DK166566B1 - Enzympraeparat til rensningsformaal og fremstilling heraf samt anvendelse af praeparatet til ikke-terapeutisk rensning - Google Patents

Description

DK 166566 B1

Den foreliggende opfindelse angår et præparat, der indeholder et fordøjelses- og/eller vævsenzympræparat fra et i vand levende dyr valgt blandt dyr tilhørende ordenen Euphausiaceae. Præparatet anvendes til at rense levende eller dødt materiale ved at nedbryde og fjerne 5 kontaminanter af biologisk oprindelse eller nedbrydningsprodukter af sådanne kontaminanter derfra.

I nærværende beskrivelse og krav betegner udtrykket "enzym" et aktivt enzym, medmindre andet er angivet.

Opfindelsen er anvendelig til såvel terapeutisk rensning af pattedyr 10 som ikke-terapeutisk rensning i almindelighed. Begrebet rensning anvendes således i sin bredeste betydning, dvs. rensning af såvel dødt som levende materiale såsom forskellige typer tekstiler, hår, pels, skind, plast, læder, negle, ører, spejle, glas, porcelæn, tandproteser, metaller, sten, tænder, facader, dun, kunstværker såsom 15 malerier, etc. Rensning omfatter også rensning af mennesker og dyr ved fjernelse af stoffer såsom pus (purulent exsudat), fibrin, koaguleret blod, blodskorper og necrotisk væv. Den sidstnævnte type rensning er særlig vigtig til behandling af sår, brandsår og dermatoser, fx det såkaldte enzymatiske debridement, men kan også udføres i andre 20 områder af den levende krop, hvor kontaminanter kan forekomme. Urinvejene og urinblæren er eksempler på sådanne andre områder.

Den normale fordøj ende virkning af enzymerne i dyrene samt deres autolytiske virkning i dyrene post mortem er ikke omfattet af begrebet rensning.

25 I krillen (der tilhører ordenen Euphausiaceae) findes en blanding af forskellige enzymer såsom proteinaser (med et surt og neutralt-til-basisk pH-optimum), peptidaser (exo- og endopeptidaser), lipaser, phospholipaser, amylaser og andre carborihydratnedbrydende enzymer, phosphataser, nucleaser, nucleotidaser og esteraser (T.E. Ellingsen, 30 Biokjemiske Studier over Antarktisk Krill, doktorafhandling, Institutt for Teknisk Biokjemi, Norges Tekniske Hogskole, Trondheim, 1982). Den proteolytiske (trypsinlignende) aktivitet, som findes i en vandig ekstrakt fra krill, er blevet undersøgt og beskrevet (C.-S.

Chen et al., J. Food Biochem. 2, 1978, s. 349-66). Forskellige pro- DK 166566 B1 2 teaseaktiviteter i vandige ekstrakter fra lodder er også tidligere beskrevet (A. Gildberg, Autolysis of fish tissue - General aspects, afhandling, Institut for Fiskeri, Tromsø Universitet, Norge, 1982).

Så tidligt som 1913 er det blevet foreslået at anvende enzymer i de-5 tergenter. Enzympræparater til rensning af døde materialer, fx som vaskemidler, har hidtil været baseret på forskellige mikrobielle proteaser fra slægten Bacillus. En sådan protease, der almindeligt anvendes, er subtilisin, som fås fra Bacillus subtilis-stammer, og som bl.a. markedsføres under navnet Alcalase® (Novo Industri, Køben-10 havn). Der er også blevet anvendt forskellige lipaser til rengøringsformål, især til at muliggøre nedbrydning af lipider. Ud over enzymer indeholder sådanne præparater også forskellige anioniske, kationiske og neutrale detergenter sammen med optisk hvidt såsom perborater. De hidtil anvendte enzymer har ligesom enzymer i almindelighed været 15 relativt ustabile.

De vigtigste enzympræparater på markedet til debridement af de ovennævnte komponenter er Streptokinase-streptodornase (Varidase®, Lederle Lab., American Cyanamid Company, Wayne, New Jersey, USA), stabiliseret krystallinsk trypsin (Trypure®, Novo Industri, København) og 20 bovint fibrinolysin kombineret med deoxyribonuclease (Elase®, Parke Davis & Company, Detroit, Michigan, USA). Streptokinase virker på necrotisk materiale navnlig ved sin virkning på DNA, og streptodorna-se har en specifik fibrinolytisk virkning. Trypsin virker proteoly-tisk og ekstraheres fra bovint pancreas. Fibrinolysin/deoxyribonucle-25 ase er en kombination af to enzymer, hvoraf det ene er et fibrinned-brydende enzym, og det andet virker på deoxyribonucleinsyre, som er en vigtig bestanddel i puds.

De ovennævnte enzympræparater har flere ulemper. Således er de alle relativt ustabile, hvilket medfører en hurtig nedgang i deres aktivi-30 tet enten under lagring eller anvendelse. Deres aktivitet er ofte begrænset til et bestemt pH-område, fx neutral til moderat basisk pH.

Deres aktivitet er også i mange tilfælde begrænset til visse temperaturintervaller. Ved en temperatur på over 50“C iagttages et hurtigt tab af aktivitet, og ved stuetemperatur eller normal udendørstempera-35 tur har de en lav aktivitet. I modsætning til præparatet ifølge DK 166566 B1 3 opfindelsen forårsager trypsin endvidere smerte ved behandling af sår.

Virkningen af Varidase®, Trypure® og Elase® er relativt ringe til deres formål. Der opnås sædvanligvis kun en moderat debriderende virk-5 ning efter en behandling i en periode på 3 uger.

Et formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe et rensningspræparat, som er forbedret i forhold til de ovennævnte ulemper. Et andet formål er at muliggøre en forbedret metode til rensning af levende eller dødt materiale fra de ovennævnte kontami-10 nanter, især til debridement af fibrin, koaguleret blod og dødt væv ved nedbrydning af disse bestanddele, hvorved fjernelsen deraf lettes , tilsyneladende uden at deres vandindhold forøges. Opfindelsen er derfor baseret på præparater med mere effektive enzymer end de kendte præparater. Dette gælder den samlede enzymatiske virkning på den 15 pågældende kontaminant.

Disse formål opnås ved anvendelse af et præparat, som indeholder en enzympræparation, som er isoleret fra de ovenfor anførte dyr. Enzymblandinger fra disse dyr kan opnås i et højt udbytte og på en enkel måde. For tiden er de mest foretrukne og nyttige kilder til enzympræ-20 paratet dyr af ordenen Euphausiaceae, fx antarktisk krill (Euphausia superba), Euphausia crystallorophias og dermed beslægtede arter og andre arter af krill, herunder Meganyc tiphanes norvegica, Tysanoessa inermis og andre beslægtede arter.

De enzymaktiviteter, som er vigtigst for opfindelsen, synes at stamme 25 fra dyrenes fordøjelseskanal. Den komplekse blanding af forskellige enzymaktiviteter, som fås fra dyrene, forklarer antageligvis, hvorfor præparatet udvirker en overraskende hurtig nedbrydning af biologiske kontaminanter uanset deres oprindelse. Enzymerne er aktive i basisk, neutralt og surt medium og kan udnyttes i rensningspræparater sammen 30 med forskellige overfladeaktive midler (tensider og emulgatorer) og/eller andre bestanddele såsom bærere og tilsætningsstoffer.

Den omstændighed, at præparatet indeholder en blanding af enzymer, gør det nyttigt til fjernelse af kontaminantholdige blandinger af DK 166566 B1 4 stoffer valgt blandt lipider, phospholipider, biopolymerer såsom proteiner, peptider, nucleinsyrer, mucopolysaccharider og polysac-charider og nedbrydningsprodukter af sådanne forbindelser. Disse forbindelser findes i pus, sårskorpe og necrotisk væv.

5 Der opnås særlig gode resultater, hvis de anvendte enzymer har en molekylvægt i området 15.000-80.000 Daltons eller er aktive aggregater af sådanne enzymer. Navnlig foretrækkes enzymer med en molekylvægt fra ca. 20.000 til ca. 40.000 Daltons. Disse molekylvægtområder gælder for enzymer, som fås ved vandig ekstraktion af de homogent-10 serede dyr, dvs. enzymer, som er vandopløselige under ekstraktionen.

Enzympræparatet fremstilles ved, at en enzympræparation, som stammer fra et dyr af ordenen Euphausiaceae, blandes med, opløses i, bindes til eller på anden måde kombineres med én eller flere vanduopløselige eller vandopløselige vandige eller ikke-vandige bærere, om nødvendigt 15 sammen med hensigtsmæssige tilsætningsstoffer. Det nye præparat kan have form af en salve, et pulver, en pasta, en creme, en spray, en gel, et liniment, en bandage, en olie, en tablet, en sirup, et granulat, en kapsel, etc.

Visse ikke-sterile homogene vandige opløsninger, som kun består af 20 pufferstoffer, vand som det eneste opløsningsmiddel og en enzympræparation fra de pågældende dyr, er udelukket fra begrebet det nye præparat. Sådanne vandige opløsninger er beskrevet i de ovennævnte publikationer. Det samme gælder lyofiliseret vandig ekstrakt, som ikke indeholder nogen tilsætningsstoffer.

25 I den for øjeblikket foretrukne udførelsesform enzymerne i det anvendte præparat vandopløselige og/eller har molekylvægte inden for de ovennævnte områder.

Opfindelsen angår også anvendelse af en enzympræparation, der er isoleret fra et dyr tilhørende ordenen Euphausiaceae, til fremstil-30 ling af et middel til behandling af sår, forbrændinger eller der-matoser, især til enzymatisk debridement af nekrotiske sår.

DK 166566 B1 5

Endelig angår opfindelsen anvendelsen af ovennævnte enzympræparation til ikke-terapeutisk rensning.

Opfindelsen muliggør en metode til fjernelse af biologiske kontami-nanter fra levende eller dødt materiale, fx ved enzymatisk debride-5 ment. Metoden består i at sådanne kontaminanter, som findes på dette materiale, bringes i kontakt med et enzympræparat, som indeholder en effektiv mængde enzymer, fx en proteolytisk og/eller lipolytisk effektiv mængde enzymer, som stammer fra de ovennævnte dyr, hvorefter præparatet fjernes fra materialet sammen med nedbrudte eller opløste 10 kontaminanter. I den for tiden foretrukne udførelsesform udnytter fremgangsmåden enzymer (herunder disses aktive aggregater) med molekylvægte fra ca. 15.000 til ca. 80.000 Daltons eller aktive aggregater af sådanne enzymer. Især foretrækkes enzymer med en moletylvægt på fra ca. 20.000 til ca. 40.000 Daltons. Der opnås meget store 15 fordele til fjernelse af devitaliseret materiale såsom pus, sårskorper og necrotisk væv samt fibrin eller koaguleret blod. Dette er især tilfældet, når disse materialer fjernes fra levende væv.

Den tid, som kræves til at nedbryde og/eller opløse kontaminanterne, varierer fra det ene tilfælde til det andet, men bør vælges således, 20 at den er tilstrækkelig lang til at gøre det muligt for enzymerne at nedbryde og/eller opløse kontaminanterne. Behandlingen kan om nødvendigt gentages.

Den anvendte enzympræparation kan indeholde en lang række forskellige enzymer, fx af de ovennævnte typer. Ifølge opfindelsen er det muligt 25 at anvende præparater, hvor ét eller flere af disse enzymer er blevet fjernet ved kendte metoder, fx ved at tilsætte en inhibitor, som er specifikt for ét enzym, eller ved at fjerne det pågældende enzym.

Den proteolytiske aktivitet ved den optimale temperatur er høj i pH-området 5-10. pH-0ptimum er i området 7-9. Temperaturområdet for god 30 proteolytisk aktivitet er 25-70°C, og den optimale temperatur er i området 30-55°C. Aktiviteten bevares ned til 0°C.

DK 166566 B1 6

De ovennævnte temperatur- og pH-områder kan alle udnyttes til forskellige anvendelser ifølge opfindelsen, selv om visse potentielle udførelsesformer også kan udnytte andre områder.

Fremstillingen af enzymerne fra dyrene udføres ved velkendte metoder.

5 Således kan friske eller friskfrosne dyr homogeniseres og ekstraheres med vandigt medium (fx vand). Den vundne ekstrakt kan lyofiliseres og lagres. Ekstrakten kan renses yderligere fx ved ekstraktion med et lipidopløsende opløsningsmiddel for at ekstrahere lipider. Hvis yderligere rensning er nødvendig, kan der foretages gel-, ultra-10 eller membranfiltrering. Andre rensningstrin, som er potentielt nyttige, er ionbytnings- og affinitetschromatografi. Ekstraktionen og homogeniseringen bør udføres koldt under eller nær 5°C.

De enzympræparationer, som fås ved ekstraktion med vand, kan anven des direkte eller om nødvendigt efter yderligere rensning. I de 15 fleste tilfælde er det fordelagtigt at lyofilisere en præpration, hvorfra lipider er blevet ekstraheret. I sådanne tilfælde kan det vundne pulver lagres i lang tid. Hvert anvendelsesområde kræver specifikke præparater eller former deraf. Sådanne former er i og for sig kendte. Således angår opfindelsen enzympræparater med forskellige 20 fysiske former såsom lyofiliserede enzymer, homogene vandige opløsninger eller de ovennævnte enzympræparater, som anses for at være hidtil ukendte. Den nøjagtige mængde enzymer i hvert præparat varierer fra det ene tilfælde til det andet - fra den rene lyofiliserede ekstrakt til meget komplekse detergentpræparater. Mængden af enzym 25 skal være effektiv til nedbrydning og/eller opløsning af de pågældende kontaminanter uden at have unødvendige negative virkninger på det materiale, hvorfra kontaminanterne skal fjernes. De andre bestanddele i det hidtil ukendte rensningspræparat skal vælges således, at de ikke vil påvirke det negativt under brugsbetingelserne.

30 Mængden af enzympræparation i det færdige præparat kan variere fra 0,0001% (w/w) op til 100%. Hvad angår proteaseaktivitet, kan det færdige præparat indeholde 0,0001-0,1 enzymenhed pr. mg. Afhængig af renheden af den anvendte enzympræparation kan andre mængder anvendes.

De ovennævnte enzymenheder er angivet som μπιοί tyrosinækvivalenter 35 pr. minut med casein som substrat.

DK 166566 B1 7 I præparaterne ifølge opfindelsen kan der inkorporeres forskellige tilsætningsstoffer og bærere. Egnede bærere kan være sterile, vandige og fysiologisk acceptable saltopløsninger, organiske og uorganiske geldannende materialer, fx polymerer, siliconeolier og andre stoffer 5 og blandinger deraf, som giver præparatet de ønskede fysiske egenskaber. Af tilsætningsstoffer kan nævnes antimikrobielle midler, parfumer, forskellige anioniske, kationiske, zwitterioniske og neutrale overfladeaktive midler (tensider og emulgatorer). Sådanne bestanddele er i og for sig kendte i forbindelse med andre enzympræ-10 parater til tøjvask eller enzymatisk debridement, jfr. fx tysk patentansøgning nr. 2 130 833, britisk patentskrift nr. 1 280 497, 1 296 901 og 1 573 964 og USA patentskrift nr. 3 627 688, 3 855 142, 4 212 761, 4 243 546, 4 242 219, 4 287 082, 4 305 837 og 4 307 081, hvortil der henvises.

15 Til behandling af beskadiget levende væv er det fordelagtigt at anvende et præparat, som indeholder en fysiologisk og farmaceutisk acceptabel bærer eller slet ingen bærer. Et sådant præparat kan være sterilt. Sterilisering kan udføres fx ved sterilfiltrering, når præparatet er en opløsning. Sterile præparater kan også fremstilles 20 ved at blande sterile bestanddele under aseptiske betingelser. De forskellige udførelsesformer for opfindelsen fremgår endvidere af kravene.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler.

EKSEMPEL 1 25 A. Fremstilling af en krillekstrakt

Krill, Euphausia superba, der er fanget i løbet af den antarktiske sommer og frosset med det samme og lagret i ca. 2 år ved ca. -80°C, anbringes i et rum ved ca. +5°C. Når krillene næsten er tøet op, blandes 25 g af krillene med 50 ml deioniseret vand med en temperatur 30 på 0eC. Blandingen homogeniseres og centrifugeres derefter koldt (ca.

0°C) i 1/2 time ved 12.500 x g. Den røde supernatant afdekanteres og gemmes. Bundfaldet resuspenderes i 50 ml deioniseret vand og centri- 8 DK 166B66 B1 fugeres som ovenfor beskrevet. Den nye supernatant afdekanteres og kombineres med supernatanten fra den første ekstraktion.

For at fjerne lipider fra ekstrakten sættes 20 ml carbontetrachlorid til den samlede supernatant, og der homogeniseres koldt (0°C). Blan-5 dingen centrifugeres koldt ved 25.000 x g i 15 minutter. Den vandige fase fjernes og ekstraheres påny med carbontetrachlorid og centrifugeres som ovenfor beskrevet. Den vandige fase anvendes som beskrevet under IB, hvor den betegnes den vandige ekstrakt.

B. Yderligere rensning ved gelchromatografi 10 20 ml af den vandige ekstrakt fra A chromatograferes på Sephadex® G- 100 (dextran tværbundet med epichlorhydrin, Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige) i en søjle med en diameter på 3,1 cm og en højde på 69 cm. Søjlen ækvilibreres og elueres (30 ml i timen.) med tris-HCl-puffer (0,05M, pH-værdi 7,5) ved 5°C. Fraktioner indsamles.

15 Elueringsprofilen overvåges spektrofotometrisk ved måling af UV-ab-sorptionen ved 280 nm, og fraktionernes proteolytiske aktivitet bestemmes hver for sig. De enzymatisk aktive fraktioner samles i puljer og dialyseres mod deioniseret vand. Til sidst lyofiliseres de i pulje samlede fraktioner og anvendes ifølge opfindelsen.

20 Den proteolytiske aktivitet i fraktionerne og i den lyofiliserede præparation bestemmes ved anvendelse af hæmoglobin og/eller casein som substrat (W.I. Rick, Methods of Enzymatic Analysis, vol. 2 (red.

H.V. Bergmeyer), Academic Press, New York, 1974, s. 1013-1023). Ved gelchromatografi udvindes hovedsagelig enzymaktivitet fra fraktioner, 25 som svarer til molekylvægte på 20.000-40.000 Daltons.

EKSEMPEL 2

Præparat indeholdende krill-enzymer i opløsningen 10 mg af en lyofiliseret enzympræparation (fremstillet som beskrevet i eksempel IB) blandes med 0,4 mg calciumacetat og absorberende sti-30 velse op til 1 g. Den således vundne homogene pulver rystes med 10 g DK 166566 B1 9 saltopløsning, og det således fremstillede præparat anvendes til gennemvædning af et sterilt kompres med en størrelse på 3 x 3 cm bestående af 4 lag gaze. Det våde kompres anbringes på et necrotisk sår. Der vikles gaze to gange rundt om kompresset for at holde det 5 fast. Denne bandage fastgøres yderligere med klæbeplaster. Kompresset gennemvædes hver fjerde time med præparatet. For at begrænse påføringen til kun den del af kompresset, som dækker såret, påføres blandingen ved hjælp af en injektionskanyle med en grov spids. Hele bandagen fjernes én gang om dagen og erstattes med en frisk bandage. Samtidig 10 skal nedbrudte og desintegrerede necrotiske dele fjernes mekanisk.

Ved den specifikke behandling, som blev udført, forekom såret at være rent efter 1 uge.

EKSEMPEL 3

Virkningen af krill-enzymer på necrotiske materialer 15 For at undersøge virkningen af krill-enzymer på necrotiske bestanddele, som findes på menneskehud, blev følgende forsøg udført:

Necrotisk materiale blev påført på den intakte hud på oversiden af 2 personers højre hånd. Det necrotiske materiale stammede fra et sår i et ben. Materialet bestod af devitaliseret collagenvæv, koaguleret 20 blod, fibrin, puds og sårskorpe. De mængder, som blev anbragt på hver person, var 0,5 g.

Det necrotiske materiale på hver person blev dækket med et kompres (areal 10 cm^), der var blevet gennemvædet med et i henhold til eksempel 2 fremstillet krill-enzympræparat. Hvert kompres blev dækket 25 med gaze. Eter 4 timer var begge kompresser næsten fuldstændig tørre, hvorfor der skulle tilsættes mere enzympræparat. Efter 12 timer blev kompresserne fjernet, og det necrotiske væv, som var tilbage på hver hånd, blev vejet hver for sig. Materialet viste karakteristiske tegn på nedbrydning og udviste et vægttab på ca. 25%. Den hud, som var i 30 berøring med det necrotiske materiale under forsøget, blev ikke påvirket. Der blev ikke oplevet nogen negative symptomer af forsøgspersonerne.

DK 166566 B1 10 EKSEMPEL 4

In vivo test på en person med et mindre necrotisk sår

En person med en mindre ulcus indeholdende necrotisk materiale på højre tommelfinger behandlede sig selv i en periode på 5 dage med 5 daglig påføring af en 1%'s krill-enzymopløsning (fremstillet som beskrevet i eksempel 2). Det sårede område tolererede enzympræparatet godt og viste en signifikant tendens til at blive rent og danne epithelium. Der blev ikke iagttaget nogen negative virkninger.

EKSEMPEL 5 10 Den rensende virkning på lipidrig seboretisk hud af krill-enzymer kombineret med et amfotert tensid

Der anvendtes et sædvanligt detergent bestående af 18,00% (w/wj alkylimidazolin, 1,90% (w/w) lauryl-polypeptidkondensat, 1,70% (w/w) undecylenyl-polypeptidkondensat, 28,00% (w/w) modificeret alky lether-15 sulfat pufret med fedtstoffer (lanolin), 1,40% (w/w) kokos-aminsarco-sinat, 1,90% (w/w) undecylensyre, 2,00% (w/w) undecylen-monoethan-olamid-sulfosuccinat, mælkesyre q.s. pH-værdi 6,4 og to gange destilleret vand op til 100% (w/w).

En mængde af den lyofiliserede krill-enzympræparation (fremstillet 20 som beskrevet i eksempel IB) sattes til detergentet, hvilket gav et 1%'s (w/w) enzym-detergentpræparat. Et område på 10 cm^ af huden i regio sternalis hos to personer med en synlig seborrhoea oleosa i dette område blev udvalgt til testning. Disse områder blev vasket to gange daglig i 5 dage med enzym-detergentpræparatet. Prøver fra samme 25 område blev taget før og efter vaskeperioden. Prøverne blev indsamlet og analyseret fotometrisk i henhold til H. Schaeffer og H. Kuhn-Bussius, Arch. Klin. u. exper. Dermatol. 238, 1970, s. 429.

Resultatet viste en signifikant nedgang i transmissionsværdien for begge de undersøgte personer. Dette viser således en nedbrydning af 30 hudens lipid med det anvendte enzympræparat. Til sammenligning blev DK 166566 Bl 11 der opnået en meget lille virkning, når de to personer anvendte detergent i fravær af enzymer.

EKSEMPEL 6

Sammenlignende vaskeforsøg med tekstil. Sammenligning mellem enzym 5 fra E. superba (krill), Alcalase® og destilleret vand

Lige store stykker (5x5 cm) blev klippet ud af en homogen del af et stykke klæde. Klædet havde to sider, idet den ene side var af silke og den anden af et væv bestående af en blanding af bomuld og syntetiske fibre. Seks af stykkerne blev plettet med blod, seks med mælk og 10 seks med tusch. Til hver af seks Erlenmeyer-kolber sattes 100 ml af en vandig opløsning (0,5% w/v) af det lyofiliserede krill- enzym (fremstillet som beskrevet i eksempel IB). Til hver af seks andre Erlenmeyer-kolber sattes 100 ml af en 0,5% (w/v) Alcalase® opløsning (Novo Industri, København) i destilleret vand. Til seks andre Erlen-15 meyer-kolber sattes 100 ml destilleret vand.

Til hver af to kolber indeholdende krill-enzymopløsningen, til hver af to kolber indeholdende Alcalase®-opløsningen og til hver af to kolber indeholdende destilleret vand sattes et af stykkerne, som var plettet med blod. Analogt hermed anbragtes de andre plettede stykker 20 i de resterende kolber, således at kun ét stykke var til stede i hver kolbe. Dette betyder, at hver af præparaterne lodes virke in duplo på klæde, som var plettet med blod, mælk og tusch. Derefter blev kolberne agiteret i et rystevandbad i 1 time ved 45°C. Efter denne behandling blev vaskevæsken af dekanteret, og til hver kolbe sattes 25 100 ml destilleret vand. Kolberne blev derefter forseglet med en gum miprop og agiteret kraftigt i 1 minut. Derefter blev klædestykkerne opsamlet og vasket langsomt i rindende ledningsvand i 10 minutter. Stykkerne blev foldet sammen med rene hvide håndklæder og lodes tørre.

30 Effekten af vaskningen, dvs. renheden af klædet, blev derefter bestemt ved en dobbelt blindprøve, dvs. den undersøgende person vidste ikke, hvilket vaskepræparat hvert stykke var blevet behandlet med.

DK 166566 B1 12

Vaskeeffekten, dvs. klædets renhed, blev bedømt visuelt i henhold til nedenstående rækkefølge: 0 = fuldstændigt rent klæde, 1 = ubetydelig mængder tiloversblevent snavs, 2 = moderate mængder tiloversblevet snavs, 3 = betydelige mængder tiloversblevet snavs. Resultatet af 5 vaskningen er vist i tabel I.

Tabel I

Vaskevirkningen af 0,5% (w/v) krill-enzym i destilleret vand, 0,5% (w/v) Alcalase® i destilleret vand og destilleret vand uden tilsætning af enzymer 10 0,5% krill-enzym 0,5% Alcalase® Destilleret vand i destilleret vand i destilleret vand alene

Kontami-

nanter Klæde I Klæde II Klæde I Klæde II Klæde I Klæde II

15 _

Blod 1 1 2 2 2 3 Mælk 112 12 2

Tusch 2 2 2 2 3 3 20 Det fremgår af tabel I, at enzympræparatet fra krill er mere effektivt end Alcalase® eller destilleret vand.

EKSEMPEL 7

Nedbrydning af fibrin, necrose og koaguleret blod A. Fibrin 25 Fibrin blev skåret i stykker, der varierede i vægt fra 0,2 til 0,3 g.

For hvert anvendt enzympræparat nummereredes 20 reagensglas, og til hver af disse sattes et stykke forudvej et fibrin. Til de 20 reagensglas for hvert præparat sattes lige mængder af enzympræparatet. Der DK 166566 B1 13 anvendtes Varidase® i en fortynding af 1:20 (w/v baseret på det kommercielle præparat) i destilleret vand. Trypure® blev anvendt i koncentrationen 1:15 (w/v baseret på det kommercielle præparat) i saltopløsning. De andre enzympræparationer blev fortyndet i saltop-5 løsning, og koncentrationerne af de således vundne præparater er angivet i tabel II. Krill-enzymerne, som blev anvendt, var de lyofi-liserede præparater, der blev fremstillet i henhold til eksempel IB.

De anvendte lodde-enzymer blev fremstillet på følgende måde:

Lodde (Mallotus villosus), som var fanget ud for Finmarkens kyst i 10 september måned, blev frosset og opbevaret ved -20°C i 1 år. De frosne lodder blev derefter anbragt ved 5°C. Efter 24 timer blev indvoldene, herunder fordøjelseskanalen, fjernet fra de delvis optøede lodder. 25 g af indvoldene blev blandet med 50 ml deioniseret vand og homogeniseret ved 0°C. Blandingen blev derefter centrifugeret 15 ved 12.500 x g i 1/2 time. Den delvis uklare supernatant afdekanteres og gemmes. Bundfaldet resuspenderes i 50 ml deioniseret vand og centrifugeres som ovenfor beskrevet. Den nye supernatant afdekanteres og kombineres med supernatanten fra den første ekstraktion. For at fjerne lipider fra ekstrakten sattes 20 ml carbontetrachlorid til den 20 samlede supernatant, og der homogeniseredes koldt (0°C). Blandingen blev centrifugeret koldt ved 2.500 x g i 15 minutter. Den vandige fase blev fjernet og påny ekstraheret med carbontetrachlorid og centrifugeret som ovenfor beskrevet. Den vandige fase blev til sidst lyofiliseret.

25 Undersøgelsen blev udført ved en temperatur på 33°C, som er den samme som temperaturen i sår. Efter henholdsvis 12 og 24 timer blev reaktionen standset, og det resterende fibrin blev indsamlet og holdt på et vådt filtrerpapir i 60 sekunder og vejet. Papain, ficin og Pankre-atin® var alle erhvervet fra E. Merck, Darmstadt, Tyskland.

DK 166566 B1 14

Symbolforklaring: nedgang i vægt 0-25% nedgang i vægt 26-50% — nedgang i vægt 51-75% 5 ---- nedgang i vægt 76-100%

Tabel II

Indvirkningen af forskellige enzympræparater på fibrin. Koncentrationer er angivet i procent w/v.

10 Aflæsning efter

Enzym 12 timer 24 timer

Trypure® ---- intet tilbage

Varidase® 15 Ficin 1%

Papain 1%

Pankreatin® 1% — —

Krill-enzymer 1% ---- intet tilbage

Lodde-enzymer 1% ---- intet tilbage.

20 Fibrin blev opløst på kortest tid af de præparater, som indeholdt krill-enzymer, lodde-enzymer og Trypure® i den nævnte rækkefølge. Varidase® og Alcalase® havde tilsvarende virkning som ficin, og papain havde den svageste virkning.

B. Nedbrydning af necroser 25 Necroser blev skåret i stykker på 0,2-0,3 g. For hvert anvendt enzympræparat blev der nummereret 20 reagensglas, og til hvert af disse reagensglas sattes et stykke af de forudvejede necroser. Til hvert af de 20 reagensglas for hvert præparat sattes lige store mængder af hvert enzympræparat. De anvendte præparater er vist i tabel III, og 30 deres koncentrationer er angivet som % (w/v) i saltopløsning. Varidase® og Trypure® blev fortyndet i henhold til eksempel 6A. Efter tidsintervaller på 12, 24, 36 og 72 timer blev nedbrydningen standset, og necroserne blev indsamlet og vejet.

DK 166566 B1 15

Symbolforklaring: ---- nedgang i vægt 76-100% — nedgang i vægt 51-75% nedgang i vægt 26-50% 5 - nedgang i vægt 1-25% 0 status quo 0% + forøgelse i vægt 1-25% ++ forøgelse i vægt 25-50% +++ forøgelse i vægt 51-75% 10 ++++ forøgelse i vægt 75-100% DK 166566 B1 16

Tabel III

Indvirkningen af forskellige enzympræparater på necroser. Koncentrationer i % er beregnet på en w/v-basis.

Enzympræparat Aflæsning efter 5 Koncen- 12 24 36 72 tration timer timer timer timer

Varidase® 1:20 (w/v) +++ +++

Trypure® 1:15 (w/v) ++ ++ 10 Ficin 0,5% 0 0 0 - 1,0% + 0 2,0% +

Papain 0,5% 0 + + 1,0% 0 + + 15 2,0% + + + +

Alcalase® 0,5% 0 - 0 1,0% - - -- 2,0% ....

Krill-enzymer 0,5% 20 1,0% 2,0% - --- ---- ----

Lodde-enzymer 0,5% -- — 2,0%

Pankreatin® 0,5% 0 ++ ++ ++ 25 1,0% + +++ +++ +++’ 2,0% ++ ++++ +++ +++

Det fremgår, at krill-enzymer bedre er i stand til at opløse necroser end lodde-enzymer og Alcalase® og forøger ikke deres vandindhold 30 ligesom Varidase®, Trypure® og saltvand. Hvad angår deres indflydelse på necroser, udviser papain og Pankreatin® imidlertid de samme tendenser som præparaterne på markedet, dvs. en vægtforøgelse som følge af en forøgelse i vandindhold. Ficin har en virkning, som ligner, men er svagere end virkningen af krill-enzymerne.

DK 166566 B1 17 C. Nedbrydning af koaguleret blod

Koaguleret blod blev skåret i stykker og anbragt portionsvis i reagensglas, som var anordnet som beskrevet i eksempel 7A og 7B. De anvendte enzympræparater blev opløst i saltopløsning, og koncentra-5 tionerne (% w/v) af de således vundne præparater er angivet i tabel IV. Efter henholdsvis 12 og 24 timer blev nedbrydningen standset, og blodkoaglerne blev indsamlet og vejet.

Symbolforklaring: nedgang i vægt 0-25% 10 -- nedgang i vægt 26-50% — nedgang i vægt 51-75% ---- nedgang i vægt 76-100%

Tabel IV

Indvirkningen af forskellige enzympræparater på koaguleret blod 15 Enzympræparat Koncen- Aflæsning efter tration 12 timer 48 timer , Varidase® 1:20 (w/v)

Saltopløsning 0,9% - - 20 Ficin 1,0%

Papain 1,0%

Alcalase® 1% - -

Pankreatin® 1,0%

Krill-enzymer 1,0% — ---- 25 Lodde-enzymer 1,0% — ----

Det fremgår af tabel IV, at hvad angår koaguleret blod, var krill-en-zymerne bedre end lodde-enzymerne og de andre undersøgte enzympræparater .

Claims (15)

1. Enzympræparat, kendetegnet ved, at det indeholder en enzympræparation, som er isoleret fra et dyr tilhørende ordenen EuphausLaceae, til anvendelse som et terapeutisk rensningsmiddel.

2. Enzympræparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at enzymerne i præparatet er isoleret ved vandig ekstraktion fra det homogeniserede dyr.

3. Enzympræparat ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at enzymerne i præparatet har en mole-20 kylvægt på fra ca. 15.000 til ca. 80.000 Daltons, eller er aktive aggregater af sådanne enzymer.

4. Enzympræparat ifølge krav 1, 2 eller 3, kendetegnet ved, at enzymerne omfatter proteinaser.

5. Enzympræparat ifølge krav 4, 25 kendetegnet ved, at proteinaserne omfatter en blanding af exo- og endopeptidaser. DK 166566 B1

6. Enzympræparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at det fra levende væv er i stand til at fjerne devitaliserede bestanddele såsom necrotisk væv og pus og fibrin og koaguleret blod.

7. Enzympræparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, kendetegnet ved, at enzympræparationen er kombineret med en bærer og/eller et tilsætningsstof.

8. Enzympræparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, kendetegnet ved, at det foreligger i en form valgt blandt 10 salver, cremer, spray, pulvere, pastaer, geler, linimenter, bandager, olier, tabletter, kapsler, syrupper eller opløsninger.

9. Anvendelse af en fra et dyr fra ordenen Euphausiaceae isoleret enzympræparation til fremstilling af et middel til behandling af sår, forbrændringer eller dermatose, især til enzymatisk debridement af 15 nekrotiske sår.

10. Anvendelse af en enzympræparation, der er vundet fra et i vand levend dyr, til ikke-terapeutisk rensning, kendetegnet ved, at enzympræparationen er blevet isoleret fra et dyr tilhørende ordenen Euphaysiaceae.

10 PATENTKRAV

11. Anvendelse ifølge krav 9 eller 10, kendetegnet ved, at enzymerne er blevet isoleret ved vandig ekstraktion fra det homogeniserede dyr.

12. Anvendelse ifølge krav 9, 10 eller 11, kendetegnet ved, at enzymerne i præparationen har en 25 molekylvægt på fra ca. 15.000 til ca. 80.000 daltons, eller er aktive aggregater af sådanne enzymer.

13. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af kravene 9-12, kendetegnet ved, at enzymerne omfatter proteinaser. DK 166566 B1

14. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af kravene 9-13, kendetegnet ved, at proteinaserne omfatter en blanding af exo- og endopeptidaser.

15. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af kravene 10-14, 5 kendetegnet ved, at den ikke-terapeutiske rensning er rensning af kunstværker såsom malerier.