JPH083468B2 - 細胞内無機質濃度の定量方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 （１） 発明の分野 本発明は一般的には細胞内無機質濃度のエネルギー分
散性分析に関し、さらに詳しくは、比較的少量の組織検
体中の低分子量無機質の濃度を測定する方法、およびこ
のような濃度を疾患および代謝状態と関係づける方法に
関する。

組織が適切に成長、発達、機能するためには、様々な
低分子量無機質、たとえばカルシウム、リン、カリウ
ム、マグネシウム、ナトリウムおよび塩素イオンが必須
である。これまで、多くの研究者が、これらの無機質の
血清中レベルを、患者の疾患および代謝状態と関連づけ
ることを試みてきた。しかしながら、無機質の血清中レ
ベルは必ずしも、ある与えられた時点における細胞内無
機質濃度を反映するとは限らない。実際、本発明の方法
を用いることにより、細胞内無機質レベルは、その血清
レベルに比べて、疾患状態や他のストレス因子にはるか
によく応答するものであることが観察されている。

しかしながら、細胞内無機質濃度の定量には問題があ
る。従来方法、たとえば原子吸光法を利用した場合、所
望の情報を得るには比較的大量の組織サンプルを必要と
する。しかも、このようなサンプルは外科的手法によつ
てのみ得ることが可能で、このような方向は無症状の患
者の定常的なスクリーニング方法としてはほとんど期待
できない。一部の研究者は、細胞源として白血球を用い
ることにより、この問題点を回避することを試みてき
た。残念ながら、白血球中の無機質の濃度は、生体組織
中の濃度と必ずしも対応せず、白血球の使用は一般に有
用ではない。その上、白血球は核と細胞質の比が大き
い。しかも、白血球の状態は感染の存在および免疫応答
の状態によつて著しく影響される。さらに、白血球の単
離技術が細胞内無機質の測定値に影響するように思われ
る。

これらの理由から、非侵襲的方法で得ることができる
比較的少量の組織サンプルにより細胞内無機質の濃度を
測定するための改良方法が望まれてきた。また、無機質
の値を相対的な比ではなく絶対濃度の測定値として与
え、しかも被検患者の疾患および代謝状態と相関する情
報を与えることができる、すべての問題の無機質のきわ
めて正確な測定値が得られる方法が望まれていたのであ
る。

（２） 関係技術についての記述 細胞内無機質濃度は多くの疾患と関連することが知ら
れている。マグネシウムおよび他の無機質は、心脈管系
疾患、虚血、心筋壊死、心毒物に対する感受性に関係す
るのみでなく、冠血流、血液凝固および動脈形成に影響
する（Seeling＆Heggtveit:Amer.J.Clin.Nutrition,27:
59−79,1974）。心脈管系疾患と、血清、全血および組
織分析によつて確認された無機質の関係は多くの研究者
によつて報告されている（たとえば、Abraham:N.Eng.J.
Med.,296:862〜863,1977;Dyckner:A.Heart J.,97:12〜1
8,1979;Whang:Acta Med.Scand.,647:139〜144,1981;Lev
ine:N.Eng.J.Med.,310:1253〜1254,1984;およびLevin:C
ardiovascular Med.,Octover:37〜42,1985参照）。Hook
ら（J.Am.Coll.Nutrition 4:322,1985,American Colleg
e of Nutriton 第26回年会および“マグネシウムに関
する第４回国際シンポジウム”抄録26）には、末梢血単
球中のマグネシウムの定量のための電子プローブ微量分
析の利用が述べられている。

細胞内マグネシウム／カルシウム比の定量およびこの
比と心脈管系疾患の診断との関係が初めて問題にされた
のは、Federation,Proceedings,Vol.42,1983年３月、お
よび“マグネシウムとその心脈管系、腎系および代謝性
疾患との関係に関するシンポジウム、LosAngeles,Calif
ornia,1985年２月における本発明者による報告である。
この発表においては運動競技前後の選手でのカルシウム
とマグネシウムのレベルの変化についても論じられてい
る。前者の発表に基づく論文はその後、Magnesium:Expe
rimental and Clinical Research,4:210,211,1985年11
月に掲載された。

発明の要約 本発明は、組織検体の細胞内無機質濃度を定量的に測
定する非侵襲的方法を提供するものである。さらに、本
発明は、このような無機質の濃度と患者の疾患および代
謝状態、とくに心脈管系疾患、高血圧症、ならびに骨粗
鬆症のような代謝性疾患との関係づけを提供するもので
ある。細胞内無機質濃度は、わずか１〜３個の細胞を含
む少量の組織サンプルに励起光を照射し、蛍光すなわち
無機質が励起光の照射に曝露された結果放出される予め
選択されたエネルギー帯内の光を検知することによつて
測定される。各エネルギー帯内の蛍光強度は特定の無機
質の細胞内濃度に比例する。多くの対象について試験を
実施した結果、上述の細胞内無機質濃度とある種の疾患
および代謝状態を関係づけることが可能になつた。

特定の態様においては、舌下の細胞をかき取り、これ
を適当なサブストレート上に固定する。ついで細胞に約
８〜12keVの範囲のエネルギーを有する励起光を照射
し、生成した蛍光を、所望の無機質、通常マグネシウ
ム、カルシウム、カリウム、ナトリウム、塩素イオン、
およびリンに相当する複数個の特定のエネルギー帯にお
いて測定する。次にこの測定された蛍光を期待された蛍
光ピーク以外のエネルギー帯における放出光を測定する
ことによつて通常得られる蛍光バツクグラウンドと比較
することにより、無機質濃度の標準化値を求める。標準
化値は、無機質のエネルギー帯内の蛍光とピークを含ま
ないエネルギー帯における蛍光との比である。

特定の態様の説明 本発明によれば、心脈管系および代謝の状態の診断に
使用できる細胞内無機質濃度の定量方法が提供される。
すなわち、マグネシウム、カルシウム、リン、カリウ
ム、ナトリウムおよび塩素イオンを包含する生物学的に
重要な無機質の定量方法、さらに、これらの濃度を心脈
管系疾患、高血圧症、骨粗鬆症および歯根膜崩壊の存在
または罹病性と関連づけた診断指針を提供するものであ
る。本発明の方法はきわめて少量の組織検体たとえば舌
下組織塗抹等の使用に適しているが、実際には任意の起
源の生存能のある、好ましくは有核の、好気性の細胞ま
たは組織が使用できる。無機質は、細胞サンプルに励起
光、通常は高エネルギー電子ビームを照射し、測定する
無機質に特徴的な特定のエネルギー帯における蛍光の強
度を観察することにより測定される。本発明の試験を心
脈管系疾患および骨粗鬆症／歯槽膿漏患者に実施し、試
験結果を無症候対照群の場合と比較することによつて、
心脈管系疾患、骨粗鬆症および歯根膜崩壊に特徴的な細
胞内無機質のプロフイルが明らかにされた。

本発明は、患者から得た各組織細胞の試験に頼るもの
である。各種の細胞源が本発明の目的に適しているが、
主たる条件は、細胞が生存能を有し、好ましくは有核
で、表面の微小構造または微絨毛を示していることであ
る。このような細胞は、通常、生検、膣垢、喀痰、舌下
塗抹等から得られる。舌下塗抹は容易に得られ、患者の
全細胞代謝の特徴をよく反映する細胞を与えるので好ま
しい。本発明の方法はまた、血清サンプルならびに白血
球および赤血球中の細胞内無機質濃度の測定にも有用で
ある。しかしながら、これらのサンプル中の無機質濃度
は、患者の全身性の疾患または代謝状態を代表するもの
ではないと考えられている。

舌下塗抹は、少繋帯に近接する口の底部粘膜を強くか
き取ることにより、最近置換された有核の上皮細胞が得
られる。採取前に、口腔内を数回蒸溜水ですすぐ必要が
ある。試験前１時間には患者に食物を摂取させない。採
取に使用するスパーテルは、定量すべき無機質の測定に
用いられる電子蛍光を妨害するような痕跡の元素や他の
物質を放出するものであつてはならない。（この点は以
下に詳述する）。必要な細胞サンプルを採取するために
は、スパーテルで強くこする必要があるが、痛みや出血
を伴うほど激しくする必要はない。

スパーテル上の細胞を接鏡サブストレートに移し（以
下により詳細に説明する）、塗抹標本を動かして細胞を
予め指定された領域に分布させる。塗抹がまだ新鮮な場
合は、緩和な固定剤を細胞上に滴加し、乾燥させる。適
当な固定剤は、電子照射下に蛍光を発し、試験を妨害す
るような物質を含まないことが重要である。適当な固定
剤のひとつはMedical Packaging Corporation,Panorama
City,Californiaから“Cytology Fixative"の商品名で
市販されている95％エチルアルコールと2.5％のカーボ
ワツクスの製品がある。ほかに適当な固定剤には84.2％
イソプロピルアルコール、6.4％ポリエチレングリコー
ルからなり、残部は噴射剤の固定剤がある。この固定剤
は“Spray−Cyte"の商品名でClay Adams、Division of
Becton−Dickenson,Parsippany,New Jerseyから市販さ
れている。塗抹が乾燥したならば、保存しても、試験の
ために中央検査室に送つても、また直ちに試験してもよ
い。

接鏡サブストレートは伝導性で、また細胞無機質から
期待される蛍光パターンを妨害する物質を含んでいては
ならない。とくに適当なものは高純度カーボンスライド
またはプランセツトであり、通常大きさは約１×２イン
チである。スライドはUnion Carbide Corp.,Danbury,Co
nneticutから入手できるGTA Grade Grafoil から調製
してもよい。通常、小さい視領域が隆起させてあつた
り、または他の方法で、スライド上の組織標本を置く適
当な位置が指示されている。接鏡サブストレートをガラ
スまたはプラスチツクのような他の材料で製造すること
もできるが、表面に伝導層を沈着させ、以下に述べる走
査電子顕微鏡の操作が可能なようにする必要がある。

細胞内無機質濃度の検知は、細胞サンプルの高エネル
ギー照射線、通常、電子またはＸ線の照射に依存してい
る。この照射エネルギーは一部、問題の無機質を含めた
標本中の原子に遷移し、この相互作用の一部で遷移した
エネルギーが第二の放射線の蛍光、通常はＸ線を発生さ
せる。特定の原子もしくは元素からの蛍光のエネルギー
線またはエネルギー帯はその特定の原子もしくは元素に
特徴的である。本発明は、細胞内に存在する無機質の濃
度、これらの特性Ｘ線帯内の蛍光の測定によつて定量す
る。

エネルギー源は、問題の生物学的無機質を励起するた
めに十分のエネルギーを有するものであり、また、周囲
の細胞を励起させないで単一の細胞のみを励起させるこ
とが好ましいことから、集束可能である必要がある。電
子ビームまたはＸ線照射の使用は、一般に、これらの要
求に合致する。

本発明においては、さらに試験中に細胞を可視化でき
ることが要求される。このような可視化により、個々の
細胞を走査し、生存能のある、傷害を受けていない細胞
を励起用に選択することが可能になる。可視化の要求の
ため、本発明の方法の実施に際しては、市販の走査電子
顕微鏡を使用することがきわめて便利である。この種の
顕微鏡は、問題の範囲８〜12keVのエネルギーを有する
電子ビームを与え、電子ビームの集束が可能で、また、
細胞サンプルを様々な倍率で可視化することができる。

本発明はまた、組織細胞が電子励起線で照射されたと
きに発光する蛍光を検知するためのシステムが必要にな
る。検知システムは、問題のエネルギー帯の範囲内、通
常は約500〜5000keVを識別するものでなければならな
い。適当な検知器としては、Princeton Gamma Tech,Pri
nceron,New Jereyを含め多くの業者から市販されている
シリコン−リチウム検知管を挙げることができる。

認められる発光帯は一般に約500〜5000keVの範囲に入
り、他の光源からの妨害がない特定のバンドを選択でき
る。問題の６種の無機質に相当する発光帯および本試験
の条件下で発光を認めないように選択された２つのバツ
クグラウンド発光帯を第１表に示した。一般に、本発明
の方法では、所望の各発光帯について、予め定められた
時間の組織サンプルからの集積発光カウントを求める。
以下にさらに詳細に述べるように、この発光をバツクグ
ラウンド発光と比較すると、単一の細胞内の無機質の絶
対濃度に正比例する値が得ら れる。通常、多くの細胞について試験を行い、細胞濃度
を平均として求める。

所望の組織検体をカーボンスライド上に載せ、固定し
たのち、カーボンスライドを走査電子顕微鏡の検体ホル
ダーに位置させ、サンプル室内を真空にする。サンプル
と電子ビームの相対的角度が各細胞の可視化と励起に影
響することが明らかにされている。電子ビームとカーボ
ンスライドの間の結合の角度は約60゜以下に、好ましく
は約50゜以下に、さらに好ましくは約30゜以下と小さく
する。結合の角度が小さくなると、可視像の形成とＸ線
蛍光の誘導を行う二次的電子の放出が改善されるようで
ある。さらに、この角度は、全細胞への電子の透過を最
大とし、全体の無機質の濃度の測定を保証する。垂直に
電子ビームが入る慣用の電子顕微鏡を使用する場合は、
検体を水平から上方に傾けて、結合角を小さくする。

細胞検体を保持したスライドを配置し、真空にしたの
ち、顕微鏡の倍率を約250〜300倍の範囲に調整する。通
常これで数百の細胞が視野に現れる。次に、有核の、傷
害を受けていない、微絨毛または膜の微小構造が明瞭な
細胞を選択する。１個の細胞を選択したのち、倍率を上
げて、顕微鏡の視野にその細胞だけが見えるようにす
る。顕微鏡の性質により、電子ビームはその１個の細胞
のみに限定され、スライド上の他の細胞には照射が行わ
れない。

１個の細胞に集束されたならば、Ｘ線蛍光検知器のス
イツチを入れ、予め定められた時間、通常は約100秒
間、発光パターンを観察する。検知器をカウンター、通
常はコンピユーター制御カウンターに接続し、問題の各
エネルギー帯についての照射カウントを記録する。予め
定められた試験期間後に、各バウンドの総照射の測定値
が得られる。この操作を所望の数だけの細胞について反
復する。通常は10〜100個の範囲、とくに15〜20個の範
囲で反復される。全データが蓄積されたならば、細胞あ
たりのエネルギー放出の平均を計算する。問題の各エネ
ルギー帯についての平均エネルギー放出が得られたなら
ば、細胞内の無機質濃度を計算する必要がある。

システムの性質によつては、濃度を慣用の単位たとえ
ばMeg/Lで直接計算することが可能である。各標準の検
量線と比較すれば、同一の測定時条件たとえば細胞あた
りの重量または容量に対して濃度を直接、次のように計
算できる。

C:未知無機質濃度 SP:検体のカウント^＊ STD:標準のカウント^＊ Meg（STD）：標準の無機質濃度 ＊バツクグラウンドを差し引いて標準化後の値 別法として、本発明は、単位容量あたりの蛍光カウン
トとして定義される任意の濃度単位を用いることもでき
る。単位容量は単一細胞の容量、約800μm³とする。

電子顕微鏡の電子ガンの電圧制御は、約５〜15keV、
好ましくは約８〜12keVの範囲に調整される。これは問
題の生物学的無機質の励起範囲に相当する。電圧を上げ
れば、原子量の大きい元素からのＸ線放出が容易になる
が、原子量の小さい元素、ナトリウムやマグネシウムの
効果的な刺激が行われない。5keV未満の電圧では、電子
量の大きい生物学的無機質の適当な励起は不可能であ
る。励起電圧は12keVを選択するのが便利である。励起
電圧を変更した場合には、システムの再検量が必要にな
ることに留意すべきである。

本発明の方法を実施するに際しては、放出エネルギー
検知器を組織スライド上の細胞塗抹に可能な限り接近さ
せて置き、放出Ｘ線の部分をできるだけ高度に捕集すべ
きである。検知器はサンプルから50mmの範囲内に、好ま
しくはサンプルから20mmの範囲内に、さらに好ましくは
サンプルから10mmもしくはそれ以下の範囲内に置かれ
る。スライド面に対する検知器の角度にはとくに限定は
ないが約60゜の角が適当で、90゜がとくに好ましいこと
が明らかにされている。これらのパラメータのどれかを
変更した場合には、システムの再検量が必要なことに留
意すべきである。さらに重要なことは、以下に述べる心
脈管系および代謝の状態に関するデータは、特定の配置
を有する特定のシステムにのみ相関する。システムに実
質的な何らかの変更を行つた場合には、このような変更
を反映するようにデータを補正しなければならない。

すでに述べたように、本発明の方法を用いて、心脈管
系疾患および骨粗鬆症を有する大群の患者について、マ
グネシウム、カルシウム、リン、ナトリウム、塩素およ
びリンの細胞内濃度を測定し、スクリーニングを行つ
た。患者について認められた濃度を、等しく多数の外見
上健康な、無症状の対照者から得られた濃度と比較し、
正常および非正常無機質濃度を誘導した。この範囲を第
２表に示す。

第２表に示した値は、もちろん、患者および対照被検
者のスクリーニングに使用した装置に特異的なものであ
る。しかしながら、これらの２疾患に関連して確認され
たマグネシウムおよびカリウムレベルの低下、ならびに
カルシウム、ナトリウム、塩素およびリンの上昇のパタ
ーンは、どのようなシステムを用いても普遍的なものと
考えられる。示さなかつた疾患も含めて、特定の疾患に
おける関係を第３表に示す。

本発明はとくに、心脈管系疾患および／または骨粗鬆
章の罹病性のある患者を同定するためのスクリーニング
方法として有用である。本発明の方法を用いれば、患者
の細胞内無機質のプロフイルが得られ、これを第３表の
表示または将来、無機質分析法を用いて作成される相関
と比べることができる。患者がいずれかの無機質濃度に
おいて、とくにマグネシウム、カルシウム、カリウムお
よびリンの濃度に危険因子を示すことが明らかにされた
場合、その患者が実際、心脈管系疾患、高血圧症、骨粗
鬆症、および／または歯根膜骨崩壊の危険があるかどう
かを確認するため、さらに診断的調査を行うことができ
る。

次に、本発明を実験結果によつて例示するが、これは
いかなる意味においても本発明を限定するものではな
い。

実験の部 材料および方法 ヒト対象から舌下部分を蒸留水で完全にすすいだの
ち、舌下細胞塗抹を採取した。化学的に洗浄した木製の
スパーテルを用いて細胞を激しくかき取り、塗抹を純粋
なカーボンスライドサブストレート上に置いた。また湿
つている間に塗抹を、上述のように、使い捨て包装の液
体細胞固定剤または細胞スプレー固定剤のいずれかを用
いて固定した。スライドを放置して風乾したのち、走査
電子顕微鏡（International Scientific instruments,S
anta Clara,California,III A型）で、サイズ、分布お
よび細胞の特徴、すなわち、核、細胞膜成分、均一部
分、重複などを調べた。電子ビームの結合角度は55゜と
し、蛍光Ｘ線をエネルギー文散Ｘ線分析装置（Princeto
n Gamma Tech,System III,3000T型）を用いて検知し
た。細胞容量あたりの各元素についてのＸ線強度の計算
は、上述のように予め定められたエネルギー帯内の各元
素について認められたピークとバツクグラウンド照射の
比に基づいて実施した。このピーク対バツクグラウンド
値を、多数の有症状および無症状対象のスクリーニング
で得られた正常および異常状態と対比させた。

３群の健康、無症状対照群について試験を行つた。第
１の群は11例の年齢が一致する運動選手からなる。第２
の群は疾患の明らかな徴候のない10例の混合対照であ
る。第３群は４例の混合対照は、疾患の明らかな徴候を
示さず、さらに血管造影で冠動脈疾患（CAD）のないこ
とが明らかにされた群である。

患者についても４群の試験を実施した。第１群は血管
造影で心脈管系疾患と診断され、バイパス手術を受けた
11例の患者である。第２群は動脈硬化性心疾患（ASH
D）、末梢性血管疾患および高血圧症（カリウム投与は
行われている者もいない者も含む）と診断された34例の
患者からなる。第３群は心房細動（AF）と診断された患
者である。第４群は骨粗鬆症および／または歯根膜骨崩
壊と診断された16例の患者からなる。

結果 各試験および対照群について認められた細胞内無機質
濃度を第４表に示す。濃度の単位は、蛍光（ピーク／バ
ツクグラウンド）／細胞容量（800μ^３）である。

バイパス手術を施行された患者については、手術時に
採取された凍結された右心房、動脈パンチおよび伏在静
脈の凍結乾燥生検標本の分析も行い、評価した。生検標
本の評価にも、舌下塗抹の場合と同じ方法を用いた。結
果は、舌下細胞内の細胞内イオンレベルと外科的サンプ
ルにおけるレベルとに高い相関のあることを示した。11
例の舌下細胞中のマグネシウムレベルは、対照の806.6
に対して708.8であつた。カルシウムは舌下細胞でも、
また心房組織および動脈組織のいずれにおいても上昇し
ていた。伏在静脈では、カルシウムもマグネシウムも対
照レベルにあつた。カリウムの静脈内投与を受けた患者
では、舌下細胞のカリウムも塩素イオンも上述のように
正常範囲にあつた。

本発明によれば、カルシウム、マグネシウム、リン、
カリウム、ナトリウムおよび塩素の細胞内濃度を検出す
るための正確かつ高感度の定量法が提供される。このよ
うな濃度は、骨疾患、心脈管系疾患および関連疾患に診
断的価値を有する。

以上述べたように、本発明を、その理解を容易にする
ために、例示を用いて詳細に説明したが、その改変およ
び変更が本発明の範囲内に包含されるものであることは
当然である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】無機質の細胞内濃度の測定方法であって、 組織細胞塗抹を、５〜15KeVの範囲のエネルギーを有す
   る走査電子ビームにさらし； 副次的電子検知器を用いて塗抹中の各細胞を可視化し； 予め定められた選択特性に基づいて少なくとも１個の生
   存能のある細胞を確定し； その１個の生存能のある細胞を電子ビームで走査し； 特定の無機質に特徴的な少なくとも１種のエネルギー帯
   の範囲内でその１個の生存能のある細胞から放射される
   蛍光の強度を測定し； 測定された蛍光強度を第二のエネルギー帯における蛍光
   バックグラウンドと比較して無機質の細胞内濃度を測定
   する； ことからなる無機質の細胞内濃度の測定方法。