DK165931B - Fremgangsmaade til bestemmelse af den intracellulaere koncentration af et mineral samt fremgangsmaade til at diagnosticere sygelige tilstande, tilboejelighed for sygdom eller metabolisk status - Google Patents

Description

DK 165931 B

Den foreliggende opfindelsen angår en fremgangsmåde til bestemmelse af den intracellulære koncentration af et mineral i en vævsprøve, især de lavmolekylære mineraler i relativt små vævsprøver, især med det for-5 mål at diagnosticere sygelige tilstande, tilbøjelighed for sygdom eller metabolisk status.

Flere lavmolekylære mineraler, såsom calcium, phosphor, kalium, magnesium, natrium og chlor, er af væsentlig betydning for en passende vækst, udvikling og funktion 10 af væv. Hidtil har forskere forsøgt at relatere serum- koncentrationer af disse mineraler til sygdomme og metabolisk status for patienter. Koncentrationer af mineralerne i serum afviger imidlertid betydeligt fra de intracellulære koncentrationer af mineralerne. Den fo-15 religgende opfindelse er baseret på den erkendelse, at de intracellulære mineral-koncentrationer i højere grad afslører sygelige tilstande og andre stress-faktorer, end tilfældet er med serum-koncentrationerne for de samme mineraler.

20 Bestemmelsen af intracellulære mineralkoncentrationer er imidlertid problematisk. Ved hidtil kendte metoder, såsom atomabsorption, kræves forholdsvis store vævsprøver for at opnå den ønskede information. Selv om sådanne prøver kan fås ved kirurgiske indgreb, vil en 25 sådan prøveudtagning være uønsket til rutine-screening af asymtomatiske patienter. Nogle forskere har forsøgt at omgå dette problem ved at anvende lymfocytter som cellekilde. Lymfocytter er dog uheldigvis ikke generelt anvendelige, fordi deres intracellulære mineralkoncentra-30 tioner ikke nødvendigvis svarer til koncentrationerne i legemesvævet, og de har et højt forhold mellem kerne og cytoplasma. Endvidere vil status for lymfocytter i høj grad være påvirket af forekommende infektion og status for det tilsvarende immun-respons. Yderligere 2

DK 165931 B

synes metoden til isolation af lymfocytter at have en virkning på de målte koncentrationer af intrace11u1 ære mineraler.

Af disse grunde vil det være ønskeligt at tilvejebringe 5 forbedrede metoder for måling af koncentrationer af intracellulære mineraler ud fra forholdsvis små vævsprøver, der er opnået uden egentlige indgreb. Det ville yderligere være ønskeligt at tilvejebringe en metode, som giver meget nøjagtige målinger af den intracellulære 10 koncentration af alle mineraler af betydning, muliggør måling af en absolut koncentrationsværdi i stedet for forholdet mellem mineraler og giver information, som kan korreleres med sygdom og metabolisk status hos den patient, som undersøges.

15 Intracellulære mineralkoncentrationer påvirkes af et antal sygdomme. Magnesium og andre mineraler har relation til kardiovasculære sygdomme, ischemi, hjertenecro-se, følsomhed over for cardiotoxiske midler, samt har en effekt på den coronære blodstrøm, blodkoagulation 20 og artherogenese. Seelig og Heggtveit (1974) Arner. j.

Clin. Nutrition 27:59-79. Cardiovasculære sygdomme og forholdet mellem mineraler i serum, blod, og væv er rapporteret af mange forskere. Se f.eks. Abraham (1977) N. Eng. J. Med. 296:862-863; Dyckner (1979) A. Heart 25 J. 97:12-18; Whang (1981) Acta. Med. Scand. 647:139-144; Levine (1984) N. Engl. J. Med. 310:1253-1254; og Levin (1985) Card!ocascular Med. October:37-42. Hook et al. (1985) 0. Am. Coll. Nutrition 4:332, Abstract 52, 26th Annual Meeting of the American College of Nu-30 trition and the Fourth International Symposium on Magne sium, beskriver anvendelsen af elektron-prøve-mikroana-lyse til bestemmelse af magnesium i perifere blod-mono-nucleære celler.

3

DK 165931 B

Bestemmelsen af det intrace 11u1 ære forhold mellem magnesium og calcium og sammenhængen mellem størrelsen af dette og diagnosticerede cardiovasculære sygdomme blev først rapporteret af ansøgeren i Federation Proceedings, 5 Vol. 42, March 1983, og ved International Symposium on Magnesium and its Relationship to Cardiovascular,

Renal, and Metabolic Disorders, Los Angeles, Califonia, februar 1985. Ved præsentationen blev også diskuteret ændringer af calcium- og magnesium-koncentrationer hos 10 sportsfolk før og efter en atletisk konkurrence. En afhandling baseret på den tidligere præsentation blev efterfølgende publiceret i Magnesium: Experimental and Clinical Research, 4:210-211, November 1985.

Den foreliggende opfindelse angår en ikke-invasiv meto-15 de til kvantitativt at bestemme intracel1ulære mineral- koncentrationer i vævsprøver, hvorved det er muligt at korrelere sådanne mineralkoncentrationer med bestemte sygdomme og metabolisk status, især cardiovasculære sygdomme, hypertention og metaboliske knogleforstyrrel-20 ser, såsom osteoporose. Intracel1ulære mineralkoncen trationer måles ved at udsætte vævsprøven for eksite-rende stråler af en forud valgt energi, idet man måler intensiteten af den fra vævsprøven udsendte fluoroscens, i det mindste inden for et energibånd, som er karakte-25 risktisk for det pågældende mineral, hvorved den intra- cellulære koncentration af mineralet bestemmes ved sammenligning af den målte intensitet af fluoroscensen med størrelsen af baggrunds-fluoroscensen ved et andet energibånd. Metoden kan anvendes på så små vævsprøver som 30 1 til 3 celler. Intensiteten af fluoroscensen inden for hvert energibånd er proportional med den intracel-lulære koncentration af et bestemt mineral, og testning af talrige personer har muliggjort korrelation af sådanne intrace 11ulære mi nera 1koncentrati oner med visse syg-35 domme og metaboliske tilstande.

4

DK 165931 B

Ued en foretrukken udførelsesform udtages en celleprøve fra vævet under tungen ved afskrabning og fiksering på et passende substrat. Cellerne udsættes derefter for eksiterende bestråling med en energi i et område 5 mellem 8 og 12 keU, og den resulterende fluorescens måles i flere forudbestemte energibånd, svarende til de ønskede mineraler, typisk magnesium, calcium, kalium, natrium, chlor og phosphor. En normaliseret værdi for mineralkoncentrationen opnås ved sammenligning af den 10 målte fluorescens med en baggrundsfluorescens, typisk opnået ved måling af udsendt bestråling ved et bånd fri for forventet fluorescens-toppe. Den normaliserede værdi er forholdet mellem fluorescensen inden for mineralbåndet og fluorescensen i det bånd, som ventes at 15 være fri for toppene.

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes en fremgangsmåde til at bestemme de intracellulære mineralkoncentrationer, der kan benyttes til at diagnosticere cardiovasculære tilstande og metabolisk status. Metoden 20 muliggør kvantitativ måling af biologisk vigtige mine raler, såsom magnesium, calcium, phosphor, kalium, natrium og chlor, og giver endvidere en diagnostisk rettesnor for at relatere sådanne koncentrationer til forekomsten af eller modtageligheden for cardiovasculære sygdomme, 25 hypertention, osteoporose og periodontal knoglestyrke.

Metoden er velegnet i forbindelse med meget små vævsprøver, såsom tungeafskrab, men kan benyttes i forbindelse med praktisk taget enhver kilde for levende, fortrinsvis nucleerede, aerobe celler eller væv. Mineraler-30 ne detekteres ved at udsætte celleprøven for eksiterende bestråling i form af en elektronstråle med høj energi, og iagttage intensiteten af fluorescensen ved bestemte energibånd, som er karakteristiske for det mineral, som skal detekteres. Ved at udføre testningen på patienter 35 med cardiovasculære lidelser og osteroporose, og ved 5

DK 165931 B

at sammenligne resultaterne af prøverne med en population af a s ymt oma t i ske individer, har det været muligt at udvikle intracel1 ulære mi nera 1-profi 1 er, som er karakteristiske for cardiovasculære sygdomme, osteoporose 5 og periodontal knogletab.

Den foreliggende opfindelsen er baseret på undersøgelse 'af individuelle vævsceller, som er udtaget af en patient, forskellige cellulære kilder er egnet, idet hovedbetingelsen er, at cellerne er levende, fortrinsvis nucleerede, 10 og udviser ultrastruktur eller mikrovilli. Sådanne celler fås normalt ved biopsi, vaginal afskrab, spyt, afskrab fra underside af tungen og lignende. Fortrinsvis benyttes tungeafskrab, der let fås og giver celler som er meget karakteristiske for patientens totale cellulære 15 metabolisme, fremgangsmåden ifølge opfindelsen er også velegnet til at bestemme intracellulære mineralkoncentrationer i serumprøver, herunder lymfocytter og erythtro-cytter. Minera 1koncentrati onerne i sådanne prøver anses dog ikke for at være repræsentative for patientens to-20 tale sygdoms- eller metaboliske status.

Tungeafskrab fås hensigtsmæssigt ved kraftigt at skrabe slimhinden ved tungeroden tæt ved frenulum for derved at få isoleret nucleerede epithelceller. Forud for skrab-ningen bør mundhulen være skyllet flere gange med destil-25 leret vand, og patienten bør ikke have spist en time forud for prøven. Den til skrabningen anvendte spatel må være fri for sporelementer og andre materialer, som kan indvirke på elektronfluorescensen, der benyttes til detektering af mineralerne som skal testes, således 30 som det skal beskrives i enkeltheder i det efterfølgende.

Spatlen må gnubbes kraftigt til opnåelse af den nødvendige celleprøve, men uden at forårsage smerte eller blødning.

6

DK 165931 B

Cellerne på spatlen overføres til et observationssubstrat, som beskrevet i det efterfølgende, og en udstry-gende bevægelse anvendes til at fordele cellerne over et forudbestemt areal. Medens udstrygningen stadig er 5 frisk, dryppes et mildt fixativ på cellerne, og der henstilles til tørring. Egnede fixativer må være fri for stoffer, som kan fluorescere under elektronbombard-ment og interferere med testningen. Et egnet fixativ består af 9 5 % ethylalkohol og 2,5 % carbovoks fra fir-10 maet Medical Packaging Corporation, Panorama City, Cali fornia, forhandles under varemærket Cytology Fixative.

Et andet egnet fixativ er 84,2 % isopropylalkohol, 6,4 % polyethylenglycol, idet resten af drivmiddel. Dette fixativ sølges under varemærket Spray-Cyte af Clay Adams, 15 Division of Becton-Dickenson, Parsippany, New Jersey.

Såsnart præparatet er lufttørret, kan det opbevares, transporteres til et centrallaboratorium for testning eller kan testes umiddelbart.

Observationssubstrater må være ledende og fri for ma-20 terialer, som kan interferere med det forventede fluorescensmønster fra de cellulære mineraler. Særlig velegnet er carbon-præparater eller planchetter med høj renhed, typisk med en dimension på 25 x 50 mm. Præpa-

R

raterne kan fremstilles ud fra GTA Grade Grafoil fra 25 Union Carbide Corp., Danbury, Connecticut. Sædvanligvis dannes et observationsområde på kulstofskiven ved dannelse af en fordybning for at angive en passende placering af vævsprøven. Iagttagelsessubstratet kan også fremstilles ud fra andre materialer, såsom glas eller plast, 30 men det vil være nødvendigt at anbringe et ledende lag på overfladen for at muliggøre drift af scanningselektronmikroskopet som beskrevet i det efterfølgende.

Detektionen af de intracellulære mineralkoncentrationer afhænger af et bombardment af celleprøven med stråler 7

DK 165931 B

af høj e npr gi, typisk elektroner eller rønt genstråJer.

Lnergien af denne bestråling overføres delvis til atomerne i prøven, herunder de mineraler, der skal bestemmes, og den overførte energi vil delvis resultere i 5 en fluorescens af sekundære stråler, typisk røntgenstrå ler. Fluorescens!mier eller bånd for røntgenenergien fra det pågældende atom eller grundstof er entydigt karaktensktisk for det pågældende atom eller grundstof.

Ved f r emgangsmådefl i føl ge den foreliggende opfindelse 10 kan man således foretage måling af fluorescensen inden for disse karakteristiske røntgenstrålebånd til at bestemme koncentrationen af mineralerne, som findes i cellerne.

Energikilden må besidde en energi mellem 8 og 15 keV, 15 fortrinsvis 8-12 keV til at eksitere de biologiske mi neraler, som skal måles, og må også kunne fokuseres, fordi det er ønsket at eksitere enkelte celler uden at eksitere de omgivende celler.

Det er endvidere hensigtsmæssigt, at cellerne kan vi-20 sualiseres under prøvningen. En sådan visualisering gør det muligt at scanne de enkelte celler, således at levedygtige, ikke-beskadigede celler kan udvælges til exitation. Til dette formål har det vist sig særligt bekvemt at anvende kommercielt tilgængelige scannings-25 elektronmikroskoper til udførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Sådanne mikroskoper frembringer elektronstråler med energier i området 8 til 12 keV, som kan fokuseres og muliggører en visualisering af celleprøven ved forskellige forstørrelser.

30 Til detektion af fluorescensen, som udsendes fra vævs cellerne, når de bombarderes med den exiterende elektronstråling, benyttes en detektor, der skal muliggøre 8

DK 165931 B

diskrimination inden for det energibånd, som anvendes, typisk fra 500 til 5000 eV. Egnede detektorer er sili-con-lithiumdetektorrør, der forhandles på markedet af mange leverandører, såsom Princeton Gamma Tech, Prince-5 ton, New Jersey.

De observerede emissionsbånd falder generelt inden for området 500 til 5000 eV, idet de udvalgte særlige bånd er fri for interferens fra andre kilder. Emissionsbånd svarende til de seks mineraler, som har betydning, sam-10 men med to baggrundsemissionsbånd, der udvælges for at være fri for emission under prøvebetingelserne, fremgår af efterfølgende tabel 1. Den omhandlede metode omfatter integrering af emissionstællinger fra vævsprøven i hvert af de ønskede emissionsbånd i et forudbe-15 stemt tidsrum. Sådanne emissioner vil, når de sammen lignes med baggrundsemissionerne som beskrevet i det efterfølgende, kunne relateres direkte til den absolutte mineralkoncentration i en enkelt celle. Sædvanligvis vil et antal af individuelle celler blive testet, og 20 cellekoncentrationen beregnes som et gennemsnit.

Tabel 1

Element _Bånd-grænse (eV)

Bred Snæver

Baggrund 680- 810 687,5 - 802,5

Magnesium 1170 - 1330 1179,8 - 1324,2

Phosphor 1900 - 2090 1935,1 - 2088,9

Natrium 2220 - 2390 2227,3 - 2384,7

Chlor 2530 - 2710 2539,5 - 2700,5

Kalium 3220 - 3400 3227,6 - 3396,4

Calcium 3600 - 3780 3603,5 - 3776,5

Baggrund 4100-4250 4100-4250 9

DK 165931 B

Efter at den ønskpde vævsprøvp er monteret og fikseret på en carbonstrimmel, anbringes denne i prøveholderen af scanningselektronmikroskopet, og prøvekammerat evakueres. Det har vist sig, at den relative vinkel for 5 prøven til elektronstrålen har en effekt på visuali sering og eksitenng af de individuelle celler. Det foretrækkes, at indfaldsvinklen mellem elektronstråling og carbonstnmlen reduceres til under ca. 60°, fortrinsvis under ca. 50°, og mere fortrinsvis under 30°. Den mindste 10 indfaldsvinkel synes at forbedre emissionen for de sekun dære elektroner, der producerer både det visuelle billede og inducerer røntgenstrålefluorescensen. Endvidere synes vinklen at maximere indtrængningen af elektroner gennem hele cellen, hvilket sikrer, at den totale mineralkon-15 centration iagttages. Under anvendelse af et konventionelt elektronmikroskop med en lodret elektronstråle kan i n d -faJdsvinklen reduceres ved at hælde prøveholderen opad fra det horisontale plan.

Såsnart præparatholderen for den cellulære prøve er 20 bragt på plads og vakuumet er opnået, tilsluttes mikro skopet med en forstørrelse på fra 250 til 300 gange, hvilkpt sædvanligvis vil afsløre flere hundrede enkeltceller. Operatøren bør udvælge celler, som er nucle-erede, ikke-beskadigede og udviser mikrovilli eller 25 har en diskret membran ultrastruktur. Efter udvælgelse af en sådan celle forøges forstørrelsen, indtil kun den celle er synlig på mikroskopets skærm. Som følge af mikroskopets egenskaber er scanningsarealet af elektronstrålen reduceret til den nævnte enkelte celle, 30 og indfaldende bestråling rammer ikke andre celler i præparatet.

Såsnart der er fokuseret på den enkelte celle tilsluttes røntgpnfluorescensdetektoren, og det udsendte strå- ίο

DK 165931 B

lingsmønster iagttages i et forudvalgt tidsrum ved den benyttede forstørrelse, typisk ca. 10 sek. Detektoren er forbundet med en tæller, hensigtsmæssigt en computer kontrolleret tæller, som registrerer strålingstæl1inger 5 ved hvert energibånd af i-nteres-se. Efter forløbet af prøveperioden er der således foretaget en måling af den totale emission for hvert bånd. Denne proces gentages for et ønsket antal celler, typisk 10 til 100 og fortrinsvis 15 til 25. Såsnart alle data er akkumuleret 10 beregnes middelværdien for energiemission pr. celle.

Efter opnåelse af middelværdien for energiemissionen for hvert energibånd af betydning, herunder baggrundsenergibåndene, er det nødvendigt at beregne mineralkoncentrationen i hver celle.

15 Den beskrevne procedure gør det muligt direkte at beregne koncentrationerne i konventionelle enheder, såsom Mækv/1.

Ued anvendelse af kalibrerede individuelle standards til sammenligning er det muligt direkte at beregne koncentrationerne, idet man udnytter samme målebetingel-20 ser, f.eks. masse pr. celle eller volumen, efter føl gende ligning: C = SP (Mækv(STD))

STD

hvor: C = ukendt mineral-koncentration.

SP = Prøve-tælling.* STD = Standard-tælling.* Mækv(STD) = Standard mineral-koncentration.

* Efter normalisering af standard og ukendt ved subtraktion af baggrund.

I stedet kan der ved den omhandlede opfindelsen anvendes 25 arbitrere koncentrationsenheder, der er defineret som 11

DK 165931 B

f1uorescens-tæl1inger pr. rumfangs-enhed, hvor rumfangs-enheden kan være rumfanget af en enkelt celle, dvs. ca. 800 yum^.

Spændingskontrollen for elektrongeneratoren i elektron-5 mikroskopet kontrolleres mellem 5 og 15 keU, fortrins vis mellem 8 og 12 keV, hvilket svarer til eksitations-området for de biologiske mineraler, som har interesse.

Højere spændinger ville lettere kunne stimulere røntgenstråler fra tungere grundstoffer og ville ikke til-10 strækkelig effektivt stimulere de lettere grundstoffer, såsom natrium og magnesium. Spændinger under 5 keV ville ikke være i stand til tilfredsstillende at eksitere de tungere biologiske mineraler. Hensigtsmæssigt vælges en eksitations-spænding på 12 keV. Det be-15 mærkes, at en ændring af eksitations-spændingen vil kræve en rekalibrering af systemet.

Ued udførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen bør den emitterede energidetektor anbringes så nær som mulig ved cel lepræparatet for at opfange så stor en del af 20 de udsendte røntgenstråler som muligt. Detektoren an bringes fortrinsvis inden for 50 mm fra prøven, særlig hensigtsmæssigt mellem 20 mm og 10 mm eller mindre fra prøven. Detektorens vinkel i forhold til præparatets plan er ikke kritisk, men en vinkel på ca. 60° har vist 25 sig hensigtsmæssig, men 90° foretrækkes. Det bemærkes, at såsnart en af disse parametre ændres vil systemet kræve rekalibrering. Af særlig betydning er det, at data for cardiovasculær og metabolisk status, som anføres i det efterfølgende, kun henfører til et særligt 30 system med en særlig konfiguration. Såsnart systemet er forandret på væsentlig måde, må dataer korrigeres under hensyn til sådanne forandringer.

fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er 12

DK 165931 B

benyttet til en stor gruppe patienter med cardiovascu-lære sygdomme og osteoporose, som er screenet til bestemmelse af intracellulære koncentrationer af magnesium, calcium, kalium, natrium, chlor og phosphor. Ved at 5 sammenligne de observerede koncentrationer hos de syge patienter med samme antal tilsyneladende sunde og symtom-fri kontrol personer er der opstillet et område for optimal og suboptimal mineralkoncentrationer. Disse områder er anført i efterfølgende tabel 2.

Tabel 2

Mineral Optimalt område* Sub-optimalt område*

Magnesium 800 - 1000 600 - 800

Calcium 50 - 80 80 - 200

Kalium 100 - 400 50 - 100

Natrium 10 - 14 14 - 30

Chlor 11 - 25 25 - 50

Phosphor 900 - 1200 1200 - 2100 10 * Enheder for fluorescens-intensitet (top/baggrund) /celle volumen (800 jj ) .

De i tabel 2 angivne enheder er naturligvis specifikke for det apparatur, der anvendes til screening af patienterne og kontrolindividerne. Mønstret til identificering 15 af nedsat koncentrationer af magnesium og kalium samt forhøjede af calcium, natrium, chlor og phosphor til korrelenng af disse to bestemte sygdomme er imidlertid universel og kan anvendes i forbindelse med et vilkårligt system. Særlige sygdomsforhold, som hidtil er 20 afsløret, fremgår af tabel 3.

13

DK 165931 B

Tabel 3

Sygdom Mg £a K _Na C_1 P

Cardiovas-culær tilstand D E D EN E

Hypertension D E D EN E

Osteporose/

Periodontal

knoglebrud D E E N E E

D - Nedsat E - forhøjet N - normal

Den foreliggende opfindelsen er særlig velegnet som en screeningsmetode til at identificere patienter med tilbøjelighed til cardiovasculære lidelser og/eller osteoporose. Ved anvendelsen af fremgangsmåden ifølge 3 opfindelsen kan der opnås cellulære mineral-profiler for patienten, og de kan sammenlignes med indikationerne i tabel 3 eller med fremtidige korrelationer, som opnås ved anvendelse af mineral-analyseteknikken.

Hvis patienten udviser risikofaktorer i forbindelse 10 med enhver af de nævnte mineralkoncentrationer, især koncentrationerne for magnesium, calcium, kalium og phosphor, kan der foretages yderligere diagnostiske prøver for at finde ud af, om patienten rent faktisk har risiko for cardiovasculære sygdomme, hypertension, 13 osteoporose og/eller periodontal knoglesvind.

Opfindelsen illustreres ved hjælp af efterfølgende eksempel.

DK 165931 B

u

Eksempel

Materialer og metoder 1. Tungeafskrab blev udtaget fra humane individer efter omhyggeligt skylning af mundområdet med destilleret 5 vand. En kemisk ren træspatel blev anvendt til kraftig skrabning af celler og udstrygning af dem på et substat bestående af en ren carbonskive. I stadig fugtig tilstand blev det udstrøgne præparat fikseret ved hjælp af et flydende cytologisk fixativ fra en engangsembal-10 lage eller et cytologisk spray-fixativ som ovenfor be skrevet. Præparatskiverne blev lufttørret og derefter undersøgt i et scanning electron-mikroskop (International Scientific Instruments, Santa Clara, California,

Model/IIIA) for størrelse, fordeling og celleegenskaber, 15 dvs. kerne, cellemembran-elementer, flad position og overlapning. Indfaldsvinklen for elektronstråling blev indstillet til 55 °, og de fluorescerende røntgenstråler blev detekteret ved hjælp af en energi-dispersiv røntgenstråle-analysator (Princeton Gamma Tech, System 20 III Model 3000T). Beregninger af røntgenstråleintensi teten for hvert grundstof pr. cellerumfang blev udført på basis af forholdet mellem maximum og baggrundsstråling, iagttaget for hvert grundstof i de foruddefinerede energibånd som ovenfor beskrevet. Sådanne værdier for 25 forholdet mellem maximum og baggrundsstråling blev der efter korreleret med normale og unormale tilstande ved screening af store populationer af symptomatiske og asymptomatiske forsøgspersoner.

Tre sunde og symptomfrie kontrolgruppe blev undersøgt.

30 Den første gruppe bestod af 11 lige gamle triatleter.

Den anden gruppe bestod af 10 forskellige personer uden påviselige sygdomssymptomer. Den tredie gruppe omfattede 4 forskellige personer uden påviselige sygdomssymptomer, 15

DK 165931 B

og som endvidere ikke udviste symptomer på koronaer arteriesygdom (CAD), når de blev undersøgt ved intravenøs angiografi.

Fire grupper patienter med symptomer blev også undersøgt.

5 Den første gruppe bestod af elleve patienter, som var underkastet hjertekirurgi, og som var diagnosticeret med cardiovasculær sygdom ved intravenøs angiografi.

Den anden gruppe bestod af 34 patienter, der var diagnosticeret for arteriosclerotisk hjertesygdom (ASHD), 10 periferisk vasculær sygdom og hypertension med og uden kaliumopfyldning. Den tredie gruppe bestod af ti patienter, der var diagnosticeret med atrialfibri1lation (AF). Den fjerde gruppe bestod af seksten patienter, diagnosticeret med osteoporose og/eller periodontal 15 sygdom.

Resultater

Tabel 4 angiver de observerede intracellulære mineral-koncentrationer for de forskellige test- og kontrolgrupper, hvor koncentrationsenhederne er angivet som 20 fluorescens (top/baggrund)/cel levolumen (800 /jm^).

16

DK 165931 B

σ' co i—i r·' co o ^

<—I r“t i—j ί I i—1 -f· I

— I +1 +1 +1 +1 +1 O' cj| r-~ —i o —i

VC

Ό Ό O θ' Γ" r- r—< pH fsj r—I I r—4 «π:

Cl CM ΙΛ LA CM ΓΛ ral o o o o o o z.\ +1+1 +1 +i +i I*' iT\ O' —I —» —i

»I Vk *>. rv «s CO

fA CM CM CM t- i—! pH rH *“H <-H .Π

pH CJ

CO On O On ** C

- - - - o o

LA O' a LA CM _Y

+1 +1 +1 +1 +1 I

A LA θ' Γ- lA E

r» ·» *\ r» p

QN lA Q\ SO ί—I H

CD On CO <t —t

rH i—I CO

-X

en

• H

a O' ·—i i" r*· ’•i ·—> CM A LA FA Ό L- —> D-l +1 +1 +1 +1 +1 ro ΓΟΟ 1A O CO r» ro c O CM Ό Ό A er ω

c cm <r <r <—i <r o E

O i—i i—i r—4 i—1 i—I r— li

•ri -TO C

-U C C

ro roe; c- er ·

4-i Ό LA

<r C CO lA q; c

CD <+ - CO A - ZD (DO

—1 CJ -<}-- CM CM

U C CTf 00 .—I Ό θ' -η E (DO

CD o s; I +1 +1 +1 +1 +1 O Ό <t-Y Ό LA r— CM O' "O C ? °C0 I— I O O' CM — - er ro ro o.

—i cavor-rio

CD r-l A CD CD E

(Η I" r- CD - D

ro ro tro tro · -i c K c — •ri --i ti ro ro s: o ό ro ro ε roe or'- - cm - roe ό ro

- — Ό - O CD : n D

rol cmoo-to· h roroo.en cj| +i +i +i+i +i > o. æ oorAv+Mf -d· o er ro —i - - - - - -HOCDro

Ό <r I-H tA ‘CD "D 1 r—I

O0'CMr-| r-| CnCnEn-i i—i r—i i—i cd o ro ro

O Cl_ -ri O

-n CD ti E CO ti o ro roe -t>

O— --i C

* —i roe ή ro ro i -i cd ·ί ro ro i o ti roe u- ro Ό Ό E -1 Cl- T) ccro c tro cd E > rocoti o roe e s o co

r-ι -i er Π Q. Ή O C CD JC

ro ro o i-! > cd ro •ri CD CJ1 CD > - ' ro ro roe roe er xioro -p co ro c ro α cd cd c —> ml ro -h ro ro ro ro —! Q. -1 T| < * Z Ί -4 Ί. E dl er roro -*J *i ri *—i ro ro -o roro + i— ro cdo ro-eic-ro roro rococo roro æro .oro rooc ftj — rora er -ro £ ε ό ro ro -i ro ro ro roe ro hq.

i—14-i ro o o ro 4-i er 4-> u_ 4-> -n o roe ό -ro o c *—i 4—1 4—1 roe oc ic c o.*—< ro ro co c roro 4-> o. o. ro ro ro — ro ro o ro co ro= q-lj 4TO ri ra E E ro *r1 Q *r1 — -ι-t -1 CD —-i C 4-i * ri 4—> CD U IC -TO ro 4— t-i n— c o cd rocDCDQ.cDcora4->roracDo * ml roe ο] ι~<<οο.<ο_Γ2;ο.ο.ο·σ * * ml ml

Claims (9)

1. Fremgangsmåde til bestemmelse af den intracellulære koncentration af et mineral i en vævsprøve, kendetegnet ved, at vævsprøven udsættes for eksiterende stråling i form af en fokuseret elektronstråle med en 5 energi i området 8 til 15 k e\l, at man måler intensi teten af den fra vævsprøven udsendte fluorescens, i det mindste inden for ét energibånd, som er karakteristisk for det pågældende mineral, og at den intracellulære koncentration af mineralet bestemmes 10 ved sammenligning af den målte intensitet af fluorescensen med størrelsen af baggrunds-fluorescensen ved et andet energibånd.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den eksiterende stråling er rettet mod en enkelt 15 celle i vævsprøven.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den eksiterende stråling er rettet mod et præparat af udstrøget cellevæv under anvendelse af en scan-nings-elektronstråle med den nævnte energi, 20 at man visualiserer individuelle celler i det udstrøgne præparat ved hjælp af en sekundær elektrondetektor, at man identificerer mindst én enkelt levende individuel celle, baseret på forud bestemte selektionsegenskaber, at man scanner den nævnte levende celler med elektron-25 strålen, DK 165931 B at man måler intensiteten af fluorescensen, som udgår fra den ene levende celle med mindst ét energibånd, der er karakteristisk for det pågældende mineral, og at man bestemmer den intracellulære koncentration af 5 mineralet ved at sammenligne den målte intensitet af fluorescensen med et mål for baggrunds-fluorescensen ved et andet energibånd.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at en enkelt individuel celle udvælges, baseret 10 på tilstedeværelse af en kerne, microvilli og membran-ultrastruktur .

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at et minerals fluorescensegenskaber måles ved hjælp af en røntgendetektor, der kan måle strålingen 15 med en energi i området fra 500 til 5000 eV.

6. Fremgangsmåde til at diagnosticere sygelige tilstande, tilbøjelighed for sygdom eller metabolisk status, kendetegnet ved, at man ved fremgangsmåden ifølge krav 1-5 bestemmer 20 de intracellulære koncentrationer af flere cellemineraler, at man sammenligner de intracellulære mineralkoncentrationer med forud bestemte normale koncentrationer til at bestemme et mønster for forhøjede, nedsatte eller normale koncentrationer, og 25 at man diagnosticerer sygdommen, tilbøjeligheden for sygdom eller metabolisk status baseret på den opnåede profil.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet DK 165931 B ved, at de intraceJ1 uJære koncentrationer af celleminera-Jerne bestemmes ved: at vævsprøven udsættes for eksiterende elektronstrå-Jing med den i krav 1 angivne energi, 5 at man måler intensiteten af fluorescensen fra vævsprøven inden for flere energibånd, der er karakteriske for de mtracel lulære mineraler, og at man bestemmer de intracellulære koncentrationer af cellemineralerne ved at sammenligne intensiteten af 10 fluorescensen med et mål for baggrunds-fluorescensen ved et andet energibånd.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at vævsprøven er udstrøgne vævsceller.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet 15 ved, at de udstrøgne vævsceller stammer fra tungeafskrab.