DK165714B - Fremgangsmaade til bestemmelse af blods koaguleringsparametre og en reagensbaerer til anvendelse ved fremgangsmaaden - Google Patents

Description

i

DK 165714 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til bestemmelse af de såkaldte koaguleringsparametre, dvs. til analyse af blod med henblik på de bestanddele, der har indflydelse på koagulationsprocessen, samt en reagensbærer til anvendelse ved 5 fremgangsmåden.

Til kvalitative eller kvantitative analytiske bestemmelser af bestanddele i legemsvæsker, navnlig blod, er der i den senere tid i tiltagende omfang anvendt såkaldte bærerbundne prøver.

IC Ved sådanne er reagenser indlejret i tilsvarende lag i en fast reagensbærer, der bringes i kontakt med analyseprøven. Reaktionen mellem analyseprøven og reagenser fører til et påviseligt signal, navnlig et farveomslag, som kan bedømmes visuelt eller ved hjælp af et apparat, for det meste reflektionsfotometrisk.

15

Reagensbærere er hyppigt udformet som reagensstrimler, der i det væsentlige består af et aflangt bærerlag af plastmateriale og derpå anbragte reagensfelter. Der kendes imidlertid også reagensbærere, der er udformet som kvadratiske eller rektangu-20 lære småplader.

I EP-A nr. 00 45 476 beskrives et middel og en fremgangsmåde til adskillelse af plasma eller serum fra helblod, navnlig til reagensbærere til diagnostisk bestemmelse af legemsvæskers be-25 standdele (såkaldte parametre), som gør det muligt at bestemme indholdsstoffer fra helblod på enkel måde. Ifølge dette litteratursted kan plasma adskilles fra erythrocytter, idet man lader helblodet løbe gennem et lag af glasfibre med fiberdiametre på under 2,5 μ, som tilbageholder erythrocytterne. For-30 trinsvis påføres derved blodet på enden af et rektangulært glasfibervlies, hvorfra plasmaet kapillært transporteres til det øvrige område. På denne med plasma fyldte vliesdel trykkes efter plasmaudvindingsprocessen en matriks (papir, sugende film etc.), der indeholder de for reaktionen nødvendige rea-35 genser, hvori påvisningsreaktionen for de parametre, der skal eftervises, gennemføres ved remissionsmålinger.

2

DK 165714B

Dette simple plasmaudvindings- og plasmatransportsystem kan anvendes for alle kl i nisk-kemisk vigtige parametre med undtagelse af parametre, der skal bestemmes indenfor rammerne af undersøgelser af hæmostasiologiske spørgsmål. Det er kendt, at 5 koaguleringsanalyser principielt må gennemføres i plastbeholdere eller glasbeholdere, der er inaktiveret med en belægning af si 1iconeharpiks, da ubehandlet glas påvirker blods eller plasmas koaguleringsevne. Således forkorter glas ved aktivering enfase-koagulationstiden ifølge Quick for plasmaer, hvis 10 koagulationsfaktorer ligger i normalområdet. Enfase-koagula-tionstiden ifølge Quick forlænges ved lavprocentuelle plasmaer ved inaktivering af koagulationsfaktorer. Glas inaktiverer herved fremfor alt faktorerne V og Ila. Ved denne inaktivering og de dermed fejlagtigt forlængede koagulationstider forsvin-15 der den diagnostiske nytte, da forholdene mellem de enkelte koagulationsfaktorer forskydes. Den i procent angivne Quick-værdi omfatter ud over fibrinogenkoncentrationen aktiviteten af faktorerne II, V, VII og X. Et sammenføjet plasma fra sunde donorer defineres som 100% plasma, og ved fortynding med fy-20 siologisk kogsaltopløsning fremstilles tilsvarende lavprocen-tuelle plasmaer. Ved hjælp af denne fortyndingsrække tilvejebringes en referencekurve, på basis af hvilken Quick-værdien for patientplasma kan bestemmes.

25 Også bestemmelsen af den partielle thromboplastintid (PTT) påvirkes imidlertid negativt ved inaktivering af faktorerne XII og XI. Påvisningen af antithrombin III og heparin forstyrres betydeligt ved en inaktivering af thrombin ved hjælp af glas.

30 Det er således formålet med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en fremgangsmåde til bestemmelse af blods koaguleringsparametre såvel som til anvendelse ved fremgangsmåden navnlig som adskillelses- og transport-system i en reagensbærer egnede glasfiberlag, der er koagulationsneutrale, og der-35 ved også er anvendelige til hæmostasiologiske undersøgelser.

Herved skal de fortrinsvis bibeholde deres adskillelses- og transportegenskaber.

DK 165714 B

3

Dette opnås med en fremgangsmåde til bestemmelse af koagulationsparametre, der er ejendommelig ved det i krav l’s kendetegnende del angivne, og ved hjælp af den i krav 3 angivne reagensbærer.

5

Det har vist sig, at man kan modificere glasoverflader kemisk ved tilsætning af polyvinylalkoholer på en sådan måde, at de bibeholder de hydrofile egenskaber, der f.eks. er nødvendige for sugeevnen hos glasfibervlies, men taber indflydelsen på 10 koagulationsfaktorerne, dvs. bliver koagulationsneutrale. Dette er særligt overraskende, da det er kendt, at man kan belægge glas på overfladen ved si 1iconisering med siliconehar-piksemulsioner, og derved udelukke en påvirkning af koagulationsfaktorerne, men at denne si 1iconisering i specielle ti 1 — 15 fælde bevirker en så kraftig hydrofober ing af glasfibrenes overflade, at der ikke mere kan finde nogen befugtning sted, således at fibrene fuldstændigt taber deres plasmatransportegenskaber og deres egenskaber til at fraskille erythrocytter.

20 Polyvinylalkohol fremstilles ud fra polyviny1 acetat ved for sæbning, idet der i afhængighed af de ønskede produktegenskaber kan gennemføres en fuldstændig eller delvis forsæbning.

Til anvendelse ved den foreliggende opfindelse er både et fuldstændigt forsæbet og et partielt forsæbet produkt anvende-25 ligt. Polyvinylalkoholer, der i stor mængde tilbydes i hand len, adskiller sig navnlig ved deres gennemsnitlige molekylvægt, der normalt ligger mellem ca. 10.000 og 100.000 og i enkelte særtilfælde også kan nå væsentligt højere værdier, samt ved restindholdet af acetylgrupper. De lavmolekylære forbin-30 delser, der indeholder ca. 5-15%, navnlig ca. 10% acetylgrup per, er lettest opløselige i vand, produkter der er højmolekylære og/eller har et større indhold af acetylgrupper, er derimod mindre opløselige i vand. Af indflydelse på opløseligheden er endvidere den indbyrdes vekselvirkning mellem polyvinylal-35 koholkæderne. Ved en parallel lejring af polymerkæderne i bestemte områder opstår der "krystallinske områder", idet orienteringstendensen er, jo større, jo mere regelmæssigt kæderne 4

DK 165714B

er opbygget, og jo lavere antal der er af acetylgrupper, der på kraftigste måde modvirker orienteringen. Ved en forsæbningsgrad på 97-100 mol%, dvs. ved en acetyleringsgrad på 3-0 mol% forøges "krystal 1initeten" derfor særlig kraftigt, hvor-5 ved omvendt opløseligheden i koldt vand aftager kraftigt.

Vandopløseligheden kan endvidere forringes ved efterbehandling med aldehyder (acetalisering) eller ved andre kemiske omdannelser af alkoholgrupperne. Anvendelige i forbindelse med den IC foreliggende opfindelse er navnlig polyvinylalkoholer med en ringe opløselighed i koldt vand, men med en god opløselighed i varmt vand. Produkterne skal ved 20°C kun langsomt eller slet ikke opløses i vand, men ved temperaturer på 50-100eC, navnlig ved temperaturer over 60°C, skal de være let opløselige i 15 vand.

Fremstillingen af gi asfibervi i es ifølge opfindelsen kan ske ved at et tilsvarende glasfibervlies efterfølgende behandles med en opløsning af polyvinylalkohol i vand eller et egnet or-20 ganisk opløsningsmiddel, og derefter tørres, fortrinsvis ved temperaturer på over 60°C, navnlig ved 90-140°C eller ved at man ved fremstilling af glasfibervlies tilsætter polyvinylalkohol. Som bekendt fremstilles glasfibervlies på den måde, at man suspenderer og derved spreder de tørre og sammenf i 1 trede 25 glasfibre, der har en middeldiameter på 0,1-20 pm og en længde på 0,1-5 mm, i et meget stort overskud af vand og former denne "bøtte" i tynde lag og tørrer på en måde, der er analog med den ved papirfremstilling konventionelle metode, og ved hjælp af de ved papirfremstilling konventionelle maskiner. Polyviny-30 lalkoholpulver eller -fibre, der er sat til bøtten, fordeler sig ved opslæmningen af glasfibrene på regelmæssig måde i massen, og bliver ved den efterfølgende fremstilling af vlies-et opløst eller opsmeltet i et sådant omfang, at de efterfølgende under tørringen af vlieset danner et regelmæssigt over-35 træk på glasfibrene. Dette overtræk bevirker, at glasfibrene bliver koaguleringsneutrale, men ellers stadig bevarer hydrofile egenskaber i et sådant omfang, at sugeevnen og transpor- 5

DK 165714B

! ten af vand eller vandige opløsninger gennem et sådant vlies ikke forringes.

Særligt foretrukket anvendes der i bøtten silaniserede glasfi-5 bre. Egnede sådanne fibre er beskrevet i DE patentansøgning nr. 35 23 969, til hvis hele indhold der her henvises. Disse kan derefter ifølge den foreliggende opfindelse overtrækkes med polyvinylalkohol eller polyvinylal kohol/vinylacetat. Derved opnås gi asf iberl ag, der i særligt høj grad er koagula-IC tionsneutrale og udmærker sig ved en særlig god styrke.

Da polyvinylal kohol en overtrækker glasfibrene forholdsvis regelmæssigt, når den påføres ifølge opfindelsen, er allerede forholdsvis små mængder, navnlig ca. 0,5-20%, fortrinsvis 15 1-5%, tilstrækkelige til at gøre fibrene koagulationsneutrale.

Andele på over 20% ville ganske vist ikke være skadelige for den ønskede virkning, men de ville dog af økonomiske grunde ikke være formålstjenlige.

20 Dersom glasfibervlieset ikke blot skal anvendes til transport af serum og plasma, men også skal anvendes til fraskillelse af erythrocytter fra plasma ifølge EP-A 00 45 476, skal glasfibrene have en middeldiameter på 0,2-5 μιη, fortrinsvis 0,5-2,5 μιη, og vlieset skal have en vægtfylde på 0,1-0,5 g/cm^. Dersom 25 det kun kommer an på koagulationsneutraliteten og transportegenskaberne, kan der også anvendes glasfibre med større tykkelse og vlies med andre vægtfylder. Også vliesets polyvinylalkohol indhold kan for sådanne vliestyper forøges ud over det ellers fordelagtige indhold på 20%.

30

Glasfibrene ifølge opfindelsen udlægges ifølge konventionelle metoder til vlies, der, som det bl.a. er beskrevet i eksemplerne, kan anvendes i midler til bestemmelse af koagulationsparametre. Oe kan dog også anvendes i form af en kort søjle 35 til plasmaudvinding ifølge EP-A 00 45 476, hvorpå plasmaet derefter på konventionel måde kan anvendes ved koagulationsprøver.

DK 165714 B

6

Yderligere udformningsmuligheder for prøvebæreren ifølge opfindelsen til bestemmelse af koagulationsparametre kan fremstilles i analogi med de midler, der er beskrevet i EP-A 00 45 476, hvortil der her henvises. Naturligvis må i sådanne midler 5 ikke blot galsfiberlagene ifølge opfindelsen, men også alle de øvrige dele, der kommer i kontakt med plasmaet, bestå af koagulationsneutrale materialer, idet der navnlig kan anvendes tilsvarende for fagmanden kendte plastmaterialer.

10 Opfindelsen belyses nærmere i det følgende i forbindelse med tegningen og nogle eksempler.

På tegningen viser: 15 fig. 1 et skematisk sidebillede af en reagensbærer ifølge opfindelsen, og fig. 2 en remissionskurve, der er fremstillet under anvendelse af en reagensbærer ifølge fig. l.

20

Den på fig. 1 viste reagensbærer 1 har den principielle form af en konventionel reagensstrimmel. På et bærelag 2 af plastfolie (f.eks. polystyren) er der ved hjælp af en smelteklæbestrimmel 3 fastgjort et glasfiberlag 4 og et afdækningsnet 3a, 25 der delvis overlapper glasfiberlaget 4.

På den anden side overlappes glasfiberlaget 4 af et oxida-tionsmiddellag 5 og et reaktionslag 6, som klapagtigt er fastgjort til bærelaget 2 ved hjælp af en yderligere smelteklæbe-30 strimmel 7.

Til gennemføring af en analyse bliver en bloddråbe anbragt på afdækningsnettet 3a og transporteret gennem glasfiberlaget 4 til oxidationsmiddellagets 5 og reaktionlagets 6 område. Der-35 ved sker der en adskillelse af plasma, sådan som det er beskrevet i den europæiske patentansøgning nr. 45476. For at indlede reaktion med de i lagene 5 og 6 indeholdte reagenser, 7

DK 165714B

trykkes disse nedad, således at prøvevæsken trænger ind i disse lag, og de tilsvarende reaktioner forløber.

Nærmere enkeltheder vedrørende de ved en koagulationsprøve af 5 den omhandlede art forløbende kemiske reaktioner fremgår af den europæiske patentansøgning med offentliggørelsesnummer 182373 og af de følgende eksempler.

Eksempel 1: 10

Fremstilling af et qlasfibervlies ifølge opfindelsen 1 kg glasfibre opslås i en hollænder med 420 1 vand, der er indstillet let surt (pH 3,0), til spredning af fibrene. I en 15 papirmaskines (skråsigtemaskine Void, Heidenheim) forrådsbeholder fortyndes til en stoftæthed på 0,3%, og til denne fortynding sættes 50 g polyvinylal koholfibre (Kuralon VPB 105-2 fra firmaet Kuraray), og der blandes. I papirmaskinens stofudløb fortyndes suspensionen med ledningsvand til 0,05%, og den 20 bringes i denne tilstand på sigten. Her sker bladdannelsen. Bladet tørres på en tørrecylinder ved 110-120eC. I afhængighed af maskinens indstilling opnås der vlies med fladevægt på 20-100 g/m2 og tykkelser på 0,2-1 mm.

25 Eksempel 2

Afprøvning af glasfibervlies for koaqulationsneutralitet

Prøver på hver 40 mg af det ifølge eksempel 1 fremstillede 30 glasfibervlies bringes hver sammen med 300 μΐ sammenføjet plasma fra sunde donorer såvel som fra patienter, der er behandlet med antikoagulatmidler, og der inkuberes i 1 min ved 37eC. Derefter fraskilles plasmaet ved centrifugering. Plasmaet undersøges før og efter behandlingen med glasfibervlies til 35 bestemmelse af enfasekoagulationstiden ifølge Quick. Herved kan størkningsprøven anvendes: start af koagulationskaskade calciumchlorid og thromboplastin og ophængning (tysk: håkeln)

DK 165714B

s af prøven, idet tiden til dannelse af fibrintråde måles. Der kan ligeledes anvendes en fotometrisk prøve til bestemmelse af Quick-tiden {U. Becker et al: Neue Aspekte der Gerinnungsdiag-nostik, F.K. Schattauer-Ver1 ag, Stuttgart - New York, 1984, 5 side 17 til 30).

Eksempel 3

Bestemmelse af enfasekoaqulationstid ifølge Quick 10 a) Fremstilling af reagensbærer.

Der fremstilles en reagensbærer ifølge fig. 1. Glasfiberlaget 4 er et vlies med en fladevægt på 50-60 g/m^ og en tykkelse på 15 0,5 mm. Det er i reagensbærerens længderetning ca. 15 mm langt. Afdækningsnettet 3a har en trådtykkelse på 140 μιη og en maskevidde på 250 μιη.

Reaktionslåget 6 består af en polycarbonatfolie med en tyk- 20 kelse på 200 μιη, på hvilken der med en rakel påføres en rea gensfilm med en vådfilmtykkelse på 110 Mm, og tørres ved 45°C.

Den filmdannende masse fremstilles på følgende måde: 111 vand opløses: 10 g lineær tværbundet polyacrylamid 25 ("Rohagit 700" fra firmaet Rohm, Darmstadt), 4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazin-ethansulfonsyre 100 mmol, Tos-Gly-Pro-Arg-p-phenylendiamin 1 mmol, N-(4-fluorphenyl)-N-methylaminomethan-phosphonsyre 15 mmol, kaninhjernethromboplastin 4,9 g.

30 Denne opløsning indstilles på pH 7,5 med natronlud.

Oxydationsmiddellaget 5 består af et tilsvarende imprægneret nylonnet (trådtykkelse ca. 40 μιη, maskevidde ca. 60 μιη, type NY 20 HC super fra firmaet Ziiricher Beutel tuchfabrik, 35 Schweiz). Nettet imprægneres med en vandig opløsning af 50 mmol K3[Fe(CN)e)/l og 50 mmol calciumchlorid/1.

Claims (7)

1. Fremgangsmåde til bestemmelse af blods koagulationsparametre, kendetegnet ved, at blodet før kontakten med reagenserne ledes gennem et glasfiberlag, hvori glasfibrene er overtrukket med polyvinylalkohol eller polyvinylalkohol/vi- 35 nylacetat.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at blodet ledes langs med laget. DK 165714B

3. Reagensbærer til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at den omfatter et lag (4), der indeholder glasfibre, der er overtrukket med polyvi-nylalkohol eller polyvinylal kohol/vi ny1 acetat. 5

4. Reagensbærer ifølge krav 3, kendetegnet ved, at laget (4) indeholder 0,5-20%, fortrinsvis 1-5% polyvinylalko-hol.

5. Reagensbærer ifølge krav 3, kendetegnet ved, at glasfibrene har en gennemsnitlig diameter på 0,2-5 pm, fortrinsvis 0,5-2,5 pm, og at laget har en vægtfylde (rumvægt) på 0,1-0,5 g/cm3.

6. Reagensbærer ifølge krav 3, kendetegnet ved, at glasfibrene er silaniseret.

7. Reagensbærer ifølge krav 3, kendetegnet ved, at laget er udformet som vlies. 20 25 30 35