JPH0714960B2 - ペプチドおよびタンパクのメチオニル結合での分裂方法 - Google Patents
ペプチドおよびタンパクのメチオニル結合での分裂方法Info
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- JPH0714960B2 JPH0714960B2 JP60249148A JP24914885A JPH0714960B2 JP H0714960 B2 JPH0714960 B2 JP H0714960B2 JP 60249148 A JP60249148 A JP 60249148A JP 24914885 A JP24914885 A JP 24914885A JP H0714960 B2 JPH0714960 B2 JP H0714960B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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Description
【発明の詳細な説明】 遺伝子工学によりペプチド及びタンパク（例えばインシ
ュリン、プロインシュリン、プレプロインシュリン及び
そのアナログ、インターフェロン、生長ホルモンなど）
を取得する場合に、それら生成物を高分子量の「融合タ
ンパク」の形でまず単離するのが有利であることがしば
しば判明している。
ュリン、プロインシュリン、プレプロインシュリン及び
そのアナログ、インターフェロン、生長ホルモンなど）
を取得する場合に、それら生成物を高分子量の「融合タ
ンパク」の形でまず単離するのが有利であることがしば
しば判明している。
このように製造された融合タンパクは目的物よりも安定
であり、また誘導系の利用により高収率で単離すること
ができる。このタイプの融合に基本的に適しているの
は、ホスト生物により比較的多量に合成されるすべての
タンパクである（特にそれらの合成が容易に誘導可能な
場合）。β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、Cr
oタンパクの部分、ＣIIタンパク、及びトリプトファン
代謝の酵素（特にTrpD及びTrpE）については、しばしば
報告がある。目的遺伝子とβ−ガラクトシダーゼとの融
合がこの目的に対し特に汎用されているが、それは、こ
の場合に当初に産生されるタンパクはしばしば難溶性で
あり従って濃縮しやすいためである（A.V.Fowler及びI.
Zabin,J.Biol.Chem.258（1983）14354〜58参照）。
であり、また誘導系の利用により高収率で単離すること
ができる。このタイプの融合に基本的に適しているの
は、ホスト生物により比較的多量に合成されるすべての
タンパクである（特にそれらの合成が容易に誘導可能な
場合）。β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、Cr
oタンパクの部分、ＣIIタンパク、及びトリプトファン
代謝の酵素（特にTrpD及びTrpE）については、しばしば
報告がある。目的遺伝子とβ−ガラクトシダーゼとの融
合がこの目的に対し特に汎用されているが、それは、こ
の場合に当初に産生されるタンパクはしばしば難溶性で
あり従って濃縮しやすいためである（A.V.Fowler及びI.
Zabin,J.Biol.Chem.258（1983）14354〜58参照）。
目的物は得られた融合タンパクから化学的及び酵素的方
法を用いてとり出すことができるが、これら分裂反応は
生成物に対する損傷を避けるために特異性が高いもので
ある必要がある。
法を用いてとり出すことができるが、これら分裂反応は
生成物に対する損傷を避けるために特異性が高いもので
ある必要がある。
タンパク分裂の化学的方法は通常、タンパクのペプチド
配列分析に関連して言及されている（例えば、Handbook
of Protein Sequence Analyses,第２版、L.R.Crof
t,John Wiley and Sons;B.Witkop,Advan.Prot.Chem.16
（1961）,221及びE.Gross,Methods in Enzymology,XI
巻.238（1967）参照）。
配列分析に関連して言及されている（例えば、Handbook
of Protein Sequence Analyses,第２版、L.R.Crof
t,John Wiley and Sons;B.Witkop,Advan.Prot.Chem.16
（1961）,221及びE.Gross,Methods in Enzymology,XI
巻.238（1967）参照）。
臭化シアンを用いたメチオニル結合での分裂が特に言及
されることが多い（B.Witkop,Adv.Prot.Chem.16（196
1）221参照）が、それは、一般的にこれによって他のペ
プチド結合またはアミノ酸側鎖に対する損傷を伴うこと
なく高い分裂収率が達成されるからである。
されることが多い（B.Witkop,Adv.Prot.Chem.16（196
1）221参照）が、それは、一般的にこれによって他のペ
プチド結合またはアミノ酸側鎖に対する損傷を伴うこと
なく高い分裂収率が達成されるからである。
高い分裂収率を得るために、通常、分裂させるべきメチ
オニル結合に対して大過剰の臭化シアン（250倍まで。
前記B.witkopによる論文参照）、及び30時間までの長い
反応時間、そして室温が用いられている。反応は強酸性
媒質中で行なわれるが、好ましい溶媒は70〜88容量％の
濃度範囲の蟻酸である。
オニル結合に対して大過剰の臭化シアン（250倍まで。
前記B.witkopによる論文参照）、及び30時間までの長い
反応時間、そして室温が用いられている。反応は強酸性
媒質中で行なわれるが、好ましい溶媒は70〜88容量％の
濃度範囲の蟻酸である。
臭化シアン（BrCN）は固体（融点52℃，沸点62℃）であ
り、また毒性の高い化合物である。正常人に対する致死
量は10分間の曝露時間として92ppmである（Gmelin Sys
t.No.14C,F1.D3 1976,217〜241頁;Petty′s Industrial
Hygiene and Toxicology、第３版、2c巻、4861頁参
照）。不純物を含む製品を含んだ包装体の自然爆発も報
告されている（「Safety with Merck」,E.Merck,Darmst
adt 5/13090/60/1282R,と題する冊子を参照）。
り、また毒性の高い化合物である。正常人に対する致死
量は10分間の曝露時間として92ppmである（Gmelin Sys
t.No.14C,F1.D3 1976,217〜241頁;Petty′s Industrial
Hygiene and Toxicology、第３版、2c巻、4861頁参
照）。不純物を含む製品を含んだ包装体の自然爆発も報
告されている（「Safety with Merck」,E.Merck,Darmst
adt 5/13090/60/1282R,と題する冊子を参照）。
従って、工業的に大規模に多量のBrCNをタンパク分裂に
用いるのには大きな問題があり、また安全性の見地のほ
かに、技術的要因（例えば固体輸送）も関係する。
用いるのには大きな問題があり、また安全性の見地のほ
かに、技術的要因（例えば固体輸送）も関係する。
今般、驚くべきことに、塩化シアン（CICN）を用いてメ
チオニル結合を分裂できることを見出だした。
チオニル結合を分裂できることを見出だした。
すなわち、本発明は塩化シアンを用いて分裂を行うこと
よりなるメチオニル結合でのペプチド及びタンパクの分
裂方法に関する。
よりなるメチオニル結合でのペプチド及びタンパクの分
裂方法に関する。
CICNを用いたタンパク開裂は文献に記載されていない。
非酵素的タンパク分裂にClCNを用いることは当業者にと
り、必ずしも予測可能ではない。何故ならClCNの化学的
反応性はBrCNのそれとは余りにも異なるからである（こ
の点については、Houben−Weyl、II巻、545頁;Ullmann.
9巻、688、B.S.Thyagarajan,The Chemistry of Cyanoge
n Halides ２，（1968）;R.T.Parfitt,J.Chem.Soc.
（Ｃ），140，（1967）参照）。BrCNとClCNの反応性及
び活性の相違のほかに、同じ反応体との反応の仕方にも
相違が見出だされている。
り、必ずしも予測可能ではない。何故ならClCNの化学的
反応性はBrCNのそれとは余りにも異なるからである（こ
の点については、Houben−Weyl、II巻、545頁;Ullmann.
9巻、688、B.S.Thyagarajan,The Chemistry of Cyanoge
n Halides ２，（1968）;R.T.Parfitt,J.Chem.Soc.
（Ｃ），140，（1967）参照）。BrCNとClCNの反応性及
び活性の相違のほかに、同じ反応体との反応の仕方にも
相違が見出だされている。
ClCNは室温で気体である（融点−6.9℃；沸点13.0
℃）。それはBrCN程有毒ではない（Gmelin Syst.No.14
C,F1,D3,1976,185頁;Petty′ｓ Industrial Hygience
and Toxicology,第３版,1982,第2c巻，第4859頁参
照）。人体に対する致死量は曝露時間10分で159ppm（Br
CNの場合は92ppm）である。ClCNの刺激閾値は2.5mg/m3
でありBrCNのそれ（6.0mg/m3）よりも顕著に低いので、
ClCNにより与えられる「自動警報」はより明白である。
即ちClCNは工業的に用いる上で相当に安全上有利であ
る。
℃）。それはBrCN程有毒ではない（Gmelin Syst.No.14
C,F1,D3,1976,185頁;Petty′ｓ Industrial Hygience
and Toxicology,第３版,1982,第2c巻，第4859頁参
照）。人体に対する致死量は曝露時間10分で159ppm（Br
CNの場合は92ppm）である。ClCNの刺激閾値は2.5mg/m3
でありBrCNのそれ（6.0mg/m3）よりも顕著に低いので、
ClCNにより与えられる「自動警報」はより明白である。
即ちClCNは工業的に用いる上で相当に安全上有利であ
る。
更に、ClCNの使用はまた処理技術上相当有利である。即
ち、ClCNは気体なため、固体であるBrCNよりも計量及び
輸送が簡単であり危害がない。
ち、ClCNは気体なため、固体であるBrCNよりも計量及び
輸送が簡単であり危害がない。
反応の完了後、過剰の塩化シアンは、適当な気体を吹き
込むことにより反応混合物から除去することができる。
例えば窒素のような不活性気体が適している。泡形成を
抑えるために適当な消泡剤を添加することができる。極
めて適切な例は、Wacker ChemieタイプSE3、６及び９で
ある。その後、反応混合物を常法により後処理する。
込むことにより反応混合物から除去することができる。
例えば窒素のような不活性気体が適している。泡形成を
抑えるために適当な消泡剤を添加することができる。極
めて適切な例は、Wacker ChemieタイプSE3、６及び９で
ある。その後、反応混合物を常法により後処理する。
ClCNの負荷された気流は水性NaOH及び／またはNaOCl溶
液を含有する洗浄器に通すことができる。これによりCl
CNは分解されてNaCl及びNaOCNを与える（Gmelin Syst.N
o.14C,F1,D3,1976,184頁;Petty′s Industrial Hygiene
and Toxicology,第３版,1982,第2C巻，第4859頁参
照）。
液を含有する洗浄器に通すことができる。これによりCl
CNは分解されてNaCl及びNaOCNを与える（Gmelin Syst.N
o.14C,F1,D3,1976,184頁;Petty′s Industrial Hygiene
and Toxicology,第３版,1982,第2C巻，第4859頁参
照）。
この手順を用いれば、より有毒なBrCNよりも相当安全に
分裂剤（ClCN）を処分することができる。これに伴って
その処分は既知方法（蒸留、凍結乾燥）により行うこと
のできるタンパク単離から時間及び空間的に切り離され
る。
分裂剤（ClCN）を処分することができる。これに伴って
その処分は既知方法（蒸留、凍結乾燥）により行うこと
のできるタンパク単離から時間及び空間的に切り離され
る。
塩化シアンは分裂すべきメチオニル結合あたり２〜30モ
ル過剰で用いるのが有利である。５〜８倍モル過剰が好
ましい。反応時間は通常１〜10時間、好ましくは３〜６
時間である。
ル過剰で用いるのが有利である。５〜８倍モル過剰が好
ましい。反応時間は通常１〜10時間、好ましくは３〜６
時間である。
適当な媒質は水と鉱酸または水と混和しうる有機酸との
混合物である。例えば蟻酸などの有機酸が好ましい。反
応媒質中の蟻酸含量は50〜95容量％、好ましくは65〜88
容量％である。
混合物である。例えば蟻酸などの有機酸が好ましい。反
応媒質中の蟻酸含量は50〜95容量％、好ましくは65〜88
容量％である。
次の実施例は本発明を例示するものであって限定するも
のではない。
のではない。
実施例 １（比較例） 1gの大腸菌（E.coli）β−ガラクトシダーゼ〔含量約70
％、メチオニン含量0.16ミリモル/g（アミノ酸分析によ
る測定）〕を7.5mlの70容量％のHCOOHに攪拌混合し、そ
して0.135gの臭化シアン（＝1.28ミリモル）を添加す
る。
％、メチオニン含量0.16ミリモル/g（アミノ酸分析によ
る測定）〕を7.5mlの70容量％のHCOOHに攪拌混合し、そ
して0.135gの臭化シアン（＝1.28ミリモル）を添加す
る。
その反応混合物を室温で６時間攪拌し、100mlのH2Oで希
釈しそして凍結乾燥する。残留物は0.97gの分裂タンパ
ク混合物である。
釈しそして凍結乾燥する。残留物は0.97gの分裂タンパ
ク混合物である。
β−ガラクトシダーゼはゲル電気泳動（SDS−PAGE）に
よってもはや検出できない。タンパク断片の好ましい分
子量範囲は5.000〜20.000ダルトンであることがわか
る。アミノ酸分析及びガスクロマトグラフィによるメチ
ルチオシアネート測定によれば94％の分裂が生じてい
る。
よってもはや検出できない。タンパク断片の好ましい分
子量範囲は5.000〜20.000ダルトンであることがわか
る。アミノ酸分析及びガスクロマトグラフィによるメチ
ルチオシアネート測定によれば94％の分裂が生じてい
る。
実施例 ２ 1gの大腸菌β−ガラクトシダーゼ〔含量約70％、メチオ
ニン含量0.16ミリモル/g（アミノ酸分析による測定）〕
を7.5mlの70容量％のHCOOHに攪拌混合し、そして0.079g
のClCN（＝1.28ミリモル）を添加する。
ニン含量0.16ミリモル/g（アミノ酸分析による測定）〕
を7.5mlの70容量％のHCOOHに攪拌混合し、そして0.079g
のClCN（＝1.28ミリモル）を添加する。
その反応混合物を室温で６時間攪拌する。
反応完了後、１〜５μの消泡剤（Wacker Chemie,Bur
ghausen,より供給されるSE9）を添加し、そして約1.5時
間後N2を吹き込む（15／時）ことによって過剰の塩化
シアンを除去する。その塩化シアンの負荷されたN2気流
を水酸化ナトリウム溶液を含む洗浄ビンを通過させる。
ghausen,より供給されるSE9）を添加し、そして約1.5時
間後N2を吹き込む（15／時）ことによって過剰の塩化
シアンを除去する。その塩化シアンの負荷されたN2気流
を水酸化ナトリウム溶液を含む洗浄ビンを通過させる。
ClCNを放逐後、その溶液を100mlのH2Oで希釈しそして凍
結乾燥する。残留物の量は1gである。
結乾燥する。残留物の量は1gである。
β−ガラクトシダーゼはSDS−PAGEによりもはや検出で
きない。タンパク断片の好ましい分子量範囲は5.000〜2
0.000ダルトンであることがわかる。アミノ酸分析及び
ガスクロマトグラフィによるメチルチオシアネート測定
によれば、93％の分裂が生じている。
きない。タンパク断片の好ましい分子量範囲は5.000〜2
0.000ダルトンであることがわかる。アミノ酸分析及び
ガスクロマトグラフィによるメチルチオシアネート測定
によれば、93％の分裂が生じている。
実施例 ３ プラスミドpBR322を含有する大腸菌菌体から単離された
1gのβ−ラクタマーゼ（含量約75％，メチオニン含量0.
28ミリモル/g）を10mlの70容量％のHCOOHを攪拌混合
し、そして0.236のClCN（＝2.28ミリモル）を添加す
る。
1gのβ−ラクタマーゼ（含量約75％，メチオニン含量0.
28ミリモル/g）を10mlの70容量％のHCOOHを攪拌混合
し、そして0.236のClCN（＝2.28ミリモル）を添加す
る。
その反応混合物を室温で６時間攪拌する。
反応完了後、１〜５μの消泡剤（Wacker Chemie,Bur
ghausen,により供給されるSE9）を添加し、そして約1.5
時間後にN2を吹き込む（15／時）ことにより過剰の塩
化シアンを除去する。その塩化シアンで負荷されたN2気
流を水酸化ナトリウム溶液を含む洗浄ビンに通す。
ghausen,により供給されるSE9）を添加し、そして約1.5
時間後にN2を吹き込む（15／時）ことにより過剰の塩
化シアンを除去する。その塩化シアンで負荷されたN2気
流を水酸化ナトリウム溶液を含む洗浄ビンに通す。
ClCNを放逐後、その溶液を100mlのH2Oで希釈しそして凍
結乾燥する。
結乾燥する。
残留物の量は0.99gである。
β−ラクタマーゼはSDS−PAGEによりもはや検出されな
い。タンパク断片の主な分子量範囲は3,000〜10,000ダ
ルトンであることがわかる。アミノ酸分析及びガスクロ
マトグラフィによるメチルチオシアネート測定によれ
ば、92％の分裂が生じている。
い。タンパク断片の主な分子量範囲は3,000〜10,000ダ
ルトンであることがわかる。アミノ酸分析及びガスクロ
マトグラフィによるメチルチオシアネート測定によれ
ば、92％の分裂が生じている。
Claims (10)
- 【請求項１】ペプチドおよびタンパクを塩化シアンを用
いてメチオニル結合で分裂させる方法。 - 【請求項２】反応完了後、適当な気体を用いて反応混合
物から過剰の塩化シアンを除去し、そしてその反応混合
物を次に常法により後処理する特許請求の範囲第１項記
載の方法。 - 【請求項３】窒素を用いて反応混合物から過剰の塩化シ
アンを除去する特許請求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項４】塩化シアンを分裂すべきメチオニル結合１
個あたり２〜30倍モル過剰で用いる特許請求の範囲第１
〜３項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】塩化シアンを分裂すべきメチオニル結合１
個あたり５〜８倍モル過剰で用いる特許請求の範囲第１
〜４項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】反応を１〜10時間で行う特許請求の範囲第
１〜５項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項７】反応を３〜６時間で行う特許請求の範囲第
３〜６項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】使用反応媒質が水と、水と混和しうる酸と
の混合物である特許請求の範囲第３〜７項のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項９】使用反応媒質が水と蟻酸との混合物である
特許請求の範囲第８項記載の方法。 - 【請求項１０】反応媒質中の蟻酸含量が50〜95容量％で
ある特許請求の範囲第９項記載の方法。
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| DE19843440988 DE3440988A1 (de) | 1984-11-09 | 1984-11-09 | Verfahren zur spaltung von peptiden und proteinen an der methionyl-bindung |
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| DE3726655A1 (de) * | 1987-08-11 | 1989-02-23 | Hoechst Ag | Verfahren zur isolierung basischer proteine aus proteingemischen, welche solche basischen proteine enthalten |
| US4945157A (en) * | 1988-05-27 | 1990-07-31 | University Of Florida | Novel Extraction procedure for protein G |
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| DE19726167B4 (de) | 1997-06-20 | 2008-01-24 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung |
| DE19825447A1 (de) | 1998-06-06 | 1999-12-09 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung |
| DE10114178A1 (de) | 2001-03-23 | 2002-10-10 | Aventis Pharma Gmbh | Zinkfreie und zinkarme Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
| DE10227232A1 (de) | 2002-06-18 | 2004-01-15 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Saure Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
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-
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- 1985-11-09 KR KR1019850008387A patent/KR930007428B1/ko not_active Expired - Fee Related
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