DK165750B - Fremgangsmaade til fremstilling af humant gamma-interferonlignende polypeptid, polydeoxyribonucleotid, der koder for polypeptidet, plasmid indeholdende polydeoxyribonucleotidet samt en vaert for dette plasmid - Google Patents

Description

i

DK 165750 B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et humant gamma - interferon1 ignende polypeptid (i det følgende forkortet til γ-IFN), polydeoxyribonucleotid, der koder for polypeptidet, plasmid indeholdende pol ydeoxyri bonuc1eot idet 5 samt en vært for dette plasmid.

Det kemisk syntetiserede DNA-molekyle, som omhandles heri, er ejendommeligt ved, at DNA-sekvensen, som koder for et polypeptid, stemmer i alt væsentligt overens med hensyn 10 til aminosyresekvensen og sammensætningen med humant gamma-interferon og har humant gamma-interferons immunologiske eller biologiske virkning.

Interferon omfatter tre klasser, nemlig alpha, beta og gam-15 ma, af proteiner, som angives at være i stand til at fremkalde en antiviral tilstand, eller som også udviser antitumorvirkning.

Det er kendt, at γ-IFN kan fremstilles ved gensplejsnings-20 teknikken under anvendelse af et gen fremstillet ved omvendt transskription af en messenger RNA i nærværelse af en omvendt transskriptase (Nature, 295, 503, 1982). Denne teknik er imidlertid ufordelagtig, bl.a. ved, at det på grund af, at gensekvensen defineres af messenger RNA, er 25 umuligt at vælge codoner, der er passende for værtsceller.

Kemisk syntese af γ-IFN-genet kan sandsynligvis løse den ovennævnte ulempe og kan også føre til opbygningen af et chimerisk polypeptid ved additionen af arbitrære restrik-30 tionsenzymspaltningssteder. Syntesen af nævnte gen er imidlertid ikke let, da det er sammensat af flere hundrede basepar.

De pågældende opfindere bestræbte sig på at løse denne van-3 5 skelighed, og det lykkedes dem at syntetisere et γ-IFN-gen.

De udviklede således en fremgangsmåde til fremstilling af

DK 165750 B

2 γ-IFN ved gensp1ejsningsteknikken under anvendelse af nævnte gen.

Den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde til 5 fremstilling af humant gamma-interferon-1 ignende polypeptid, som er ejendommelig ved dyrkning i et næringsmedium af værtsceller transformeret med et plasmid med et polydeoxyribonu-cleotid, som har en translations-initieringskode ved 5'-enden, efterfulgt af en nucleotidsekvens, som består af 10

1 10 TGC TAC TGC CAG GAC CCA TAC GTG AAG GAA GCT GAA AAC CTG AAG

ACG ATG ACG GTC CTG GGT ATG CAC TTC CTT CGA CTT TTG GAC TTC

15 20 30

AAA TAC TTC AAC GCT GGT CAT TCT GAC GTT GCT GAC AAC GGT ACT

TTT ATG AAG TTG CGA CCA GTA AGA CTG CAA CGA CTG TTG CCA TGA

A0

20 CTG TTC CTG GGT ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAA TCT GAC CGT

GAC AAG GAC CCA TAG GAC TTT TTG ACC TTT CTT CTT AGA CTG GCA

50 60

AAA ATC ATG CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAG CTG TTC

25 TTT TAG TAC GTC AGA GTC TAG CAA AGA AAG ATG AAG TTC GAC AAG

70

AAA AAC TTC AAG GAC GAC CAG TCT ATC CAG AAA TCT GTT GAA ACT

TTT TTG AAG TTC CTG CTG GTC AGA TAG GTC TTT AGA CAA CTT TGA

30 80 90

ATC AAG GAA GAC ATG AAC GTT AAG TTC TTC AAC TCT AAC AAG AAA

TAG TTC CTT CTG TAC TTG CAA TTC AAG AAG TTG AGA TTG TTC TTT 1 100

AAG CGT GAC GAC TTC GAA AAG CTT ACT AAC TAC TCT GTT ACT GAC

TTC GCA CTG CTG AAG CTT TTC GAA TGA TTG ATG AGA CAA TGA CTG

DK 165750 B

3

110 120 CTT AAT GTA CAG CGT AAA GCT ATC CAT GAA CTG AT C CAG GTT ATG

GAA TTA CAT GTC GCA TTT CGA TAG GTA CTT GAC TAG GTC CAA TAC

5 130

GCT GAA CTG TCC CCG GCT GCT AAA ACT GGT AAG CGT AAA AGA TCT

CGA CTT GAC AGG GGC CGA CGA TTT TGA CCA TT C GCA TTT TCT AGA

140 146 10 CAG ATG CTG TTC CGT GGT CGT CGT GCT TCT CAG GTC TAC GAC AAG GCA CCA GCA GCA CGA AGA GTC, hvori TGC kan være erstattet med TGT,

ACG ACA

15 der koder for aminosyresekvensen 1 10 Cys Tyr Cys Gin Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu 20 .

Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala ‘Gly His Ser Asp Val 20 30

Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn 40 50

Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gin Ser Gin 60

Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys 70

Asp Asp Gin Ser Ile Gin Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys 25 80 90

Glu Asp Mer Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys 100

Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val 110

Thr Asp Leu Asn Val Gin Arg Lys Ala Ile His Glu Leu 120 3Q Ile Gin Val Mer Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr 130 140

Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gin Met Leu Phe Arg Gly Arg

Arg Ala Ser Gin, og en efterfølgende nuc1eot idsekvens, der koder for transla-35 tionens afslutning, indført deri, og derved forårsager dannelse af polypeptidet med den ovennævnte aminosyresekvens som en proteinkomponent i ku 1 tursuppen. Opfindelsen angår endvidere 4

DK 165750B

det ovennævnte polydeoxyribonucleotid, det ovennævnte plasmid, en Escherichia co1 i-stamme- transformeret med nævnte plasmid og fremgangsmåder til fremstilling deraf.

5 På tegningerne er hensigten med figurerne 1 - 5 og figurerne 8 - 11 at supplere beskrivelsen af eksemplet. Sekvensen af hver af 62 oligodeoxyribonucleotider anvendt til syntesen af et syntetisk γ-IFN-gen, fig. 1-(2), viser aminosyresekvensen af humant γ-IFN, og nucleotidsekvensen 10 af γ-IFN-genet, fig. 2 og 3 belyser oligodeoxyribonucleo- tid-synteseprocessen, fig. 4 viser oligodeoxyribonucleotid-ligationsskemaet, fig. 5 belyser skemaet for bestemmelse af basesekvensen af det syntetiserede Ύ-IFN-gen, og fig. 8 viser fremgangsmåden til konstruktion af plasmid pGIF.

15 Fig. 9 er 14% polyacrylamidgel-elektroforese-kortlægningen for polydeoxyribonucleotidblokkene A, B, C, D, E og F syntetiseret og for molekylvægtsmærkeren M (Hinfl digest med φ x 174RF) , fig. 10 er 8% polyacrylamidgel-elektrcforese-kortlægningen for hver af blokprodukterne [I] og [II] af 20 ligation ifølge det i fig. 4 viste skema og for molekyl vægtsmærkeren M (Hpall digest med φ x 174RF), og fig. 11 er 6% polyacrylamidgel-elektroforese-kortlægningen for hver af de ovennævnte blokke [I] og [II], det syntetiske Ύ-IFN og molekylvægtsmærkeren M (Hpall digest af pBR322 25 DNA). Fig. 6 er restriktionsenzym-spaltningskortet for det syntetiske γ-IFN-gen, og fig. 7 er restriktionsenzymspaltningskortet for plasmidet pKO703, idet de numeriske værdier i parenteserne repræsenterer afstanden i antal af basepar fra EcoRI-genkendelsesstedet. Fig. 12 er en gra-30 fisk illustration af molekylvægten af hver fraktion op nået ved gelfiltrering af den overliggende væske, som igen blev opnået ved centrifugering af frarevne Escherichia coli-celler, som udviste inteferonvirkning.

^ 5 Et foretrukket eksempel på det ovennævnte polydeoxyribo= nucleotid er ét, som har en sekvens, der koder for aminosyresekvensen 1-146, som vist i fig. 1—(2) og med en trans-

DK 165750 B

5 lations-initieringskode såsom ATG ved 5'-enden og en translations-termineringskode såsom TAA ved 3'-enden.

Fordi ATG binder (cords) methionin, omfatter γ-IFN ifølge 5 den foreliggende opfindelse naturligvis et peptid tilsat med formyl-methionin eller methionin ved 5'-enden af ovennævnte aminosyresekvens 1-142, således som det er vist i fig. 1-(2).

10 For nemheds skyld i forbindelse med genmanipulation foretrækkes det at tilsætte en nucleotidsekvens, som kan spaltes med et restriktionsenzym til hver af de translationsinitierende og translations-terminerende kodeafslutninger.

Ved en foretrukket udførelsesform sættes en EcoRI-spaltelig 15 nucleotidsekvens til 5'-enden og en Sall-spaltelig nucleo= tidsekvens til 3'-enden.

Det ovennævnte polydeoxyribonucleotid kan syntetiseres f.eks. på følgende måde. Først syntetiseres de 62 genfraktioner 20 (oligodeoxyribonucleotider), der er vist i fig. 1-(1), ved hjælp af den i og for sig kendte modificerede phosphor= triestermetode og fastfasemetode. Derpå konstrueres et komplet γ-IFN-gen [jfr. fig. 1-(2)] ved ligation af disse fragmenter under anvendelse af T4 DNA -ligase. Dette syn-25 tetiske gen indeholder restriktionsenzymspaltningssteder, som vist i fig. 6. Dette er med henblik på at lette eftersøgningen efter aktive grundstrukturer (site structures) eller konstruktion af chimeriske gener.

30 På det næste sted indføres det ovennævnte gen i et vektor-plasmid. I det følgende findes et eksempel på indføringsmetoden .

Først konstrueres et plasmid, pKO703, ved at indsætte pro-motorregionen (99 basepar) af Escherichia coli-lactose= operonen mellem EcoRI-og Sall-spaltningsstederne af pBR322.

Derpå konstrueres et plasmid, pGIF, ved at indføre det syn-

DK 165750 B

6 tetiske gen, som vist i fig. 1-(2), som har et EcoRI-spaltningssted på 5'-endesiden og et Sall-spaltningssted på 3'-endesiden, mellem EcoRI-'og Sall-spaltningsstederne af plasmidet pKO703 (jfr. fig. 8).

5

Om ønsket kan der konstrueres et plasmid med et andet gen end γ-IFN-genet, der er indført mellem de ovenfor nævnte spaltningssteder. Dyrkning af værtsceller transformeret med det ovenfor nævnte plasmid kan fordelagtigt bevirke 10 dannelse af et produkt af nævnte gen under kontrol af lactosepromotoren.

Som værtsceller kan der anvendes bakterier, gær og andre svampe såvel som dyrkede humane og andre animalske celler 15 og dyrkede planteceller.

Bakterierne er f.eks. af slægterne Escherichia, Bacillus eller Pseudomonas. Mere specielle eksempler er Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseu-20 domonas putida og Pseudomonas aeruginosa.

Gærarterne er f.eks. de som hører til slægten Saccharomyces.

Saccharomyces cerevisiae er et foretrukket eksempel.

25

En stamme, som hører til slægten Escherichia, transformeres med det på ovennævnte måde opnåede plasmid pGIF. · Når Escherichia coli WA802 anvendes som nævnte stamme, opnås der en transformant-s tamme, der benævnes VJA802/pGIF. Denne 30 stamme er ampicillin-resistent (Ampr) og tetracyklin- følsom (Tets), hvorfor den kan isoleres fra non-transfor-manter.

Ved induktiv dyrkning af ovennævnte transformantstamme i 35 et medium, såsom L-suppe, under anvendelse af isopropyl- β-D-thiogalactopyranosid dannes et stof med interferonvirkning i cellerne.

DK 165750 B

7

Stammen Escherichia coli WA802/pGIF4 har fået kodenavnet SBMG105 og er blevet deponeret ved Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, under deponeringsnummer FERM BP 282.

5

En fremgangsmåde til udøvelse af den foreliggende opfindelse er beskrevet nedenfor ved hjælp af et eksempel. Escherichia coli betegnes undertiden som E.coli.

10 EKSEMPEL:

Kemisk syntese af Y-IFN-genfragment.

15 Den kemiske syntese af 62 oligodeoxyribonucleotider, henholdsvis betegnet F^ - Fgj i fig. 1-(1), blev, bortset fra de i det følgende nævnte forbedringer, gennemført i alt væsentligt ved hjælp af den af Ken-ichi Miyoshi et al.

20 [Nucl.Acids Res., 8, 5507 (1980)] beskrevne fastfase-metode.

Enkelthederne vedrørende den kemiske syntese af disse oligodeoxyribonucleotider ved hjælp af den forbedrede teknologi er som følger: 25 a) Først blev, som vist i fig. 2, 3'-ende-mononucleosid-enheden bundet til en aminomethyleret polystyrenharpiks. Således er den i fig. 2 viste aminomethylerede polystyrenharpiks (1) en harpiks, der er tværbundet med 1% divinylbenzen, og 30 harpiksen (2) blev fremstillet ved åt sætte to enheder af &-alanin til (1). Derpå blev tre forskellige forbindelser (3) (B repræsenterer thymin, N-benzoylcytosin eller N-iso= butyrylguanin) omsat med den ovennævnte harpiks (2) til dannelse af tre forskellige polystyrenharpikser (4), hver 35 med 3*-ende-nucleosidet.

DK 165750 B

8

Det følgende er et eksempel på syntese af den samme harpiJcs (4) relevant for N-isobutyrylguanin for B i fig. 2.

20 g aminomethyleret polystyren,HC1 (divinylbenzen 1%, 5 100-200 mesh, N^:0,63 mmol/g) blev opkvældet omhyggeligt med 100 ml CHjC^rOg N-t-BOC-fJ-alanin (1,34 g, 15,1 mmol) blev tilsat. Kondensationsreaktionen blev gennemført i nærværelse af DCC (3,11 g, 15,1 mmol) ved stuetemperatur i 3 timer. Harpiksen blev filtreret gennem et glasfilter 10 og vasket to gange med 200 ml portioner af , tre gange med 150 ml portioner af DMF og til slut tre gange med 100 ml portioner af pyridin. Harpiksen blev derpå behandlet med 100 ml 25% eddikesyreanhydrid-pyridin i 1 time for at acety-lere de uomsatte aminogrupper. Harpiksen blev derpå be-15 handlet med 120 ir.l 20% CF^COOH-C^C^ ved stuetemperatur i 30 minutter for at eliminere t-BOC-grupperne. Harpiksen blev vasket med 200 ml 5% triethylamin-C^C^ og yderligere vasket fire gange med 100 ml portioner af CH^C^· Den ovennævnte fremgangsmåde blev gentaget endnu en gang for at opnå har- 20 piksen (2) fra fig. 2, d.v.s. den aminomethylerede poly= styrenharpiks med to β-alanin-enheder. I 60 ml DMF blev der suspenderet 10 g af den ovennævnte harpiks [fig. 2 (2) ], efterfulgt af tilsætning af 11 mmol af forbindelse (3) [fig. 2 (3)] (hvor B betegner N-isobutyrylguanin) og 25 1 ml triethylamin. Blandingen blev omrystet ved stuetemperatur i 12 timer. Efter reaktionen blev harpiksen skilt fra ved filtrering, vasket med DMF og derpå med pyri= din og til slut behandlet med 150 ml 10% phenylisocyanat- pyridin i 3 timer til beskyttelse af de uomsatte amino-30 grupper. Harpiksen blev derpå vasket med pyridin-methanol og tørret under reduceret tryk i nærværelse af £^5' ^vor“ ved harpiksen (4) fra fig. 2 (B betegner N-isobutyrylguanin) blev opnået.

3 5

Under anvendelse af en portion af denne harpiks [fig. 2 (4) , hvor B er N-isobutyrylguanin] blev den mængde 3'-ende-nucleosid, som er fastgjort til 1 g af harpiksen, bestemt ved undersøgelse af metoden ifølge M.J.Gait et al. [Nucl.Acids 9

DK 165750B

Res., 8, 1081 (1980)]. Resultatet var 0,12 mmol. Harpikser. (4), hvori B er thymin eller N-benzoylcytosin, blev også fremstillet på den samme måde som beskrevet ovenfor.

Mængden af 3'-ende-nucleosid fastgjort til 1 g harpiks 5 (4) var'0,126 mmol for B=thymin og 0,125 mmol for B=N~ benzoylcytosin.

b) Under anvendelse af disse tre typer af harpiks (4) og 31-phosphorsyrediesterdimerblokken (fig. 3, n=0) og 3'-10 phosphorsyrediestertrimerblokken (fig. 3, n=l) har 62 oligo= deoxyribonucleotider F^ - de specificerede, forudbestem te basesekvenser. Harpiksen (4) blev således behandlet med 10% trichloreddikesyre (forkortet: TCA), -CHC13 til fjernelse af dimethoxytrytylgruppen (forkortet: DMTr) og der-på 4 ækvivalenter af 3'-phosphorsyrediesterdimer (fig. 3, n=0),eller 3 ækvivalenter 3’-phosphorsyrediestertrimer (fig. 3, n= 1) pr. ækvivalent af 3'-nucleosid-enheden, der er fastgjort til harpiks (5), blev fortløbende kondenseret ved hjælp af 20 - 50 ækvivalenter mesithylensulfonyltetra= zolid (MsTe) . Overskydende 3'-phosphorsyrediesterblok og kondensationsmiddel kunne let fjernes ved at filtrere reaktionsblandingen gennem et glasfilter.

Til beskyttelse af den uomsatte 5' -hydroxygruppe blev har-*5 piksen derpå enten behandlet med 10% eddikesyreanhydrid- pyridin ved stuetemperatur i 1 time eller behandlet med en blanding af 10 ml 10% eddikesyreanhydrid og 20 mg 4-di= methylaminopyridin (DMAP) ved stuetemperatur i 30 minutter, hvorved de uomsatte 51-hydroxygrupper blev acetyleret. Har-30 piksen blev derpå behandlet med 10% TCA til fjernelse af 5'-ende-DMTr-gruppen,og derpå blev den næste kondensationsreaktion gennemført.

Ovennævnte fremgangsmåde blev gentaget, indtil den ønskede 35 længde var opnået.

En eksempelvis synteserække er anført nedenfor under henvisning til F^g-fragmentet.

DK 165750 B

10 200 mg harpiks (4) [fig. 2 (4), B=N-isobutyrylguanin] blev behandlet tre gange med 20’ ml 10% TCA-CHCl^ i 30 sekunder hver for at få harpiksen (5) uden DMTr. Til denne harpiks (5) blev der sat 96 pnol af 3'-phosphorsyredimerblokken CA 5 (fig. 3, n=0, B^benzoylcytosin, B-j=N-benzoyladenin) / og den azeotropiske destillation med 3 ml pyridin blev gentaget tre gange. Harpiksen blev derpå suspenderet i 2 ml pyridin, og kondensationsreaktionen blev udført under anvendelse af 1 mmol af kondensationsmidlet MsTe ved 10 stuetemperatur i 2 timer. Efter reaktionen kunne overskud af 3'-phosphorsyredimer og kondensationsmiddel let fjernes ved at filtrere reaktionsblandingen gennem et glasfilter og vaske harpiksen omhyggeligt med pyridin. Til beskyttelse af de uomsatte 5'-hydroxygrupper blev harpiksen derpå su-15 spenderet i 20 ml 10% eddikesyreanhydrid-pyridin, og su spensionen blev omrystet ved stuetemperatur i 1 time. Efter denne reaktion blev harpiksen skilt fra ved filtrering gennem et glasfilter og vasket omhyggeligt med pyridin og CHC13 i den nævnte rækkefølge. Harpiksen blev derpå behand-20 let tre gange med 20 ml 10% TCA-CHCl^ i 30 sekunder hver, hvorved DMTr-gruppen blev fjernet fra harpiksen. Harpiksen blev vasket omhyggeligt med CHCl^ og pyridin i nævnte rækkefølge. Den ovennævnte fremgangsmåde blev gentaget, indtil den krævede længde var opnået. Til at syntetisere oligo= 25 deoxyribonucleotidet af F·^ blev således de næste 3'-phos= phorsyredimerblokke CC, TA, GA og TC anvendt i rækkefølge.

Ved disse trinvise kondensationsreaktioner blev der opnået en fuldstændigt beskyttet oligodeoxyribonucleotid-harpiks med F1€'s basesekvens. De andre fragmenter - F15 og 30 F17 ~ F62' blev også fremstillet på den samme måde, bort set fra, at der blev anvendt forskellige kombinationer af nucleotider.

c) Adskillelsen af det fuldstændigt beskyttede oligodeoxy= 35 ribonucleotid med en sådan bestemt basesekvens fra harpik sen og den fuldstændige deprotektionering deraf blev gennemført ved at behandle harpiksen med koncentreret vandig ammoniak-pyridin (2:1, volumen/volumen) ved 55°C i 10 timer og derpå med 80% eddikesyre ved stuetemperatur i 10 mi-

DK 165750B

11 nutter (proces A).

Fragmenterne F^, Fg, F7 - F1Q/ F22 - F24, F2g, 729' F30' F33 " F42' F53 " F55 og F57 " F62 kunne imidlertid ikke opnås under de ovennævnte deprotektioneringsbetingelser. 5 Disse fragmenter blev derfor fuldstændigt deprotektioneret ved hjælp af Reese et al.'s fremgangsmåde[Nucl.Acids Res., 9, 4611 (1980)] (proces B).

Denne deprotektioneringsmetode er beskrevet nedenfor under henvisning til F^g- og F2g-fragmenter.

10 Proces A: I et lukket rør blev 50 mg af F16 -harpiksen omrystet med 1 ml pyridin og 2 ml koncentreret vandig ammoniak ved 55°C i 10 timer, og efter dette tidsrum blev harpiksen filtreret fra og filtratet koncentreret under reduceret tryk.

15 Resten blev sat til toluen, og den azeotropiske destilla tion blev gentaget for at fjerne pyridinet. Resten blev behandlet med 2 ml 80% eddikesyre ved stuetemperatur i 10 minutter, hvorved der blev opnået et fuldstændigt deprotektioneret oligodeoxyribonucleotid.

20 Proces B:

50 mg af F2g-harpiksen blev behandlet med en opløsning (0,3 M) af l,l,4,4-tetramethylguanidinium-2-pyridinaldox-imat i 3,5 ml dioxan-vand (7:1, volumen/volumen) ved 40°C

i 48 timer og blev derefter i et lukket rør yderligere be~ 2 *5 handlet med 3 ml koncentreret vandig ammoniak-pyridin (2:1, volumen/volumen) ved 55°C i 10 timer. Derefter blev F2g-harpiksen behandlet med 2 ml 80% eddikesyre ved stue- 12

DK 16B750B

temperatur i 20 minutter til opnåelse af fuldstændigt deprotektioneret oligodeoxyribonucleotid.

d) Isoleringen og rensningen af slutproduktet blev gennemført ved hjælp af højtydende væskekromatografi (forkortet: 5 HPLC). Der blev således anvendt ALTEX, model 110A Liquid

Chromatograph, en lineær gradientmetode under anvendelse af opløsningsmiddel A (20% CH^CN-l m MKH2P04, pH 6,5) og opløsningsmiddel B (20% CH^CN-SOO mM K^PO^, pH 6,5), og en Partisil 10 SAX (Whatman) -søjle (4,6 dia. x 250 mm).

10 Gradienten blev etableret ved at tilsætte 3% opløsningsmid del B til opløsningsmiddel A med 1 minuts mellemrum. Elu-ering blev gennemført ved 58°C og en strømningshastighed på 2 ml/min. Fraktionerne, som indeholdt den ønskede forbindelse, blev opsamlet, afsaltet ved dialyse og lyofili-15 seret. Homogeniteten af de 62 fuldstændigt deprotektione- rede oligodeoxyribonucleotider F^ - Fg2# ^er diedes blev opnået, blev bekræftet ved at mærke deres 5'-ender med [gamma- P]ATP under anvendelse af polynucleotid-kinase og gennemføre polyacrylamidgel (20%) -elektroforese. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Basesekvensen af hvert oligodeoxyribonucleotid blev bekræf 2 tet ved hjælp af den todimensionale kortlægningsmetode 3 [Bambare,J.E. et al. (1974), Nucl.Acids Res., 1, 331]. 5'- 4 32 5 enden blev således mærket med [gamma- P]ATP under anvendelse af polynucleotid-kinase, og derefter blev partiel 6 hydrolyse gennemført med nuclease. Dette partielle hy 7 drolysat blev underkastet celluloseacetat-elektroforese 8 (pH 3,5) og DEAE-cellulose-homokroma tograf i.

9

Ligation af gamma-IFN-genfragmenter: 10

Under anvendelse af de på ovennævnte måde syntetiserede 11 62 oligodeoxyribonucleotidfragmenter (1 - 62) blev genet

DK 165750B

13 (fig. 1-2) svarende til γ-IFN bestående af 450 basepar afsnøret i overensstemmelse med det i fig. 4 viste ligationsskema. Enkeltheder vedrørende fremgangsmåden er anført nedenfor.

5 Blokkene [A] - [F] blev syntetiseret. Med undtagelse af 5’-endefragmenterne af hver blok (1, 14, 15, 24, 25, 32, 33, 44, 45, 54, 55, 62) blev 1 n mol af hver af de resterende 50 fragmenter opløst i 22 μΐ destilleret vand, og opløsningen blev opvarmet til 90°C i 2 minutter og derpå 10 straks afkølet til 0°C. Til denne vandige opløsning blev der sat 5 μΐ Ci af [gamma-^P]ATP (5100 Ci/mmol) . Den blev derpå justeret til opnåelse af en 70 mM tris-HCl (pH 7,5) -10 mM MgCl2-kinasepufferopløsning. Derefter blev der tilsat 3 enheder af polynucleotid-kinase til opnåelse af 15 ialt 30 μΐ. Ved at gennemføre reaktionen ved 37°C i 15 32 minutter blev 5'-enderne mærket med P. For at phospho-rylere alle 5'-enderne blev der derpå yderligere tilsat 4 n mol ATP og 3 enheder polynucleotid-kinase, og reaktionen blev gennemført ved 37°C i 45 minutter. Reaktionen 20 blev afsluttet ved at opvarme blandingen til 90°C i 5 mi nutter. 2,1 pg af hver af de ovennævnte phosphorylerede fragmenter 2-13 og ikke-phosphorylerede fragmenter 1 og 14 (blok A), phosphorylerede fragmenter 16 - 23 og ikke-phosphorylerede fragmenter 15 og 24 (blok B), phospho-25 rylerede fragmenter 26 - 31 og ikke-phosphorylerede frag menter 25 og 32 (blok C), phosphorylerede fragmenter 34 -43 og ikke-phosphorylerede fragmenter 33 og 44 (blok D), phosphorylerede fragmenter 46 - 53 og ikke-phosphorylerede fragmenter 45 og 54 (blok E) og phosphorylerede fragmenter 30 56 - 61 og ikke-phosphorylerede fragmenter 55 og 62 (blok F) blev blandet henholdsvis dialyseret i et dialyserør over for destilleret vand ved 4°C i 16 timer for at fjerne de . 14

DK 165750 B

uomsatte ATP- og kinasepufferkomponenter. Dette DNA-dialysat for hver af blokkene A - P blev koncentreret til tørhed og opløst i 14,5 μΐ ligasepuffer (20 mM tris-HC1, pH 7,6, 10 mM MgC^). Denne opløsning blev anbragt 5 i et 40 μΐ fint glasrør,og efter lukning af begge rørets ender blev det opvarmet i et 16,5 mm testrør indeholdende 20 ml vand af 95°C i 2 minutter. Testrøret som helhed fik derpå lov til at henstå ved stuetemperatur i 2 timer for at aneale DNA-fragmentet. Det blev derpå anbragt 10 ved 0°C. Denne DNA-oplØsning blev taget ud af det fine glasrør og gjort til en ligasepuffer indeholdende 0,4 mM ATP og 10 mM DTT. Der blev derpå tilsat 30 enheder T4 DNA-ligase for at opnå et samlet volumen på 80 μΐ, og reaktionen fik lov til at forløbe ved 15°C i 16 timer. En 15 del af reaktionsblandingen blev udtaget og underkastet elektroforese med 14% polyacrvlamidgel indeholdende 7 M urinstof, og ligationstilstanden blev undersøgt ved hjælp af radioautografi. Det viste sig, at de største ligationsreaktionsprodukter med hensyn til størrelse stemte overens 20 med de ønskede produkter til 6 blokke A - F. Derefter blev den samlede mængde af det ovennævnte ligationsprodukt fraktioneret ved elektroforese gennem 14% polyacrylamid-gel indeholdende 7 M urinstof. Efter at positionerne af

- I

A - F var blevet bekræftet ved hjælp af radioautografi, 25 blev geldelene, som svarede til positionerne, udskåret og anbragt i dialyserør. Hvert rør blev fyldt med 9 mM tris-boratpuffer (pH 8,3, 0,25 mM EDTA tilsat) (elueringspuffer), og efter lukning af begge rørets ender blev elektroforese gennemført i elueringspufferen ved en konstant spænding 30 på 200 V i 3 timer for at eluere DNA i gelen. DNA’en blev udtaget fra dialyserøret og lyofiliseret. Lyofilisatet blev opløst i 100 μΐ 0,3 M natriumacetat (pH 7,0), og to volumener ethanol blev tilsat. Blandingen fik lov til at /

DK 165750 B

i- o i- oSSofSg·— SB§i<§8Hifg g h s £ s y P S 8 5 t 8 S < G § u s < s i 5§<<5<<S^S§ 8<8^§5<o<

Ps“p£s^s £Ε§ε|Ρ§ΒΒ SSlBlPlsSt «sl^ssesss

Ou§h?u5u£ui- <Uh<<OU<Uh ssssSssssss sassssssss U l" ø 0 f ) #rj μ. ^5 ^ 0 U / ) ^ h* O ^ 5 S $ § t S G tC t I Pgf35^gBC§ •l§8gs85§5l£ MBNESgig £5S|^<St§ol £<C5<§5££< gsgfgigEiii ssglgggass SSggi^StSty CS6se<-i<u8 _ _ _ _ „—s ,—, Λ Λ />S Λ ^ ^ ^ m Nt LO CD t> CO <7> O C'·* r-<Mco>iir>aJt^oocno^ iJ^r-irsr-vr'^^-Lninio cn u.

o o oOHO^ogGo S££££e§E38

§885B$§8£ s|i§§§s§<E

“588§fgb58 gog^SSggug ssggss^ttg 3éS&Ebs8B$ <»-0<h-<<h-uQ 5Γι33^^3υ<κ Οθοκ-Οο<<<< ,1^ο<ΗΗ<Ηΰ5 tSnu^toS^? [?ΰ<ΰΰ(3υΰυ<

2§iSStt;222 5 5 o 5 S 1= < 3 S P

:!5S^®^S? sasSSsgS5§

DK 165750B

£gg sås ilB £5? .„g HZ sså IBs IBS -s £§g S« S Stb slB m 008 rT< P ir < P o δ c <ou^ooo o*bg ?s5oS§£ #tS8|§^ Λ&3 n<øu < u cd oø o o gl h < s2<h ω r 2 c O O aUø a> u Q Q-< o 73 fr 3 J5 b Ø S3t= 3gb = !<£ 33b >δυ <Ou φ 0 o i_ ^ i— f— f$ o. ^ o c ^5 o Pt5 3 IBl $£3 <S^§ SSd δ3δ <U« wOO 3^1- cg ^ Øfeo 0» y S ?δυ øøb CD 5 o < CJ O — <H- <00 (/)<(~ 3 <£ t— 9-¾ o ι/i ΰ u 3l?< >» b g

§3E oSb 3gb i31= 36S

ϋ-Ιί= °lrl i= ISBsilt isB§<Sg m s3^ m iu &* cuo c y is »u® cyo »ug 3!2< ts, <5i= £t2 ^<1= =¾^ 3&® i =5t s,5t sag sbS 3 G S |ga Λ oSG 5*3 (= «3t <λΡ9 <o>-> S<h- . < τ ø u ιλ < t— c U ΰ in > t £<f • iSuo φ F- < ^ < t «o 51 >r> P øy5 CD <ØU -I O Φ _J<f- < < b- _j<t- 3 5h φ o φ _ £ c_> § £ o ° Pfe u fcho U- S5 o D =5i£SaÉ< £t=å ^8e>

“Ss >6i gg3 sg§ s§g iSD

ir < b oo 8 iibo £ b < o o b <<'- _ rtu Ί w u uiOy w Q υ —<t? ¢, ^ b 5§S IBs 3-5!= 55!= 5§5 u. o o ^ug i u ΰ jz < 5 *< g ?ί5υ έ{=< έί=< >bS < < b ίδ§ IBS iSS I3S IBS SSc tsesiss inisiw mss§3 £ < b -bo fe b o § ^ f £ b g £ 5 £ o o o o O O øl— < <oo t— < I— W O O C o ø -1-5 33iz il<l= o £ § 3<P >OU O g b > O O -J < I- s.yg sag ±s§ s.3s fcd| 5G«

(i μ < <oD — 5 F —i < P ø b- < < O O

y, O O nj b- < C £ O ¢, O CD ^ O O i2bg -§!2y 3§8 o S S =55 ?iS <08 s g a -3 E < o fc b § -fe 5 s 81 < t i§8

2 5b > O (J Øø b- < t— < b- — < < t- Q- O O

O o b- 5 CO < in 15

DK 165750B

henstå ved -80°C i 30 minutter, og efter dette tidsrum blev den centrifugeret til udvinding af DNA som sediment. DNA-sedimenterne til blokkene A - F blev opløst i 20 pi destilleret vand, og en 1 pi portion af opløsningen blev 5 undersøgt ved hjælp af elektroforese med 14% polyacrylamid- gel indeholdende 7 M urinstof. Som vist i fig. 9, blev der opnået i alt væsentligt ensartede bånd svarende til størrelserne af DNA'erne for de respektive blokke [A] -[F]. DNA-opløsningen til hver af blokkene A - F blev 10 afpasset til sammensætningen af kinasepufferen, og 2 n mol ATP og 6 enheder polynucleotid-kinase blev tilsat. Denne reaktion blev gennemført ved 37°C i 1 time, hvorved blokkenes 5'-ender blev phosphoryleret. DNA til blokkene [A],

[B] og [C] (20 p mol hver) blev blandet, og ATP og DTT 15 blev tilsat i koncentrationer på 0,4 mM ATP og 10 mM DTT

til ; fremstilling af ialt 50 pi. Under anvendelse af 8 enheder T4 DNA-ligase blev blandingen derpå omsat ved 15°C i 16 timer. DNA'erne til blokkene [D], [E] og [F] blev også blandet i mængder på 5 p mol hver, og ligations-20 reaktionen blev gennemført ved 15°C i 16 timer. Efter den ovennævnte reaktion blev der udtaget en portion af hvert reaktionsprodukt, og ligationstiistanden blev undersøgt ved hjælp af elektroforese med 8% polyacrylamidgeler indeholdende 7 M urinstof. Som vist i fig. 10, viste det sig, 25 at blokkene [I] og [II] svarende til 225 bp var blevet syn tetiseret. Hele mængden af den ovennævnte reaktionsblanding blev derpå fraktioneret ved hjælp af elektroforese gennem 8% polyacrylamidgeler indeholdende 7 M urinstof. Efter at positionen af de 225 basepar DNA var blevet bekræftet ved 30 hjælp af radioautografi, blev den tilsvarende del af gelen skåret ud, og DNA'en blev elueret ved hjælp af den ovenfor nævnte elektroforetiske elueringsmetode. DNA-opløsningen blev lyofiliseret og opløst i 100 pi 0,3M natriumacetat 16

DK 165750 B

(pH 7,0), efterfulgt af tilsætning af 2,5 volumener ethanol, hvorved DNA'en blev udfældet. Til denne DNA blev der sat 0,5 n mol ATP og 3 enheder polynucleotid-kinase, og reaktionen blev gennemført ved 37°C i 1 time på samme måde som 5 tidligere beskrevet. DNA'erne (1 p mol af hver) af blokke ne [I] og [II] blev blandet og tilpasset til ligasepuffer-sammensætningen. Der blev derefter sat ATP og DTT til blandingen i koncentrationer på 0,4 mM ATP og 10 mM DTT til fremstilling af ialt 20 μΐ. Under anvendelse af 5 enheder 10 T4 DNA-ligase blev ligationsreaktionen udført ved 15°C i 16 timer. Efter reaktionen blev en del af reaktionsblandingen udtaget, og ligationstilstanden blev undersøgt ved hjælp af elektroforese med 6% polyacrylamidgel indeholdende 7 M urinstof. Resultatet er vist i fig. 11. I fig. 11 betegner 15 I og II de isolerede og rensede produkter til henholdsvis blokkene [I] og [II].

Desuden betegner G resultatet af ligation af det samlede Y-IFN-gen, hvilket indicerer, at der blev opnået et DNA-molekyle svarende til 450 basepar. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Til hele mængden af den ovennævnte reaktionsblanding blev 2 der sat 1/10 volumen 3 M natriumacetat, efterfulgt af til 3 sætning af 2,5 volumener ethanol, hvorved DNA'en blev ud 4 vundet som et bundfald. Dette bundfald blev opløst i 5 100 pi TA-puffer (33 mM tris-acetat, pH 7,9, 66 mM kalium= 6 phosphat, 10 mM magnesiumacetat, 0,5 mM DTT), og der blev 7 tilsat 20 enheder restriktionsenzym EcoRI og 20 enheder 8 restriktionsenzym Sall. Reaktionen blev gennemført ved 9 37°C i 1 time. Til reaktionsblandingen blev der sat 10 jul 10 0,3M natriumacetat, og derpå blev der tilsat yderligere 11 2,5 volumener ethanol, hvorved DNA'en blev udvundet som et bundfald. Denne DNA blev opløst i en opløsning indeholdende 17

DK 165750 B

80% formamid, 10 mM NaOH og 1 mM EDTA, og opløsningen blev underkastet elektroforese med 6% polyacrylamidgeler indeholdende 7M urinstof. Efter bekræftelse af 450 basepar ved hjælp af radioautograf i blev den tilsvarende gel ud-5 skåret og anbragt i et dialyserør. Røret blev fyldt med elueringspufferen, og efter lukning blev elektroforese gennemført i den samme puffer ved en konstant spænding på 200 V i 3 timer, hvorved DNA'en i gelen blev elueret. DNA-opløsningen blev udtaget fra dialyserøret og lyofili-seret. Lyofilisatet blev opløst i 100 μΐ 0,3M natriumacetat (pH 7,0), og 2,5 volumener ethanol blev tilsat, hvorved DNA'en blev udvundet som et bundfald. Ved hjælp af den ovennævnte fremgangsmåde blev der opnået ca. 0,05 p mol γ-IFN-gen. Denne DNA blev opløst i 10 μΐ af kinasepufferen, og 15 2 enheder polynucleotid-kinase og 0,1 n mol ATP blev til sat. Reaktionen blev gennemført ved 37°C i 1 time for at tilvejebringe DNA til transformation.

Konstruktion af pGIF-plasmid:

Til at udtrykke det kemisk syntetiserede gen som et fuld-20 stændigt protein i Escherichia coli blev et Escherichia coli-plasmid pKO703, hvori γ-IFN-genet kan indføres i modstrøm til UV5-promotor~operatorregionen af Escherichia coli-lactose-operon, konstrueret, og γ-IFN-genet blev klonet i dette pKO703-plasmid. 1

Detaljer vedrørende konstruktionen af den i dette forsøg anvendte række af plasmider er angivet nedenfor (fig. 8).

(1) Konstruktion af pK0703-plasmid:

Plasmidet pKO703 indeholdende UV5-promotor-operatorregionen 18

DK 165750B

af E.coli-lactose-operon blev konstrueret ved hjælp af den følgende fremgangsmåde.

(A) Fremstilling af pBR322 plasmid med EcoRI og Clal spaltningssteder fyldt i: 5 pBR322 DNA (1,5 pg) blev spaltet ved 37°C i 60 minutter med 5 enheder af hver af restriktionsenzymerne EcoRI og Clal i 20 pi af 1 x TA-blanding (indeholdende 33 mM tris-acetatpuffer, pH 7,6, 66 mM kaliumacetat, 10 mM magnesium= acetat og 0,5 mM dithiothreitol). Reaktionsblandingen 10 blev opvarmet til 65°C i 30 minutter for at inaktivere enzymerne. Tilsætning af 2,5 volumener kold ethanol gav et DNA-bundfald. DNA-bundfaldet blev suspenderet i 40 μΐ T4 DNA-polymerase-opløsning og opvarmet til 65°C i 10 minutter, efterfulgt af tilsætning af 5 μΐ af hver af dTTP, dATP, 15 dCTP og dGTP fra de respektive 4mM opløsninger og 5 μΐ 100 mM β-mercaptoethanol. Blandingen blev derefter omsat med 1 enhed T4 DNA-polymerase ved 37°C i 60 minutter. Reaktionsblandingen blev opvarmet til 65°C i 30 minutter for at inaktivere enzymet og .udfsldende ethanol. Til slut blev 20 DNA-bundfaldet opløst i 15 μΐ destilleret vand.

(B) Fremstilling af DNA i Lac UV5-promotor-operatorregionen med EcoRI-spaltningssteder fyldt i:

For at separere UV5-promotor-operatorregionen af lactose-operon blev der gennemført følgende forsøg.

25 Plasmid pK06Ql er et plasmid med lactose-operon-promotor- operator i området mellem to EcoRI-spaltningssteder.

80 pg af dette plasmid pKO601 blev behandlet med 150 enheder 19

DK 165750 B

restriktionsenzym EcoRI i 500 μΐ 1 x TA-blanding ved 37°C i 60 minutter. Reaktionsblandingen blev underkastet 10% . polyacrylamidgel-elektroforese. Således blev DNA-fragmentet af promotor-operatorregionen bestående af 95 basepar og med 5 EcoRI-sammenhængende ender skilt fra gelen ved elektrofore- se. (Vedrørende enkeltheder om separeringsmetoden henvises til japansk patentansøgning nr. 163303/1981, eksemplerne).

Efter ethanoludfældning blev DNA-bundfaldet opløst i 40 μΐ T4 DNA-polymerase-opløsning, og opløsningen blev opvarmet 10 til 65°C i 30 minutter og derpå hurtigt afkølet. Derefter blev der tilsat 5 μΐ af hver af dATP, dTTP, dCTP og dGTP fra de respektive 4 mM opløsninger såvel som 5 pi 100 mM (3-mercaptoethanol. Blandingen blev omsat under anvendelse af 10 enheder T4 DNA-polymerase ved 37°C i 60 minutter. Re-15 aktionsblandingen blev opvarmet til 65°C i 30 minutter for at inaktivere enzymet, og DNA'en blev udfældet med ethanol.

Til slut blev DNA-bundfaldet opløst i 20 μΐ destilleret vand.

(C) Ligation af de i (A) og (B) fremstillede plasmider til lactose UV5-promotor-operatorregionen og transformatio-20 nen deraf til Escherichia coli:

Under anvendelse af 0,8 pg pBR322 DNA med EcoRI- og Clal-spaltningssteder fyldt i, som fremstillet i (A), 0,8 pg af lactose-operon-UV5-promotor-operatorregion DNA, som fremstillet i (B), og 2,5 enheder T4 DNA-ligase blev ligationsre-2 5 aktionen gennemført ved 16°C i 20 timer.

(Denne ligationsreaktion blev gennemført i overensstemmelse med eksemplerne i japansk patentansøgning nr. 163303/1981).

Efter ligationen blev DNA udfældet fra ethanol og opløst i.

20

DK 165750 B

10 pi destilleret vand. Under anvendelse af denne DNA-opløsning blev transformation af Escherichia coli K12 WA802 gennemført.

(Denne transformation blev gennemført i overensstemmelse med 5 den fremgangsmåde, der er beskrevet i japansk patentansøg ning nr. 163303/1981).

Trans forman ten blev dyrket på et M9S-X-gal-medium (5 g NaCl, 1 g NH4C1, 5,94 g Na2HP04, 3 g KH2P04 (pH 7,0), 0,2 g MgS04, 2 g casaminosyre, 5 g glucose, 400 mg 5-brom-4-chlor-10 3-indoyl~3-D-galactopyranosid, 15 g agar, 1.000 ml vand - i det følgende forkortet til M9S-X-gal-niedium) indeholdende 40 pg/ml ampicillin og 10 ampicillinresistente dybblå kolonier taget op og betegnet som WA802/pK0701~WA802/pK0710.

Genkendelsesstedet af restriktionsenzym Clal på plasmid 15 pBR322 ligger inden for promotor-området af det tetracyklin- resistente gen, og hvis et andet DNA-fragment indsættes mellem EcoRi- og Clal-genkendelsessteder på pBR322-plasmid, bliver Escherichia coli med et sådant plasmid tetracyklin-følsomt. Det forventes imidlertid, at hvis DNA-fragmentet 20 i UV5-promotor-operatorregionen af lactose-operonen indføres med den ønskede retningsbestemmelse, vil transformanten med plasmidet blive tetracyklin-ufølsomt.

Derfor blev de ovenfor opnåede WA802/pK0701 - WA802/pK0710-stammer dyrket ved enkelt-kolonisering på almindelige næ-25 ringsagarmedier indeholdende 10 pg/ml tetracyklin for at undersøge deres tetracyklin-følsomhed. Det viste sig, at WA802/pK0701, WA802/pK0703, WA802/pK0706 og WA802/pK0709 var tetracyklin-ufølsomme. Plasmid DNA blev derpå skilt fra hver af disse stammer, og 2 pg DNA blev omsat i 1 x TA-blan- 21

DK 165750 B

ding med 5 enheder af restriktionsenzymer EcoRI og Hpall ved 37°C i 60 minutter, og retningsbestemheden af lactose-operon-promotor-operatorregionen blev undersøgt ved hjælp af 10% polyacrylamidgel-elektroforese. Det viste sig, at 5 i tilfældet med WA802/pK0703 og WA802/pK0709 var promotor- operatorområdet blevet indsat med den ønskede orientering. Dette pKO703-plasmid blev anvendt ved kloningen af Y-IFN-genet. Plasmidet pKO703 har EcoRI-genkendelsessted modstrøms i transskriptionsretningen fra promotoren, idet 10 pBR322's tetracyklin-resistente gen forbliver intakt på plasmidet, idet genet med de sammenhængende ender af et restriktionsenzym til spaltning af det tetracyklin-resistente strukturgen, såsom EcoRI, Sall og BamHI, opnået kemisk eller fra et plasmid, let kan indføres ved ligation i plas-15 midet pKO703, og den ønskede klon kan let udvælges som en ampicillin-resistent, tetracyklin-følsom stamme.

(2) Konstruktion af plasmid pGIF^: I 30 μΐ 100 mM tris-HCl-puffer (pH 7,3) -5 mM MgCl2 -50 mM NaCl blev 15 pg plasmid pK07Q3 omsat med 10 enheder af hvert 20 af restriktionsenzymerne EcoRI og Sall ved 37°C i 60 minut ter. Reaktionsblandingen blev opvarmet til 65°C i 30 minutter for at inaktivere enzymerne og derpå underkastet 0,7% agarosegel-elektroforese. Ved elektroforese blev 3,8 kb DNA-fragment skilt fra gelen. Efter ethanoludfældning blev 25 DNA opløst i 4,5 μΐ destilleret vand. Det resulterende

EcoRI/Sall-spaltede fragment DNA (0,3 pg) og 5'-OH-ende-phosphorylerede γ-IFN-gen (24 μΐ), der tidligere var blevet opnået, blev opløst i T4 DNA-ligaseblanding, og opløsningen blev opvarmet til 65°C i 10 minutter. Efter afkøling med is 30 blev der tilsat 3 μΐ 100 mM DTT og 3 μΐ 4 mM ATP, og under anvendelse af 3 enheder enheder T4 DNA-ligase blev ligation 22

DK 165750B

gennemført ved 16°C i 20 timer. Efter denne ligationsreaktion blev der tilsat 2,5 volumener kold ethanol, hvorved DNA'en udfældedes. Til denne udfældede DNA blev der sat 10 μΐ destilleret vand, og transformationen af E.coli 5 WA802 blev gennemført. Trans formanten blev dyrket på et M9S-X-gal-medium indeholdende 40 pg/ml ampicillin, og ampicillin-resistente og dybblå kolonier blev udplukket og overført til et almindeligt næringsagarmedium indeholdende 10 pg/ml tetracyklin ved enkelt-kolonisering.

10 Tetracyklin-følsomme kolonier blev udvalgt og betegnet som WA802/pGIF1- WA802/pGIF5.

Efter separering af plasmid-DNA'er blev hver plasmid-DNA spaltet med restriktionsenzymer EcoRI og Sall, EcoRI og Hindlll eller EcoRI og Bglll, og størrelserne af DNA-15 fragmenterne blev målt ved hjælp af agarosegel-elektroforese og polyacrylamidgel-elektroforese. På denne måde blev WA802/pGIF^ og WA802/pGIF^, hvori det ønskede γ-IFN-gen var blevet klonet, bekræftet. I disse plasmider, pGIF^ og pGIFj., er start-codon ATG af Y-IFN-genet placeret i 10 20 basepar modstrøms til Shine-Dalgano-DNA-basesekvensen i UVg-promotorregionen af lactose-operonen.

Shine-Dalgano-basesekvens 5’--AGGAAACAGAATTCATG

i !

--TCCTTTGTCTTAAG.TAC

25 EcoRI-genkendelsessted.

Identifikation af basesekvensen af et Y-IFN-gen: Basesekvensen i området, som svarer til 450 basepar Y-IFN- s 23

DK 165750B

gener, der kan opnås ved EcoRI/Sall-spaltningen af pGIF^~ plasmid-DNA, blev identificeret i overensstemmelse med det i fig. 5 viste. Bestemmelsen af basesekvensen blev udført i overensstemmelse med Maxam-Gilbert-metoden 5 (Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 74, 560-564, 1977). Det blev bekræftet, at i alle de 450 basepar var sekvensen som oprindeligt betegnet (fig. 1-2) .

(3) Ekspression og identifikation af humant gamma-inter-feronlignende polypeptid i E.coli-cellen.

10 I E.coli WA802/pGIF4 og WA802/pGIF5 blev γ-IFN-genet ind ført modstrøms til promotorregionen af lactose-operonen.

Det måtte derfor forventes, at γ-IFN'et ville blive udtrykt under styring af lactose-operonen. Følgelig blev ekspression og fastgørelse af γ-IFN i cellerne af E.coli 15 WA802/pGIF4 og WA802/pGIFg gennemført. Hver af E.coli WA802/pGIF4-og WA802/pGIF2“Stammerne blev anvendt til at inocculere 2,0 ml M9S-glycerolmedium (5 g NaCl, 1 g NH4C1, 5,94 g Na2HP04, 3 g K^PC^, 0,2 g MgS04,7H20, 2,5 g glyce= rol, 2 g casaminosyre, 1.000 ml vand) indeholdende 40 pg/ml 20 ampicillin,og det inocculerede medium blev inkuberet ved 37°C natten over. Den resulterende kultur blev overført til 4 rør af M9S-glycerolmedium (5 ml) indeholdende 40 pg/ml ampicillin i en størrelse, som giver en ekstinktion (OD 660 run) på 0,1. Inkubationen blev gennemført ved 37°C, og 25 når OD 660 nm nåede 0,8, blev isopropyl-&-D-thiogalacto= pyranosid (forkortet: IPTG) som lactose-operon-fremkalder sat til to af de fire rør ved slut-koncentrationen på 1 mM, yderligere efterfulgt af inkubation ved 37°C i 2 1/2 time.

De resterende to rør blev inkuberet uden IPTG ved 37°C i 30 2 1/2 time. En 5 ml portion af hver af disse kulturer blev centrifugeret ved 3.000 omdrejninger pr. minut i 10 mi- 24

DK 165750 B

nutter, hvorved celler blev udvundet som et bundfald.

Derpå blev 0,5 ml 1 x PBS (10 mM phosphatpuffer, pH 7,0, 150 mM NaCl) indeholdende 1 mg/ml okseserumalbumin sat til hvert af de to rør, hvoraf det ene indeholdt IPTG, og 5 det andet ikke indeholdt IPTG, og cellerne blev revet fra hinanden ved ultralydbehandling. Til hvert af de to resterende rør, hvoraf det ene indeholdt IPTG, og det andet ikke indeholdt IPTG, blev der sat 0,5 ml 1 x PBS indeholdende 1 mg/ml æggehvide-lysozyme. Lysozymebehandlingen 10 blev gennemført ved 0°C i 40 minutter, efterfulgt af ultra lydbehandling. 0,5 ml af de fra hinanden revne celler blev centrifugeret ved 25.000 omdrejninger pr. minut i 30 minutter ved 4°C, og den overliggende fraktion blev anvendt til aktivitetsprøven af Y-IFN.

15 Bestemmelse af interferon-aktivitet:

Under anvendelse af en Coaster's 96-well-plast-multiplade og et Eagle's minimal medium indeholdende 5% føtal kalveserum blev en fortyndingsserie af interferon-prøver fremstillet ved multi-pipettering. Derefter blev 10 ul FL- 5 20 celler (5 x 10 celle/ml) sat til hver well, og dyrknin gen blev gennemført ved 37°C natten over i en 5% CC^gas-atmosfære. Kulturen i den øverste fraktion blev fjernet, og 100 pi Sindbis virus i en 100 gange så stor koncentration som TCIDj-q blev sat til hver well, og inkubationen blev 25 gennemført ved 37°C natten over i en 5% CO 2~gas-atmosfære.

Efter 17 timers forløb blev den overliggende fraktion fjernet, og resten blev tilsat 1% krystal-violet-opløsning indeholdende 20% ethanol. Med hensyn til interferon-styrke blev fortyndingsfaktoren af interferon-prøven, som udviser 30 en halv så stor farvningsintensitet som forskellen i inten siteten af farven mellem den virusfri well og den interferon- 25

DK 165750B

fri virus-tilsatte well, udtrykt i laboratorie-enheder/ml. Dette prøvesystem gav en 7 - 25 gange så stor følsomhed som a--interferon, for hvilken der findes en international standard.

5 Om interferon-aktiviteten faktisk var human gamma-inter feron-aktivitet, blev bekræftet immunologisk ved anvendelse af et anti-humant gamma-interferon-antistof. I dette tilfælde blev 10 pi anti-humant gamma-interferon-antistof (med en tilstrækkelig aktivitet til at inaktivere 2.000 en-10 heder/ml human gamma-interferon-aktivitet) sat til 50 μΐ af en interferon-aktiv prøve, og efter henstand ved stuetemperatur i 3 timer blev blandingen centrifugeret ved 10.000 omdrejninger pr. minut i 5 minutter. Den overliggende fraktion blev skilt fra med henblik på anvendelse som en 15 prøve.

Som vist i tabel 1, blev det bekræftet, at transformeret E.coli WA802/pGIF^ og WA802/pGIFjj havde dannet et humant gamma-interferon-lignende stof under styring af lactose-operonen, medens ikke-transformanten (WA802/pK0703) ikke 20 udviste denne aktivitet.

E.coli WA802/pGIF^ sønderdelt/centrifugeret overliggende fraktion, som udviste interferon-aktivitet i det ovennævnte eksempel, blev sat til Ultrogel AcA 54 (0,7 cm dia. x 47 cm høj) , og dets molekylvægt blev bestemt ved hjælp af 25 gel-permeationskromatografi. Fysiologisk afbalanceret saltopløsning (1 x PBS) blev anvendt til opnåelse af 0,7 ml-fraktioner. Som standardreference-proteiner blev der anvendt ribonuclease A (molekylvægt 13.700), chymotrypsino* gen A (molekylvægt 25.000) og ovalbumin (molekylvægt 30 43.000). Interferon-aktiviteten blev elueret mellem chymo= 26

DK 165750B

trypsinogen A og ovalbumin, og molekylvægten af den maksimale interferon-aktivitet under de ovennævnte betingelser blev bestemt til at være ca. 30.000 (se fig. 12).

27

DK 165750B

Ό !

14-1 Q) I

(0 £ I

I CN I

<D II·· _· J

G G I Φ I B B O O bo

ø -η i > i · · · I

. φ η i sl i 2 s z +> +> το i ø i o) G G m i ft i

+> (0 Ιβ O I

•H +> Si +> I

> G Φ Ifl I

•H G Λ -Η I

4J 0 +> I

X. O 0 G I

η) 04 t) n) I

I 3 +> I !

G W Ή C I

O I QJ O I

Η Η 0 I Η I

Q) G 4-1 Φ I I · · r * J

4_l tji Q)m I φ I B B o o bo J-l G +* J-) I > I *

qjvh -Η φ I "Øl I Z 25 <3 I

+) -ri > -P I ø I

GØ -H G I Λ I

-ri +5 +> -Η I

G X I I

iH <D C >” I

ifl ϋ j * •I J-I H I ! i—1 t 0) -Η I Μ i to jj il * *

J I iH I 0) I O O O CO B CN I

WIQ)< I I > 1 H ‘ ^ cqicnw i <u i Ό. i Z 00

3 I ·& CQ G--Hr-ilHI

B I W O 4J ø g I Pj I

J-i Φ J4 (D 0\ I

φ +> Φ +> +> J-I I !

>d il IH -ri 10 φ I

C » U > U Ό I η I

G Μ Φ -ri O Φ I I * M \

+> +! £l ,C I φ I O O 0"Τ3* B CO I

<H +> G λ: ro C I > I fN ‘i?! 10 (0 H OH Φ I & I Z r" . 10 1 ø Ό i Λ i φ φ i

4J > I

(0 · G I

•j-i-Pø O I

rH φ φ -Η I

G HH -PI i i ! 0) i—1 r-j ΙΛ! I 1+ 1+ i + Φ -Η Φ O G I * K -P O B 'ϋ I +* 10 øi G I g g Φ Η -Η I > 0) o § Η Φ I &

Ή rH I

T3 I M

> G I « Φ« I ft Λ ·..

H Æ I O ΙΟ I Φ jq Φ I r- &4 &4 I 4*» n I O'-» H h i -*!

φ Ό I W rH U O I H

G >1 I Øl o 04 & J

J-l r—i I \ 0 \ N I

d) 10 I CM +! CN (NI··

>ø I o G o o I

«. +) I co 0 oo co I B

0 Η I ►*» *£ j * 04 G I 5 w !s s I z « · < 28

DK 165750B

P Ό I I

<D O) I l

H g I I

f-t I I

O) &>H I CM I I

Ό SO II·»· · I

H -P I φ I B B O O BOl <D *—i t n i > i · · · I

Ό Ό Η I «. I 2 2 2 I

0) G -P I p I I

H (tf G I CU I I

Ό Λ G I I

G 03 I I I

G Λ G I I

XI O I I

0) P P I I

X) 03 (D I I

Ό -P Η I I

>t h P I I

H 03 03 I I

G *P l Η I I

P -P G I I · · »I

P 0) H 10)1 B B O O Bol H 43 J I > I * · . I

G H I "Θ. I 2 2 2 I

> I 13-)1 I

0) -Η -Η I Di I I

Ό -P -P I I

03 X G I I

H C G I I

Ό I I

G I I

it) I I

χ: i i 0) I CM I 1

Λ II »I

i i iQ)ioo oo Bol

0) I <D I > I oo · oo I

g G *- Η Η 1 Ό. I CM 2 cm I

^ O -P 5-1 g l P 1 I

N P 03 0\ I Pj I I

0 0) -P +> P 1 I

ω . m -H rd 0) i i

>i P > P -d I H I I

I-I 0) H o 0) I I »I

+>+3ΛΛΙ0)1 o o o CN B cm 1 Ή GAi «3 G I > I · c\ l

G H (t) ri 0) I Ό. I CM 2 ri I

I 5-1 I I

0) I ft I I

G I I

P I I

0) I I

•P C I I

G O I I

fG -ri I I

-P -P I I

(ti I Xi I I + I + I + I

G OG I I

P B Ό I I ·

0) Gt G I I -P

& Η -Η I I 0) GI I > 03 I I TS-

II IP

Hl I Dj

«1 IH

01 I I G

G 1 oo I

Η IO »3* if) I 0)

H I Γ" (p Pm I M

r. D 1 O rv H H I M

-P -P I «HU U I H

H G G I Dj O Di Dj I

0] Q) I \ p \ \ I

G) -P U I CM +> CM CM 1

W P I O G O O I

ra O I CO O co oo I B

< Η . I < « < < I

B'-' m i Si-2

DK 165750 B

29

Sammenligningsforsøg.

Virkning af DNA-sekvens af et fremmed strukturelt gen på ekspression af det fremmede polypeptid.

5

Virkningen af strukturelle gener, som har forskellige DNA-sekvenser, men som koder for det samme polypeptid med identisk aminosyresekvens, på ekspressionen af genet blev undersøgt.

10 Narmere bestemt blev to slags gener, som koder for humant, interferon-gamma (forkortet som IFN-γ) bestående af 146 amino-syrerester som beskrevet af Gray et al. (Nature 295, 503-508, 1982), og som har forskellige DNA-sekvenser, hvor det ene gen er beskrevet af Gray et al. (herefter forkortet som GIFm), og 15 det andet gen har DNA-sekvensen ifølge opfindelsen (herefter forkortet som GIFs), udtrykt i værtsceller af Escherichia coli under de samme dyrkningsbetingelser, hvorefter udbytterne af IFN-γ blev sammenlignet (TABEL 2).

20 Metoden til konstruktion af de to vektorer (pGIFm og pGIFs) til ekspression af IFN-γ forklares ikke i detaljer, men vektorerne er illustreret i fig. 13.

GIFm er en cDNA af IFN-γ fremstillet ifølge metoden af Gray et 25 al., og DNA-sekvensen er konstateret at være identisk med den, som er beskrevet af Gray et al.

GIFs er et gen, som er kemisk syntetiseret som beskrevet i det foregående, og som koder for IFN-γ.

30

Disse to gener har forskellige DNA-sekvenser, men koder begge for et polypeptid (IFN-γ) med identisk am inosyresekvens.

GIFm og GIFs er vektorer med fuldstændig samme struktur, bort-35 set fra at de regioner, som koder for IFN-γ, er forskellige fra hinanden, idet den 3’-ikke-kodende region på 340 DNA-par hos GIFm er nedstrøms for IFN-genet.

30

DK 165750B

Udbytterne af IFN-y blev undersøgt ved dyrkning af Escherichia coli transformeret med hvert af disse plasm i der til ekspression af IFN-y. Resultaterne er vist i TABEL 2 nedenfor.

5 TABEL 2

Sammenligning af virkning af promoter på ekspression af IFN-y-gener med forskellige DNA-sekvenser.

10 Mængde af IFN-y (enhed/ml) Bemærkninger

Promoter GIFs GlFm lacUV5* 23,7 1,5 Induceret med IPTG (2 timer) 15 *

En promoter hidrørende fra et beta-galactosidasegen af Escherichia col i.

Udbyttet af IFN-y ved hver transformant blev bestemt som følger: 20

Efter fordyrkning blev hver transformant dyrket i 2 ml L-kød- afkog indholdende 40 pg/ml ampicillin, indtil OD når værdier på 0,7 til 0,8. Herefter blev 1 mmol af IPTG (isopropyl-(3D- thiogalactopyranosid) blev sat dertil, og dyrkning blev fort-25 sat i yderligere 2 timer.

Cellerne blev efterfølgende opsamlet fra hver resulterende kultur ved centrifugalprecipitering og knust ved frysning og optøning til opnåelse af de pågældende ekstraktopløsninger.

30

Ekstrakter nes antivirusaktivitet (enhed/ml) blev bestemt på konventionel måde.

Resultaterne i TABEL 2 viser, at selv når gener koder for det samme polypeptid (i dette tilfælde IFN-y bestående 146 amino-35 , ^ · syrerester) og promoteren er den samme, varierer udbyttet af polypeptid meget.

Claims (11)

1. 31 DK 165750B Med andre ord fremgår det' af resultaterne, at selv om gener koder for det samme polypeptid, er deres funktion eller virkning forskellig fra hinanden alt afhængigt af deres DNA-se-kvens, og at DNA-sekvensen ifølge opfindelsen er meget nyttig 5 til fremstilling af IFN-γ. Patentkrav. 1° 1· Fremgangsmåde til fremstilling af humant gamma-interferon- lignende polypeptid, kend e t egnet ved, at man i et næringsmedium dyrker værtsceller transformeret med et plasmid med et polydeoxyribonucleotid, som har en trans 1 at ions i nitie-rende kode ved 5'-enden, efterfulgt af en nucleotidsekvens, 15 som består af 1 10 TGC TAC TGC CAG GAC CCA TAC GTG AAG GAA GOT GAA AAC CTG AAG ACG ATG ACG GTC CTG GGT ATG CAC TTC CTT CGA CTT TTG GAC TTC 20 20 30 AAA TAC TTC AAC GCT GGT CAT TCT GAC GTT GCT GAC AAC GGT ACT TTT ATG AAG TTG CGA CCA GTA AGA CTG CAA CGA CTG TTG CCA TGA 25 40 CTG TTC CTG GGT ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAA TCT GAC CGT GAC AAG GAC CCA TAG GAC TTT TTG ACC TTT CTT CTT AGA CTG GCA 50 60

   30 AAA ATC ATG CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAG CTG TTC TTT TAG TAC GTC AGA GTC TAG CAA AGA AAG ATG AAG TTC GAC AAG 70 AAA AAC TTC AAG GAC GAC CAG TCT ATC CAG AAA TCT GTT GAA ACT

   35 TTT TTG AAG TTC CTG CTG GTC AGA TAG GTC TTT AGA CAA CTT TGA 32 DK 165750B 80 90 ATC AAG GAA GAC ATG AAC GTT AAG TTC TTC AAC TCT AAC AAG AAA TAG TTC CTT CTG TAC TTG CAA TTC AAG AAG TTG AGA TTG TTC TTT 5 100 AAG CGT GAC GAC TTC GAA AAG CTT ACT AAC TAC TCT GTT ACT GAC TTC GCA CTG CTG AAG CTT TTC GAA TGA TTG ATG AGA CAA TGA CTG 110 120
2. 2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at værtscellerne er en stamme, der hører til slægten Escherichia.
3. 3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at værtscellerne er af en stamme, som hører til arten Escherichia col i.
4. 4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, 15 at de transformerede værtsceller er af Escherichia coli K12.WA802.
5. 5. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at det gamma-interferon-1ignende 20 polypeptid udvindes fra kultursuppen.
6. 6. Polydeoxyribonucleotid som defineret i krav 1, kendetegnet ved, at TGC er erstattet med TGT . ACG ACA 25
7. 7. Polydeoxyribonucleotidet ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det ud over nævnte sekvens har en translations-i ni tierende kode ved 5'-enden og en transi at ions-termi nerende kode ved 3'-enden. 30
8. 8. Polydeoxyribonucleotidet ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det har restriktionsenzym-spaltelige nucleotid-sekvenser sat til begge ender.
9. 9. Polydeoxyribonucleotidet ifølge krav 8, kendeteg-35 net ved, at 5'-ende-siden kan spaltes med EcoRI, og at 3*-ende-siden kan spaltes med Sall. 34 DK 165750 B
10. 10. Plasmid med det i krav 6-9 definerede polydeoxyribonucle-otid indført deri.

    10 CTT AAT GTA CAG CGT AAA GCT ATC CAT GAA CTG ATC CAG GTT ATG GAA TTA CAT GTC GCA TTT CGA TAG GTA CTT GAC TAG GTC CAA TAC 130 GCT GAA CTG TCC CCG GCT GCT AAA ACT GGT AAG CGT AAA AGA TCT

    15 CGA CTT GAC AGG GGC CGA CGA TTT TGA CCA TTC GCA TTT TCT AGA 140 146 CAG ATG CTG TTC CGT GGT CGT CGT GCT TCT CAG GTC TAC GAC AAG GCA CCA GCA GCA CGA AGA GTC, 20 hvori TGC kan være erstattet med TGT ACG ACA som koder for aminosyresekvensen 25 1 10 Cys Tyr Cys Gin Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu m 20 ' · Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly Hxs Ser Asp Val 30 Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly lie Leu Lys Asn 40 50 Tro Lys Glu Glu Ser Asp. Arg Lys lie Met Gin Ser Gin 3U 60 lie Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lvs Asn Phe Lys 70 Asp Asp Gin Ser lie Gin Lys Ser Val Glu Thr lie Lys 80 90 . . Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys 100

    35 Lys Arg Aso Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val 110 Thr Asp Leu Asn Val Gin Arg Lys Ala lie His Glu Leu 120 lie Gin Val Met Ala Glu Leu Ser- Pro Ala Ala Lys Thr 130 140 Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gin Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gin 33 DK 165750B og en efterfølgende nucleotidsekvens, der koder for translationstermineringen, indført deri og derved forårsager dannelse af polypeptidet med den ovennævnte aminosyresekvens som proteinkomponent i kultursuppen. 5
11. 11. Stamme hørende til Escherichia coli og transformeret med 5 plasmidet ifølge krav 10. 10 15 20 25 30 35