DK165748B - Fremgangsmaade til isolering af et rekombinant fremstillet polypeptid fra bakterieceller - Google Patents

Description

i

DK 165748 B

Opfindelsen angår en særlig fremgangsmåde til isolering af et rekombinant fremstillet polypeptid fra bakterieceller.

Den foreliggende litteratur angiver adskillige op-5 lukningsfremgangsmåder for mikrobielle celler.

Således angives i JP offentliggørelsesskrift nr.

72/43 834 (refereret i C.A. 79 (1973), abstract 124689g) en mikrobiel oplukningsfremgangsmåde, især for gærceller, under anvendelse af en afspændingsdyse, og GB patent-10 skrift nr. 1 432 039 beskriver en oplukningsfremgangsmåde i to trin, hvorved cellevæggene i de behandlede celler først svækkes ved kemisk behandling, eksempelvis med en syre eller base, hvorefter de mekanisk destrueres ved formaling.

15 Derudover beskrives i EP-A-0.052.861 en fremgangs måde til kemisk oplukning af bakterieceller med det formål at isolere rekombinant fremstillet interferon, især IFN-α, som er kendetegnet ved følgende trin: 1. En bakteriesuspension, især en E.coli suspension, 20 hvor bakterierne indeholder det genteknologisk fremstillede IFh', indspilles ved hjælp af mineral-syre på pH 2,0-2,5 med det formål at dræbe bakterierne.

2. De døde bakterieceller fraskilles.

25 3. Den tilvejebragte sure biomasse udsuspenderes i en puffer, f.eks. i tris(2-amino-2-hydroxymethyl- 1,3-propandiol) + natriumchlorid, og indstilles med natronlud på pH 7,3, hvorved bakteriecellevæggene destrueres.

30 4. Efter fjernelse af bakteriecellerne fraskil les interferon, der nu findes i opløsning, efter kendte metoder, og renses yderligere.

Derudover er det bekendt, at polypeptider som 35 interferoner udviser ringe stabilitet over for mekaniske påvirkninger (se Proceedings of the Society for experimentel Biology and Medicine 146, 249-253 (1974)).

DK 165748 B

2 Sådanne mekaniske påvirkninger optræder ved mekanisk destruktion af bakterieceller fra de her optrædende forskydningskræfter. Af denne grund kendes indtil nu ingen mekanisk oplukningsfremgangsmåde for bakterieceller til 5 isolation af et genteknologisk dannet polypeptid, f.eks. af interferon, hvorved man kan isolere dette i højt udbytte.

Opfindelsens formål er at fremskaffe en forbedret ekstraktionsfremgangsmåde for rekombinant fremstillede 10 polypeptider fra baktericeller, ved hvilken bakteriecellerne bliver oplukket på. mekanisk vis.

Dette formål opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, der er ejendommelig ved, at bakterieceller, som indeholder et genteknologisk fremstillet polypeptid, 15 suspenderet i en vandig syreopløsning ved et pH på 1,0-4,0, destrueres mekanisk ved hjælp af forskydningskræfter, og at det i den derved dannede suspension tilstedeværende polypeptid fraskilles og yderligere renses efter kendte metoder.

20 Mere detailleret fraskiller man bakterier, der indeholder det rekombinant fremstillede polypeptid, f.eks. et syrestabilt interferon, og som er dræbt ved hjælp af en mineralsyre efter bekendte fremgangsmåder (se f.eks. "Sterilisation, Desinfektion, Konservierung, 25 Chemotherapie - Verfahren, Wirkstoffe, Prufungsverfah-ren", Dr. K. H. Wallåusser og Prof. Dr. H. Schmidt,

Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1967, side 145-16.1), udsuspenderer den tilvejebragte biomasse i en vandig syreopløsning ved en pH på 2,0-4,0, f.eks. i en mineral-30 syre som fortyndet saltsyre eller i en vandig opløsning af en alkansyre, som eddikesyre eller propionsyre og destruerer bakteriecellevæggene mekanisk ved hjælp af optrædende forskydningskræfter, f.eks. ved hjælp af en homogenisator, hensigtsmæssigt med en homogenisator af 35 typen Ultra-Turrax, og derefter efter neutralisering af den tilvejebragte suspension og fraskillelse af bakteriebrudstykkerne fraskiller det i opløsningen s

DK 165748B

3 forekommende polypeptid efter kendte metoder og renser det yderligere.

Til isolation af et rekombinant fremstillet syrestabilt interferon, f.eks. et α-interferon som IFN-a2-5 (arg), er fremgangsmåden ifølge opfindelsen særlig hensigtsmæssig ved en pH på 2,5-3,5, især i fortyndet saltsyre med pH 2,5 eller i 1% eddikesyre.

Derudover kan det i mange tilfælde være en fordel, hvis man efter homogeniseringen og før neutrali-10 seringen tilsætter et fældningsmiddel, f.eks. poly-ethylenamin i en koncentration på 0,1-0,5%.

Omdrejningstallet for homogenisatoren og den tid, der kræves til at oplukke bakteriecellerne, hænger sammen med tætheden af den anvendte biomasse. Hvis f.eks.

15 biomassen udviser tæthed på 1,03-1,05, bør homogeni-satorens omdrejningstal hensigtsmæssigt ligge mellem 5000-10.000 ο/min.. Ved tæthed af biomassen på eksempelvis 1,04 er omdrejningstallet for^homogenisåtoren hensigtsmæssig mellem 7000-8000 o/min. og oplukningstiden 20 er 2 min..

Fremgangsmåden ifelge opfindelsen lader sig r.esr hensigtsmæssig i laboriatcriemålestok gennemføre med en IKA-Ultra-Turrax T 45 og i større målestok med Dispax-Reacrcr 3-5/6,begge fra firmaet Jar.ke & Kunkel 25 KG (D-7813 Staufen).

Ultra-Turrax T 45 er et dispergeringsapparat, hvor en kniv med højt omdrejningstal roterer mod en spaltekrans, hvorved bakteriecellerne bliver destrueret i et højturbulent strømningsfelt. Når bakteriecellerne 30 skal destrueres, anbringer man apparatet i et /bægerglas, der indeholder mediet, der skal homogeniseres, hvorved dette føres rundt ved hjælp af en pumpeeffekt. Omdrejningstallet herved ligger omtrent mellem 5000-10.000 o/min. og oplukningstid mellem 1-10 min..

35 Derimod er homogenisatoren Dispax-Reactor 3-6/6 en 3-trins Ultra-Turrax med føring af væsken, dvs. alle bakteriecellerne må passere homogeniseringskam-

DK 165748 B

4 rene med samme gennemløbshastighed. Herved tilvejebringes et bakteriehomogenisat, der er ens oplukket.

I denne Dispax-reaktor er omdrejningstallet 3000-8000 c/min og trykket på homogenisatet max. 2 bar ved udløb.

5 Med denne homogenisator kan man homogenisere 50 liter biomasse i løber af 1-10 min..

Fig. 1 viser et tværsnit gennem en homogenisator af samme type som Dispax-reaktor 3-6/6. I denne fig. er F indløbskammeret for stoffer, der skal homogeniseres, 10 E er en glideringspakning ved drivakslen H; G er hovedleje for denne drivaksel. På drivakslen H sidder i rækkefølge efter hinanden tre cylinderformede rotorer C, der står i indgreb med tilsvarende udragende statorer D, som er fæstet på indervæggene af homogenisatorhuset.

15 På enden af akslen H er en drivsnegl fastgjort, der rager ud i afløbet A. Til køling af statorerne tjener et kølekammer, der strækker sig rundt om statorerne med indløb L og udløb K for kølevandet. Gliderings-tætningen ved drivakslen forsynes med kølevand, hen-20 sigtsmæssig under forhøjet tryk, f.eks. 1,5 bar, via vandindløbet J. De cylinderf ormede rotorer kan udføres som dobbelttromler, tredobbelte eller_flerdobbelte tromler, hvis tromlevægge rager ind i mellemrummene på de tilsvarende-' udformede vægge af statorerne. Væsken, der skal 25 homogeniseres, føres ved hjælp af sneglen B gennem mellemrummene mellem rotorerne og statorerne. På grund af rotorernes raske rotation destrueres bakteriecellevæggene ved hjælp af de optrædende forskydningskræfter, og den homogeniserede væske forlader homogenisatoren via 30 afløbet A.

I princippet kan fremgangsmåden også gennemføres ved hjælp af andre bekendte mekaniske celleopluknings-mekanismer, som f.eks. beskrevet i Biochemical Engineering, side 359ff (2. Udgave, Academic 35 Press 1973). Herved er udbytterne dog lavere, hvorimod man ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen under anvendelse af Ultra Turrax T45 eller af Dispax-reaktor

DK 165748 B

5 3-6/6 opnår et højere udbytte, f.eks. af interferon, i forhold til den anvendte biomasse end ved de hidtil kendte metoder, hvad man ikke kunne forudse på grund af hvad der ovenfor er anført om den nuværende status 5 for denne teknik.

De følgende eksempler skal nærmere belyse opfindelsen.

Eksempel 1 10 En bakteriesuspension af E.coli-klonen HB 101/pER 33 (se EP-A-0-115-613), hvis bakterier indeholder humaninterferon a2, indstilles ved hjælp af mineralsyre på pH 2,0-2,5 med det formål at dræbe bakterierne. De dræbte bakterieceller skilles fra suspensionen og ned-15 fryses til -20°C.

20 kg af en dybfrossen biomasse, Charge A, op-slæmmes i 250 1 1% eddikesyre ved 8°C. Når biomassen er tøet fuldstændig op, dispergeres den med 3-trins homogenisatoren (Dispax-Reactor 3-6/6). Der tilsættes 20 som fældningshjælpemiddel 0,1% polyethylenimin til det findispeirgerede lysat. Derefter indstiller man pH- * værdien på 7,5 ved hjælp af 5N natronlud. Efter 2 timers ekstrahering fraskilles den udludede biomasse ved hjælp af en tallerkenseparator (Westfalia) med en gennem-25 strømningshastighed på 1,5 1/min.. Fra gennemløbet udtages prøver til bestemmelse af indhold af interferon og protein.

Udbytte: 46,9 x 10^ I.E./g biomasse.

Til bedømmelse af indflydelsen af homogenisatoren 30 på interferonudbyttet udtages 500 ml opslæmmet biomasse før dispergering og ekstraheres uden homogenisering ifølge EP-A-0.052-861. pH indstilles på 7,3 med 3N natronlud. Efter 1 times ekstraktionstid skilles lysatet fra den udludede biomasse ved hjælp af en laboratorie-35 centrifuge. Der udtages, som ovenfor nævnt, prøver fra filtratet for indhold af interferon og protein.

Udbytte ifølge EP-A-0.052.816: 25,3 x 106 I.E./g biomasse.

DK 165748 B

6

Eksempel 2

Udføres analogt til eksempel 1 under anvendelse af biomassen, Charge B.

Udbytte: 21,3 x 10^ I.E./g biomasse.

5 Udbytte ifølge EP-A-0.052.861: 9,7 x 10^ I.E./g biomasse.

Eksempel 3

Udføres analogt til eksempel 1 under anvendelse 10 af biomassen, Charge C.

g

Udbytte: 13,8 x 10 I.E./g biomasse.

Udbytte ifølge EP-A-0.052.861: 5,1 x 106 I.E./g biomasse.

15 Eksempel 4

Udføres analogt til eksempel 1 under anvendelse af 1000 g biomasse, Charge BC24, som opslæmmes i 10000 ml fortyndet saltsyre (pH 2,5; 4 ml 37% saltsyre fortyndes* med vand til 10000 ml) og dispergeres med IKA-20: Ultra-Turrax T45.

g

Udbytte: 50 x 10 I.E./g biomasse.

Claims (8)

1. Fremgangsmåde til isolering af et rekombinant fremstillet polypeptid fra bakterieceller, kendetegnet ved, at bakterieceller, som indeholder et 5 genteknologisk fremstillet polypeptid, suspenderet i en vandig syreopløsning ved et pH på 2,0-4,0, destrueres mekanisk ved hjælp af forskydningskræfter, og at det i den derved dannede suspension tilstedeværende polypeptid fraskilles og yderligere renses efter kendte metoder.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kende tegnet ved, at der anvendes bakterieceller, som indeholder et rekombinant fremstillet syrebestandigt interferon.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kende-•15. tegnet ved, at der anvendes bakterieceller, som indeholder et rekombinant fremstillet a-interferon.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der anvendes bakterieceller, som indeholder rekombinant fremstillet IFN-a2(arg).

5. Fremgangsmåde ifølge krav 2-4, kende tegnet ved, at den gennemføres ved et pH på 2,5-3,5.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1-5, kendete g n e t ved, at bakteriecellerne destrueres ved 25 hjælp af en homogenisator.

7. Fremgangsmåde ifølge kravene 1-6, kendetegnet ved, at der som syre anvendes en mineralsyre eller en alkansyre.

8. Fremgangsmåde ifølge kravene 1-7, kende-30 tegnet ved, at der som vandig syreopløsning anvendes fortyndet saltsyre (pH 2,5) eller 1% eddikesyre.