JPH04504362A - 酵素による７―アミノセフアロスポラン酸の製造 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 酵素による７−アミツセフアロスボラン酸の製造！量 多くの生物が他の生物にとって毒性である化学物質を製造する。これらの化合物 の重要な種類は酵母、菌・カビ、及びバクテリアにより製造される薬効性抗生物 質、例えばペニシリン、及びストレプトマイシンである。

抗生物質の主要な種類はセファロスポリンである。セファロスポリンＣ１及び７ −アミツセフアロスボラン酸を含むその誘導体などのセファロスポリン類は重要 な抗生物質である。セファロスポリンＣ及びその誘導体の製造法は、例えばＵ、 　Ｓ、特許３，８２１．２０９：Ｕ、ｓ、特許３，６５８．６４９；Ｕ、ｓ、特 許４，１１３．９４１：Ｕ、ｓ、特許３，７７６．８１５；Ｕ、ｓ、特許３，７ ２５．４００：Ｕ、ｓ、特許４，１４５，５３９、及びＵ、　Ｓ、特許３，９６ ０．６６２に記載されてい葛。しかしより良い、有効なセファロスポリン製造法 が必要である。

発明の要約 本発明はセファロスポリンＣ及び関連化合物からの７−・アミノセファる。本方 法は２段階酵素反応である。第１段階はセファロスポリンＣをカタラーゼ、及び Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＯ）から成る酵素混合物と接触させ、中間体グ ルタリル７−アミノセフ１０スポラン酸を形成する段階を含む。第２段階はアシ ル化生成物を脱アシル化酵素と接触させ、７−アミツセフアロスボラン酸を高収 率で製造する段階を含む。

反応は加圧酸素雰囲気下で行い、それによって反応の両段術を単一反応容器中で 行えるようにする。

本発明は又、大量のＤ−アミノ酸オキシダーゼを生産する酵母の変異株、及び大 量の脱アシル化酵素を生産するバクテリアの変異株に関する。

好ましい変異株は野生型の約１６０倍の量のＤ−アミノ酸オキシダーゼのための 本方法において使用することができる。好ましい変異バクテリアは野生型よりか なり大量の脱アシル化酵素を発現するアシネトバクチル種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａ ｃｔｅｒ　ｓｐｐ、）である。

本方法はセファロスポリンＣの７−アミツセフアロスボラン酸への変換のための 有効な一容器系を与える。

改良株を１列に示すフローチャートを描いたものである。

発明の詳細な説明 セファロスポリンＣからの７−ア冬ノセフアロスポラン酸の製造は２段階酵素反 応である：　（１）第１段階はセファロスポリンＣをカタラーゼ、及びＤＡＯと 接触させ、グルタリル７−アミツセフアロスボラン酸（グルタリル−７ＡＣＡ） を製造する段階を含む；　（２）第２段階はグルタリル７ＡＣＡを脱アシル化酵 素と接触させ、７−ＡＣＡを生産する段階を含む。

一般に以前の方法において、第１酵素段階では反応混合物：グルタリル７ＡＣＡ 、及びα−ケト酸中間体を与え、グルタリル７　Ａ、　ＣＡが主生成物である。

しかしα−ケト酸中間体は脱アシル化酵素との反応性が低い。反応性を増すため に追加の化学反応を使用する：微量の過酸化水素を第１酵素反応混合物に導入し 、過酸化水素を非酵素的に酸化的脱カルボキシル化によりα−ケト酸生成物と反 応させる。その結果グルタリル７−ＡＣＡが形成され、全反応が行われ、完結す る。

その後反応溶液を、脱アシル化酵素を含む第２の反応容器に導入し、７−ＡＣＡ を形成する。しかし第２段階を行う前に過酸化水素を除去しなければならない。

反応溶液を過酸化水素の除去のためにカタラーゼ酵素に暴露しなければならない 。

本方法は過酸化水素の必要をなくし、従って全反応を一反応容器中で行うことが できる。これは本システムにおいて、第１酵素反応器を約５０ｐｓｉｇかそれ以 上の酸素雰囲気下で操作することによりグルタリル７−ＡＣＡが主生成物となる ために可能になる。従って反応流出物に過酸化水素を加え、その後過剰の過酸化 水素をカタラーゼ反応物で除去する段階を除くことができる。両酵素にとって最 適の操作条件（例えば２５℃、ｐＨ８，０、及び５０ｐｓｉｇ圧力下）、及びＤ −アミノ酸オキシダーゼに必要な適した溶解酸素９下で、本方法は二酵素を相互 作用させて一単位とし、それによりセファロスポリンＣの７−ＡＣＡへの１段階 変換を可能にする（実施例８参照）。

酵素 本方法で使用する酵素はＤＡＯ，カタラーゼ、及びグルタル酸に特異的な脱アシ ル化酵素である。

ＤＡＯは数種類の供給源、例えばカビ（例えばペニシリウム　クリソ±１）、ア スペルギルス　ニゲル（Ａｓｐｅｒ　ｉ　目ｕｓ　ｎｉｇｅ工）、ネウロスポラ 　クラップ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）、バクテリア（例えばアニ ロバクチル種（Ａｅｒｏｂａ、ｃｔｅｒ　ｓｐｐ、Ｌバシルス　プロテウス（Ｂ ａｃｉｌｌｕｓ　ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス　アエルギノサ（Ｐｓｕｅ ｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、酵母（例えばトリボノブシス　パ リアビリス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ　ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、ガンシダ　ト ロピカリス乳類の組織（例えばブタ腎臓、ブタ肝臓、ねずみ肝臓）、及びがらが らへびの毒から発見することができる。

発明の変異倍数体（実施例１参照）はこの酵素の特に有用な供給源である。ＤＡ ＯはセファロスポリンＣのアミノ基を切断する。

ＤＡＯはトリボノブシス　パリアビリス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓｖａｒｉａｂ ｉｌｉｓ）のミクロボディー、及び細胞質に存在する。酵素は以下の方法で酵母 細胞から抽出することができる：高圧ホモジナイザーにより酵母細胞壁を破壊し 、透明無細胞抽出物を無機塩（硫酸アンモニウム）で処理する。硫酸アンモニウ ム処理上澄み液をフェニルセファロースを含むクロマトグラフィーカラムを用い て分別する。この粗酵素を穏やかな酸析出によりさらに精製する。この段階で特 異的酵素活性は１ｍｇ蛋白質当たり約３０単位である。さらに精製の必要がある 場合は、ＤＥＡＥ官能基を含む付加クロマトグラフィーカラムを使用することが できる。その後この酵素を微孔性膜シート素材などの基質に固定化し、酵素反応 器を形成することができる。

酵素カタラーゼは過酸化水素の酸素と水への分解を促進する。しかし、本方法の 場合のように高圧酸素下、及びＤＡＯの共存下でカタラーゼはセファロスポリン Ｃからグルタリル７−ＡＣＡへの酸化的脱アミノ化の促進剤でもある。カタラー ゼは多くの動物細胞に存在する酵素である。

遊離の溶液の状態で、ＤＡＯ／カタラーゼ酵素混合物の活性はＤＡＯのみに比べ て非常に増大する（少なくとも１８０％）。固定化酵素（例えば酵素反応器）を 用い、高圧酸素下で（例えば５０ｐ８ｉｇ）、反応性は少なくとも１０−１５倍 に増大する。

驚くべきことに、カタラーゼとＤ−アミノ酸オキシダーゼの組み合わせを含む反 応器を、高濃度のセファロスポリンＣを用いて大気圧下、そとから酸素が反応容 器に拡散しない条件下で操作すると、酸素が制限因子となる。この条件下で反応 は可逆的となり、生成物は製造されない。

しかし同反応器を大気圧下、酸素が外から反応容器に拡散する条件下で操作する と、反応性が増し、少量の生成物が形成される。反応に得られる溶解酸素の制限 を除くために本方法においては、加圧反応系を使用する。この操作条件下では溶 解酸素はもはや制限因子ではなく、反応は基質、セファロスポリンＣの濃度に依 存する、すなわち反応は１次反応になる。大気圧条件下と比較して、約５０ｐｓ ｉｇの圧力下の反応系の反応性は初期製造速度において８−１０倍、及び全反応 速度において４−５倍に増加する。

本方法の第２段階で酵素として使用する脱アシル化酵素はノ（クチリア、アシネ トバクチル種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐｐ、）中で発現する。このバ クテリアは０．１ｘＯ，３μの大きさのグラム陰性短桿である。ここでデアシラ ーゼとも呼ばれる脱アシル化酵素は中間化合物、グルタリル　７−アミノ−セフ ァロスポラン酸（グルタリル７−ＡＣＡ）のグルタリル側鎖を切断する。

脱アシル化酵素はアシネトバクチル種（Δ、　１２」二ｐグラム陰性）くクチリ アの細胞質中に存在する。脱アシル化酵素は以下の方法でノ（クチリアから抽出 することができる：培養物から形成した細胞ペーストを、ｐＨ８，０で０．０５ Ｍのリン酸ナトリウムを含む緩衝溶液中に懸濁する。高圧ホモジナイザーにより 細胞壁を破壊し、透明無細胞抽出物を硫酸アンモニウム処理により分別、濃縮す る。蛋白質濃厚液を、ＤＥＡＥを含む液体クロマトグラファーカラムを用いて精 製する。この酵素は凍結条件下で少なくとも６力月安定である。この酵素溶液を シリカ浸漬微孔性プラスチックシート（ＭＰＳ）素材などの基質に固定化し、酵 素反応器を形成することができる。

反応は約７．５−約８．５のｐＨにて行うことができる。変換のための最適ｐＨ 値は約８．５である。し均１しグルタリル７ＡＣＡ、及びセファロスポリンＣの 生物学的活性はｐＨ８，０以下でより安定である。従うて本方法において、操作 ｐＨ値としてｐ）Ｉｓ、０を使用する。

酵素−生産変異細胞 上記の通り、ＤＡＯ及びデアシラーゼは多種類の供給源からの多数の細胞により 発現する。しかしほとんどの場合、細胞による酵素の生産量は低すぎて実際には 有用でない。

本発明は野生型に比べてＤＡＯ及びデアシラーゼの発現を非常に増加させること ができる変異細胞系を含む。これらの変異細胞は野生型細胞を選択された条件下 で１種類かそれ以上の突然変異誘発物に暴露し、酵素の生産の増加を示す生存細 胞を選択することにより製造する。

酵母細胞、トリボノブシス　パリアビリス（Ｔｒｉｇｏｎｏ　５ｉｓｖａｒｉａ ｂｉｌｉｓ）（Ｔ、ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）変異倍数体の培養物をニトロサミン 化合物で処理する。得られた変異酵母細胞は野生型細胞より非常に多量のＤＡＯ を生産する。

デアシラーゼを生産するアシネトバクチル種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃ１！工　ｆ ｆｌ工）（Δ、ｓｐｐ、）細胞の培養物をニトロサミンで処理し、突然変異を起 こさせる。このようにして製造したアシネトバクチル種（Δ、王且旦工）の変異 株は野生型アシネトバクチル種（Δ、且旦本方法は固定化酵素、又は酵素反応器 を用いて行う。酵素は一般にプラスチック、又は布の支持体のような基質に固定 化するか、あるいはある条件下では反応溶液中で遊離していることもできる。微 孔性プラスチックシー）　（ＭＰＳ）は特に有用な寧持体である。しかし綿布な どの他の支持材料も使用することができる。

微孔性プラスチックシート（ＭＰＳ）はシート型のシリカ−ポリビニルクロリド 複合材料で、成型して種々の直径のカートリッジとすることができる。ＭＰＳは ポリエチレンイミン、及びグルタルアルデヒドを用いて誘導することができる。

誘導体ＭＰＳ　（ＰＥＩＧＬＵＴ）は蛋白質のアミノ基と反応することができる 。それは単位重量当たりの表面積が大きく、最高その重量の１０％の蛋白質と反 応することができる。

ポリエチレンイミン−グルタルアルデヒド誘導ＭＰＳカートリッジ（Ａｍｅ　ｒ 　ａ　ｃ　ｅ）を本方法において酵素の固定化のために使用する。

酵素、又は酵素を生産する全細胞を支持体に固定化することができる。

例えばＤＡＯを支持体上に固定化する、又は反応器中でＤＡＯを生産する上記の トリボノブシス　パリアビリス（Ｔｒ　ｉ　ｇｏｎｏｐｓ　ｉ　ｓ　ｖａｒｉａ ｂｉｌｉｓ）の変異株などのＤＡＯ−生産細胞を固定化することができる。約７ ｇの蛋白質を１００ｇの活性化ＭＰＳ上に固定化する。

酵素、又は細胞の固定化のために、中性のｐＨ（例えばｐＨ６，０）で０．０５ Ｍのリン酸ナトリウムなどの緩衝液を含む溶液、及び特定の酵素又は細胞懸濁液 を、２５℃で２時間、又はすべての蛋白質がＭＰＳに結合するまでどちらか早い 時間だけ活性化ＭＰＳに通す。その後ＭＰＳを緩衝液で洗浄する。その後反応Ｍ ＰＳを０．５Ｍのグリシン溶液で洗浄し、未処理アルデヒド部位をすべて覆う。

さらにリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄した後、反応ＭＰＳを酵素反応に使用する ことができる。

反応段階 本発明の方法は単一反応容器中で行う。酵素を適した支持体上に固定化し、出発 材料セファロスポランｃ４接触させる。

好ましい場合は、約６．０−約８．５のｐＨで濃度が約１．０ｇ／ｌのセフ１０ スポリンＣの溶液を用いる。特に好ましいｐＨは約８．　０である。セファロス ポリンＣはトリス緩衝液などの緩衝液に溶解する。セフ、１０スポリンＣの溶液 を最初に固定化ＤＡＯ／カタラーゼ酵素に接触リル−７−ＡＣＡとなる。第１段 階のグルタリル　７−ＡＣΔ生成物はその後第２の固定化酵素、デアシラーゼと 接触し、その酵素が所望の生成物７−ＡＣＡへの変換を触媒する。反応生成物は ７−ＡＣＡ、グルタル酸、及びアンモニアである。

反応は約２０−約５０℃の温度で行い、約２５℃−約３５℃の温度が好ましい。

反応のｐＨ範囲は約６．５−約９．０であることができ、約８．０が好ましい。

反応は加圧酸素雰囲気下で行い、酸素を反応媒体に溶解させ、それによってセフ ァロスポリンＣの酸化を可能にする。約５０ｐｓｉｇの圧力、又は酸素圧が本発 明において特に有効である。

本発明の他の具体化において、ナトリウムボロハイドライドを反応混合物に加え る。ナトリウムボロハイドライド（ＮａＢＨ４）は反応における固定化ＤＡＯ酵 素の半減期を延長する。

本方法により７−アミノセファロスポラン酸の高収率で有効な製造を行うことが できる。

セファロスポリン類はペニシリンと密接に関連している。これらの化合物は製薬 、及び医学的用途において抗微生物剤として有用である。本方法は有効な薬剤の 新しい系列の基礎となるセファロスポリン誘導体、７−ＡＣＡの高収率製造に使 用することができる。

７−ＡＣＡはセファレキシン、セファログリシン、セファロリジン、セファロチ ン、セファクロール、及びセフアンドールを含む第３及び第４のセファロスポリ ンファミリー抗生物質のすべてのための主要成分、又は中間体である。過去にお いて、はとんどの７−ＡＣΔ製造には厳しい反応条件下で、ある毒性化学物質を 用いた化学的方法を使用した。環境的、及び経済的面から、現存の化学的方法に 代わって生物触媒を使用する傾向がある。７−ＡＣＡの製造のためにはアルファ 　アミノ　アジピン酸側鎖をセファロスポリンＣ分子から除去しなければならな い。この側鎖は長すぎてほとんどの酵素が反応できない。本方法は２段階酵素法 を使用する；しかし両酵素に関する反応条件が非常に類似しているので両段階を 結び付け、一段階法とすることができる。

本発明を以下の実施例により説明するが、いずれにしろ制限として理解するべき ではない。

実施例 実施例１：トリボノブシス　パリアビリス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓｖａｒｉａ ｂｉｌｉｓ）のための倍数体突然変異トリボノブシス　パリアビリス（Ｔｒｉｇ ｏｎｏｐｓｉｓ　ｖａｒｉ導する。野生型細胞を０．０２％カンファー、及び／ 又はカンファー類似物（カンファーカルボン酸、及びカンファースルホン酸）で ４８時間、３回処理する。処理微生物をＹＭ寒天プレートで３０℃にて３日間培 養する。成長が速く、最も大きい単一コロニーの群が見られる。これらのコロニ ーを個別にＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）で処 理し、さらに変異さする。０℃の温度にて４０−６０分の間、培養物１ｍｌ当た り０．２５ｍｇのＮＴＧを加える。

一系列のトリボノブシス　パリアビリス（Ｔ、ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）倍数体変 異単一コロニーを単離し、培養する。修正培地、及び発酵条件を組み合わせるこ とにより、変異トリボノブシス　パリアビリス（Ｔｒ−ＬＬｑ」刃」す５ｉｓ− ヱａｒｉａｂｉユ」」−）において発現するＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性が０ ．１国際単位／ｍ１　（野生型）から１５５国際単／ｍｌに増加する。

ｓ　ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）の改良株はＡｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕ ｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣ番号２０９３１で預託した。

トリボノブシス　パリアビリス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ　ｖａｒｉａｂｉｌｉ ｓ）（Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ）の培養法トリボノブシス　パリアビリス（Ｔ ｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ　ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）の酵母の１ループを：酵母抽出 物、５ｇ／ｌ；麦芽抽出物、５ｇ／ｌ；ペプトン、５ｇ／ｌ；及びグルコース、 １０ｇ／ｌを含むｌｏＯｍｌの培養ブロス（ＹＭ培地）に移す。混合物を３０℃ にて２４時間培養し、５００ｍ１の培養フラスコに移す。第２段階を上記と同様 の操作条件下で２４時間培養する。この成長したばかりの接種材料をツルリス、 ビオチン、ＤＬメチオニン、チアミン、ウレア、及びある無機塩を含む発酵媒地 に移す。培地の処方は以下に示す。発酵器は３０℃に２４−４８時間保ち、穏や かに撹拌しく１５ｌ５０−３０Ｏｒｐ　、穏やかに空気を通す（大気圧にて０． ３リットル／リットル／分）。最初の１２時間は溶解酸素を５０％以上に保ち、 その後１０％以下に保つ。

接種後３６時間で成長が定常相に達したら（ＯＤｓ　＠・が３５に達し、培地の ｐＨが５．０であり、細胞が暗茶に変わる）、酵素の発現は最高に達する。この ６０リツトルの発酵により約１７３０ｇの充填湿潤細胞、及び９００．０ＯＯＩ ＵのＤ−アミノ酸オキシダーゼが製造される。

トリボノブシス　パリアビリス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ　ｖａｒｉ培地ＮＯ１ ■ ｇ／　ｌ　ｇ／　Ｉ ＫＨｚＰＯ＜　４　Ｍｇ５０４７ＨｔＯｌＣａＣｌ２２ＨｔＯｏ、５　ＨｓＢＯ ｓ　Ｏ，１（ＮＨ４）ｓＭｏＯｔｎ　ｏ、ｏ４　Ｍｎ５Ｏａ４ＨｔＯｏ、０４Ｚ ｎＳＯｎ７Ｈ＊０　０．０４　ＣｕＳＯ４５ＨｚＯＯ，０４５ＦｅＳＯａ７Ｈｔ Ｏｏ、０２５　ＤＬメチオニン　２．６７ビオチン　０．０２　チアミン　０． ０００１グルコース　２０　ウレア　２．５ Ｍａｚｕｄｆ（消泡剤）　１ｍｌ 培地Ｎｏ、２ ｇ／Ｉ ＫＨＨＦＯ２４ウレア　ｌ ＭｇＳＯ４７Ｈ２０１ＤＬメチオニン　３ツルリス　７．５　ビオチン　０．０ ２グルコース　１５　スクロース　１０ Ｍａｚｕｄｆ（消泡剤）　１ｍｌ。

殺菌の前にｐＨを５．６に調節した。

実施例２：Ｄ−アミノ酸オキダーゼの単離と精製実施例１に記載の要領で製造し た細胞１７３０ｇを、ｐＨ８，０にて０．０１Ｍのどロリン酸、０．０ＩＥＤＴ Ａ７．７１に再懸濁した。細胞懸濁液を高圧ホモジナイザー（ｍａｎ　ｔ　ｐｎ −Ｇｓ　ｕ　１　ｉ　ｎホモジナイザー、１１．０ＯＯｐｓｉ）に３回通した。

この段階で、２６０．　０００単位のＤ−アミノ酸オキシダーゼが回収され１． ＝。その後透明な上澄み液（９，３１）を１５５３ｇの硫酸アンモニウムと約６ ０−９０分混合した。５ｈａｒｐｌｅｓの遠心機により沈澱と上澄み液を分離し た。

透明な上澄み液（９，３１）を１．２Ｍの硫酸アンモニウムで平衡化したフェニ ルセファロース液体クロマトグラフィーカラム上に置いた。酵素をｐＨ８，３に て０．ＯＯＩＭのＥＤＴＡを含む０．ＯＩＭのビロリン酸塩緩衝液を用いて溶離 した。結果：酵素活性の５８，５％を回収した。その後プールした留分をｐＨ５ ，２にて酢酸で処理した。回収した酵素の比活性は蛋白質１ｍｇ当たり３０単位 でありだ。約９５．０００！ＵのＤ−アミノ酸オキシダーゼを回収した。酵素を ４℃にてＤＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）と共に保存し、固定化まで２週間安定であった 。

てグルタル酸を使用し、１ｍｌ当たり０．００５−０．０１国際隙率のデアシラ ーゼを生産する。

バクテリアをＮ−メチル−Ｎ′−÷ドローＮ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）　 、及びエチルメタンスルホネートで処理した。この処理の条件は０℃にて０．２ −０．５ｍｇ／ｍｌで１０−５０分間である。酵素デアシラーゼ活性はく野生型 ）０．００５−０．０１１０／ｍｌから０、　４１　Ｕ／ｍ　１に増加した。

アシネトバクチル種（Δ工王且且、）ＹＳ１１４で示されるアシネトバクチル種 （Ａ、ｓｐｐ、　）の改良株をＡｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃ ｏ１１ｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣＮｏ、５３８９１で預託した。

脱アシル化酵素生産バクテリアの培養 ＹＳ１１４の単一コロニーを１００ｍ１の培地に２５℃にて２４時間移した。接 種培地の処方を以下に挙げる；ＹＳ１１４のための接種培地（ＹＭ培地）の処方 ペクトペプトン　Ｌｏｇ／ｌ 酵母抽出物　２ｇ／ｌ 牛肉抽出物　５ｇ／ｌ ＮａＣ１５ｇ／ｌ グルタル酸　１ｇ／ｌ　ｐＨ７，０ 発酵培地処方を以下に挙げる： ＹＳ１１４のための発酵培地の処方 培地Ｎ０１１ プロフロ　１０　ｇ／　１ 酵母抽出物　５ｇ／ｌ ツルリス　２ｇ／ｌ グルタル酸　１寥／１ ＮａＣ３５ｇ／ｌ グルコース　Ｌｏｇ／ｌ　ｐＨ７，５ 培地Ｎ００２ 酵母抽出物　２ｇ／Ｉ ＫＨｔＰＯｓ　１ｇ／ｌ ツルリス　２ｇ／ｌ モノナトリウムグルタメート　２ｇ／ｌＮａＣ１５ｇ／Ｉ Ａｔｇｅ１２００　２０ｇ／ｌ　ｐＨ７，５５５０１の発酵器を酵素製造に使用 した。１０１の接種材料を使用し、２５℃にて穏やかに空気を吹き込み（２１／ １／ｍ）、激しく撹拌して（４００−６００ｒｐｍ）発酵を行った。溶解酸素は 飽和の５０％以上を保持し、ｐＨは運転中制御せず、ｐＨは結局８．５に上がっ た。培養物を３０分間発酵させ、１１のブロス当たり４００国際単隙率酵素が発 現した。５ｈａｒｐｌｅｓｓ遠心機から約２５２７国隙率位の酵素、及び５５０ ０ｇの細胞ペーストを回収した。

＊国際単位（Ｉ［）−３７℃、ｐＨ８，０にて１分当たりに生産される１マイク ロモルの７　ＡＣＡ。

実施例４：脱アシル化酵素の単離と精製実施例３に記載の要領で製造した２、６ ｋｇの充填アシネトバクチル種（Ａ、ｓｐｐ、）細胞を室温にて終夜解凍し、２ ．６１の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８，０に再懸濁した。懸濁液を別 の緩衝液６１と混合し、高圧ホモジナイザーに３回通過させ、透明上澄み液を回 収した。この段階で１１．５Ｌ及び１１３２１Ｕの脱アシル化酵素活性を回収し た。溶液に１１７１ｇの硫酸アンモニウムを加え、６０分間混合し、５ｈａｒｐ ｌｅｓ遠心機を用いて遠心した。上澄み液、及び追加の２０２１ｇの硫酸アンモ ニウムを加えた。遠心後、５２２単位の酵素を回収した。この蛋白質沈澱を０． ０５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液にｐＨ８，０にて溶解し、同緩衝液を用いて終 夜透析した。その後酵素溶液をＤＥＡＥ液体クロマトグラフィーカラムを用いて 分別し、濃度を０から０．３Ｍに直線的に変化させたＮａＣ１溶液を用いて溶離 した。酵素のピークは０．１ＭのＮａＣ１塩にて溶離した。この段階で４．７ｇ 。

及び４２６国際単隙率０．０８９１Ｕ／ｍｇ蛋白質）の脱アシル化酵素を回収し た。酵素を一２０℃にて冷凍保存し、固定化に備えた。この調剤は６力月間安定 であった。

３００ｍ１のＤ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＯ）溶液（７１４０１Ｕ、９００ ｍｇ）を、厚さが０．５インチ（２３シート、直径４７ｍｍ）の活性化ＭＰＳに 通過させた。ＤＡＯ溶液を６ｍ１７分にて２時間再循環させた。酵素の９０％が ＭＰＳに結合した。反応器の過剰のアルデヒド部位を０．０５Ｍのトリス緩衝液 中でｐＨ８，０にて０．５Ｍのグリシンを用いてクエンチし、０．０５Ｍのトリ ス緩衝液中、４℃にて保存した。この反応器を続いてセファロスポリンＣ／グル タリル−７−ＡＣＡ変換研究に使用した。

Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、及びカタラーゼの場合の固定化法７７０ｍｇのＤＡ Ｏ（１４８１の抽出物、及び５ｍｇ／ｍｌのＤＴＴから３０ＩＵ／ｍｇ）、及び １０．３ｍｇのカタラーゼ（Ｓ　ｉ　ｇｍａＣ３０，２２，８００１Ｕ／ｍｇ） を９６００ｍｇ　（厚さが０．５インチ、２４シート、及び直径が４７ｍｍ）の ＰＥＩ／ＧＬＵ活性化ＭＰＳ上に固定化した。酵素溶液を６ｍ１／分にて３回反 応器に通過させた。

反応器の過剰のアルデヒド部位をｐＨ８，０の０．０５Ｍのトリス緩衝液中、０ ．５Ｍの別のグリシン３００ｍ１を用いてクエンチした。その後反応器をｐＨ８ ，０にて０．０５Ｍのトリス緩衝液で洗浄し、１０／ｌ］／ｍｇのゲンタマイシ ンを含む同緩衝液２０ｍ１中に保存した。固定化の効率は約８９％であり、合計 ２０６７０単位のＤ−アミノ酸オキシダーゼが反応器に固定化された（ＭＰＳＩ シート当たり８６０単位のＤ−アミノ酸オキシダーゼ）。

酵素２−説アシル化酵素の固定化法 １２シートのＭＰＳ（直径が４７ｍｍ、４８００ｍｇ）を持つＰＥＩ／ＧＬＵ活 性化モジュールを使用した。１１０ｍ１の酵素ＩＩ溶液（０，２国際単位／ｍＬ 　２２．２単位、及び３９２ｍｇ蛋白質）を６ｍｌ／分にて３回反応器に通過さ せた。反応器をｐＨ８，０にて０．０５Ｍのトリス緩衝液中の０．５Ｍのグリシ ン２００ｍ１に通過させ、続いて１００ｍ１の０．０５Ｍ１−リス緩衝液を用い てフラッジした。洗浄後、反応器をｐＨ８，０にて１０Ｍｇ／ｍｌのゲンタマイ シンを含む０．０５Ｍのトリス緩衝液中に保存した。結局合計３３１ｍｇの蛋白 質、及び１９９国際単が反応器に結合した。酵素２−アシル化酵素の８４゜５％ が結合した（ＭＰＳのシート１枚当たり１．５６１Ｕ）。

ロスボリンＣのｐＨの影響 １．０ｇ／ｌの濃度のセファロスポリンＣ溶液を用いてＤ−アミノ酸オキシダー ゼ／カタラーゼ酵素混合物へのｐＨの影響を研究した。保存溶液を作り、１００ ｍ１アリコートに分け、ｐｔｉを６．　０．７．０、及び８．０に調節した。セ ファロスポリンＣ溶液の各アリコートを固定化酵素を含む反応器に２ｍ１７分の 速度で、１回通過法にて通過させた。

実験前に反応器を適した緩衝溶液でフラッジした。

これらの実験は室温、及び大気圧下で行った。最適ｐＨは８．０である。

５、Ｑ　７５％ ７．０　８５％ ８．０　１００％ 固定化酵素Ｄ−アりノ酸オキシダーゼの反応性に対する作業温度の頭 Ｄ−アミノ酸オキシダーゼへの温度の影響を数種類の作業温度条件下で研究した 。反応器を２０，２５．３０．３５．４０．４５、及び５０℃に設定した湯浴中 で操作した。作業パラメーターは２ｍ１／分、ｐＨ８，０であり、セファロスポ リンＣの濃度はＩｇｍ／ｌである。反応性は４５℃で最高に達した。しかし反応 器は３０−４５℃でも類似の性能を持つ。温度研究の結果を表ＩＩに示す：３０ 　主ス ４０　旦互 固定化酵素デアシラーゼの反応性に対する基質のｐＨの影響希釈基質、１回通過 法を用いてデアシラーゼへのｐＨの影響を研究した。５．５５ｇ／ｌのグルタリ ル　７−ＡＣＡの保存溶液を作り、１００ｍ１のアリコートに分け、ＩＮのＮａ ＯＨを用いてｐＨを以下の値に調節した：ｐＨ５，０，７，０，７，５，８，０ ，８，５、及び９．０゜基質の各アリコートを螺動ポンプを用い、２ｍ１／分の 速度にて１回通過法で酵素ＩＩの反応器を通した。実験は室温、及び大気圧にて 行った。

わかる通り、酵素ＩＩを用いたグルタリル７ＡＣＡの７ＡＣＡへの変換の最適ｐ Ｈは約８．５である。種々のｐＨの相対的反応性を表ＩＩＩに示す： ５．０　５７％ ７．０　５８％ ７．５　６６％ ８、０　７６％ ８．５　１００％ ９、０　９８％ 固定化酵素Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの反応性への作業温度の影響数種類の作業 温度条件下で反応器ＩＩへの温度の影響を研究した。反応器を２０．２５．３０ ．３５．４０．４５．５０．５５、及び６０℃に設定した湯浴中で操作した。作 業パラメーターは２ｍ１／分、ｐＨ８゜０であり、グルタリル７ＡＣＡの濃度は ０．４５ｇｍ／Ｉである。反応性は４５℃で最高に達した。しかし反応器は３５ 、及び４５℃でも類似の性能を持つ。温度研究の結果を表Ｉｖに示す：両酵素反 応器の反応性への酸素の圧力 この実験はセファロスポリンＣからグルタリル７−ＡＣＡへの脱アミノ化反応に おける溶解酸素の有効性を示す。反応を５０ｐｓ　ｉｇの圧力下で行い、純粋の 酸素を反応容器中に拡散する。濃度が５１．３−６４゜５ｇ／ｌ、ｐＨが８．０ のセファロスポリンＣ溶液を循環法で反応器にポンプで通す。この反応器は、反 応器１シートにより生産されるグルタリル７−ＡＣＡが１分当たり１９．６ｍｇ という高い初期速度を示し、全体の速度は８．４である。大気圧で作業し、純粋 の酸素を反応容器中に拡散させる反応と比較して反応速度は、反応器１シートに より生産されるグルタリル７−ＡＣＡが１分当たり１．７−２．３ｇｍの範囲に 減少した。反応性は初期、及び全体の生産速度において類似であった。これらの 研究の比較を以下に示すチャートに挙げる。さらに反応性が非常に向上したばか りでな（、反応生成物も改良され、表Ｖに示すようにグルタリル７−ＡＣＡが主 生成物となる：表Ｖ 時間　速度（ｍｇグルタリル？ＡＣＡ生産／分／ＭＰＳシート）分　５０ｐｓｉ ｇ’　Ｏｐｓｉｇ”　Ｏｐｓｉｇ”２０　１９．６　データなし　データなし４ ０　１３．４　データなし　データなし６０　１１．３　２．６　１．５５ ８０　８、４　データなし　データなし９０　データなし　２．６　データなし １２０　データなし　２．６５　１．６０１８０　データなし　データなし　１ ．７５’　５０ｐｓｉｇ、ｐＨ８，０、及び流量６ｍｌ／分、２４シート反応器 で作業 ２大気圧、ｐｉ−Ｉｇ、０、及び流量６ｍ１／分、１シート反応器で作３大気圧 、ｐ）１８．０、及び流量１４ｍ１／分、４シート反応器で作業 実施例７：５０ｐｓｉｇ酸素圧力下におけるＤ−アミノ酸オキシダーゼ／カタラ ーゼの酵素反応器の条件、及び結果１９．３５ｇの精製セファロスポリンＣ（ロ ット番号２３５ＣＸ６）を０．１５Ｍのトリス緩衝液３００ｍ１に溶解し、０． ＩＮのＮａＯＨを用いてｐＨを８．０に調節した。セファロスポリンＣ溶液をポ ンプで酵素反応器１　（ＤＡＯ／カタラーゼ）に通し、６．０ｍｌ／分で循環さ せた。全系を５０ｐｓｉｇの圧力の純粋酸素で酸素を濃縮した環境下に置いた。

８０分以内にすべてのセファロスポリンＣがα−ケト酸（１４゜８８ｇｍ／ｌ） 、及びグルタリル７−ＡＣＡ　（５２，６ｇｍ／ｌ）に変換された。１分当たり １９７ｍｇのグルタリル酸７−ＡＣＡの製造速度（８゜２ｍｇ／分／シート反応 器）、及び９０．６％の生成物回収（モル比）が達成された。酸素濃縮環境下で 酸素が豊富になり、この反応は１次反応になる。結果を表ＶＩに示す：表ｙ１ ５０ｐｓｉｇ酸素圧力下における反応器１時間　ｐＨセファロＣセファロＣαケ ト　グル７ＡＣＡ　モルラし　Ｌ　黙国乙工広　広　囲諌 ０８．０６４．５０　０　０ ２０　７．７　２８．３　３６．２　１４．３　３１．４　９６．４％４０７． ３　１２．　３　５２．　２　１４．　２　４２．　８　９１．　３％６０　７ ．２５　４．３　６０．２　１４．６　５４．４９３．７％８０　７、　１　０ ゜０　６４．５　１４．８　５２．６　９０．６％大気酸素圧力下におけるＤ− アミノ酸オキシダーゼの酵素反応器の条件、及び結果 １２．０４ｇの精製セファロスポリンＣ（ロフト番号２３４ＣＸ６）をｐＨ８， ０の０．１５Ｍのトリス緩衝液５０ｍ１に溶解した。０．ＩＮのＮａＯＨを用い て溶解セファロスポリン溶液のｐＨを６．７に調節した。セファロスポリンＣ溶 液をポンプで１０．０ｍｌ／分にて酵素反応器■に通し、純粋な酸素をスパージ ャ−を通して反応槽に吹き込む。

この低酸素圧下で、反応器の反応性は実施例７に挙げた５０ｐｓｉｇの高酸素圧 下の反応性の約５分の１であった。この実験における製造は表Ｖｌｌに示す通り 、１分当たり約６．４ｍｇのグルタリル７ＡＣＡ　（１゜６ｍｇ／分／シート反 応器）であり、生成物回収（モル）は７８．０％である： 表ＶＩＩ 大気酸素圧 時間　セファロＣセファロＣδケト　グル７ＡＣＡ　モル−ａ−呈ｚ１　使用ｇ ／ｌ　呈乙１　ｇ／ｌ　皿区肇０４０．１　０　０　０ ３０　３３．２　６．９　３．２　３．６６０　２３．８　１６．３　６．２　 ７．４１２０　１７．１　２３．０　１２．０　１５．３１８０　５．５　３４ ．６　２０．２　２５．２　８０．９％２１０　１．９　３８．２　１７．４　 ２６．８　７８．０％グルタリル７−ＡＣＡのための化学反応の条件３．０％過 酸化水素溶液６．０ｍｌを、前実験からの生成物溶液（α−ケト酸中間体とグル タリル７ＡＣＡの混合物）に２５℃で２時間加えた。α−ケト酸はすべてグルリ タル７−ＡＣＡに変換された。グルタリル７ＡＣＡの最終濃度は２５．９ｇ／ｌ と分析された。

デアシラーゼの場合の酵素反応の条件と結果１１５ｍ１のグルタリル７ＡＣＡ溶 液（２５，９ｇｍ／１．３ｇ）を、６ｍｌ／分の流量にて酵素反応器ＩＩ（デア シラーゼ固定化ＭＰＳ３５シート、直径４７ｍｍ）に通した。基質のｐＨを手動 で８．０に調節した。１分光たり５．８ｍｇの７−ＡＣＡの製造速度で反応を４ 時間行った。反応の終結後１．４ｇの７−ＡＣＡを回収した。この反応器のモル 生成物回収は７５−８３％であった。

実施例８：セファロ不ポリンＣから７ＡＣＡへの一段階変換以下の酵素反応器配 置を用いてセファロスポリンＣからの７ＡＣＡへの一段階変換を行った。酵素１ 反応器（合計３４５０単位のＤ−アミノオキシダーゼを含む、直径４７ｍｍの５ シート）のすぐ下流に酵素２反応間抜合材料（合計３１国際隙率の脱アシル化酵 素を含む直径が４７ｍｍの２４シート）を置いた。ｐＨ８，０の０．１Ｍのトリ ス中の６．６ｇ／ｌのセファロスポリンＣ溶液３００ｍ１を４．４ｍｌ／分の速 度でこの系に循環させた。全系を５０ｐｓｉｇ酸素下で加圧した。結果を表Ｖ［ Ｉ夏に示す： 表ｖＩｉｉ 時間　セファロＣα−ケト　グル７ＡＣＡ　７ＡＣＡＡ分と　（ｇ／Ｉ）　工院 ’１）　（ｇ／　Ｉ）　（ｇ／　１）−０６，６０００ ３０６，３０００，０３ ６０５，３６００，０７０，１１ ９０４，１５００，１８０，２３ １２０３，９４００，３００，３７ １８０２，８５００，４６０，７０ ２４０１゜９７　０　０．５０　１．０３００　１．８５　０　０．５１　１． ５３３６０　１４５　０　０．４１　１．７０４２０　０．９０　０　０．２９ 　１．８０４６５　０．７５　０　０．２３　１．８９基質を７６７５時間循環 させた後、基質を除去した。反応器を９５ｍ１のトリス緩衝液、０．０５Ｍ、ｐ Ｈ８，０を用いてフラッジした。合計１０．４５ｍｇのセファロスポリンＣ，３ ０，４ｍｇのグルタリル７−ＡＣＡ、及び１２３．５ｍｇの７−ＡＣＡを回収し た。７−ＡＣＡの合計製造速度は１．４９ｍｇ／分であり、合計回収率は６２． ９％であった。α−ケト酸中間体は検出されなかった。

グルタルアルドヒト処理、続いてナトリウムボロハイドライド処理を用いて酵素 と支持体の間の結合の安定化を試みた。グルタルアルデヒドは酵素を可能なペン ダントＰＥＩ基に接続するのに使用された。ナトリウムボロハイドライドはアル デヒド−アミノ結合により形成されたシッフ塩基を還元し、それによつて結合を 飽和し、攻撃からそれを保護するために使用した。

未処理　Ｇｌｕ−ＮａＢＨ。

投影半減期　１２時間　１３０時間 第１半減期中に　５．８ｍｇ／ＩＵ　４４ｍｇ／ＩＵ作られたグルタリル− ７ＡＣＡ、ｍｇ／ＩＵ 実施例１０：デアシラーゼ　グルタルアルデヒド固定細胞Ｌｏｇのアシネトバク チル種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐｐ、）細胞ペースト（２０時間収穫 ）に８０ｍ１のｐＨ８食塩水を加えた。その後２５％グルタルアルデヒドを溶液 に加え、最終濃度を１％とした。

ｐＨを６．５に調節し、混合物を室温にて１時間放置、又はゆっくり撹拌した。

細胞を回転して落とし、０．１Ｍリン酸塩緩衝液で２回洗浄し、同緩衝液に再懸 濁した。固定の前、酵素活性は７６５．５１Ｕ／ｍｌ　；固定の後活性は７０４ ．５１Ｕ／ｍｌであり、活性の３％損失を示す。

細胞をｇＱｍｌｓのグルタリル−７ＡＣＡ溶液（３５ｇ／ｌ、ｐＨ８，０）に懸 濁した。ＩＯＮのＮ　ａ　ＯＨを用いて、周期的にｐＨを８゜０に調節した。

投影半減期は１７０時間である（細胞の分析活性に基づいて）。

反応器の第１半減期に作られた合計７ＡＣＡは５．９５ｇである。

平均速度は０．５１６ｍｇ／時間・ＩＵである。

第１半減期に作られた７ＡＣＡのｍｇ／ＩＵは１０４ｍｇ／ＩＵに等しい。

８７の二試料を以下のように処理した＝２５ｇの細胞を３％酢酸エチルと共に２ ０分間練った。細胞混合物を回転して落とし、上澄み液を除去した。両試料をそ れぞれ１００ｍ１ｓの０．０５Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ８，０に再懸濁した。試 料を、４．９ｇのポリエチレンイミン　グルタルアルデヒド誘導フランネルを積 み重ね、厚さ４７ｍｍｘｌ／２’としたものに１回通し、反応器カートリッジ酸 に詰め、２％グルタルアルデヒドを用いて２時間固定した。その後試料を同緩衝 液でフラッジした。

結合容量は全細胞４．５ｇ、マイナス−抽出細胞１０ｇであった。試験条件は酸 素が５９ｐｓ　ｉ、流量が２２ｍ１／分、及びセファロスポリンＣ濃度が４０　 ｇ／　１であった。結果は以下である：全細胞　マイナス−抽出細胞 投影半減期　２００時間　４６５時間 第１半減期中に　５．２ｇｍ／ｇｍ細胞　８．２４ｇｍ／ｇｍ細胞作られたグル タル− ＡＣＡ 新しい場合の　１．３ｍｇ／分・ｇｍ　１．４ｍｇ／分・ｇｍ平均速度 １対のＤ−アミノ酸オキシダーゼ反応器を用い、４０ｇ／Ｉのセファロスポリン Ｃ，５０ｐｓｉｇのＯ！、及び２２ｍ１／分の流量にて寿命の研究を行った。反 応器をバッチ循環法により終夜運転し、２４時間毎にＦＡＤ−メルカプトエタノ ール還元カクテルで洗浄した。

同等物 日常的実験を用いるだけで、同業者は本文に記載の特定の物質、及び方法の多数 の同等物を認識する、又は確認することができるであろう。

そのような同等物は本発明の範囲内であり、以下の特許請求の範囲により網羅さ れていると思われる。

トリゴノプシスバリアとリスの改良種の列トリゴノプシスバリアとリス　（ＤＡ Ｏ０，１−０，５Ｉ　Ｕ／曽１）ＴＶ−ｃ−ＩＩ　（ＤＡ（）０．５−０．８　 Ｉ　Ｕ／ｍｌ　）ＴＶ−ｃｃ　−Ｖ　（ＤＡＯＯ，ツー１．ＯＩＵ／ｍ１）ＴＶ −ｃｃｃ−ＶＩＩ　（ＤＡＯｌ、２−１．５ＩＵ／ｅｅｌ）ＴＶ−ＣＮ−Ｉ　Ｉ ＊　ＴＶ−ＣＮ−Ｉ＊（ＤＡＯ８−１１ＩＵ／ｍｌ）　（ＤＡＯツー１０　Ｉ　 Ｕ／ｍｌ　）ＴＶ−ＣＮ−Ｉ　Ｉ−Ｉ＊　ＴＶ−ＣＮ−Ｉ−Ｉ＊（ＤＡＯ１１− １４Ｉ　Ｕ／論１）　（ＤＡＯ１０−１３ＩＵ／ｍ１）ＴＶ−ＣＮ−Ｉ　Ｉ−Ｉ −Ｉ　３３１６７（ＤＡＯ１５−２０Ｉ　Ｕ／ｍｌ）　（ＤＡｏ　１０−１４　 Ｉ　Ｕ／論ｌ）補正音の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成 ３年１０月４日Ｕ町

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．７−アミノセファロスポラン酸の製造法において：ａ．セファロスポリンＣ を、その脱アミノ化を起すのに十分な条件下でカタラーゼ、及びＤ−アミノ酸オ キシダーゼと接触させ、それによりグルタル７−アミノセファロスポラン酸を製 造し：ｂ．（ａ）段階の生成物を７−アミノセファロスポラン酸の製造に十分な 条件下でデアシラーゼと接触させる段階を含むことを特徴とする方法。 ２．第１項に記載の方法において、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼをトリゴノプシス バリアビリス（Ｔ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）から誘導することを特徴とする方法 。 ３．第２項に記載の方法において、トリゴノブシスパリアビリス（Ｔ．ｖａｒｉ ａｂｉｌｉｓ）がＡＴＣＣ２０９３１株であることを特徴とする方法。 ４．第１項に記載の方法において、デアシラーゼをアシネトバクテル種（Ａｃｉ ｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｓｐｐ．）から誘導することを特徴とする方法。 ５．第４項に記載の方法において、アシネトバクテル種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃ ｔｅｒｓｐｐ．）がＡＴＣＣ５３８９１株であることを特徴とする方法。 ６．第２項に記載の方法において、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを支持体上に固定 化することを特徴とする方法。 ７．第４項に記載の方法において、デアシラーゼを支持体上に固定化することを 特徴とする方法。 ８．第１項に記載の方法において、セファロスポリンＣの脱アミノ化を起こすの に十分な条件が、約２０℃から約４５℃の温度、約６．５から約８．５のｐＨ、 及び約５０ｐｓｉｇの酸素圧力から成ることを特徴とする方法。 ９．第８項に記載の方法において、温度が約２５℃から約３５℃であり、ｐＨが ８．０であり、酸素圧力が約５０ｐｓｉｇであることを特徴とする方法。 １０．７−アミノセファロスポラン酸の製造法において：７−アミノセファロス ポラン酸の製造に十分な条件下でセファロスポリンＣ、カタラーゼ、Ｄ−アミノ 酸オキシダーゼ、酸素、及びデアシラーゼを反応容器中で結合することを特徴と する方法。 １１．第１０項に記載の方法において、反応容器を加圧することを特徴とする方 法。 １２．第１０項に記載の方法において、さらにナトリウムポロハイドライドを含 むことを特徴とする方法。 １３．７−アミノセファロスポラン酸の製造法において：７−アミノセファロス ポラン酸の製造に十分な条件下でセファロスポリンＣ、Ｄ−アミノ酸オキシダー ゼの供給源、カタラーゼ、及びデアシラーゼの供給源、及び酸素を反応容器中で 結合することを特徴とする方法。 １４．第１３項に記載の方法において、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの供給源がト リゴノプシスパリアピリス（Ｔ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）細胞であることを特徴 とする方法。 １５．第１４項に記載の方法において、トリゴノプシスバリアビリス（Ｔ．ｖａ ｒｉａｂｉｌｉｓ）細胞を固定化することを特徴とする方法。 １６．第１３項に記載の方法において、デアシラーゼの供給源がアシネトバクテ ル種（Ａ．ｓｐｐ．）細胞であることを特徴とする方法。 １７．第１６項に記載の方法において、アシネトバクテル種（Ａ．ｓｐｐ．）細 胞を固定化することを特徴とする方法。 １８．第１３項に記載の方法において、７−アミノセファロスポラン酸の製造に 十分な条件が：約２０℃から約３５℃の温度；約６．５から約８．５のｐＨ；及 び約５０ｐｓｉｇの圧力下から成ることを特徴とする方法。 １９．変異株トリゴノプシスバリアビリス（Ｔ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＡＴＣ Ｃ２０９３１。 ２０．変異株アシネトバクテル種（Ａ．ｓｐｐ．）ＡＴＣＣ５３８９１。