og den kommercielle udnyttelse deraf alvorligt. Der er faktisk kun udført få undersøgelser af 5 immobiliseringen af adenylatkinase. Som en af det begrænsede antal fremgangsmåder, der hidtil er blevet beskrevet, kendes der f.eks. en fremgangsmåde, ved hvilken man immobiliserer adenylatkinase fra svinemuskel i en polyacrylamidgel, der indeholder en N- hydroxysuccinimi-10 dogruppe deri (se "Methods in Enzymology", vol. 44, side 887 (1976) , redigeret af K. Mosbach, Academic Press). I-følge denne kendte fremgangsmåde kræves der en kompliceret og vanskelig procedure, således at enzymets aktivitet ikke forringes, dvs. at der i løbet af immobilise-15 ringen sættes adenylatkinase til en ikke-oxiderende atmosfære i flere sekunder, indtil acrylamidet er størknet. Immobiliseringen af adenylatkinasen og anvendelsen deraf har været underkastet tydelige begrænsninger. Tillige mister adenylatkinase fra svinemuskel, som ikke kan immo-20 biliseres på en bærer, sædvanligvis dets aktivitet ved immobiliseringsfremgangsmåden i en sådan grad, at det praktisk talt er umuligt at genvinde og genanvende. I overensstemmelse med disse sædvanlige fremgangsmåder har immobiliseringen af adenylatkinase og dannelsen af ade-25 nin-cofaktorer under udnyttelse af det immobiliserede adenylatkinase derfor ikke været praktisk mulig. Selv hvis adenylatkinase immobiliseres uden hensyn til sådanne operationelle og økonomisha ulemper, går aktiviteten i det væsentlige tabt, når immobiliseringen udføres 30 ved stuetemperatur (20° til 30°C), og derfor må immobiliseringen udføres ved lav temperatur, f.eks. nær 0°C.

I denne henseende har fremstillingen af et immobiliseret adenylatkinase-kombinationsprodukt været uigennemførlig set fra et operationelt og økonomisk synspunkt.

35 Et af opfindelsens formål er at tilvejebringe adenylatkinase, som er stabiliseret imod varme og bevarer dens aktivitet over et langt tidsrum, samt en fremgangsmåde til fremstilling heraf.

DK 165702 B

6

Et andet af opfindelsens formål er at overvinde de ovenfor beskrevne ulemper, som man møder ved immobiliseringen af adenylatkinase ved den sædvanlige fremgangsmåde, og at tilvejebringe en immobiliseringsfrem-5 gangsmåde, der har fortræffelige økonomiske og operationelle egenskaber, samt en hidtil ukendt immobiliseret adenylatkinase, som forbliver stabil over et langt tidsrum.

Som et resultat af omfattende undersøgelser til 10 opnåelse af de ovennævnte formål har det vist sig, at adenylatkinase med de ovenfor beskrevne egenskaber findes i cellen af en mikroorganisme tilhørende slægten Bacillus, og endvidere at adenylatkinasen er et hidtil u-kendt enzym, som let kan oprenses og har overraskende 15 høj stabilitet sammenlignet med den adenylatkinase, der findes i gær og lignende.

Som et resultat af undersøgelser af immobiliseringen af en sådan varmeresistent adenylatkinase ved, at man prøver sig frem, har det endvidere overraskende vist 20 sig, at uden hensyn til arten af den anvendte immobili-seringsfremgangsmåde har det immobiliserede adenylatki-mase-kombinationsprodukt altid en katalytisk evne og bevarer denne stabil over et længere tidsrum i modsætning til den sædvanlige adenylatkinase. Som et resultat af 25 yderligere undersøgelser har det i tilfælde af adenylatkinase vist sig, at hvis immobiliseringen udføres under anvendelse af et enzym, som tåler en bestemt varmeresi-stensprøve, bevarer den immobiliserede adenylatkinase stabilt dens aktivitet over et langt tidsrum.

30 Den varmeresistente adenylatkinase ifølge opfin delsen er ejendommelig ved, at dens aktivitet efter inku-bering i en bufferopløsning ved ca. 50°C i ca. 15 minutter er mindst ca. 80% af den oprindelige aktivitet forud for inkuberingen, at den har en molekylvægt på ca.

35 22.000 {målt ved gelchromatografi), antager en optimal pH-værdi på ca. 7,5 ved 30°C og fungerer ved en temperatur på fra ca. 25°C til 65°C ved ca. pH 7,5, idet nævnte adenylatkinase er identisk med den adenylatkinase, der 7

DK 165702B

fremkommer ved dyrkning af en stamme af Bacillus stearo-thermophilus.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af den omhandlede varmeresistente adenylatkinase 5 er ejendommelig ved, at man dyrker en bakterie tilhørende arten Bacillus stearothermophilus og derfra opsamler den varmeresistente adenylatkinase. En hensigtsmæssig udførelsesform for denne fremgangsmåde er angivet i krav 3.

Det stabile, immobiliserede adenylatkinase-kom-10 binationsprodukt ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det er fremstillet ved covalent binding af varmeresistent adenylatkinase ifølge opfindelsen til en vanduopløselig bærer. En hensigtsmæssig form for dette kombinationsprodukt er angivet i krav 5.

15 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstil ling af det omhandlede stabile, immobiliserede adenylat-kinase-kombinationsprodukt er ejendommelig ved, at man covalent binder en varmeresistent adenylatkinase ifølge opfindelsen til en vanduopløselig bærer. Hensigtsmæssige 20 udførelsesformer for denne fremgangsmåde er angivet i krav 7, 8 og 9.

Den omhandlede adenylatkinase er meget stabil over for varme og kan derfor efter isolering af enzymet lagres i et langt tidsrum, sammenlignet med de kendte ade-25 nylatkinaser.

Det ifølge opfindelsen fremstillede stabile, immobiliserede adenylatkinase-kombinationsprodukt kan beva-re dets aktivitet over et langt tidsrum, og det er derfor muligt at tilvejebringe en fremgangsmåde til 30 omdannelsen af adenin-cofaktorer.

Derfor er det muligt at udføre det såkaldte bioreaktor sy stem, således at in-vivo-biosyntesen udføres in vitro i kommerciel målestok.

Opfindelsen beskrives nærmere under henvisning 35 tJLX tegningen, hvorpå fig. 1 er en grafisk afbildning, der viser restaktiviteten af den omhandlede adenylatkinase (kurve A) og adenylatkinase opnået fra gær (kurve B) efter opvarm- 8

DK 165702B

ning i 15 minutter til forskellige temperaturer, og fig. 2 er en grafisk afbildning, der viser restaktiviteten af den omhandlede adenylatkinase (kurve C) og adenylatkinase opnået fra gær (kurve D) efter hen-5 stand ved 30°C.

Når den behandles i ca. 15 minutter i en bufferopløsning, der holdes ved. ca. 50°C, bevarer den omhandlede adenylatkinase en restaktivitet, som er mindst ca. 80%, fortrinsvis mindst ca. 90%, og mest foretrukket 10 ca. 100%, af den oprindelige aktivitet. Navnlig er aktiviteten efter en behandling i ca. 15 minutter i en bufferopløsning, der holdes ved ca. 57°C, mindst ca. 80% af den oprindelige aktivitet. I det følgende betegnes alle disse egenskaber som "varmeresistente egenskaber".

15 Bufferopløsningens koncentration og pH-værdi er ikke kritisk. I almindelighed er koncentrationen imidlertid fra 5 mM (millimolær) til 500 mM, og pH-værdien er fra 7 til 10,5. Det er navnlig foretrukket at anvende en 50 mM phosphatbufferopløsning med en pH-værdi på 20 ca. 7,5.

Den omhandlede adenylatkinases foretrukne fysiske og kemiske egenskaber beskrives nedenfor: (1) Enzymfunktion:

Den katalyserer den følgende reaktion:

25 ΆΜΡ + ATP * 2 ADP

(2) Substratspecificitet:

Michaelis-konstanterne (km værdier) til AMP, ATP og ADP er henholdsvis 0,017 mM, 0,04 mM og 0,05 mM.

30 (3) Optimal pH:

Ca. 7,5 (temperatur: 30°C) (4) Stabilt pH-område:

Der sker næsten ingen inaktivering ved behandling inden for et pH-område fra 7,0 til 10,5 35 ved 4°C i 24 timer.

(5) Optimalt temperaturområde:

Aktiviteten forøges ved en forøgelse i temperatur fra 25°C til 65°C ved pH 7,5. Reaktionen udføres typisk ved 30°C.

9

DK 165702B

(6) Varmeresistens:

Den bevarer en aktivitet på. 99% imod opvarmning ved 57°C i 15 minutter og forbliver stabil.

(7) Molekylvægt: 5 Ca. 22.000, som bestemt ved gelchromatografi un- der anvendelse af Sephadex G-100.

(8) Bestemmelse af aktivitet:

Til en imidazol-saltsyrebufferopløsning (75 mM; pH på 7,2) sættes 1,5 mM AMP, 1,2 mM ATP, 1 mM magnesi-10 umsulfat, 135 mM kaliumchlorid, 0,4 mM phosphoenol-pyrodruesyre, 0,2 mM reduktions-type nicotinamidadenin-dinucleotid (NADH), 5 enheder (E)/ml pyrovatkinase og 10 enheder (E)/ml lactatdehydrogenase til fremstilling af en blandet opløsning. Der sættes en passende mængde (0,1 15 til 0,002 enheder pr. 1 ml af den blandede opløsning) adenylkinase til den blandede opløsning, hvorpå absor-bansen af NADH ved 340 nm nedsættes med tiden. En enzymatisk aktivitet til nedsætning af absorbansen ved 340 nm i et forhold svarende til 2 micromol NADH pr. minut 20 betegnes som "én enhed".

(9) Ensartethed:

En oprenset prøve bevæger sig mod anoden ved acryl-amidskiveelektroforese og giver et ensartet bånd. Selv ved natriumdodecylsulfat(SDS)gelelektroforese giver den 25 et ensartet bånd.

(10) Analyse:

Aminosyreindholdet er anført nedenfor (mol%). Asparaginsyre 10,24%, threonin 3,65%, serin 1,87%, glutaminsyre 12,05%, prolin 6,06%, glycin 9,74%, alanin 30 7,64%, cystin (cystein) 0,80%, valin 7,37%, methionin 2,94%, isoleucin 10,55%, tyrosin 3,28%, phenylalanin 2,98%, lysin 5,86%, histidin 2,52%, arginin 7,17%, tryptophan 0,65%.

(11) Krystalstruktur: 35 Ikke bestemt, idet den endnu ikke er blevet kry stalliseret.

Den omhandlede adenylatkinase kan fremstilles ved dyrkning af en mikroorganisme tilhørende arten Bacillus 10

DK 165702B

stearothermophilus og ved opsamling af adenylatkinasen fra det resulterende dyrkningsprodukt.

Enhver bakterie tilhørende arten Bacillus stearothermophilus, som kan danne den omhandlede adenylatki-5 nase, kan anvendes ved opfindelsen. Typiske eksempler på sådanne stearothermophilus omfatter ATCC nr. 7953, 7954, 8005, 10149, 12980, NCA 1503 og UK-788 (FERM-P 5141).

Eksempler på carbonkilder, som kan anvendes ved dyrkningen af sådanne bakterier, omfatter saccharider, 10 såsom glucose, saccharose, fructose, hydrolyserede stivelsesprodukter, melasse og spildvæsker fra sulfitpulp; organiske syrer, såsom eddikesyre og mælkesyre; samt alkoholer, lipider, alifatiske syrer, glycerol og lignende, som kan assimileres af de anvendte bakterier. Eksempler 15 på nitrogenkilder, som kan anvendes, omfatter organiske og uorganiske forbindelser, såsom ammoniumsulfat, ammo-niumchlorid, ammoniumphosphat, ammoniak, aminosyrer, pepton, kødekstrakt og gærekstrakt. Tillige kan man som u-organiske salte anvende salte af kalium, natrium, phos-20 phorsyre, zink, jern, magnesium, mangan, kobber, calcium, cobalt og lignende, og om nødvendigt kan man anvende små mængder metalsalte, majsstøbevand, vitaminer, nuclein-syrer og lignende. Sædvanligt næringsmedium kan anvendes til udførelse af den omhandlede fremgangsmåde.

25 Under anvendelse af det således fremstillede dyrk

ningsmedium dyrkes bakterien tilhørende arten Bacillus stearothermophilus almindeligvis ved fra 20°C til 80°C, fortrinsvis fra 40°C til 70°C, og mest foretrukket ved ca. 60°C, i fra ca. 2 til 6 timer under beluftede betingelser. Når den omhandlede 30 fremgangsmåde udføres i kommerciel målestok, foretrækkes det at udføre dyrkningen kontinuerligt ved indstilling af fortyndingsforholdet(i det følgende simpelt hen betegnet som "D"), som defineret i det følgende, på 0,9 eller mere gange μ for den ved fremgangsmåden anvendte bak-35 terie. Når dyrkningen udføres kontinuerligt, medens D

holdes på 0,9 eller mere gange μ for den ved frem- max gangsmåden ifølge opfindelsen anvendte bakterie, overskrider adenylatkinaseindholdet i de dannede celler deri mak 1 1

DK 165702B

simale værdi af adenylatkinase pr. celleenhed,opnået ved en portionsvis fremgangsmåde. Endvidere forøges cellernes produktivitet.

Især forøges cellernes adenylatkinaseindhold, når D holdes nær , til så meget som 1,3 gange det, der op-5 nås ved en portionsvis fremgangsmåde. På den anden side er cellernes adenylatkinaseindhold, når der udføres kontinuerlig dyrkning, medens D holdes under 0,9 gange ymax/ mindre end det, der opnås ved en portionsvis fremgangsmåde.

10 Det omhandlede fortyndingsforhold, D, udtrykkes ved den følgende ligning: D = I (1) hvor D: fortyndingsforhold (1/time) 15 F: den hastighed, hvormed en fødevæske tilføres til en gæringstank, hvilket er den samme hastighed, hvormed et dyrkningsprodukt udtages fra gæringstanken (£/time) V: væskemængde i gæringstanken (£).

20 Symbolet "Ρ|υ3χΜ r som benyttet heri, betegner en bakteries maksimale specifikke væksthastighed (1/time) under kontinuerlige dyrkningsbetingelser; dvs. en specifik propageringshastighed, som bestemt, når D forøges ved hjælp af en kemostat (se Herbert, Elsworth og Tel-25 ling, "Journal of General Microbiology", vol. 14, nr. 8, side 601-622 (1956)), og cellekoncentrationen ikke kan holdes på et konstant niveau, dvs. det såkaldte "udvasknings-fænomen" .

Bestemmelsen af μ under anvendelse af en stam- max 30 me af Bacillus stearothermophilus udføres som følger:

En 2 til 30 liters gæringstank påfyldes 1,5 til 20 liter af et næringsmedium, som derpå podes med bakterien, idet temperaturen holdes på 40 til 75°C, og fortrinsvis på 48 til 61°C, og pH-værdien på 4,5 til 9,0, 35 fortrinsvis på 6,0 til 8,0. Den således podede bakterie dyrkedes portionsvis. Når bakteriens vækst begynder, og mængden af carbonkilden i dyrkningsvæsken nedsættes til

DK 165702 B

12 0,01 vægt% eller mindre, påbegyndes den kontinuerlige dyrkning, ved hvilken carbonkilden alene er en væksthæmmende faktor, under anvendelse af et næringsmedium, der har den samme sammensætning som det, der fyldtes i 5 gæringstanken. Ved at gå således frem kan man etablere en kemostat. Efter at den kontinuerlige dyrkning har nået en ligevægt, medens D forøges trinvis, er der en tidsforskel mellem cellekoncentrationen i kulturen og restmængden af carbonkilden. D forøges yderligere gradvis.

10 Når D overskrider bakteriens specifikke propageringshastighed, begynder cellekoncentrationen, som har et stabilt niveau, at mindskes, og koncentrationen af carbonkilden begynder omvendt at forøges. Den hastighed, ved hvilken den kontinuerlige dyrkning ikke kan holdes ved 15 en ligevægt, hvis D forøges yderligere, kaldes udvaskning ("wash-out") . Denne specifikke propageringshastighed betegnes ".

3 max

Selv om man anvender den samme stamme, varierer værdien af y meget, af hasngigt af typen af det an-20 vendte næringsmedium og dyrkningsbetingelserne. Hvis imidlertid kombinationen er den samme, har en vis

ltlaX

konstant værdi. Hvis derfor ymax én gang er bestemt, er den pålidelig over et langt tidsrum.

Indstillingen af D kan opnås ved 25 en fremgangsmåde, ved hvilken dyrkningen udføres ved den sædvanlige for-dyrkning og portionsvise dyrkning, indtil den Ønskede cellekoncentration er nået, og derefter udføres den kontinuerlige dyrkning. Den kontinuerlige dyrkning kan påbegyndes til enhver tid i løbet af dyrknings-30 perioden. Det er imidlertid gunstigt, at den kontinuerlige dyrkning påbegyndes på et senere trin i den logaritmiske vækstfase under den portionsvise dyrkning og omgående fastlægges ved den forudbestemte værdi af D.

En udførelsesform af opfindelsen, ved hvilken der 35 benyttes Bacillus stearothermophilus NCA 1503, beskrives i det følgende.

Under anvendelse af et næringsmedium med glucose som carbonkilde etableredeskemostaten i en 30 liters gæ- 13

DK 165702B

ringstank (påfyldt 20 liter) ved den optimale temperatur (57°C) og pH-værdi (6,8), og ymax måltes og fandtes at være 1,1 (1/time) . Således kan den kontinuerlige dyrkning ved D = y udføres ved en fremgangsmåde, ved hvilken 5 man kontinuerligt fører nyt næringsmedium med den samme sammensætning, til en gæringstank, under anvendelse af en pumpe, i en mængde på 1,1 gange den påfyldte mængde pr. time, dvs. med en hastighed på 22 Jl/time ifølge lig-'ningen (1) , samtidig med at man fjerner dyrkningsblandii*· 10 gen med den samme hastighed.

Den omhandlede adenylatkinase isoleres fra dyrkningsblandingen. F.eks. kan adenylatkinasen isoleres fra ethvert produkt, såsom en dyrkningsblanding, isolerede celler, forarbejdede produkter af isolerede celler, rå-15 enzym, oprenset enzym og lignende, som dannes ved dyrknings- og oprensningstrinnene. Til oprensningen kan en sædvanlig enzym-oprensnings-fremgangsmåde anvendes (se Alan Wiseman et al., "Handbook of Enzyme Biotechnology", Ellis Horwood Ltd., (1975)). F.eks. kan celler opsamles ved centrifu-20 galseparation eller lignende fremgangsmåder og sønderdeles ved hjælp af en Manton Gaulin, en Dyno-mølle, en fransk presse eller en ultralydsbehandling. Derpå fjernes cellebrudstykkerne ved centrifugalseparation for således at opnå en celleekstrakt. Den således opnåede celleeks-25 trakt underkastes streptomycinsulfat- eller protaminsul-fatbehandling til udfældning af nucleinsyrer. Endvidere anvendes ammoniumsulfatfældning, acetonefældning, varmebehandling og lignende. Til oprensningen kan man anvende ionbytningschromatografi under anvendelse af en DEAE-30 cellulosesøjle osv., absorptionschromatografi under anvendelse af en hydroxyapatits^jle osv., gelfiltrerings-chromatografi, såsom Sephadex-chromatografi, og lignende i kombination med hverandre. På denne måde kan den omhandlede adenylatkinase isoleres og oprenses.

35 Da den omhandlede adenylatkinase er meget stabil over for varme, kan den efter isoleringen oplagres i et langt tidsrum sammenlignet med de kendte adenylatkinaser.

14

DK 165702B

Det omhandlede, hidtil.ukendte, immobiliserede adenylatkinase-kombinationsprodukt er fremstillet ved covalent binding af den ovenfor beskrevne adenylatki-nase til en vanduopløselig bærer. Til covalent binding 5 af adenylatkinasen til den vanduopløselige bærer kan der anvendes den kendte covalent-bindingsfremgangsmåde eller ionbindingsfremgangsmåde som beskrevet i f.eks.

I. Chibata, "Koteika Koso" ("Immobilized Enzyme"),

Kodansha, Tokyo (1975). Tillige kan der anvendes en 10 særlig covalent-bindingsfremgangsmåde, ved hvilken man anvender et 1-alkyl-2-halogenpyridiniumsalt.

Eksempler på sådanne covalent-bindingsfremgangsmåder omfatter: en fremgangsmåde, ved hvilken man behandler en vanduopløselig bærer, som f.eks. indeholder en 15 carboxylgruppe, med et l-alkyl-2-halogenpyridiniumsalt, således at det kan omsættes med en aminogruppe, en hy-droxylgruppe og en carboxylgruppe, og adenylatkinasen bindes derpå dertil; en fremgangsmåde, ved hvilken man omdanner en vanduopløselig bærer, der indeholder en aro-20 matisk aminogruppe, til et diazoniumsalt, og adenylatkinasen diazo-kobles dertil; en fremgangsmåde, ved hvilken man omdanner en bærer, der indeholder en carboxylgruppe, til et derivat, såsom et azid, chlorid, carbodiimid eller isocyanat, og adenylatkinasen bindes dertil gennem 25 en peptidbinding ; en fremgangsmåde, ved hvilken adenylatkinasen bindes til en vanduopløselig bærer, der indeholder en aktiv fraspaltelig gruppe, såsom halogen; en fremgangsmåde, ved hvilken man behandler en vanduopløselig bærer, der indeholder en hydroxylgruppe, med cyano-30 halogenid, og adenylatkinasen bindes til en vanduopløselig bærer ved anvendelse af et mindst to-funktionelt reagens, f.eks. et l-alkyl-2-halogenpyridiniumsalt, tbluen-diisocyanat, epichlorhydrin, glutaraldehyd og 2-amino- 4,6-dichlor-S* tolyaz in.

35 Denne immobilisering kan udføres ved en sædvanlig fremgangsmåde, ved hvilken man blander en vandig opløsning af den varmeresistente adenylatkinase og en vanduopløselig bærer eller dens precursor, om nødvendigt under

DK 165702 B

15 tilstedeværelse af en polymeriseringsinitiator. Ved op-findelsen er det imidlertid ikke nødvendigt at styre ud-førelsestemperaturen, således at udførelsen sker ved lave temperaturer, hvilket er nødvendigt ved den sædvanli-5 ge fremgangsmåde. Således kan den omhandlede immobilisering udføres ved normale temperaturer (f.eks. 20°C-30°C). Dette er en af opfindelsens hovedfordele.

Det omhandlede, stabile,immobiliserede adenylat-kinase-kombinationsprodukt er fremstillet ved en cova-10 lent-bindingsfremgangsmåde, hvilket er særlig ønsket, da bindingskraften mellem adenylatkinasen og den vanduopløselige bærer er stor, og aktiviteten derfor er meget vedvarende,f.eks. kan ade-nin-cofaktorer omdannes stabilt over et langt tidsrum. Isaac foretrækkes en covalent-bindingsfremgangsmåde, ved hvilken der anven-15 des et reagens, som indeholder en mindst to-funktionel gruppe, navnlig et l-alkyl-2-halogenpyridiniumsalt,Jda der kan anvendes milde immobiliseringsbetingelser, under hvilke der sjældent sker inaktivering af adenylatkinasen, og restaktiviteten er høj. Navnlig foretrækkes især en 20 fremgangsmåde, ved hvilken man omsætter en vanduopløselig bærer,som i forvejen indeholder en carboxylgruppe, med et l-alkyl-2-halogenpyridiniumsalt under tilstedeværelsen af et syrefjernende middel, og den varmeresistente adenylatkinase bindes covalent dertil.

25 Fremstillingen af et immobiliseret adenylatkinase- kombinationsprodukt under anvendelse af 1-alkyl-2-halo-genpyridiniumsaltet kan udføres som følger:

En vanduopløselig bærer, indeholdende en carboxylgruppe og fra 1 til 1000, fortrinsvis fra 2 til 200, 30 mest foretrukket fra 2 til 20 mol, pr. mol af carboxyl-gruppen af et syrefjernende middel, blandes med et vandfrit organisk opløsningsmiddel. Derpå omsættes 1-alkyl- 2-halogenpyridiniumioner hermed i et forhold på 1,2 til 1200, fortrinsvis på 2,4 til 480 mol, og mest foretruk-35 ket på 2,4 til 24 mol, pr. mol af carboxylgruppen. Omsætningen kan udføres inden for et område fra normal temperatur til den temperatur, ved hvilken opløsningsmidlet koger. Efter opretholdelse af reaktionen i mere end 10 minutter, 16

DK 165702B

og fortrinsvis mere end 1 time, vaskes reaktionsproduktet gentagne gange med et vandfjernende opløsningsmiddel, der kan opløse det syrefjernende middel. Således kan man opnå en vanduopløselig bærer med en enzymbinden-5 de evne.

Den således opnåede bærer blandes med en vandig opløsning af den varmeresistente adenylatkinase under betingelser, hvor temperaturen er fra 0°C til 50°C, fortrinsvis fra 0°C til 30°C, og mest foretrukket fra 0°C 10 til 20°C, og ved en pH-værdi fra 6 til 10, fortrinsvis fra 7 til 9, og mest foretrukket fra 7 til 8, til fremstilling af et immobiliseret adenylatkinase-kombinations-produkt. Den ovennævnte blandingsbehandling udføres i et tidsrum på 2 minutter eller mere, fortrinsvis fra 5 mi-15 nutter til 10 timer, og mest foretrukket fra 10 minutter til 2 timer.

Alternativt kan et immobiliseret adenylatkinase-kombina- tionsprodukt, under anvendelse af 1 -alkyl-2-halogenpyridiniumsaltet, fremstilles ved en fremgangsmåde, ved hvilken man direk- 20 te blander en vanduopløselig bærer indeholdende en carb- oxylgruppe, fra 1,2 til 240, fortrinsvis fra 2,4 til 120, og mest foretrukket fra 2,4 til 48 mol pr. mol af carboxylgruppen, af l-alkyl-2-halogenpyridiniumioner, fra 2,4 til 480, fortrinsvis fra 4,8 til 240, og mest fore- 25 trukket fra 4,8 til 98 mol pr. mol af carboxylgruppen, af et syref jernende middel, samt adenylatkinase med en blanding af vand og organisk opløsningsmiddel. Den heri 6 10 anvendte mængde adenylatkinase er fra 10 til 10 en- 7 9 heder, fortrinsvis 10 til 10 enheder, og mest foretruk-30 ket fra 10 til 10 enheder, pr. mol af carboxylgruppen på den vanduopløselige bærer. pH-Værdien i blandingen af vand og organisk opløsningsmiddel er fra 6 til 9, fortrinsvis fra 6 til 8, og mest foretrukket fra 6,5 til 7,5. Temperaturen er almindeligvis fra 0°C til 50°C, 35 fortrinsvis fra 0°C til 30°C, og mest foretrukket fra 0°C til 20°C. Behandlingstiden er fra 2 minutter til 5 timer, fortrinsvis fra 2 minutter til 2 timer, og mest foretrukket fra 5 minutter til 2 timer. Med hensyn til 17

DK 165702B

forholdet mellem vand og organisk opløsningsmiddel tilsættes det organiske opløsningsmiddel i en mængde på fra 0,6 til 6 volumendele, og fortrinsvis fra 0,8 til 1,2 volumendele pr. volumendel vand.

5 Ved fremstillingen af et immobiliseret adenylatki- nase-kombinationsprodukt kan forskellige 1-alkyl-2-halo- genpyridiniumsalte anvendes.

Eksempler på alkylgrupper, som kan anvendes, omfatter ligekædede alkylgrupper/ såsom methyl, ethyl, n-10 propyl, n-butyl og n-dodecyl\ alkylgrupper, der indeholder sidekæder, såsom isopropyl, tert-butyl og neopen- tyl; 1-alkyl-gruppen i ovennævnte salt kan erstattes af cycliske alkylgrupper, såsan cyclopentyl og cyclohexyl, og aromatiske ringe, der indeholder de ovennævnte alkylgrupper, f.eks. phenyl 15 og naphthyl, og/eller umættede alkylgrupper, f.eks. vinylbutynyl og isobutynyl. Halogenatomet i 2-positionen i 1-alkyl-2-halogenpyridiniumsaltet kan være fluor, brom, chlor og iod.

Eksempler på modioner, der indgår i pyridiniumsal-tet, omfatter halogenioner, nemlig fluor, brom, chlor og 20 iod, organiske anioner, såsom tosylat og prosylat, samt • koordinationstype-anioner, såsom fluorsulfat og tetra-fluorborat.

Eksempler på syrefjernende midler, som kan anvendes, omfatter baser, som ikke indeholder noget aktivt 25 hydrogen, f.eks. triethylamin, trimethyl- amin, methyldiethylamin, pyridin og lutidin, samt superbaser, f.eks. 1,8-diazabicyclo[5,4,0]-7-undecen og 1,5-diazabicyclo[4,3,0]-5-nonen.

Organiske opløsningsmidler, som kan anvendes, 30 omfatter carbonhydrider, såsom benzen, toluen, xylen og cyclohexan, alkoholer, såsan methanol, ethanol, amylalkohol, cyc-lohexanol, ethylenglycol, glycerol, ethylenglycolmono-methylether og diethylenglycol, ethere, såsom diethyl-ether , diamylether, benzylether, dioxan, tetrahy-35 drofuran og ethylenglycoldimethylether, ketoner, såsom acetone, methylethylketon og cyclohexan, estere, såsom ethylacetat, propylpropionat, butylformiat og butylace-tat, halogenerede carbonhydrider, såsom chloroform, methylenchlorid, carbontetrachlorid og triethylenbromid, 18

DK 165702B

nitroforbindelser, såsom nitrobenzen og nitromethan, ni-triler, såsom acetonitril og benzonitril, og amider, såsom diethylformamid, dimethylacetamid og N-methylpyrro-lidon.

5 Den vanduopløselige bærer, som anvendt heri, be tegner en forbindelse, som i al væsentlighed er uopløselig i vand. Eksempler på sådanne vanduopløselige bærere omfatter derivater af polysaccharider, såsom cellulose, dextran, agarose og stivelse; cellulosepolyacetat; visse 10 derivater af polyvinylalkohol (f.eks. tværbundne, yand-uopløselige derivater); polymere fremstillet ud fra monomere, som indeholder umættede carbonatomer, såsom polystyren, polypropylen, polyethylen, polyvinylchlorid, polymethylmethacrylat, polybuten, polypenten, polyvinyli-15 denchlorid, polyacrylsyre, polyaminostyren, polybutadien, polyisopren, poly(maleinsyremonoester), tværbundet poly-acrylamid, polyvinylamin, poly(dialkylaminoethylmetha-crylat), poly(dialkylaminomethylstyren), poly(vinylpyri-din), poly(vinylpyrrolidon), poly(acrylsyreanhydrid), 20 poly(methacrylsyreanhydrid), poly(maleinsyreanhydrid), polymethacrylonitril, poly(trifluorethylen), poly(tetra-fluorethylen), poly(divinylbenzen), poly(a-methylstyren), poly(N-vinylamin), poly(tetramethylenglycoldivinylether), polyvinylsulfon, polyvinylsulfoxid, polyacrolein og po-25 ly(methylvinylketon); polyethere, såsom polvphenylenoxid, polymethylenoxid, polyethylenoxid og polytetramethylenoxid; polypeptider, såsom polyalanin og polyphenylalanin; polyamider, såsom nylon-3, nylon- 4, nylon-5, nylon-6, nylon-7, nylon-11, nylon-12, nylon-6,6, nylon-6,10, poly-30 (m-phenylenisophthalamid) og poly(p-phenylenterephthal-amid); polyestere fremstillet ud fra polycarboxylsyrer, f.eks. terephthalsyre, isophthalsyre, adipinsyre, malein-syre, fumarsyre og trimellitsyre samt polyoler, f.eks. ethylenglyeol, propylenglyeol, butylenglyeol, pentaeryth-35 ritol og bisphenol A; polyestere fremstillet ud fra glycerinsyre, mælkesyre og hydroxypivalinsyre; silicongum-mier, såsom dimethylpolysiloxan, methylphenylpolysilo-xan, methylvinylpolysiloxan, cyanoalkylmethylpolysiloxan 19

DK 165702B

og fluoralkylmethylpolysiloxan; polyurethaner fremstillet ud fra polyisocyanater, f.eks. toluendiisocyanat, phenylendiisocyanat, ethylendiisocyanat, diphenylmethan-diisocyanat og toluentriisocyanat, samt polyoler, f.eks.

5 polyethylenglycol, polypropylenglycol og polyestere indeholdende OH-endegrupper; formaldehydharpikser, såsom en phenol-formaldehydharpiks, en xylen-formaldehydharpiks, en urinstof-formaldehydharpiks og en melamin-formalde-hydharpiks; polyimider; polymere indeholdende 4-leddede 10 ringe, såsom polybenzimidazol og polythiazol; polycarbo-nater; polysulfoner; uorganiske derivater, såsom glas, asbest, ler, glimmer, hydroxylapatit, aktivt kul, sili-cagel og aluminiumoxid; samt syntetiske uorganiske polymere, såsom polyphosphergen.

15 Nogle af den omhandlede fremgangsmådes hovedfor dele er opremset nedenfor: (1) Man kan undgå den ulempe, at man skal bestemme en passende immobiliseringsfremgangsmåde for hver ade-nylatkinase ved at prøve sig frem, som det er nødvendigt 20 ved sædvanlige fremgangsmåder, (2) Der kræves ingen komplicerede særlige fremgangsmåder til immobiliseringen.

(3) Adenylatkinase, som ikke er immobiliseret på en bærer, kan genvindes og anvendes til det næste immo- 25 biliseringstrin.

Det ved den omhandlede fremgangsmåde fremstillede stabile, immobiliserede adenylatkinase-kombinationspro-dukt kan anvendes i forskellige former, f.eks. i form af granulater, fibre, et hulmateriale, en film, en belagt 30 film eller lignende, dvs. i en omrøringstank, en påfyldningstank, en væsketank, en reaktor af rør- eller filmtypen eller lignende til omdannelse af adenin-cofakto-rer.

Da det ved den omhandlede fremgangsmåde fremstil-35 lede stabile immobiliserede adenylatkinase-kombinations-produkt bevarer dets aktivitet over et langt tidsrum, er det muligt at tilvejebringe en fremgangsmåde til omdannelse af adenin-cofaktorer under anvendelse af 20

DK 165702B

en reaktor som beskrevet ovenfor. Det bliver således muligt at etablere det såkaldte bioreaktorsystem, således at de samme biosynteser som in vivo udføres in vitro i kommerciel målestok. Det omhandlede stabile immo-5 biliserede adenylatkinase-rkombinationsprodukt bidrager væsentligt til oprettelsen af et sådant system i kommerciel målestok.

Opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

10 Eksempel 1 og sammenligningseksempel 1

Der fremstilledes et dyrkningsmedium, der omfattede 0,5 g/dl (deciliter) polypepton, 0,5 g/dl gærekstrakt, 1,0 g/dl saccharose, 0,13 g/dl kaliumsulfat, 0,644 g/dl dinatriumphosphat, 0,027 g/dl magnesiumsulfat, 0,032 g/dl 15 citronsyre, 0,0007 g/dl ferrosulfat og 0,015 g/dl mangansulfat, og pH-værdien indstilledes på 7,00. Derpå steriliseredes 250 liter af det således fremstillede dyrkning smedium ved 115°C i 10 minutter og podedes med Bacillus stearothermophilus stamme NCA 1503. Dyrkningen 20 udførtes under aerobe betingelser ved 60°C og ved et 2 tryk på 0,5 kg/m G i 3 timer.

Efter dyrkningen opsamledes cellerne straks ved hjælp af en centrifugalseparator af De-Laval-typen under afkøling med vand, og således opnåedes 700 g celler. De 25 således opnåede celler oplagredes i frossen tilstand.

300 g af de frosne celler suspenderedes i en 0,1 M phos-phatbufferopløsning (pH 7,5), hvis volumen var ca. 2 gange de frosne cellers volumen, og cellerne sønderdeltes fuldstændigt under anvendelse af en fransk presse.

30 Efter fjernelse af cellerester ved centrifugalseparation opnåedes en råekstrakt, som indeholdt adenylatki-nase.

En IS's protaminsulfatopløsning sattes til råekstrakten i en mængde på 300 ml pr. 600 ml af råeks-35 trakten, og det -blandedes derpå fuldstændigt. Efter tilstrækkelig omrøring fjernedes udfældninger ved centrifugalseparation , og der opnåedes en protaminsuperna-

DK 165702 B

21 tantvæske. Til den således opnåede supernatantvæske sattes gradvis fast airanoniumsulfat indtil 60%'s mætning (4°C). Dannede udfældninger opsamledes ved centrifugalseparation og opløstes igen i 20 ml af en 0,1 M phosphat-5 bufferopløsning (pH 7,5) og dialyseredes og afsaltedes mod 4 liter af en 0,1 M phosphatbufferopløsning (pH 7,5).

Den ovenfor fremstillede råen2ymopløsning passeredes gennem en DEAE-cellulosesøjle, som var blevet ek-vilibreret med en 20 mM phosphatbufferopløsning (pH 7,5) 10 indeholdende 2 mM mercaptoethanol og 2 mM natriumethy-lendiamintetraacetat og elueredes derfra med en bufferopløsning fremstillet ved tilsætning af kaliumchlorid til den ovennævnte bufferopløsning. Nær en kaliumchlo-ridkoncentration på 0,14 M elueredes den ønskede adeny-15 latkinase. Denne fraktion opsamledes, koncentreredes, af salt edes, passeredes gennem en hydroxyapatit søjle, som var blevet ekvilibreret med en 10 mM phosphatbufferopløsning (pH 7,5), og elueredes med en phosphatbufferopløsning med en lineær gradient fra 10 mM til 250 mM.

20 Nær en koncentration på 120 mM elueredes den ønskede adenylatkinase. Denne aktive fraktion koncentreredes, afsaltedes og underkastedes Ultrogel ACA-34 chromatogra-fi under anvendelse af en 50 mM Tris-saltsyrebufferopløsning indeholdende 0,1 M kaliumchlorid som eluerings- 25 middel. Den således eluerede aktive fraktion passeredes © gennem en DEAE-Sephadex A-50 søjle, som var blevet ekvilibreret med en 30 mM phosphatbufferopløsning (pH 7,7) indeholdende 2 mM mercaptoethanol og 2 mM natriumethylen-diamintetraacetat og elueredes med en opløsning fremstil-30 let ved tilsætning af kaliumchlorid til den ovennævnte bufferopløsning. Som resultat elueredes der renset adenylatkinase nær en kaliumchloridkoncentration på 0,2 M.

Den således opnåede adenylatkinase bevægede sig mod anoden under anvendelse af acrylamidskiveelektrofo-35 rese og gav et enkelt bånd. Endvidere gav den en enkelt top med en molekylvægt på ca. 22.000 ved Sephadex^-100 chromatografi.

Udbyttet var ca. 6 mg og der opnåedes eh aktivitet.på 22

DK 165702B

ca. 500 enheder pr. milligram af enzymet.

Derefter udførtes en sammenlignende undersøgelse med hensyn til stabilitet af den således opnåede adenylatkinase med adenylatkinase opnået fra gær (sammenlig-5 ningseksempel 1).

Resultaterne er vist i fig. 1 og 2 på tegningen.

Fig. 1 er en grafisk afbildning, der viser adenylatkina-sens restaktivitet, når den opvarmes i en 50 mM phos-phatbufferopløsning med en pH-værdi på 7,5 i 15 minutter 10 ved forskellige temperaturer. I fig. 1 angiver kurverne A og B henholdsvis adenylatkinase fra eksempel 1 og sammenligningseksempel 1. Fig. 2 er en grafisk afbildning, der viser ændringen i adenylatkinasens restaktivitet med tiden, når den oplagres i en 50 mM phosphatbufferopløs-15 ning med en pH-værdi på 7,5 ved 30°C. I fig. 2 betegner kurverne C og D henholdsvis adenylatkinase fra eksempel 1 og sammenligningseksempel 1.

Som det tydeligt fremgår af disse resultater, mistede den fra gær opnåede adenylatkinase næsten fuld-20 stændigt dens aktivitet irreversibelt, når den inkuberedes ved 50°C i 15 minutter, hvorimod den omhandlede adenylatkinase ikke mistede aktiviteten overhovedet ved in-kubering ved 50°C. Ved en temperatur på 30°C mistede den fra gær opnåede adenylatkinase i al væsentlighed aktivi-25 teten efter 10 til 20 dage, hvorimod der overhovedet ikke observeredes nogen nedsættelse af aktiviteten for den omhandlede adenylatkinase selv efter 50 dage.

Det kan således ses, at den omhandlede adenylatkinase er overraskende stabil over for varme og kan op-30 lagres i et langt tidsrum. Der findes ingen mikrobielle adenylatkinaser med sådanne egenskaber.

Eksempel 2-5

Anvendt stamme: 35 Bacillus stearothermophilus NCA 1503.

Sammensætning af næringsmedium:

Fremstillet under anvendelse af glucose som car-bonkilde og ved opløsning af de følgende bestanddele i 1000 ml ledningsvand: 1,3 g glucose, 1,0 g gærekstrakt 23

DK 165702B

(fremstillet af Oriental Yeast Co., Ltd.), 0,5 g pepton (fremstillet af Difco Co., Ltd.), 0,5 g KE^PO^, 0,5 g NaHP04*12H20, 0,1 g MgS04*7H20, 0,01 g ZnS04.7H20, 0,01 g MnS04*7H20, 0,01 g CuS04-5H20 og 0,01 g CoCl2*6H20.

5 Første dyrkning Næringsmediet med den ovennævnte sammensætning deltes i to portioner. En portion på 20 ml af næringsmediet fyldtes i en 100 ml Erlenmeyerkolbe,og en anden 100 ml portion af næringsmediet fyldtes i en 500 ml Er-10 lenmeyerkolbe. Efter tilpropning af kolberne med vat dampsteriliseredes disse næringsmedier under tryk ved 121°C og 1 kg/cm^ i 10 minutter. Efter afkøling podedes 100 ml Erlenmeyerkolben sterilt med ca. 5 ml frysetørrede celler opnået fra American Type Culture Collection 15 (ATCC). Under anvendelse af en rotationsomryster (fremstillet af Takasaki Seisakusho Co., Ltd.) udførtes dyrkning under rotationsomrystning (160 o/m) ved 55°C i et døgn. Cellernes vækst iagttoges, og turbiditeten forøgedes. Absorbansen ved 660 nm (bestemt ved anvendelse af 20 et Model 101 Spektxofotcmeter fremstillet af Hitachi Corp., herefter betegnet som "OD 660 nm") nåede op på fra 0,8 til 1,0. Således podedes 500 ml Erlenmeyerkolben med ca. 5 ml af udsædskulturen fra 100 ml Erlenmeyerkolben.

Med den således podede 500 ml Erlenmeyerkolbe udførtes 25 dyrkning under rotationsomrystning under de sairme betingelser scrn anvendt i tilfældet for 100 ml Erlenmeyerkolben i flere timer. Da OD 660 nm nåede op på ca. 1,0, blev dyrkningen med rotationsomrystning afbrudt,og den således fremstillede kultur anvendtes som udsædskultur til den følgende 30 hoveddyrkning.

Hoveddyrkning 20 liter af det ovenfor fremstillede næringsmedium fyldtes i en 30 liters gæringstank og steriliseredes ved 121°C og 1 kg/cm^ i 15 minutter. Dyrkningsbetingel-35 serne blev fastlagt til en temperatur på 55-l°C, en pH-værdi på 6,5 til 7,0 (indstillet med 4 N NaOH), en be-luftningsmængde på 20 liter luft/minut (luft), med en 24

DK 165702B

omrøringshastighed på 900 o/m. Derpå podedes gæringstanken med ca. 1 liter af udsædskulturen som fremstillet ovenfor, og portionsvis dyrkning påbegyndtes. Efterhånden som dyrkningen skred frem, dannedes der skum, og derfor 5 sattes en lille mængde skumdæmpningsmiddel (KM-70 fremstillet af Shin-etsu Chemical Co., Ltd.) dertil. Efter ca. 2,5 timer fra dyrkningens påbegyndelse nåede OD 660 nm op på en værdi på 1,2 (0,56 g tørcellemasse/liter), og næsten al glucosen i dyrkningsmediet var opbrugt, og glu-10 coseindholdet var formindsket til 0,01 vægt% eller mindre. Således påbegyndtes den kontinuerlige dyrkning straks. Den foreliggende stammes Umax' som i forvejen var blevet bestemt, var 1,4 (1/time). Ved kontinuerlig tilførsel af det i forvejen steriliserede næringsmedium 15 med en hastighed på 28,0 £/time og udtagelse af dyrkningsblandingen fra gæringstanken med den samme hastighed som ovenfor, reguleredes Umax derfor til 1,00 (eksempel 2). Under anvendelse af fem gange så meget næringsmedium som væske i gæringstanken, udførtes kontinuerlig 20 dyrkning til opnåelse af celler.

Derpå ændrededes D trinvis til 0,9 (eksempel 3; tilførsels- eller udtagelseshastighed: 25,2 1/time) og til 0,75 gange μ (eksempel 4; tilførsels- eller ud tagelseshastighed: 21,0 ί,/time) , og der udførtes konti-25 nuerlig dyrkning til opnåelse af celler.

Med de således opnåede celler måltes adenylatki-naseindholdet. Resultaterne er angivet i tabel 1. Tabel 1 angiver også det ved portionsvis dyrkning opnåede ade-nylatkinaseindhold (eksempel 5), som er adenylatkinase-30 indholdet i de celler, der er opnået ved den portionsvise dyrkning forud for den kontinuerlige dyrkning.

DK 165702B

25

Tabel 1

Fortyn- dings-

Eks- hastig- Adenylkinase- Produktivitet Produktivitet af pmpoi hed (D) indhold_ af celler adenylatkinase ^mas^ (enheder/g (g tør celle- (enheder/ί,/time) 5 tørcelle- masse/Jl/time) masse) 2 1,0 590 0,65 384 3 0,9 430 0,59 254 4 0,75 390 0,54 “ ' 211 •JO 5 (batch- 410 0,23 94 vis)

Som det tydeligt fremgår af tabel 1, er adenylat-kinaseindholdet i de celler, der er dannet under betingelser, hvor D er 0,9 eller mere gange , større end det, der opnås ved den portionsvise fremgangsmåde.

15

Eksempel 6

Et dyrkningsmedium, fremstillet ved opløsning af 1,3 g glucose, 1,0 g ammoniumsulfat, 0,5 g gærekstrakt, 0,5 g kaliumphosphat, 0,5 g dikaliumphosphat og 0,1 g 20 magnesiumsulfat i 1 liter ledningsvand fyldtes i en 30 liters gæringstank i en mængde på 20 liter og dampste-riliseredes ved 121°C og et tryk på 1 kg/cnr i 15 minutter. Dyrkningsbetingelserne fastlagdes til en temperatur på 57°C, en pH-værdi på 6,5 til 7,0 (indstillet ved til-25 sætning af 4 N NaOH), en beluftningsmængde på 20 liter luft/minut og en omrøringshastighed. Derefter podedes dyrkningsmediet med 1 liter udsædskultur, som var blevet fremstillet ved for-dyrkning af Bacillus staerothermo-philus stamme ATCC 12980 i det samme dyrkningsmedium som ovenfor, og hvis absorbans ved 660 run nåede op på ca. 1,0. Til at begynde med udførtes der portionsvis dyrkning i ca. 2,5 timer. Når absorbansen ved 660 nm nåede op på 1,0, tilførtes der kontinuerligt det steriliserede næringsmedium med den samme sammensætning som 35 ovenfor til gæringstanken med en hastighed på 24,0 Jl/time under anvendelse af en kvantitativ pumpe, og dyrkningsblandingen blev udtaget fra gæringstanken med den samme hastighed som ovenfor. Således udførtes der kontinuerlig dyrkning under anvendelse af 100 liter af næ- 26

DK 165702B

ringsmediet til opnåelse af en dyrkningsblanding. Den således opnåede dyrkningsblanding skiltes straks fra under anvendelse af en centrifugalseparator af De-Laval-typen under køling med vand til opnåelse af 400 g celler.

5 De således opnåede celler suspenderedes i 600 ml

af en 0,1 M phosphatbufferopløsning og sønderdeltes under anvendelse af en Dyno-mølle. Efter fjernelse af uopløseligt materiale ved centrifugalseparation opnåedes en råekstrakt indeholdende adenylatkinase. Derpå sattes 10 200 ml af en 10%'s streptomycinsulfatopløsning til 400 ml af råekstrakten. Dannede udfældninger fjernedes ved centrifugalseparation til opnåelse af en streptomycin-supernatantvæske. Denne supernatantvæske underkastedes ammoniumsulfatfraktionering, og der opnåedes en fraktion 15 fra 30% (4°C) til 60%’s (4°C) mætning. Denne fraktion opløstes i en 50 mM Tris- saltsyrebufferopløsning (pH

8.0) og passeredes gennem en DEAE-Sephadex -søjle, som var blevet ekvilibreret med den samme bufferopløsning som ovenfor, og derefter elueredes den med en opløsning 20 fremstillet ved tilsætning af natriumchlorid til den ovennævnte bufferopløsning. Nær en natriumchloridkoncen-tration på 0,2 M elueredes den ønskede adenylatkinase.

Den således eluerede fraktion underkastedes hydroxyapa-titchromatografi under de samme betingelser som i eksem-25 pel 1, passeredes gennem en Sephadex G-75 søjle og elueredes med en 30 mM Tris-saltsyrebufferopløsning (pH

8.0) indeholdende 0,1 M natriumchlorid til opnåelse af en adenylatkinaseprøve, som gav et enkelt bånd ved acryl-amidskiveelektroforese, som i tilfældet i eksempel 1.

30 Som i eksempel 1 gav adenylatkinaseprøven endvidere en enkelt top med en molekylvægt på ca. 22.000, som bestemt ved Sephades^G-lOO chromatografi.

Udbyttet var ca. 10 mg, og aktiviteten var ca.

500 enheder pr. milligram af enzymet.

27

DK 165702B

Eksempel 7 oq sammenligningseksempel 2 5 g CNBr-aktiveret Sepharoseiy4B (fremstillet af Pharmacia Co.) vaskedes og kvældedes til det tredobbelte volumen på et glasfilter med 1000 ml 1 mM saltsyre og 5 opslemmedes i en 50 mM phosphatbufferopløsning (pH 8,3, 100 ml). Den i eksempel 2 opnåede adenylatkinase opløstes i 1 ml af den ovennævnte bufferopløsning (5000 enheder) og omsattes i 30 minutter under langsom omrøring ved 40°C. Reaktionsblandingen filtreredes på et glas-10 filter. Det således opnåede immobiliserede adenylatkina-se-kombinationsprodukt vaskedes tre gange med 200 ml portioner af en 50 mM Tris-saltsyrebufferopløsning (pH 8,0) indeholdende 0,5 M KC1. Filtrater opnået på alle trin samledes, og aktiviteten af filtratet og den immobilise-15 rede adenylatkinase måltes.

Uafhængigt gentoges den samme prøve som ovenfor under anvendelse af adenylatkinase opnået fra svinemuskel (fremstillet af Boehringer Mannheim GmbH). Resultaterne er anført i tabel 2.

20 Tabel 2

Enzyrnkilde Begyndel- Ernobiliseret Aktivitet genvun-sesakti- aktivitet det i filtrat _ vitet____ (enheder) (enheder) (enheder) 25 Eksempel 7 Bacillus 5000 2000 2800 philus Sammen- Svine- 30 lignings- muskel 5000 50 200 eksempel 2

Det således fremstillede immobiliserede adenylat-kinase-kombinationsprodukt opslemmedes i en 500 mM phos-phatbufferopløsning (pH 7,3) og henstod ved 30°C. Ændrin-35 gen i aktivitet med tiden fulgtes. Resultaterne er anført i tabel 3.

Det kan af tabel 3 ses, at kombinationsproduktet, som er fremstillet af den fra Bacillus stearothermophi-lus opnåede adenylatkinase, er overraskende stabilt. Den 40 i filtratet genvpndne adenylatkinase kan genanvendes.

DK 165702 B

28

Tabel 3

Enzymkilde Lige efter Efter Efter Efter ircmobili- 13 6 __sering måned måneder måneder 5 (enheder) (enheder) (enheder) (enheder).

Eksempel 7 Bacillus stearo- 2000 1900 2100 2000 thermo- philus 10 Samrrallg- Svtoe- __ ningséksem- muskel ' pel 2

Eksempel 8 500 enheder af den i eksempel 1 opnåede adenylat-15 kinase vaskedes og kvældedes (til tre gange det oprindelige volumen) på et glasfilter med 300 ml 1 mM saltsyre, fS) og derpå sattes det til 20 g aktiveret CH-Sepharose4B (fremstillet af Pharmacia Co.), som var blevet opslemmet i 50 ml af en 50 mM boratbufferopløsning. Den resulte-20 rende blanding omsattes i 1 time under langsom omrøring ved 30°C. Reaktionsblandingen vaskedes på samme måde som i eksempel 7. Derpå måltes aktiviteten af det immobil iserede adenylatkinase-kombinationsprodukt og filtratet og fandtes at være henholdsvis 280 enheder og 210 25 enheder.

Det immobiliserede adenylatkinase-kombinations-produkt opslemmedes i en 50 mM phosphatbufferopløsning (pH 7,3) og henstod ved 30°C. Ændringen i aktivitet med tiden måltes. Resultaterne er anført i tabel 4. Af tabel 30 4 kan det ses, at det immobiliserede adenylatkinase-kom-binationsprodukt har fortræffelig stabilitet som i tilfældet i eksempel 7.

Tabel 4

Total aktivitet Efter Efter Efter Efter 35 lige efter inmo- 1 måned 3 måneder 6 måneder 12 måneder bilisering_ ____ (enheder) (enheder) (enheder) (enheder) (enheder) 280 290 275 280 280 29

DK 165702B

Eksempel 9

En 10%'s opløsning af tetrafluorborsyretriethyl-oxoniumsalt i dichlormethan, holdt ved en temperatur på 30°C, cirkuleredes gennem en nylonslange med en indre ‘5 diameter på 0,2 mm med en strømningshastighed på 0,1 ml/mm i 2 timer. Slangen vaskedes derpå, ved at man lod dichlormethan cirkulere med en strømningshastighed på 0,2 ml/mm i 5 minutter. Derpå cirkuleredes en 20%'s van-dig hexamethylendiaminopløsning gennem slangen med en 10 strømningshastighed på 0,1 ml/mm og en temperatur på 30¾ i 1 time. Derpå vaskedes slangen med en 50 mM boratbuf-feropløsning (pH 8,3), og en 5%'s (w/v) dimethylsuber-imidatopløsning, opløst i samme bufferopløsning som ovenfor, cirkuleredes gennem slangen med en strømningshastig-15 hed på 0,1 ml/mm og en temperatur på 30°C i 15 minutter.

Efter vask af slangen med methanol i 5 minutter cirkuleredes en 50 mM borafbufferopløsning (pH 8,3), indeholdende 1000 enheder af den i eksempel 2 opnåede adenylatki-nase, gennem slangen ved 30°C. Efter 2 timers cirkule-20 ring vaskedes slangen med den ovennævnte bufferopløsning.

Den således genvundne aktivitet var 300 enheder, og den samlede aktivitet, som var immobiliseret på slangen, var 630 enheder.

Med det immobiliserede adenylatkinase-kombinati-25 onsprodukt fulgtes ændringen i aktivitet med tiden på samme måde som i eksempel 7. Resultaterne er anført i tabel 5. Af tabel 5 kan det ses, at adenylatkinasen har fortræffelig stabilitet.

Tabel 5 30 Total aktivitet Efter Efter Efter lige efter imro- 1 måned 3 måneder 6 måneder bilisering _ _ _ (enheder) (enheder) (enheder) (enheder) 630 640 600 640 35 Eksempel 10

Til 5 ml af en 20 mM phosphatbufferopløsning (pH 7,5), indeholdende 0,29 g/ml acrylamid, 6 mg/ml N,N'-methylenbisacrylamid og 0,1 mg/ml riboflavin, sattes 10

DK 165702 B

30 enheder af en phosphatbufferopløsning (pH 7,5) af den i eksempel 6 opnåede adenylatkinase, og det blandedes fuldstændigt ved 0°C. Derpå sattes 50 μΐ af en 50 mg/ml ka-liumsulfatopløsning dertil. Den resulterende blanding 5 henstod i 2 timer under en 20 W fluorescenslampe. Den således opnåede gel, indeholdende immobiliseret adenylatkinase, pulveriseredes med en mølle og vaskedes derpå tre gange med 10 ml portioner af en 20 mM phosphatbuf feropløsning. Som resultat var aktiviteten af den im-10 mobiliserede adenylatkinase 8,3 enheder, og aktiviteten af vaskevæsken var ca. 1,5 enheder.

Stabiliteten af det således fremstillede immobili-serede adenylatkinase-kombinationsprodukt måltes på samme måde'som i eksempel 8. Resultaterne er anført i tabel 15 6. Af tabel 6 kan det ses, at det immobiliserede adeny-latkinase-kombinationsprodukt har fortræffelig stabilitet . ,

Tabel 6

Lige efter Efter Efter Efter 20 immobilisering 1 måned 3 måneder 6 måneder (enheder) (enheder) (enheder) (enheder) 8,3 8,5 8,0 8,3

Eksempel 11 20 g carboxymethylcellulose (0,5 mmol COOH) vaskedes tre gange med 1000 ml tetrahydrofuran, hvorfra 25 vandet var blevet fjernet med molekylarsigter 4A, og det blandedes derpå med 1000 ml tetrahydrofuran. Derpå omsattes 10 mmol triethylamin og 12 mmol l-methyl-2-chlor-pyridiumiodid hermed under omrøring..Reaktionsblandingen filtreredes derpå. Dannede krystaller vaskedes ti gange 30 med 1000 ml vandfrit chloroform og ti gange med 1000 ml vandfrit tetrahydrofuran. Til det således fremstillede aktiverede carboxymethyleellulose sattes under omrøring 5000 enheder af den i eksempel 2 opnåede adenylatkinase, som var blevet opløst i en 50 mM boratbufferopløsning (pH 35 8,0), og det omsattes ved 30°C i 1 time. Reaktionsblandingen adskiltes ved filtrering. Det således opnåede immobiliserede adenylatkinase-kombinationsprodukt vaskedes 31

DK 165702B

med 1000 ml vand og 1000 ml af en boratbufferopløsning (pH 8/0). Kombinationsproduktet gennemvædedes i 100 ml af en 500 mM ethanolamin- saltsyrebufferopløsning (pH

8,0) i 4 timer og vaskedes derefter med 1000 ml af en 50 5 mM phosphatbufferopløsning (pH 7,3) tre gange. Ændringen med tiden af den immobiliserede aktivitet og af aktiviteten som bestemt ved den i eksempel 7 beskrevne fremgangsmåde måltes, og resultaterne er anført i tabel 7.

Tabel 7 10 Lige efter Efter Efter Efter immobilisering 1 måned 6 måneder 12 måneder (enheder) (enheder) (enheder) (enheder) 3000 3000 2950 3100

Eksempel 12 15 30.000 enheder af den i eksempel 1 opnåede adeny- latkinase og 10 g CH-Sepharose®(fremstillet af Pharmacia Co.), som var blevet vasket og kvældet med 500 ml 1 mM saltsyre og derpå med 1000 ml destilleret vand til det tredobbelte volumen, opslemmedes i en blandet opløsning 20 af 250 ml af en 50 mM boratbufferopløsning og 250 ml ace-tonitril. Derpå sattes 2,5 mraol tri-tert-butylamin og 1,2 mmol l-chlor-2-ethylpyridiniumbranid dertil, og den resulterende blanding omsattes ved 20°C i 30 minutter under omrøring. Reaktionsblandingen passeredes gennem et 25 glasfilter. Det således opnåede immobiliserede adenylat-kinase-kombinationsprodukt vaskedes med 1000 ml af en 500 mM ethanolamin-saltsyrebufferopløsning og derpå fem gange med 500 ml portioner af en 50 mM Tris-saltsyrebuf-feropløsning, indeholdende 0,5 M KC1 (pH 8,0).Slutteligt 30 vaskedes kombinationsproduktet tre gange med 500 ml portioner af en 50 mM phosphatbufferopløsning. Filtrater fra alle trin samledes, og aktiviteten af filtratet og af det immobiliserede adenylatkinase-kombinationsprodukt måltes. Den således fremstillede immobiliserede adenylat-35 kinase opslemmedes i en 50 mM a-glycerophosphatbufferop-løsning (pH 7,0) og henstod ved stuetemperatur. Efter 6 måneder måltes aktiviteten. Resultaterne er anført i ta- 32

DK 165702B

bel 8. Det kan ses, at det omhandlede adenylatkinase-kom-binationsprodukt er overraskende stabilt. Den i filtratet genvundne adenylatkinase kan genanvendes.

Tabel 8 5 Begyndelses- Immobilise- Aktivitet Aktivitet af aktivitet ret aktivitet genvundet kombinations- i filtrat produkt efter _ ___6 måneder (enheder) (enheder) (enheder) (enheder) 10 30.000 18.000 10.000 17,500

Eksempel 13 10.000 enheder af den i eksempel 6 opnåede adenylatkinase opløstes i 500 ml af en 5 mM phosphatbufferopløsning (pH 7,1) under omrøring i 1 time, og 1 g DEAE-15 Sephadexe,A-25 (fremstillet af Pharmacia Co.) sattes dertil. Den resulterende blanding omrørtes ved stuetemperatur i 2 timer. Den således fremstillede opslemning hældtes på et sinterglasfilter og filtreredes. Det således opnåede uopløselige materiale vaskedes fem gange med 500 .

20 ml portioner destilleret vand. Filtrater fra alle trin samledes, og aktiviteten af filtratet og af det immobi-liserede adenylatkinase-kombinationsprodukt måltes. Det således fremstillede immobiliserede adenylatkinase-kom-binationsprodukt opslemmedes i en 50 mM phosphatbuffer-25 opløsning (pH 7,1) og henstod ved stuetemperatur. Efter 6 måneder og efter ét år måltes aktiviteten. Resultaterne er anført i tabel 9. Af tabel 9 kan det ses, at det omhandlede adenylatkinase-kombinationsprodukt bevarer dets aktivitet stabilt selv efter ét år.

30 Tabel 9

Begyndelses- Immobiliseret Aktivitet Aktivitet Aktivitet aktivitet aktivitet genvundet af kombi- af komH- i filtra- nations- nations- tet produkt produkt 35 efter 6 efter _ _ _ måneder ét år (enheder) (enheder) (enheder) (enheder) (enhedei) 10.000 7.000 2.800 6.500 6.300

Under anvendelse af den i filtratet genvundne

Claims (9)

1. Varmeresistent adenylatkinase, kende- 10 tegnet ved, at dens aktivitet efter en inkubering i en bufferopløsning ved ca 50°C i ca. 15 minutter er mindst ca. 80% af den oprindelige aktivitet forud for inkuberingen, at den har en molekylvægt på ca. 22.000 (målt ved gelchromatografi), antager en optimal pH-værdi 15 på ca. 7,5 ved 30°C og fungerer ved en temperatur på fra ca. 25°C til 65°C ved ca. pH 7,5, idet nævnte adenylatkinase er identisk med den adenylatkinase, der fremkommer ved dyrkning af en stamme af Bacillus stearothermophilus.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af en varmere-20 sistent adenylatkinase ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man dyrker en bakterie tilhørende arten Bacillus stearothermophilus og derfra opsamler den varme-resistente adenylatkinase.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendete g-25 n e t ved, at dyrkningen foretages kontinuerligt under sådanne betingelser, at fortyndingshastigheden (D) tilfredsstiller det matematiske udtryk (a): D i 0,9 Pn,ax (a) 30 hvori D betegner et fortyndingsforhold, og μ betegner det maksimale specifikke vækstforhold (1/time) for bakterien under kontinuerlige dyrkningsbetingelser.

4. Stabilt, immobiliseret adenylatkinase-kombinationsprodukt 35 kendetegnet ved, at det er fremstillet ved covalent binding af varmeresistent adenylatkinase ifølge krav 1 til en vanduopløselig bærer. DK 165702B

5. Kombinationsprodukt ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den varmeresistente adenylatkinase er en varmeresistent adenylatkinase dannet af Bacillus stearothermophilus.

6. Fremgangsmåde til fremstilling af et stabilt, immobil i seret adenylatkinase-kombinationsprodukt ifølge krav 4, kendetegnet ved, at man covalent binder en varmeresistent adenylatkinase ifølge krav 1 til en vanduopløselig bærer.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendeteg net ved, at den covalente binding udføres under anvendelse af et multifunktionelt reagens.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det multifunktionelle reagens er et 1- 15 alkyl-2-halogenpyridiniumsalt.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at man covalent binder en bærer, som er fremstillet ved omsætning af en vanduopløselig bærer, der indeholder en carboxylgruppe, med 1-alkyl-2-halogenpyri- 20 diniumsaltet under tilstedeværelse af et syrefjernende middel, til den varmeresistente adenylatkinase.