JPS59501908A - クリーニング用酵素組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 クリーニング用酵素組成物、その使用及びその組成物の製造発明の分野 本発明は、オキアミ目又は魚類に属する動物よりなる群から選択された水性動物 からの消化性及び／又は組織酵素製剤を含有する組成物に関する。この組成物は 、生物又は死物（ｌｉｖｉｎｇＯｒ　ｄｅａｄ　ｍａｔｅｒｉａｌ）から生物学 的起源の汚染物質又はかがる汚染物質の分解生成物を分解及び除去することによ って、生物又は死物をクリーニングするために用いられる。本発明により、前記 の物質から前記の汚染物質を除去するための方法、及び本発明により使用される べき組成物の製法も同様に提供される。

本明細書中及び請求の範囲中に使用される酵素という用語は、伯の規定のない限 り、活性酵素を意味する。

本発明は概して、哺乳動物の治療用クリーニング及び非−治療用クリーニングの 両方に関する。従って、クリーニングという概念は、極めて広汎な意味で、即ち 死物と同様に生物、例えば種々の織物９毛髪１毛皮、皮膚、プラスチック、皮、 つめ。

ラン、芸術品１例えば絵画の作品等のクリーニングに使用される。クリーニング は、例えば膿（化膿性滲出物）、ｌａＮ素、凝固した血液、血性伽皮及び壊死組 織のような物質を除去することによる人間及び動物のクリーニングをも包含する 。この後者の型のクリーニングは、創ｒ傷、火傷及び皮膚病の治療のために、例 えばいわゆる酵素性汚染滲出物除去のために特に重要であるが、汚染物質が発生 し得るその他の生体領域において実施することもできる。尿道及び膀胱が、かか るその他の領域の例である。

動物における酵素の通常の消化作用、並びに死後の動物にお（プるその自己分解 作用は、クリーニングという用語には包含さクリル（ｋｒｉｌｌ）　（オキアミ 目に属する）中に、種々の酵素、例えばブロティナーゼ（至適ｐＨ−Ｗ性及び中 性〜アルカリ性）、ペプチダーゼ（エフソー及びエンドペプチダーゼ）、リパー ゼ、ボスホリパーゼ、アミラーゼ及びその他の炭水化物分解酵素、ホスファター ゼ、ヌクレアーゼ、ヌクレオチダーゼ及びエステラーゼの混合物が存在する（　 Ｔ　、　Ｅ　、　Ｅ　ｌｌｉｎｇｓｅｎ　；　Ｂ　ｉｏ−ｋｊｅｍ−ｉｓｋｅ　 Ｓ　ｔｕｄｉｅｒ　ｏｖｅ’ｒ　Ａｎｔａｒｋｔｉｓｋ　Ｋ　ｒｉｌｌ　；　Ｄ 　ｒ、ｉｎｇ　ａｖ−ｈａｎｄ−ｌｉｒ＋ｇ：　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｔ　ｆｏｒ　 Ｔｅｋｎｉｓｋ　Ｂｉｏｋｊｅｍｉ、Ｎｏｒｏｅｓ　丁ｅｋ−ｎｉｓｋｅ　Ｈ１ １ｇ５ｋｏｌｅ、　Ｔ　ｒｏｎｄｈｅｉｍ　（１９８２年））。クリルからの水 抽出物中に存在する蛋白質分解（トリプシン様）活性についての研究報告はある （Ｃ，−８，Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｔ　；　Ｊ　、　Ｆｏｏｄ　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ 、。

第２巻（１９７８年）、第３４９−６６頁）。カラフトシシャモ（ｃａｐｅ−１ ｉｎ　）からの水抽出物に種々のプロテアーゼ活性があることもすてに報告され ている（Ａ　Ｇｉｌｄｂｅｒｇ；　Ａｕｔｏｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｆｉｓｈｔｉｓ ｓｕｅ−Ｇｅｎｅｒａｌ　ａｓｐｅｃｔ’ｓ：　Ｔｈｅｓｉｓ　；　■ｎ５ｔｉ ｔｕｔｅ　ｏｆＦ　１ｓｈｅｒｉｅｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　７　ｒｏ ｍｓφ　Ｎ　ｏｒｗａｙ、１９８２年）。

１９１３年頃に、洗浄剤中に酵素を使用することが提案されていた。死物のクリ ーニング用酵素組成物、例えば洗濯用洗剤は桿菌（３ａｃｉｌｌｕｓ　）属から の種々の微生物プロテアーゼをベースとしていた。一般に使用されるかかるプロ テアーゼの１種は、枯草菌（Ｂ　ａｃｉ　ｌ　ｌｕｓ　ｓｕｂ口１ｉｓ）株から 得られ、とりわけアルカＦＬ フーセ　の商品名（Ｎ　ｏｖｏ　Ｉ　ｎｄｕｓｔｒｉ、ｒペンハーゲン　、デン マーク）で市販されたサブチリシンである。種々のリパーゼもクリーニング用、 特に脂質分解用に使用されてきた。かかる組成物は、酵素のほかに漂白剤２例え ば過硼酸塩及び種々の陰イオン、陽イオン、及び中性洗浄剤も含有していた。今 までに使用された酵素は、一般の酵素同様、比較的に不安定であった。

前記の成分の、汚染滲出物除去（鮮８１　）のために市販された最も重要な酵素 組成物は、ストレプトキナーゼーストリプトドｍｉｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｗａ ｙｎｅ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ　）　、安定化されよ結晶化、、ブッ 、叶すピュノ、Ｎ　ＯＶＯ■ｎｄｕｓｔｒｉ、、ペン７、−ゲン、デンマーク） 及びデオキシリボヌクレアーゼと結合した牛フィブリノリシン（エラーゼ’、　 Ｐ　ａｒｋｅ　Ｄ　ｅｖｉｓ　＆Ｃｏｍｐａｎｙ、デトロイト　、ミシガン、Ｕ ＳＡ）である。ストレプトキナーゼは主にそのＤＮＡへの影響により壊死物質に 作用し、ストレプトキナーゼは特異的な繊維素溶解作用を有する。トリプシンは 蛋白質分解作用を有する牛の膵臓抽出物である。フィブリノリシン−デオキシリ ボヌクレアーゼは、２種の酵素の組合せで、１種は繊維素を分解する酵素、もう 　１種は膿の中の重要な１成分であるデオキシリボ核酸に作用するものである。

マロータス属　ビロズス（ｌｖｌａＮｏｔｕｓ　ｖｉｌｌｏｓｕｓ）　（カベリ ン）からの特異的なペプシン様酵素（ペプシン■）の１種が火傷の医学的治療に 使用されることが、提案された（　Ｇ　ｉｌｄｂｅｒｇＡ　：前記参照、第８９ −９０頁）。ある基質に作用する１種の特異的な酵素を使用しても、創傷中に存 在する汚染物質の分解には限度がある。しかしながら、このペプシン様酵素とそ の他の酵素とを組合せて、人間の治療を目的とするクリーニングに使用すること は提案されていなかったのである。

前記の酵素製剤には多くの欠点があった。例えば、それらはいずれも比較的に不 安定であり、保管中が使用中に、その活性が急速に減衰する。その活性は屡々一 定のＩＩＨ範囲、例えば中性〜中等度にアルカリ性のＩＩＨ範囲に限定される。

それらの活性は多くの場合一定の温度後回に限られる。＋５０”Ｃ以上の温度で 活性は急速に損失し、至温又は通常の戸外温度ではその活性は低い。

β　−々 バリデース　、トリピュア　及びエフーゼ　の効果は、その目的のためには比較 的不十分である。中程度の鮮創作用が通常３週間にわたる治療期間後に達成され るだけである。

発明の目的 本発明の１つの目的により、前記の欠点に関して改善されたクリーニング用組成 物が提供される。第二の目的により、生物学的起源の物質又はかかる物質からの 分解生成物を含有する汚染物質、特に蛋白質及び脂質の両方を含有する汚染物質 を除去すべく使用されるべき改善された組成物の製法が提供される。

第三の目的により、前記の汚染物質から生物又は死物をクリーニングするための 新規な改良方法、特に繊維素、凝固血液及び失活組織の成分を分解し、かつそれ によりそれらの含水量を殆んど増加させずに除去し易くさせることによって、繊 維素、凝固血液及び失活組織を鮮創するための新規な改良方法が提供される。従 って、本発明は従来の組成物よりも５、り有効な酵素を有する組成物をベースと している。これは、当該汚染物質への全ての酵素作用に有効である。

λ１ これらの目的は、生物学的起源の汚染物質を溶解し得かつ上記に挙げた動物から 産出する酵素製剤を有効量含有する組成物を使用することによって達成される。

それらの動物からの酵素混合物は高収率で簡単に得ることができる。目下のとこ ろ、酵素製剤のための最も好ましく有用な源は、オキアミ目、例えば南極クリル （Ｅｕｐｈａｕｓｉａ　５ｕｐｅｒｂａ）　、　Ｅｕｐｈａｕｓｉａ　ｃｒｙｓ ｔａｌ１１塵舅辻且、及び同種族、並びにｌｙｌ　ｅｇａｎｙｃｔｉｐｈａｎｅ ｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃａ。

明では好ましい。その他としては、サバが挙げられる。

本発明のための最も重要な酵素活性は、動物の消化管から派生するようである。

動物から得られる種々の酵素活性が複雑に混合されているために、その組成物が それらの起源に係わりなく、生物学的な汚染物質を極めて急速に分解させ得るの であろう。酵素は、アルカリ性、中性、かつ酸性媒体中で活性を示し、種々の界 面活性剤（張力剤及び乳化剤）、及び／又はその他の成分、例えば担体及び添加 物と一緒に、クリーニング組成物中に使用され得る。

組成物が酵素の混合物を含有し得るからこそ、脂質、燐脂質。

バイオポリマー、例えば蛋白質、ペプチド、核酸、ムコ多糖類。

及び多糖類並びにかがる化合物の分解生成物よりなる群から選択された物質の混 合物を含有する汚染物質の除去にこの組成物が有用なのである。これらの化合物 は、膿、血液面皮及び壊死組織中に存在する。

本発明によれば、使用する酵素が１５０００〜ｇｏｏｏｏドルトンの範囲の分子 儀を看するか、又はかがる酵素の活性凝集体を有する場合に、特に良好な結果が 得られる。殊に、分子囲約２００００〜約４００００ドルトンを有する酵素が有 利である。これらの範囲は、均質化した動物を水抽出して得られる酵素、すなわ ち殊に抽出中に水にとりる酵素にあてはまる。

本発明の１つの実施態様は、新規な酵素クリーニング組成物及びその製法に関す る。その方法は、オキアミ目の動物、又は魚類から産出された酵素製剤を、１種 又はそれ以上の水不溶性、又は水溶性の水性又は非水性担体に、必要な場合には 適当な添加物と一緒に、混合、溶解、結合又はさもなくば組合せることを特徴と する。新規組成物は軟膏、粉末、パスタ、クリーム。

スプレー、ゲル、塗膏剤、包帯、油状物２錠剤、シロップ、顆粒、カプセル、錠 剤等の形態であればよい。

緩衝物質、単一溶剤としての水、及び当該動物からの酸素製剤のみより成るある 非殺菌性均質水溶液は、新規組成物の概念からは除外される。かかる水溶液は前 記の刊行物中に記載されている。同様のことが添加物を含有しない凍結乾燥した 水抽出物にもあ、てはまる。

現在最も有利な実施態様では、使用する製剤中の酵素は水溶性で及び／又は前記 範囲内の分子量を有する。

本発明はまた、生物又は死物からの生物学的汚染物質を、例えば酵素性汚染滲出 物除去により除去するための方法に関する。

本方法は、前記の物質上に存在するかかる汚染物質を、前記の動物から産出した 酵素を有効量、例えば蛋白質分解及び／又は脂肪分解に有効な量の酵素を含有す る酵素組成物と接触させ、その後に、組成物を分解又は溶解した汚染物質と共に 前記物質から除去することを特徴とする。現在最も有利な実施態様においては、 本方法は分子量約１５０００〜約８００００ドルトンを有する酵素（その活性凝 集体を包含する）又はかかる酵素の活性凝集体を使用する。特に、分子量約２０ ０００〜約４００００ドルトンの酵素が好ましい。例えば膿、血液掘皮及び壊死 組織の如ぎ失活物質、及びＩＩＭ素又は凝固血液の除去には極めて有利である。

これは、それらの物質を生存組織から除去する場合に特に有効である。

汚染物質を分解及び／又は溶解させるのに必要な期間は、場合により変化するが 、酵素が汚染物質を分解及び／又は溶解させるのに十分な時間を選択すべきであ る。必要ならばこの処置を繰り返してもよい。

使用する酵素製剤は、例えば前記したタイプの種々の酵素を広範囲に含有させて もよい。本発明によれば、組成物中の１種又はそれ以上の酵素がそれ自体公知の 方法、例えばある酵素に対し・て特異的な阻害剤を添加することにより、又は当 該酵素を除去することにより除去された組成物を使用することが可能である。

至適温度での蛋白質分解活性は、１））−１５−１０の範囲で高い。至適用は７ −９である。良好な蛋白質分解活性のための温度範囲は２５−７０℃であり、至 適温度範囲は３０−５５℃である。活性は０℃に下っても維持されている。

前記の温度及びｌ）Ｈ範囲は本発明の種々の適用に全て用いられ得るが、その他 の範囲を用いても実施可能である。

動物からの酵素の調製は公知の方法により行なわれる。例えば、新鮮な又は新鮮 な凍結動物を均質化しく　ｈｏｍｏｇｅｎ　ｉ　ｚｅ　）　、水性媒体（例えば 水）で抽出させてもよい。得られた抽出物を凍結乾燥し、貯蔵させてもよい。抽 出物を更に、例えば脂質を抽出する為に脂質溶解溶剤で抽出して精製させること ができる。

それ以上の精製を必要とする場合には、ゲル濾過、限外濾過又は膜濾過を実施す ることができる。利用可能なその他の精製工程は、イオン交換及びアフィニティ ーカラムクロマトグライーである。抽出及び均質化は＋５℃以下又は＋５℃近く の冷所で実施すべきである。

水抽出して得られた酵素製剤を直接又は、必要ならば、更に精製した後に使用す ればよい。殆んどの場合、脂質が抽出された製剤を゛凍結乾燥することが有利で ある。そのような場合には、得られる粉末を長時間貯蔵することができる。各適 用分野で、特異的組成物又はその形態が要求される。かかる形態はそれ自体公知 である。従って本発明は、種々の形態、例えば凍結乾燥酵素、均質水溶液の形態 の酵素組成物または又は前記しかつ新規であると請求した酵素組成物に関する。

各組成物中の酵素の正確な量は場合により一純粋な凍結乾燥した抽出物の場合か ら極めて複雑な洗浄組成物の場合まで一変化する。酵素の量は、汚染物質が除去 されるべき物質に悪影響を与えることなく、意図する汚染物質を分解及び／又は 溶解させるのに十分な量でなくてはならない。新規なりリーニング組成物中のそ の他の成・分は、組成物を使用するに必要な条件下で悪影響を与えることのない ように、選択されなければならない。

最終組成物中に存在する酵素製剤の量は０．０００１％（Ｗ／Ｗ）乃至１００％ である。プロテアーゼ活性に関しては、最終組成物はＩｍｇ当り０．０００１乃 至０．１の酵素単位を含有してよい。使用する酵素製剤の純度に依り、前記範囲 外が適用されてもよい。前記の酵素単位は、基質としてカゼインを用い１分間当 りのチロシン当量μモルとして示される。

本発明の組成物中には種々の添加物及び担体が配合され得る。

適当な担体（ｃａｒｒｉｅｒ）は、無菌の、水性及び生理学的に許容され得る塩 溶液、有機及び無機ゲル形成物質、例えば重合体、シリコン油及び組成物に所望 の物理的特性を与えるその他の物質及びそれらの混合物がよい。添加物としては 、殺菌剤、香料。

種々の陰イオン、陽イオン、両性イオン、及び中性界面活性剤（張力剤（ｔｅｎ ｓｉｄｅｓ）及び乳化剤）が挙げられる。かかる成分はそれ自体、洗濯及び酵素 性汚染滲出物除去用酵素組成物に関連してすてに公知である（例えば参照文献と してのドイツ国特許出願第２１３０８３３号明細書、英国特許第１２８０４９７ 号明細書、同第１２９６９０１号明細書及び同第１５７３９６４号明細書、及び 米国特許第３６２７６８８号明細書、同第３８５５１４２号明１書、同第４２１ ２７６１号明細書、同第４２４３５４６号明細書、同第４２４２２１９号明細書 、同第４２８７０８２号明細書、同第４３０５８３７号明細書及び同第４３０７ ０８１号明細書参照）。創傷した生存組織の治療のために、生理学的かつ製薬学 的に許容され得る担体を含有するか、又は全く担体を含有しない組成物を使用す ることが有利である。かかる組成物は無菌であってもよい。滅菌は、例えば組成 物が溶液である場合には滅菌ｅ過により実施することができる。無菌組成物は無 菌条件下で無菌成分を混合することによっても得ることができる。　本発明の種 々の実施態様は、明細書に添附の請求の範囲から更に明らかになるであろう。以 下に、本発明を非限定的種々の実施例につき説明する。

実施例１ Ａ、グリル抽出物の調製 南極の夏期に捕え、直ちに冷凍し、約−８０℃で約２年間貯蔵したクリル、Ｅ　 ｕｐｈａｕｓｉａ　５ｕｐｅｒｂａを、約＋５℃の室内に置く。

クリルがほとんど解凍した時に、クリル２５（］を温度０℃の脱イオン水５０ｄ と混合させる。混合物を均質化し、次いで冷所（約Ｏ℃）で１時間半　１２５０ ０（＋で遠心分離にかける。赤色上澄を傾瀉後、保存する。沈澱物を脱イオン水 ５（７中に再懸濁させ、前記と同様に遠心分離にかける。新たな上澄液を傾瀉し 、“最初の抽出からの上澄液と合わせる。

抽出物から脂質を除去するために、ＣＣｆ！ｚ２０７を合した上澄液に加え、冷 所（０℃）で均質化する。混合物を冷所で２５ｏＯｇで１５分間遠心分離する。

水相を除去し、もう一度ＣＣｊ！ｇで抽出し、前記と同様に遠心分離にかける。

水相を１Ｂで使用するが、ここで水相は水抽出物として示されている。

Ｂ、ゲルクロマトグラフィーによる追加精製Ａからの水抽出物２０ｄを、直径３ ．１ｃｍ及び高さ６９ｃｍのカラムぺ に充填したセファデックス　Ｇ−１００＜エビクロロヒドリンで架橋されたデキ ストラン、　ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ＡＢ。

Ｕｐｐｓａｌａ、　３ｗｅｄｅｎ　）を用いてクロマトグラフ処理する。カラム を平衡化し、トリス−１−（ＣＩ緩衝液（０，０５Ｍ　、ｐＨ７，５）を用いて ＋５℃で溶離させる（　１時間あたり３ｏＩｄ、）。両分を集める。溶離曲線を 、２８０ｎｍのＬＩＶ吸収を測定することにより分光学的にモニターし、各両分 の蛋白質分解活性を測定する。酵素活性な両分を集め、脱イオン水で透析する。

最後に集めた両分を凍結乾燥したものを、本発明により使用する。

両分中及び凍結乾燥調製物中の蛋白質分解活性を、基質としてヘモグロビン及び ／又はカゼインを用い、測定する（　Ｒ１ｃｋＷ　Ｉ　；　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏ ｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ；　Ｅｄ　Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ。

１」Ｕ；第　２巻、第　１０１３−２３頁（１９７４年）　；　Ａｃａｄｅｍｉ ｃ　ＰｒｅｓｓＮｅＷ　ＹＯｒｋ）。ゲルクロマ１〜グラフイーを実施すると、 酵素活性は分子聞２００００−４０’０００ドルトンに相当する両分から主に回 収される。

実施例２ カラフトシシャモ抽出物の調製 ９月にフィンマルク（ノルウェー）沖で捕えたカラフトシシャモ（Ｍａｌｌｏｔ ｕｓ　ｖｉｌｌｏｓｕｓ）を冷凍し、−２０°Ｃで１年間貯蔵した。その後、冷 凍カラフトシシャモを５℃に置いた。２４時間後に、消化管を含む腸を、部分解 凍したカラフトシシャモから取り除いた。腸２５（］を脱イオン水５０彪と混合 し、０°Ｃで均質化した。続いて、混合物を１２５００ｇで１時間半遠心分離に かけた。

いくらか濁っている上澄液を傾瀉し、集める。沈澱物を脱イオン水５〇−中に再 び懸濁させ、前記と同様に遠心分難する。新しい上澄液をｌ１ｉ２瀉し、最初の 抽出からの上澄液と合わせる。

抽ｕ４物から脂質を除去する為に、ＣＣρ、、、Ｌ２（７を合した上澄に加え、 冷所（０°Ｃ）で均質化した。混合物を冷所で２５００（］で１５分間遠心分離 にか【プた。水相を取り除き、もう一度四塩化炭素で抽出し、前記と同様に遠心 分離にかけた。最後に水相を凍結乾燥した。

実施例３ ＭａｌｌｏｔＵｓ　ｖｉｌｌｏｓｕｓからの酵素を含有する組成物Ａ、（実施例 ２からの）カラフトシシャモからの凍結乾燥酵素製剤１０ｍｇを、酢酸カルシウ ム０．４ｍｇ及びａｍｙｌｕｍ　ｒｅｓｏｒｂ　（３１ｏ−ｓｏｒｂ　：　Ａ　 ｒｂｒｏｏｋ、　Ｋ　１ｒｋｔｏｎ　Ｃａｍｐｕｓ、Ｌ　ｉｖｉｎｇｓｔｏｎ、 Ｓ　ｃｏｔｌ−ａｎｄ）と混合する（全量１９）。

そうして得た均質粉末を生理食塩溶液（ｓａｌｉｎｅ）　１’Ｏｇ中で撹拌し、 湿性包帯に使用することができる。

Ｂ、（実施例２からの）凍結乾燥力ラフトシシャモ製剤１０ｍｇを、ポリエチレ ングリコールグル（Ｍａｃｒｏｇｏｌ　６００及びＭ　ａｃｒｏｇｏ１８００を 等置台有する）と混合させる（全！Ｉｇ）。半固体で、均質の潤度を有する１％ 酵素組成物が得られる。

実施例４ 溶液中にクリル酵素を含有する組成物 （実施例１Ｂからの）凍結乾燥酵素製剤１０ｍｇを酢酸カルシウム０．４ｍｇ及 びａｍｙｌｕｍ　ｒｅｓｏｒｂを混合する（全ｍ１ａ＞　、そうして得た均質粉 末を５ａｌｉｎｅ　１ｏｇと撮り混ぜ、得られる組成物を、寸法３Ｘ３Ｃｍで４ 層のガーゼを有する滅菌湿布を浸すために使用する。湿らした湿布は壊死創傷の 治療に用いられる。湿布をはり付けるために、ガーゼを湿布のまわりに２回巻く 。この包帯にそれから更に絆創膏をはり付ける。湿布を４時間毎に組成物で浸す 。創傷を被う湿布のその部分に限定して適用するために、目の大きい尖を有する 注入用カニユーレを用いて混合物を施こす。１日に　１回、包帯全体をとり除き 、新しい包帯に替える。

この処理で、分解し崩壊した壊死部分は機械的に除去されるはずである。実施し た特異的処理で、創傷は１週間後にきれいになった。

実施例５ 壊死物質へのクリル酵素の作用 ヒトの皮膚上にある壊死成分へのクリル酵素の作用を試験するために、次の実験 を行った： ２人のヒトの右手の上側の無傷皮膚上に、壊死物質をほどこした。壊死物質は足 の創傷からのものであった。壊死物質は失活コラーゲン組織、凝固血液、繊維素 、膿及び伽皮よりなっていた。各人にほどこした沿は０，５ｇであった。

各人士の壊死物質を、実施例４と同様に製造したクリル酵素組成物で浸した湿布 （面積１０ｃｄ）で被った。各湿布をガーゼで被った。４時間後に、両方の湿布 どもほとんど完全に乾燥し、そのためにより多量の酵素組成物を加えなければな らなかった。

１２時間後に湿布をとり除き、名手の上に残っている壊死物質を別々に秤量した 。壊死物質は特有の分解徴候を示し、その重量は約２５％減少した。試験中、壊 死物質と接触していた皮膚は影響をうけなかった。被検者に負の症状は認められ なかった。

実施例６ 小壊死創傷のある人間への生体内試験 布の人指し指に壊死物質を含む小潰瘍を有する人間に、５日間にわたり毎日、（ 実施例４のように製造した）１％クリル酵素溶液を適用した。創傷面は酵素組成 物に十分に耐性を示し、清浄化及び上皮形成化への著しい傾向を示した。副作用 は認められなかった。

実施例７ アルキルイミダゾリン１８．００％（Ｗ／Ｗ　）　、ラウリル−ポリペプチド縮 合物１．９０％（Ｗ／Ｗ）、ランデシレニル−ポリペプチド縮合物１．７０％（ Ｗ／Ｗ　）　、脂肪物質（ラノリン）で緩衝した変性アルキルエーテルサルフェ ート２８，００％（Ｗ／Ｗ）、ココナツツーアミンサルコシネート１．４０％（ Ｗ／Ｗ　）　、ウンデシレン［１，９０％（Ｗ／Ｗ）、ウンデシレンーモノエタ ノールアミドスルホスクシネート２．００％（ｗ／ｗ　）　、ｐＨ６，４、乳酸 十分化及び２度蒸溜した（ａｑｕａ　ｂｉ　ｄｅｓｔ）水よりなる常用の洗浄剤 （全量ｉｏｏ、ｏｏ％（Ｗ／Ｗ　）　）を使用した。

（実施例１Ｂからの）凍結乾燥したクリル酵素製剤を適量洗浄剤に加え、１％（ Ｗ／Ｗ　）酵素洗浄剤組成物を生ぜしめた。

胸骨部に明らかな油性脂漏を有する２名の人間の胸骨部の皮膚面１０ｃｄを試験 のために選んだ。それらの面を１日２回、５日間にわたり酵素洗浄剤組成物で洗 った。同じ面からのサンプルを洗浄期間の前後に採取した。サンプルを集め、Ｓ 　ｃｈａｅｆｆｅｒ　ｌ−１及びＫｕｈｎ　−Ｂｕｓｓｉｕｓ　ｌ−（、（Ａｒ ｃｈ、Ｋ１１ｎ、ｕ、ｅｘｐｅｒ、［）ｅｒ−ｍａｌｏｌ、、第２３８巻、（１ ９７０年）第４２９頁）に準じて、光度計で分析した。

結果は２被検者の両方で、透過値の著しい低下を示した。従って、このことは、 使用した酵素組成物による皮膚の脂質の分解を示す。これに対して、２名の人間 が酵素を含まない洗浄剤のみを使用した場合には、極めて僅かしか効果が得られ なかった。

実施例８ 布の均質部分から同じ断片（５層５ｃｍ　）を切った。布は二重であり、一方の 側は絹で、他方の側は木綿及び合成繊維の混合物よりなる織物であった。断片６ 枚を血液で汚し、６枚を牛乳で汚し、６枚を墨で汚した。エルシンマイヤーフラ スコ６個の各々に、凍結乾燥クリル酵素の水溶液（０，５％Ｗ／Ｗ　）　１００ ｄを加えたく凍結乾燥クリル酵素は実施例１Ｂから得た）。他の６個のエルレン マイヤーフラスコの各々に、０．５％（Ｗ／Ｗ　）、Ｒ アルカラーゼ　（Ｎ　ｏｖｏ　（ｎｄｕｓｔｒｉ、　：］ペンハーゲン、デンマ ーク）蒸溜水溶液１００ｄを加えた。別の６個のエルレンマイヤーフラスコには 蒸溜水ｉｏｏｍｆ！を加えた。

クリル酵素溶液を含有りる２個のフラスコ欧、アルカラーゼ′溶液を含有する２ 個のフラスコ及び蒸溜水を含有する２個のフラスコの各々に、血液で汚した断片 の一枚を加えた。同様に、一枚の断片が各フラスコ内に存在するように、その他 の汚れた断片を残りのフラスコに加えた。このことは、各組成物を血液、牛乳お よび墨で汚れた布に重複して作用させることを意味した。

その後、フラスコを振盪づ−る水浴上で１時間、＋４５℃で撹拌した。この処理 後に、洗浄液を傾瀉し、蒸溜水１００Ｉｌｌｉ！を各フラスコに加えた。次いで フラスコをゴム栓で封閉し、１分間激しく撹拌した。次いで布片を集め、蛇口流 水中で１０分間ゆっくり洗浄した。断片をきれいな白色タオルにはさみ、乾燥さ せた。

洗浄の効果、すなわち布の明るさは、二重盲検により調べた。

つまり試験者には各断片がどの洗浄組成物で処理されたかを知らせずに、洗浄効 果、すなわち、布の明るさ及び清潔さを視覚的に評価さ”せた；　〇一完全にき れいな布；　１−僅少量の汚染残留；２＝中庸邑の残留汚染：　３−著しい量の 汚染残留。洗浄結果を１１に示す。

１ ０．５％（Ｗ、／Ｖ　）クリル酵素蒸溜水溶液；０．５％（Ｗ、、／ｌ／　）ア ルカラーゼ８蒸溜水溶液；酵素非含有蒸溜水の洗浄効果。

溜水よりも効果があることが判る。

同様の試験はカラントシシＶモ酵素を含有する類似組成物で行なうことができる 。

実施例９ 繊維素、壊死物質及び凝固血液の分解 Ａ、繊維素 繊維素を、重量０．２−０．３（］の断片数枚に切りはなした。使用する各酵素 組成物のために、試験管２０本に番号をつけ、その各々に前もって重量をはかつ ておいたｍｅｌｔ素片を加えた。各組成物の試験管２０本に、等量の酵素組成物 を加えた。バリデース′を蒸溜水中で　１：２０（ｗ／ｖ市販製剤に基づく）の 希釈度で使用した。トリピュア　（Ｔ　ｒｙｐｕｒｅ）をザリン中で１：１５（ ｗ／Ｖ市販製剤に基づく）の濃度で使用した。その他の酵素製剤はザリン中に希 釈し、そうして得た組成物の濃度は表２に示されている。使用するグリル酵素及 びカラフトシシャモ酵素は、夫々実施例１Ｂ及び２に従って得られた凍結乾燥製 剤であった。

研究は、創傷温度と同じである温度＋３３℃で行なった。１２時間及び２４時間 後に各々反応を中止し、残留する繊維素を集め、湿った濾紙上に６０秒間保持し 、秤量した。パパイン、フィシン及びパンクレアチンは全て、Ｅ８Ｍｅｒｃｋ、 　ＱａｒｌｌｌＳｔａｄｔ、　Ｑｅｒｍａｎｙから入手した。

Ｌ 繊維素への各種酵素組成物の影響。

濃度は％Ｗ／Ｖで示した。

−は重量において　０−２５％減少 −一　は重量において２６−５０％減少−ｍ−は重量において５１−７５％減少 −一一一　は重役において７６−１００％減少次の時間後の判読 酵　素　１２時間　２４時間 クリル酵素　１％　−−−一　残分無しカラフトシシャモ酵素　１％　残分無し 繊維素は、グリル酵素、カラフトシシャモ酵素及びトリピュア　を含有する組成 物により上記順番で最も短い時間で、溶解パパインは最も弱い効果を有した。

Ｂ、壊死物質の分解 壊死物質（ｎｅｃｒｏｓｅｓ　）を０．２−０．３ｊｌの断片に切った。使用す る各酵素組成物のために、試験管２０本に番号をつけ、これらの管の各々に前も って重量を測っておいた壊死物質片を加えた。

各組成物の試験管２０本に、当量の各酵素組成物を加えた。使用する組成物を表 ３に示し、それらの濃度をザリン中％（Ｗ／Ｖ）として示す。バリデースＦ及び トリビ・アを実施例８Ａに従って希釈した。１２，２４．３６及び７２時間経過 後に、分解を中止し、壊死物質を集め、重量を測った。

表３ 各種酵素組成物の壊死物質への影響。

濃度（％）はＷ／Ｖを基に計算する。

−一一一　は重量において７６−１００％減少−ｍ−は重量において５１−７５ ％減少−−は重囲において２Ｂ−５０％減少 −は重量において　１−２５％減少 ０　は０．１％　現状 ＋　は重量において　１−２５％増加 ＋十　は重量において２５−５０％増加＋＋十　は重量において５１−７５％増 加＋＋＋＋　は重量において　７５．−１００％増加酵素組成物　次の時間後判 読 フィシン　０．５％　０　０　０　− クリル酵素　０．５％　−−一一一一一カラフトシシャモ酵素０．５％　−一− −−−−−−明らかに、アルカラーゼ′、クリル酵素及びカラフトシシャー　λ モ酵素は確かに壊死物質を溶解させ得るが、バリアース　、トかしながら、壊死 物質へのその影響を考慮す。場合、ノ（／＜イン及びパンクレアチン　は市販の 組成物と同様の傾向を示す。すなわち重量増加は含水量の増加に因る。フィシン は同様・の効果、々 を有するが、アルカラーゼ　、クリル酵素及びカラフシシシャモ酵素よりも弱い 。

Ｃ１凝固血液の分解 凝固血液を切断し、実施例９Ａ及びＢのように準備した試験管に分配した。使用 する酵素組成物をザリン中に溶解させ、そうして得た組成物の濃度（％Ｗ／Ｖ） をＬ先に示す。１２及び２４時間後に、各々分解を中止し、血液凝結ゲル状物（ ｂｌｏｏｄ　ｃｏａ−ｇｅｌｓ）を集め、秤量した。

Ｌ先 各種酵素組成物の凝固血液への影響。

−は重量において　０−２５％減少 −一　は重量において２６−５０％減少−ｍ−は重量において５１−７５％減少 −−−−は重量において７６、−１００％減少酵□素　組　成　物　次の時間後 の判読濃度　１２時間　４８時間 クリル酵素　１．０％　−−−−一一一カラフトシシャモ酵素　１．０％　−一 一一一−ＬＬから、凝固血液に対して、クリル酵素はカラフシシシャモ酵素に勝 り、これら酵素は調査されたその他の酵素よりもすぐれた効果を示した。

実施例１０ 各ｆ；１醇素酵素物の健斥皮膚Ａ、の研究　′フィシン、パパイン、アルカラー ゼ　、パンクレアチンｋ。

、β クリル酵素及びカラフトシシ↑７モ酵素（全で濃度１％（Ｗ／Ｖ　）で）の各種 溶液（０，３ｒｄりを２人の被検者の健泉な皮膚にほどこし、薄い包帯で被った 。１２１Ｉｉ！−間接に皮膚上に炎症の徴候は観察されなかった。バリデース　 及びトリピュアｋを用いた場合にも同様の所見が認められた。従って、酵素は明 らかに試験で使用した濃度範囲で壊死組織のみを攻撃する。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の７第１項）昭和５９年６月２１日１ 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 １、％許出願の表示　ＰＣＴ／ＳＥ　８３１００３５９２　発明の名称　クリー ニング用酵素組成物、その使用及びその組成物の製造 ３　特許出願人 氏　名　ヘルグレン、ラルス・ダスターヴ・インゲ住　所　東京都新宿区新宿１ 丁目１番１４号　山田ビル（郵便番号１６０）電話（０３）３５４−８６２３６ 、添附書類の目録 （１）補正書の翻訳文　１　通 補正請求の範囲 １．７０−タス　ビロズスからのペプシン■が、その他の酵素と組合されて哺乳 動物の治療用クリーニングに使用される場合にのみ包含されるという条件下に、 生物学的起源の汚染物質を分解し、かつオキアミ目又はマロータス属に属する動 物よりなる群から選択された水性動物から産出する酵素製剤を有効量含有する治 療用及び／又は非−冶療用クリーニング剤として使用するた°めの酵素組成物。

２、組成物の酵素は約１５０００〜約８００００ドルトンの分子量又はかかる酵 素の活性凝集体を有する請求の範囲第１項記載の酵素組成物。

３、脂質、燐脂質、蛋白質、ペプチド、核酸、多糖類、ムコ多糖類及びこれらの 物質の分解生成物の群から選択された物質の混合物を含有する汚染物質を分解及 び除去することができる請求の範囲第１項又は第２項記載の酵素組成物。

４、生存組織、失活成分１例えば壊死組織、及び闇、及び繊維素及び凝固血液を 除去することができる請求の範囲第３項記載の酵素組成物。

５、酵素製剤が担体及び／又は添加物と組合せられる請求の範囲第２項記載の酵 素組成物。

６、軟膏、クリーム、スプレー、粉末、パスタ、ゲル、塗置剤。

包帯、油状物１錠剤、カプセル、シロップ、液剤よりなる群から選択された形態 である請求の範囲第５項記載の耐氷組成物。

７．１種又はそれ以上の界面活性剤を含有する請求の範囲第１項記載の酵素組成 物。

８、オキアミ目又はマロータス属に属する動物よりなる群から選択された動物か ら産出する酵素製剤を、担体と組合せることを特徴とする治療用及び／又は非− 治療用クリーニング剤として使用されるべき酵素組成物の製法。

９．７０−タス　ビロズスからのペプシン■が、その他の酵素と組合されて哺乳 動物の治療用クリーニングに使用される場合にのみ包含されるという条件下に、 生物又は死物上に存在する生物学的汚染物質を、オキアミ目又はマロータス属に 属する動物よりなる群から選択された水性動物から産出する酵素製剤を有効量含 有する酵素組成物と接触させ、かつ十分な時間の経過後に、組成物を、分解及び 溶解した汚染物質と共に前記物質から除去することを特徴とする、生物又は死物 から生物学的な汚染物質を除去することによる治療用及び非−治療用クリーニン グ法。

１０、組成物の製造に使用する酵素は１５０００−８００００ドルトンの範囲の 分子量又はその活性凝集体を有する請求の範囲第９項記載の方法。

１１、酵素組成物は、脂質、燐脂質、蛋白質、ペプチド、核酸。

多糖類、ムコ多糖類又はこれらの物質の分解生成物よりなる群から選択された物 質の混合物を含有する汚染物質を除去することができる請求の範囲第１０項記載 の方法。

１２、汚染物質は失活物質、例えば壊死物質及び膿、又は繊維素、凝固血液又は 血液伽皮である請求の範囲第１１項記載の方法。

１３、汚染物質は生存組織上又は内に存在し、かつ除去は酵素性汚染滲出物除去 である請求の範囲第１２項記載の方法。

１４、汚染物質は死物から、例えば織物の洗濯中に除去される請求の範囲第１０ 項記載の方法。

１５、請求の範囲第８項記載の方法によりいつでも製造されるクリーニング組成 物。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．７０−タス　ビロズスからのベプシンエが、その他の酵素と組合されて哺乳 動物の治療用クリーニングに使用される場合にのみ包含されるという条件下に、 生物学的起源の汚染物質を分解し、オキアミ目又は好ましくはマロータス属（Ｍ 　ａｌ　１ｏｔｕｓ　）の魚類に属する動物より成る群から選択された水性動物 から産出する酵素製剤を有効量含有し、治療用及び／又は非−治療用クリーニン グ剤として使用するだめの酵素組成物。 ２、組成物の酵素が分子最約１５０００〜約ｇｏｏｏｏドルトン又はかかる酵素 の活性凝集体を有する請求の範囲第１項記載の酵素組成物。 ３、脂質、燐脂質、蛋白質、ペプチド、核酸、多糖類、ムコ多糖類及びこれらの 物質の分解生成物の群から選択された物質の混合物を含有する汚染物質を溶解及 び除去することができる請求の範囲第１項又は第２項記載の酵素組成物。 ４、生存組織、失活成分２例えば壊死組織、及び党、及びｔＨＨ素及び凝固血液 を除去することができる請求の範囲第３項記載の酵素組成物。 ５、酵素製剤を担体及び／又は添加物と組合せる請求の範囲第２項記載の酵素組 成物。 ６、軟膏、クリーム、スプレー、粉末、パスタ、ゲル、塗潰剤。 包帯、油状物２錠剤、カプセル剤、シロップ、液剤よりなる群から選択された形 態である請求の範囲第５項記載の酵素組成物。 ７．１種又はそれ以北の界面活性剤を含有する請求の範囲第１項記載の酵素組成 物。 ８、オキアミ目又は好ましくはマロータス属の魚類に属づる動物よりなる群から 選択された動物から産出される酵素製剤を担体と組合せることを特徴とする治療 用及び／又は非−治療用クリーニング剤として使用されるべき酵素組成物を製造 する方法。 ９．７０−タス　ビロズスからのペプシン■が、その他の酵素と組合されて哺乳 動物の治療用クリーニングに使用される場合にのみ包含されるという条件下に、 生物又は死物上に存在する生物学的汚染物質を、オキアミ目又は好ましくはマロ ータス属の魚類に属する動物よりなる群から選択された水性動物から産出する酵 素製剤を有効量含有する酸素組成物と接触させ、かつ１分な時間経過後に、組成 物を、分解及び溶解した汚染物質と共に前記物質から除去することを特徴とする 、生物又は死物から生物学的汚染物質を除去することによる治療用及び非−治療 用クリーニング方法。 １０、組成物の製造のために使用する酵素が、１５０００−８００００ドルトン の範囲の分子量又はその活性凝集体を有する請求の範囲第９項記載の方法。 １１、酵素組成物は、脂質、燐脂質、蛋白質、ペプチド、核酸。 多糖類、ムコ多糖類又はこれらの物質の分解生成物よりなる群から選択された物 質の混合物を含有する汚染物質を除去することができる請求の範囲第１０項記載 の方法。 １２、汚染物質は失活物質、例えば壊死物質及び膿、又は繊維素、凝固血液また は血液回皮である請求の範囲第１１項記載の方法。 １３、汚染物質は生存１１織上又は内に存在し、かつ除去は酵素性汚染滲出物除 去である請求の範囲第１２項記載の方法。 １４、汚染物質は死物から、例えば織物の洗濯中に除去される請求の範囲第１０ 項記載の方法。 １５、請求の範囲第８項記載の方法により、いつでも製造されるクリーニング組 成物。