DK166546B - Fremgangsmaade til spaltning af peptider og proteiner ved methionyl-bindingen - Google Patents
Fremgangsmaade til spaltning af peptider og proteiner ved methionyl-bindingen Download PDFInfo
- Publication number
- DK166546B DK166546B DK516485A DK516485A DK166546B DK 166546 B DK166546 B DK 166546B DK 516485 A DK516485 A DK 516485A DK 516485 A DK516485 A DK 516485A DK 166546 B DK166546 B DK 166546B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- reaction
- process according
- cleavage
- proteins
- methionyl
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 15
- QPJDMGCKMHUXFD-UHFFFAOYSA-N cyanogen chloride Chemical compound ClC#N QPJDMGCKMHUXFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 9
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 9
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 8
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 claims description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 229920004482 WACKER® Polymers 0.000 description 3
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 2
- HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C(CN1CC2=C(CC1)NN=N2)=O HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 Cyanogen Halides Chemical class 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229910019093 NaOCl Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004880 explosion Methods 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N glycolonitrile Natural products N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- VYHVQEYOFIYNJP-UHFFFAOYSA-N methyl thiocyanate Chemical compound CSC#N VYHVQEYOFIYNJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- ZVCDLGYNFYZZOK-UHFFFAOYSA-M sodium cyanate Chemical compound [Na]OC#N ZVCDLGYNFYZZOK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
- C07K1/126—Aminolysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
- Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
i
DK 166546 B
Opfindelsen angår en særlig fremgangsmåde til spaltning af peptider og proteiner ved raethionylbindingen.
Inden for rammerne af den genteknologiske udvinding af peptider og proteiner (f.eks. insulin, proinsulin, 5 præproinsulin og analoge deraf, interferon, væksthormon) har det ofte vist sig at være fordelagtigt først at isolere produkterne i form af højeremolekylære "fusionsproteiner" .
De således dannede fusionsproteiner er mere sta-10 bile end de ønskede produkter og kan isoleres i højere udbytter ved udnyttelse af induktionssystemer. Til sådanne fusioner kommer i princippet alle proteiner, der syntetiseres af værtsorganismerne i større mængder, på tale, fremfor alt, når deres syntese er højinducerbar; ofte 15 beskrevne er β-galactosidasen, β-lactamaseri, dele af cro-proteinet, af C^j-proteinet og af tryptofanstofskiftets enzymer (fremfor alt Trp D, Trp E) . Hertil er fusioner af det ønskede genprodukt med β-galactos idase i besiddelse af særlig popularitet, fordi de derved først 20 dannede proteiner hyppigt er tungtopløselige og følgelig kan højkoncentreres (A.V. Fowler og I. Zabin, J. Biol.
Chem. 258 (1983) 14354-58.
Ud fra de resulterende fusionsproteiner kan man fraspalte de ønskede produkter ved kemiske og enzymatiske 25 fremgangsmåder, idet disse spaltningsreaktioner skal være højspecifikke for at undgå beskadigelser af produkterne.
Kemiske fremgangsmåder til proteinspaltning er for det meste refereret i sammenhæng med peptid-sekvensana-lytikken af proteiner (jfr. eksempelvis Handbook of 30 Protein Sequence Analyses, 2nd Edition, L.R. Croft,
John Wiley a. Sons; B. Witkop, Advan. Prot. Chem. 16 (1961) , 221 samt E. Gross, Methods in Enzymology, Vol.
XI, 238 (1967).
Særligt hyppigt er refereret en spaltning ved O c methionyl-bindinger med bromcyanid (B. Witkop, Adv. Prot.
2
DK 166546 B
Chem. 16 (1961) 221), da man hermed i almindelighed opnår høje spaltningsudbytter uden beskadigelse af andre peptidbindinger eller aminosyres'idek'æder.
For at opnå høje spaltningsudbytter anvender man 5 på gængs måde store bromcyanidoverskud (op til 250 gange, jfr. B. Witkop-artiklen), beregnet på den methionyl-binding, der skal spaltes, i forbindelse med lange reaktionstider op til 30 timer og stuetemperatur. Reaktionen gennemføres i stærkt surt miljø, og et foretrukket opløsningsmiddel er 10 myresyre i et koncentrationsområde fra 70 til 88 rumfangsprocent.
Bromcyanid (BrCN) er et fast stof (smp. 52°C, kp. 62°C) og en højtoksisk forbindelse. Den dødelige dosis for et normalt menneske er 92 ppm ved en virketid på 10 15 minutter (Gmelin Syst. Nr. 14 C, Fl. D 3 1976, S. 217-241; Petty's Industrial Hygene and Toxicologiy, 3. Auflage 1982,
Bd. 2 e, S. 4861). Ved urene præparater er beskrevet en spontan eksplosion af emballeret stof (se brochuren:
Sicherheit mit Merck, E. Merck, Darmstadt 5/13090/60/1282 R).
20 Håndteringen af store mængder bromcyanid ved den højttekniserede proteinspaltning er således særdeles problematisk; foruden sikkerhedsaspekterne spiller også tekniske problemstillinger (f.eks. transport af faste stoffer) en rolle.
25 Det har nu overraskende vist sig, at methionyl-bin- dingen lader sig spalte med chlorcyanid (C1CN).
Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til spaltning af peptider og proteiner ved methionyl-bindingen, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man gennem-30 fører spaltningen med chlorcyanid anvendt i et molært overskud fra 2 til 30 gange pr. methionyl-binding, der skal spaltes.
Proteinspaltninger med C1CN er ikke beskrevet i litteraturen.
35 For en fagmand er anvendelsen af C1CN til den ikke-enzymatiske spaltning af proteiner ikke ubetinget 3
DK 166546 B
O
forudseelig, fordi C1CN har en reaktivitet, der er tydeligt forskellig fra BrCN's (jfr. Houben-Weyl, Bd. II, s.545; Ullmann Bd. 9, s. 668, B.S. Thyagarajan, The Chemistry of Cyanogen Halides 2, (1968); R.T. Parfitt, 5 J. Chem. Soc. (C), 140, (1967)).Foruden den forskellige reaktivitet og aktivitet hos BrCN og C1CN iagttager man også forskellig reaktionsadfærd i forhold til samme reaktionspartnere.
C1CN er ved stuetemperatur en gas (smp. -6,9°C, 10 kp. 13,0°C); det er ikke så giftigt som BrCN (jfr. Gmelin Syst. Nr. 14 C, F 1, D 3, 1976, s. 185; Petty's Industrial Hygiene and Toxicology, 3. Auflage 1982, Bd. 2 c, s. 4859).
Den dødelige dosis for et menneske er 159 ppm ved en virketid på 10 minutter (jfr. 92 ppm for BrCN) .. Da irri- 3 15 tationstærskelværdien for C1CN med 2,5 mg pr. m ligger 3 tydeligt lavere end værdien for BrCN (6,0 mg pr. m ), har C1CN en større "selv-varsling". Det har således for en teknisk anvendelse vigtige sikkerhedsfordele.
Desuden har anvendelsen af C1CN også vigtige 20 fordele med hensyn til den tekniske fremgangsmåde: C1CN kan som gas doseres og transporteres simplere og mere ufarligt end det faste stof BrCN.
Efter at reaktionen er tilendebragt, kan man fjerne chlorcyanid-overskuddet fra reaktionsblandingen ved ind-25 blæsning af en egnet gas. Egnede er indifferente gasser såsom nitrogen. Til undertrykkelse af skumdannelsen kan man anvende egnede skumdæmpende midler. Velegnede er eksempelvis typerne SE 3, 6 og 9 fra firmaet Wacker Chemie. I tilslutning dertil oparbejder man reaktionsblan-30 dingen på gængs måde.
Den CICN-holdige gasstrøm kan ledes gennem en gasvasker, der er fyldt med vandig NaOH- og/eller NaOCl-opløs-ning. Derved nedbrydes C1CN til NaCl og NaOCN (jfr. Gmelin. Syst. Nr. 14 C, F 1, D 3, 1976, s. 184; Petty's Industrial 35 Hygiene and Toxikology, 3. Auflage 1982, Bd. 2 c, s. 4859).
4
DK 166546 B
Ved denne fremgangsmåde kan man bortskaffe spaltningsreagenset (C1CN) væsentligt mere sikkert end det mere giftige BrCN. Bortskaffelsen er dermed tidsligt og rumligt adskilt fra proteinisoleringen, der kan gennemfø-5 res ved kendte fremgangsmåder (inddampning, frysetørring).
Man anvender fortrinsvis chlorcyanid i et molært overskud fra 5 til 8 gange pr. methionyl-binding, der skal spaltes. Reaktionstiden er sædvanligvis fra 1 til 10 timer, fortrinsvis fra 3 til 6 timer.
10 Som reaktionsmedium egner sig en blanding af vand og en mineralsyre eller en med vand blandbar organisk syre. Organiske syrer, såsom myresyre, foretrækkes. Indholdet af myresyre i reaktionsmediet kan være fra 50 til 95 rumfangsprocent, fortrinsvis fra 65 til 88 rumfangsprocent.
15 De følgende eksempler tjener til belysning af op findelsen.
Eksempel 1 (sammenligningseksempel').
1 g β-Galactosidase fra E. Coli (indhold ca. 70%, 20 methionin-indhold 0,16 mmol pr. g, bestemt ved aminosyre-analyse) røres sammen med 7,5 ml 70 volumenprocents HCOOH, og der tilsættes 0,135 g (1,28 mmol) bromcyanid.
Reaktionsblandingen omrøres i 6 timer ved stuetemperatur, fortyndes med 100 ml H20 og frysetørres.
25 Remanensen udgør 0,97 g spaltningsproteinblanding.
Ved gelelektroforesen (SDS-PAGE) kan man ikke længere se nogen (3-galactosidase. Man finder fortrinsvis proteinfragmenter i et molekylvægtsområde fra 5.000 til 20.000 Dalton. Ifølge aminosyreanalyse og gaskromatografisk 30 methylrhodani-dbestemmelse udgør spaltnings graden 94%.
Eksempel 2 1 g /?-Galactosidase fra E. coli (indhold ca. 70%, methionin—indhold 0,16 mmol pr. g, bestemt ved aminosyreana-35 lyse) røres sammen med 7,5 ml 70 volumen-%'s HCOOH, og der tilsættes 0,079 g (1,28 mmol) C1CN.
O
DK 166546 B
5
Reaktionsblandingen omrøres i 6 timer ved stuetemperatur .
Efter at reaktionen er tilendebragt, tilsætter man fra 1 til 5 yul skumdæmpende middel (SE 9 fra firmaet 5 Wacker Chemie, Burghausen), og det overskydende chlorcyanid fjernes ved indblæsning af N2 (15 1 pr. time) i ca.
1,5 timer. Den chlorcyanid-holdige N2-strøm ledes til en vaskeflaske, fyldt med vandig natriumhydroxid-opløsning.
Efter uddrivelsen af chlorcyanidet fortyndes opløs-10 ningen med 100 ml H20 og frysetørres.
Remanensen udgør 1 g.
Ved SDS-PAGE kan man ikke længere se nogen β-galacto-sidase. Man finder fortrinsvis proteinfragmenter i et molekylvægtsområde fra 5.000 til 20.000 Dalton. Ifølge 15 aminosyreanalyse og gaskromatografisk methylthiodanidbe-stemmelse udgør spaltningsgraden 93%.
Eksempel 3 1 g β-Lactamase, isoleret fra E. Coli-celler, som 20 indeholder plasmidet pBR 322 (indhold ca. 75%, methioninind-hold 0,28 mmol pr. g) røres sammen med 10 ml 70 volumen-%'s HCOOH, og der tilsættes 0,236 g (2,28 mmol) CICN.
Reaktionsblandingen omrøres i 6 timer ved stuetemperatur .
25 Efter at reaktionen er tilendebragt, tilsættes der fra 1 til 5 yul skumdæmpende middel (SE 9 fra firmaet Wacker Chemie, Burghausen), og det overskydende chlorcyanid fjernes ved indblæsning af N2 (15 1 pr. time) i ca. 1,5 timer. Den chlorcyanid-holdige N2~strøm ledes til en va-30 skeflaske, fyldt med vandig natriumhydroxid-opløsning.
Efter uddrivelsen af chlorcyanidet fortyndes opløsningen med 100 ml H20 og frysetørres.
Remanensen udgør 0,99 g.
Ved SDS-PAGE kan man ikke længere se nogen β-lacta-35 mase. Man finder fremfor alt proteinfragmenter i et mole-
DK 166546 B
6
O
kylvægtsområde fra 3.000 til 10.000 Dalton. Ifølge amino-syreanalyse og gaskromatografisk methylrhodanidbestemmelse udgør spaltningsgraden 92%.
5 10 15 20 25 30 35
Claims (9)
1. Fremgangsmåde til spaltning af peptider og proteiner ved methionyl-bindingen, kendetegnet ved, at man gennemfører spaltningen med chlorcyanid anvendt i et 5 molært overskud fra 2 til 30 gange pr. methionyl-binding, der skal spaltes.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man, efter at reaktionen er tilendebragt, fjerner chlorcyanidoverskuddet fra reaktionsblandingen med en 10 egnet gas og derpå oparbejder reaktionsblandingen på gængs måde.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at man fjerner chlorcyanid-overskuddet fra reaktions-blandingen med nitrogen.
4. Fremgangsmåde ifølge ét af kravene 1-3, ken detegnet ved, at man anvender chlorcyanid i et molært overskud fra 5 til 8 gange pr. methionyl-binding, der skal spaltes.
5. Fremgangsmåde ifølge ét af kravene 1-4, k e n- 20 detegnet ved, at man gennemfører reaktionen i løbet af 1 til 10 timer.
6. Fremgangsmåde ifølge ét af kravene 3-5, k e n-detegnet ved, at man gennemfører reaktionen i løbet af 3 til 6 timer.
7. Fremgangsmåde ifølge ét af kravene 3-6, k e n- detegnet ved, at man som reaktionsmedium anvender en blanding af vand og en med vand blandbar syre.
8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at man som reaktionsmedium anvender en blanding af 30 vand og myresyre.
9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at myresyreindholdet i reaktionsmediet udgør fra 50 til 95 rumfangsprocent. 35
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3440988 | 1984-11-09 | ||
| DE19843440988 DE3440988A1 (de) | 1984-11-09 | 1984-11-09 | Verfahren zur spaltung von peptiden und proteinen an der methionyl-bindung |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK516485D0 DK516485D0 (da) | 1985-11-08 |
| DK516485A DK516485A (da) | 1986-05-10 |
| DK166546B true DK166546B (da) | 1993-06-07 |
| DK166546C DK166546C (da) | 1993-10-25 |
Family
ID=6249917
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK516485A DK166546C (da) | 1984-11-09 | 1985-11-08 | Fremgangsmaade til spaltning af peptider og proteiner ved methionyl-bindingen |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4644057A (da) |
| EP (1) | EP0180920B1 (da) |
| JP (1) | JPH0714960B2 (da) |
| KR (1) | KR930007428B1 (da) |
| AT (1) | ATE71109T1 (da) |
| AU (1) | AU580348B2 (da) |
| CA (1) | CA1247081A (da) |
| DE (2) | DE3440988A1 (da) |
| DK (1) | DK166546C (da) |
| ES (1) | ES8701780A1 (da) |
| FI (1) | FI85494C (da) |
| GR (1) | GR852693B (da) |
| IE (1) | IE58683B1 (da) |
| PT (1) | PT81445B (da) |
| ZA (1) | ZA858603B (da) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4745178A (en) * | 1987-04-22 | 1988-05-17 | Eli Lilly And Company | Process for selective peptide bond cleavage using sulfoxides and CF3 CO |
| DE3726655A1 (de) * | 1987-08-11 | 1989-02-23 | Hoechst Ag | Verfahren zur isolierung basischer proteine aus proteingemischen, welche solche basischen proteine enthalten |
| US4945157A (en) * | 1988-05-27 | 1990-07-31 | University Of Florida | Novel Extraction procedure for protein G |
| IL99383A (en) * | 1990-09-05 | 1996-01-31 | Hoechst Ag | Enzymatic process for the conversion of preproinsulins into insulins |
| PT821006E (pt) | 1996-07-26 | 2004-09-30 | Aventis Pharma Gmbh | Derivados de insulina com ligacao a zinco aumentada |
| DE19726167B4 (de) | 1997-06-20 | 2008-01-24 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung |
| DE19825447A1 (de) | 1998-06-06 | 1999-12-09 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung |
| DE10114178A1 (de) | 2001-03-23 | 2002-10-10 | Aventis Pharma Gmbh | Zinkfreie und zinkarme Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
| DE10227232A1 (de) | 2002-06-18 | 2004-01-15 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Saure Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
| US7193035B2 (en) * | 2002-10-29 | 2007-03-20 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Crystals of insulin analogs and processes for their preparation |
| EP2307441B1 (en) | 2008-08-07 | 2016-03-23 | Biocon Limited | A process for preparation of insulin compounds |
| RS59913B1 (sr) | 2008-10-17 | 2020-03-31 | Sanofi Aventis Deutschland | Kombinacija insulina i glp-1-agonista |
| CN102596175A (zh) | 2009-07-06 | 2012-07-18 | 赛诺菲-安万特德国有限公司 | 含有甲硫氨酸的水性胰岛素制备物 |
| MY180661A (en) | 2009-11-13 | 2020-12-04 | Sanofi Aventis Deutschland | Pharmaceutical composition comprising a glp-1 agonist, an insulin and methionine |
| PT3345593T (pt) | 2009-11-13 | 2023-11-27 | Sanofi Aventis Deutschland | Composição farmacêutica compreendendo despro36exendina- 4(1-39)-lys6-nh2 e metionina |
| PL2611458T3 (pl) | 2010-08-30 | 2017-02-28 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Zastosowanie AVE0010 do produkcji leku do leczenia cukrzycy typu 2 |
| US9821032B2 (en) | 2011-05-13 | 2017-11-21 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin |
| AR087693A1 (es) | 2011-08-29 | 2014-04-09 | Sanofi Aventis Deutschland | Combinacion farmaceutica para uso en el control glucemico en pacientes con diabetes de tipo 2 |
| TWI559929B (en) | 2011-09-01 | 2016-12-01 | Sanofi Aventis Deutschland | Pharmaceutical composition for use in the treatment of a neurodegenerative disease |
| EP3229828B1 (en) | 2014-12-12 | 2023-04-05 | Sanofi-Aventis Deutschland GmbH | Insulin glargine/lixisenatide fixed ratio formulation |
| TWI748945B (zh) | 2015-03-13 | 2021-12-11 | 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患治療 |
| TW201705975A (zh) | 2015-03-18 | 2017-02-16 | 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患之治療 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE337223B (da) * | 1967-05-23 | 1971-08-02 | Pharmacia Ab | |
| US3935072A (en) * | 1972-08-10 | 1976-01-27 | Tanabe Seiyaku Co., Ltd. | Purification of coenzyme A |
| US3876501A (en) * | 1973-05-17 | 1975-04-08 | Baxter Laboratories Inc | Binding enzymes to activated water-soluble carbohydrates |
| US3919049A (en) * | 1974-06-27 | 1975-11-11 | Tokyo Tanabe Co | Process for preparing {62 -galactosidase |
| SE8302758L (sv) * | 1983-05-17 | 1984-11-18 | Pharmacia Ab | Sett for uppspjelkning av disulfidbindningar och derigenom erhallen forening |
| GB8317697D0 (en) * | 1983-06-29 | 1983-08-03 | Shell Int Research | Dissolution of peptides in non-aqueous and mixed non-aqueous/aqueous solvents |
| US4496689A (en) * | 1983-12-27 | 1985-01-29 | Miles Laboratories, Inc. | Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer |
-
1984
- 1984-11-09 DE DE19843440988 patent/DE3440988A1/de not_active Withdrawn
-
1985
- 1985-10-31 AT AT85113857T patent/ATE71109T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-10-31 DE DE8585113857T patent/DE3585078D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-10-31 EP EP85113857A patent/EP0180920B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-11-07 ES ES548617A patent/ES8701780A1/es not_active Expired
- 1985-11-07 GR GR852693A patent/GR852693B/el unknown
- 1985-11-07 FI FI854383A patent/FI85494C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-11-07 US US06/795,920 patent/US4644057A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-11-07 PT PT81445A patent/PT81445B/pt not_active IP Right Cessation
- 1985-11-08 JP JP60249148A patent/JPH0714960B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-11-08 DK DK516485A patent/DK166546C/da not_active IP Right Cessation
- 1985-11-08 CA CA000494971A patent/CA1247081A/en not_active Expired
- 1985-11-08 ZA ZA858603A patent/ZA858603B/xx unknown
- 1985-11-08 AU AU49713/85A patent/AU580348B2/en not_active Ceased
- 1985-11-08 IE IE279585A patent/IE58683B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-11-09 KR KR1019850008387A patent/KR930007428B1/ko not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PT81445B (pt) | 1987-12-30 |
| DK166546C (da) | 1993-10-25 |
| KR860003832A (ko) | 1986-06-13 |
| EP0180920A3 (en) | 1989-01-04 |
| IE852795L (en) | 1986-05-09 |
| ES8701780A1 (es) | 1986-12-01 |
| ES548617A0 (es) | 1986-12-01 |
| FI85494C (fi) | 1992-04-27 |
| EP0180920A2 (de) | 1986-05-14 |
| GR852693B (da) | 1986-03-10 |
| JPS61115096A (ja) | 1986-06-02 |
| ZA858603B (en) | 1986-07-30 |
| CA1247081A (en) | 1988-12-20 |
| AU580348B2 (en) | 1989-01-12 |
| DE3585078D1 (de) | 1992-02-13 |
| IE58683B1 (en) | 1993-11-03 |
| FI854383A0 (fi) | 1985-11-07 |
| JPH0714960B2 (ja) | 1995-02-22 |
| KR930007428B1 (ko) | 1993-08-10 |
| ATE71109T1 (de) | 1992-01-15 |
| PT81445A (de) | 1985-12-01 |
| AU4971385A (en) | 1986-05-15 |
| DK516485D0 (da) | 1985-11-08 |
| FI854383L (fi) | 1986-05-10 |
| DE3440988A1 (de) | 1986-07-10 |
| FI85494B (fi) | 1992-01-15 |
| EP0180920B1 (de) | 1992-01-02 |
| DK516485A (da) | 1986-05-10 |
| US4644057A (en) | 1987-02-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK166546B (da) | Fremgangsmaade til spaltning af peptider og proteiner ved methionyl-bindingen | |
| Butler et al. | [14] Maleylation of amino groups | |
| Walsh et al. | Chemical modification studies on the Ca2+ ion-dependent protein modulator of cyclic nucleotide phosphodiesterase | |
| Pinkus | [45] Glutamine binding sites | |
| Vincent et al. | Structure-function relations and site of action of apamin, a neurotoxic polypeptide of bee venom with an action on the central nervous system | |
| Meggio et al. | Role of the β subunit of casein kinase‐2 on the stability and specificity of the recombinant reconstituted holoenzyme | |
| Tack | The β-Cys-γ-Glu thiolester bond in human C3, C4, and α 2-macroglobulin | |
| West et al. | Modification of proteases to esterases for peptide synthesis: methylchymotrypsin | |
| US20100210815A1 (en) | Insulin production methods and pro-insulin constructs | |
| US3950223A (en) | Stabilizing and enhancing urokinase activity | |
| JPH02131594A (ja) | デ‐ｂ３０‐インシュリンおよびデ‐ｂ３０‐インシュリン誘導体の製造方法 | |
| Carlow et al. | Profound contribution of a carboxymethyl group to transition-state stabilization by cytidine deaminase: Mutation and rescue | |
| Morino et al. | [10] Pyridoxal phosphate-binding site in enzymes: Reduction and comparison of sequences | |
| Phang et al. | Cloning and complete sequence of the DNA polymerase-encoding gene (BstpolI) and characterisation of the Klenow-like fragment from Bacillus stearothermophilus | |
| Mollner et al. | Murein hydrolase (N-acetyl-muramyl-L-alanine amidase) in human serum | |
| Chang et al. | Histidine decarboxylase of Lactobacillus 30a. III. Composition and subunit structure | |
| JPH0339491B2 (da) | ||
| CS271191A3 (en) | Enzymatic process of pre-proinsulins to insulins conversion | |
| Epand et al. | The essential role of the imidazole group of glucagon in its biological function | |
| Kase et al. | Hydrolysis of neo-kyotorphin (Thr-Ser-Lys-Tyr-Arg) and [Met] enkephalin-Arg6-Phe7 by angiotensin-converting enzyme from monkey brain | |
| FI73239B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av ett insulinderivat. | |
| IE883462L (en) | A method for the selective cleavage of fusion proteins | |
| Kuehl et al. | Tryptophanyl transfer ribonucleic acid synthetase of Escherichia coli. Character of required thiol group and structure of thiol peptides. | |
| Koch et al. | The effect of anhydrous strong acids on ribonuclease and lysozyme | |
| HONDA et al. | Active site-directed modification of tryptophanase by 3-bromopyruvate |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |
Country of ref document: DK |