DK166591B1 - Fremgangsmaade til dyrkning af mikroorganismer i et podet kulturmedium - Google Patents

Description

i DK 166591 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til dyrkning af mikroorganismer i et podet kulturmedium.

Dyrkningen af mikroorganismer kan gennemføres i et kul-5 turmedium, som indeholder næringssubstrater fortyndet med vand. Dette kulturmedium podes først med mikroorganismer, der således udvikler sig i et omtrent lukket miljø, bortset fra tilførslen af et neutraliseringsmiddel (en såkaldt "batch"-kultur). Anvendt i industriel målestok ud-10 viser denne type fermentering den fordel, at den er enkel, men den har en lav effektivitet, fordi der forekommer begrænsende faktorer, dels i selve næringssubstratet, dels som de inhiberende stoffer, der produceres af mikroorganismerne, og hvis stadig højere koncentration 15 under fermenteringen har den virkning at mikroorganismernes vækst reduceres.

Man har for at afhjælpe denne ulempe foreslået at sikre en kontinuert fermentering, dvs. at tilvejebringe på én 20 gang at sikre en afmålt fjernelse af kulturmediet samtidig med en ligeledes afmålt tilførsel af næringssubstrat, af neutraliseringsmiddel og af vand. Denne driftsmetode tillader at forbedre, for en fermenteringsbeholder med en given rumfangskapacitet, produktionen fra mikroorganis-25 mer; men .dette sker på bekostning af en formindsket koncentration af mikroorganismerne i den ekstrakt, som man gennemfører på kulturmediet, med deraf følgende forholdsvis ringe udbytte af mikroorganismer i forhold til næringssubstrat .

30

En anden, arbejdsmetode består i, at man overfører det samme kulturmedium til en fermenteringsbeholder af en klart større størrelse end det oprindelige rumfang af kulturmediet, og at man på kontinuert måde tilsætter det 35 med vand fortyndede næringssubstrat og neutraliseringsmidlet. Denne type fermentering (kaldet "feed batch"), som tillader formindskelse af den ugunstige virkning af DK 166591 B1 2 inhibitorerne ved at holde koncentrationen deraf på et begrænset niveau, udviser imidlertid den væsentlige ulempe, at den absolut nødvendiggør en fermenteringsbeholder af særdeles overdimensioneret kapacitet, således at denne 5 løsning kun sjældent er blevet anvendt i industrien.

Man har ligeledes foreslået at anvende dialysemembraner, som under visse betingelser tillader at fjerne de dannede inhiberende midler og således at forøge slutkoncentratio-10 nerne af mikroorganismer i kulturmediet; men denne løsning er ikke blevet anvendt af industrien, eftersom sådanne membraner er alt for skrøbelige, såvel mekanisk, termisk som kemisk, fordi driftskontrollen deraf er vanskelig og kompleks, deres anvendelse ved varierende volu-15 men er lidet ønskværdigt, og vægtudbyttet af fremstillede mikroorganismer i forhold til det til kulturmediet tilførte substrat stadig er beskedent.

Ultrafiltrerings-membranteknikken f.eks. beskrevet af 20 M.C. Porter og A.S. Michaels i Chemtech, januar 1972 pp.

56 tillod et fremskridt inden for fermentering af biologiske produkter gennem den tvungne passage af en recirkuleret mængde af det pågældende kulturmedium i en ultrafiltreringscelle, hvis karakteristika man kunne vælge på 25 en sådan måde, at man sikrede ekstraktionen af det eller de tilstedeværende inhiberende midler, som således blev fjernet fra kulturmediet sammen med, hvilket er uundgåeligt, en del af næringssubstratet, mens mikroorganismerne forblev £ den til kulturmediet tilbageførte mængde. Man 30 opnåede således at forøge slutkoncentrationen af mikroorganismer i kulturmediet af størrelsesordenen to til tre gange i forhold til den omtalte "batch"-fremgangsmåde.

Man konstaterede imidlertid ved denne sidst omtalte fremgangsmåde, trods dens bemærkelsesværdige kvaliteter, en * 35 klar reduktion af mikroorganismernes vækstgrad efter en høj begyndelsesudvikling.

DK 166591 B1 3

Formålet med den foreliggende opfindelse har været at finde driftsbetingelser, som tillader om muligt yderligere at forøge, under anvendelse af en fremgangsmåde af denne type, slutkoncentrationen af mikroorganismer under 5 bibeholdelse af et acceptabelt vægtudbytte i forhold til forbruget af næringssubstrater.

Det har nu overraskende vist sig, at man ved den foreliggende fremgangsmåde ifølge opfindelsen i forhold til de 10 hidtil kendte metoder, kan opnå maximale koncentrationer af mikroorganismer (f.eks. bakterier eller gær), dvs. en maximal produktivitet samtidig med et minimalt forbrug af substrat, hvilket er af afgørende betydning for biologiske produkter, hvor udgiften til forgæringssubstrat eller 15 næringsstoffer afhængig af det enkelte tilfælde kan udgøre 20 til 60 % af fabrikationsprisen.

Dette resultat er således opnået ved en fremgangsmåde af den i krav l's indledning beskrevne type, og idet frem-20 gangsmåden er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

Hver af de i krav 1 omtalte betingelser bidrager til det forventede resultat: reguleringen til en fuldstændig kon-25 stant værdi af pH ved hjælp af et neutraliseringsmiddel har den virkning, at den tillader meget nøjagtig tilførsel af substrat og af vand. Eftersom man anvender en meget præcis opretholdelse af pH, kan man ganske simpelt styre fermenteringen ud fra kendskabet til koncentratio-30 nen af det inhiberende middel, og fordi der eksisterer en korrelation mellem denne koncentration af det inhiberende middel og vækstraten, kan man således meget let med dette hjælpemiddel efter en indledningsfase ændre tilførselsbetingelserne for vand og eventuelt for substrat for at 35 sikre en vækstrate som er noget mere moderat, og som man vil kunne opretholde under hele fermenteringsprocessen, mens den ultrafiltreringskapacitet, der skal anvendes for DK 166591 B1 4 at opretholde et konstant rumfang, i sig selv er stærkt afhængig af den opretholdte vækstrate. Det er således, at en meget høj vækstrate svarer til en meget lav koncentration af det inhiberende middel, og derfor til en 5 meget stor ultrafiltreringskapacitet. Det er en af fordelene ved fremgangsmåde ifølge opfindelsen, at vækstraten for den anden udviklingsfase skal være i området 0,10 til 0,50, og som fordelagtigt er på mellem 0,15 og 0,45, endnu mere fordelagtigt mellem 0,20 og 0,40. Man har endog 10 kunnet fastslå for visse anvendelsesformer, at den optimale værdi for den mere moderate vækstrate befinder sig * mellem 0,30 og 0,35. Som det er blevet præciseret, findes således for hver fastholdt vækstrate og for hver dyrket mikroorganisme en tilsvarende maximal, kritisk værdi for 15 koncentrationen af det inhiberende middel, og det er præcist, når denne maximale, kritiske værdi er blevet opnået, at man går over til at gennemføre den efterfølgende * fase med en udvikling med mere moderat vækstrate.

20 Ifølge en vigtig detalje ved udøvelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, holder man tilførselsmængderne for substrater og for vand i konstante forhold til tilførselsmængden for neutraliseringsmiddel, under hele begyn-* delsesudviklingsfasen med høj vækstrate, og i andre ind-25 byrdes forhold under hele den efterfølgende udviklingsfase med mere moderat vækstrate, hvor den relative tilførselsmængde af vand forøges desto mere, jo lavere man har valgt den maximalt tilladelige koncentration af det inhiberende middel. Denne driftsmetode, som består i at 30 gennemføre en konstant drift og optimere tilførselsmængderne medfører en minimal udgift til næringssubstrat og en så perfekt tilpasning som muligt af mikroorganismernes næringsbehov til den vækst, som man beslutter at tildele dem. Skønt tilpasningen af begyndelsesfasen til den ef-35 terfølgeqde fase kan synes at være af beskeden betydning, ville man ikke kunne opnå succes med hensyn til vægtudbyttet af mikroorganismer i forhold til substrat uden så- DK 166591 B1 5 dan tillempning.

Opfindelsen angår blandt andre muligheder dyrkning af mælkesyrebakterier, hvor man tilfører et kulturmedium, 5 der forinden er blevet podet, næringssubstrat, som mest fordelagtig indeholder lactose og gærekstrakt, samt ammoniak (eller natriumhydroxid), der udgør neutraliseringsmidlet, idet det hele er fortyndet med vand, og hvor man på kulturmediet gennemfører en behandling til delvis 10 fjernelse af ammoniumlactat (eller natriumlactat), hvilket udøves i det mindste under en del af udviklingsfasen for mælkesyrebakterierne, og som er af den type, ved hvilken man sikrer en vækstrate for bakterierne i kulturmediet, som udviser en høj værdi i en første begyndelses-15 udviklingsfase, og i en efterfølgende fase en mere moderat, konstant værdi. Ved denne udførelsesform fastlægges ifølge opfindelsen følgende kombination af driftsbetingelser: 20 a) man regulerer under hele dyrkningsfasen tilførslen af ammoniak«(eller natriumhydroxid) til opretholdelse af pH i kulturmediet på en absolut konstant værdi, der befinder sig mellem 6 og 7; 25 b) man regulerer tilførslen af substrat og af vand i forhold til den ifølge punkt a) regulerede tilførsel af ammoniak (eller natriumhydroxid) ved hjælp af bestemmelsen af koncentrationen af ammoniumlactatet (eller natriumlactat), som stammer fra indvirkningen af ammoniak (eller 30 natriumhydroxid) på den mælkesyre, som er dannet under nedbrydningen af lactosen; c) påbegyndelsen af den mere moderate vækstfase bestemmes gennem opnåelsen af en kritisk koncentration i kulturme-35 diet af ammoniumlactat (eller natriumlactat), idet den kritiske koncentration af ammoniumlactat befinder sig mellem 19 g/1 for en vækstrate på 0,50 og 54 g/1 for en DK 166591 B1 6 vækstrate på 0,10; d) i det mindste den essentielle fase af ultrafiltreringsbehandlingen styres positivt under opretholdelse af 5 et konstant rumfang af kulturmediet.

Som man ser, drejer det sig her om en tilpasning af den ovenfor beskrevne fremgangsmåde til en dyrkning under de særlige betingelser, der udelukkende er rettet mod mælke-10 syrebakterier. Som tidligere er det helt afgørende den forud fastlagte vækstrate i den anden udviklingsfase (som tillader opnåelse af en fuldstændig fermentering inden for en fastlagt tidstermin). Til denne vækstrate svarer en maximgl, kritisk koncentration af ammoniumlactat (el-15 ler natriumlactat), som for øvrigt er forskellig fra den ene bakterie til den anden. Man har således ved afprøvninger på et meget stort antal stammer kunnet fastslå, at de kritiske ammoniumlactat-koncentrationer befinder sig mellem ca. 19 g/1 (vækstrate 0,50) og ca. 54 g/1 (vækst-20 rate 0,1Q), mere alment imellem 25 g/1 og 35 g/1. Et nødvendigt forarbejde ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er således den forudgående fastlæggelse af den kritiske koncentration af det inhiberende middel, som er knyttet til den valgte vækstrate.

25

Opfindelsens karakteristika og fordele vil i øvrigt fremgå af den efterfølgende beskrivelse, som henviser til de ved føj ede tegninger, hvori: 30 fig. 1 er en skematisk afbildning af et apparat til dyrkning af mælkesyrebakterier ved fremgangsmåde ifølge opfindelsen, fig. 2-5 er diagrammer til fastlæggelse af vækstraten.

Idet der henvises til fig. 1, tilfører man til en fermenteringsbeholder 1, der er udstyret med et omrøringsorgan 35 DK 166591 B1 7 2, i dens øvre ende 3 på den ene side et næringssubstrat (lactose og gær) stammende fra et reservoir 4 ved hjælp af en rørføring 5 forsynet med en pumpe 6 samt en volumenmåler 7, og på den anden side ammoniak til neutralisa-5 tion igennem et rør 8 forsynet med en pumpe 9 og en volumenmåler 10, og endelig sterilt vand gennem en ledning 11 forsynet med en pumpe 12 og en volumenmåler 13. Fermenteringsbeholderen er ligeledes udstyret med et rør til udtømning 20, som inkorporerer en pumpe 21, og som ender i 10 en ultrafiltreringscelle 22 med en membran 23. Udgangen, der befinder sig på siden oven for membranen 23 i strømningsretningen fra ultrafiltreringscellen 22 er forbundet med fermenteringsbeholderen 1 gennem en ledning 24, som inkorporerer en varmeveksler 25. Et apparat 30 til måling 15 af pH har en føler 31, som er anbragt i den nedre del af fermenteringsbeholderen 1, og som afgiver et signal ved måling af pH til en regulator 32. Regulatoren 32 sikrer ud fra denne information i hovedsagen gennem en kommandovej 34 den passende regulering af volumenet af ammoniak-20 vandspumpen 9 eller af dennes funktionstid, således at man holder pH på en konstant og forud fastlagt værdi, som kan justeres afhængig af bakteriearten under dyrkningens forløb. Regulatoren 32 indvirker ligeledes gennem en kommandovej 35 på volumenet eller funktionstiden af sub-25 stratpumpen 6, samt gennem en kommandovej 36 på volumenet eller funktionstiden af pumpen 12 for vand til fortynding .

Ultrafiltreringscellen 22 udviser sædvanligvis en afgang 30 på filtratsiden forbundet til udløbet ved hjælp af en ledning 40, som inkorporerer en reguleringsventil 41, der i sig selv er styret gennem en kommandovej 42 af regulatoren 32, som til dette formål modtager informationer igennem en måleledning 43 fra indikatorerne for den mini-35 male 44, middel 45 og maximale 46 niveauhøjde. Indikatoren for middelniveauet 45, består faktisk af to adskilte følere 45a og 45b, således at man kan sikre opretholdel- DK 166591 B1 8 sen af et konstant højdeniveau, som det vil blive beskrevet nærmere i det efterfølgende:

Det ovenfor beskrevne apparats funktion er som følger: 5

Ved påbegyndelsen af en dyrkning af mikroorganismer sættes til fermenteringsbeholderen 1 et rumfang substrat således, at det omtrent når niveauet for højdemåleren 45.

Man poder dette kulturmedium med en mælkesyrebakterie og 10 sikrer sig ved passende midler en temperatur i størrelsesordenen 30 °C for kulturmediet, samtidig med at man opretholder en atmosfære dækkende kulturmediet med nitrogen med trykket 0,5 bar, hvorpå man starter omrøringsanordningen 2. Næringssubstratet, som befinder sig i reser-15 voiret 4, og som i hovedsagen indeholder lactose med en koncentration Lo og gær med en koncentration Eo, fremføres ved hjælp af pumpen 6 gennem rørføringen 5 med en hastighed D^ (samlet mængde ), mens ammoniakvand med en koncentration No fremføres gennem rørføringen 8 med en 20 hastighed D2 (total mængde ), mens sterilt vand fremføres igennem rørføringen 11 med en hastighed (samlet mængde )-

Under denne første fase har man på den ene side valgt 25 koncentrationen af substratet i fermenteringsbeholderen på en forholdsvis høj værdi (lactose 45 g/1, gærekstrakt 15 g/1), og under en begyndelses første fase af udviklingen holdes koncentrationerne af lactose LI, gær El og ammoniak Ni, som når frem til enden af rørføringen 3 ind i 30 fermenteKlngsbeholderen 1, f.eks. på 40 g/1 for LI, 13,3 g/1 for El og 12 N for NI. Man vil bemærke, at disse koncentrationer let lader sig bestemme ud fra kontrolpanelet 50, som modtager registreringerne fra måleanordningerne 7, 10 og 13.

Under hele denne driftsfase er det vigtigt til opnåelse af en god afvikling af fremgangsmåden regelmæssigt at 35 9 DK 166591 B1 kontrollere vækstraten, som bør være så høj som mulig.

Denne vækstrate i den eksponentielle fase, hvori man befinder sig under hele varigheden af fremgangsmåden til 5 dyrkningen, er udtrykt ved den biologiske masses konstante logaritmiske tilvækst under udviklingen i afhængighed af tiden ifølge den kendte formel X = XQ e^t (hvori u betyder vækstraten) og man påviser i øvrigt, når det drejer sig om det valgte eksempel, at det ammoniumlactat, der 10 dannes ved foreningen mellem mælkesyre (stammende fra forbruget af lactose) og det tilførte ammoniak, er knyttet til vækstraten gennem forholdet:

Lg dL

, _ n — = μ . t konst.) 15 dt og man bemærker, at eftersom koncentrationsbestemmelsen med hensyn til ammoniumlactat er direkte proportional med tilførslen af ammoniak (for et kulturmedium med konstant pH-værdi) er det tilstrækkeligt at notere sig variationen i tilførselsmængden af ammoniak for at bestemme vækstraten som en funktion af tiden: μ = Lg dL /t.

25 dt

Det er således klart, at man til ethvert tidspunkt kan følge og,* ved hjælp af en grafisk afbildning af

Lgn dL

30 —= μ t + konst., dt den eventuelle variation i vækstraten, som er afbildet ved den således optegnede kurves hældning, samt at man 35 DK 166591 B1 10 ved passende korrektioner omvendt kan opretholde denne vækstrate konstant på en forud fastlagt værdi ved korrigerende regulering af tilførslerne af substrat og af vand i forhold til tilførslen af neutraliseringsmiddel.

5

Under hele denne første behandlingsfase er pumpen 21 i ultrafiltreringskredsløbet ude af funktion, og kulturmediets højde hæves progressivt fra det niveau, som er indikeret ved hjælp, af indikatoren 45 op til det niveau, 10 som er indikeret ved hjælp af indikatoren 46 (maximalt rumfang). Det er først når dette niveau 46 er blevet opnået, at regulatoren 32 via kommandovejen 42 iværksætter den regulerede åbning af ventilen 41, hvilket muliggør at ultrafiltratet fjernes og ultrafilteringen i praksis 15 påbegyndes.

De inhiberende midler, såsom ammoniumlactat, fjernes således på kendt måde hen over ultrafiltreringsmembranen 23, mens “omvendt mælkesyrebakterierne tilbageføres gennem 20 rørføringen 24 til fermenteringsbeholderen 1. Kulturme diets højdeniveau reduceres hurtigt, indtil det når det mellemliggende niveau, som er kontrolleret af indikatoren 45, og når først dette niveau er blevet opnået, programmeres regulatoren 32 således, at ventilen 41 lukkes no-25 get, således at man sikrer et næsten konstant niveau ved hjælp af de to niveaufølere i mellemhøjden, som er placeret i ringe afstand fra hinanden 45a og 45b.

Man har under hele denne periode sikret sig en kontrol af 30 operationerne især af vækstraten, som, således som man har set det, bestemmes ved den logaritmiske ændring i forhold til tiden af ammoniumlactatkoncentrationen i fermenteringsbeholderen. Når man først har nået en maximal koncentration af lactat, som er blevet fastlagt fra be-35 gyndelsen, som svarer til bakteriedyrkningen ved en fastlagt vækstrate, griber man ind således, at denne ammoni-umlactatkoncentration holdes konstant, hvilket har den 11 DK 166591 B1 virkning, at man holder vækstraten for bakterierne konstant. Til opnåelse heraf forøger man, såsnart denne maximale værdi for koncentrationen af ammoniumlactat er blevet opnået, i nogen udstrækning tilstrømningsmængden 5 af vand, som tilledes gennem pumpen 12, således at man i fermenteringsbeholderen indfører ammoniakmængder, som svarer meget nøjagtig til den konstante vedligeholdelse af ammoniumlactatkoncentrationen. Man kan let bestemme tilførselshastigheden for pumpen 12, således at den 10 ammoniakkoncentration, som indføres, er den, der svarer til den koncentration i fermenteringsbeholderen af ammoniumlactat, som på denne måde sikrer opretholdelsen.

Man kan således være sikker på at holde vækstraten på et 15 nøjagtigt konstant niveau, om ønsket gennem kompletterende regulering af tilførslen af substrat, idet man til stadighed holder pH konstant. Det skal her bemærkes, at iværksættelsen af ultrafiltreringsfasen er styret positivt ved, at kulturmediets niveau, som registreres ved 20 hjælp af niveaumåleren 46, således at ultrafiltreringen i påkommende tilfælde kan ske forinden eller kan følge efter modifikationer i tilførselsforholdene, som afledes af fastlæggelsen af et mere moderat vækstrateniveau åf mælkesyrebakterierne .

25 I det efterfølgende skal anføres, som eksempel på en gennemførelse for visse mælkesyrebakterier, de kritiske koncentrationer af ammoniumlactat for en vækstrate på 0,35, idet der til beskrivelse af bakterierne er anført følgen-30 de vedrørende deres oprindelse: ANRZ: bakterier, der kan fås fra "Centre National de Recherches de Zootechniques" i Jouy-en-Josas (Frankrig); NCDO: bakterier, der kan fås fra "National Collection of Dairy Organisms" i Reading (England) og : 35 DK 166591 B1 12 (S.L.) betyder "Streptococcus lactis" (S.Cr) betyder "Streptococcus cremoris" 5 (S.D.) betyder "Streptococcus diacetyl lactis".

Kritisk koncentration (u = 0,35) Bakterietype (ammoniumlactat)_ 10 CNRZ 269 "(SL) 30 g/1 NCDO 763 (SL) 26 g/1 CNRZ 29 (SL) 38 g/1 NCDO 505 (SL) 38 g/1 NCDO 1198 (SL) 26 g/1 15 CNRZ 116 (SCr) 23 g/1 NCDO 1009* (SCr) 21 g/1 NCDO 699 (SCr) 26 g/1 CNRZ 253 (SCr) 30 g/1 NCDO 1000 (SCr) 21 g/1 20 NCDO 1119 (SCr) 28 g/1 NCDO 495 (SCr) 38 g/1 CNRZ 124 (SD) 28 g/1 CNRZ 125 (SD) 32 g/1 25 Man går i almindelighed ud fra substrater i reservoiret 4 med den højest mulige koncentration, i størrelsesordenen: (Lo) = 240 g/1 (lactose) (Ei) = 80 g/1 (gærekstrakt) ammoniak (No) = 12 N (normalitet) 30

Man kan i hvert enkelt tilfælde bestemme koncentrationerne af produkter, der går ind i fermenteringsbeholderen 1; men ligeledes og frem for alt indholdet af lactat til ethvert tidspunkt ved hjælp af formlen: 35 13 T? χ 107,11 χ No (lactat) = -

Vo + T1 + T2 + T3 hvori = summen af substrat rumfang ^ Tg = summen af ammoniakvands rumfang

Tg = summen af vandrumfang

Vo = det oprindelige rumfang i fermenteringsbeholderen 107,11.= molekylvægten for ammoniumlactat.

10

Man gennemfører overgangen fra den første begyndelsesfase med høj vækstrate til den anden fase med mere moderat vækstrate simpelthen ved at forøge tilførselshastigheden af vand Dg, således at man afpasser koncentrationen af det indgående ammoniakvand til koncentrationen af ammoniumlactat i fermenteringsbeholderen, hvortil anvendes den følgende matematiske formel: (No) x 107,11 x D9

Dg = -- - (D + Dg) 20 Laetat * ligesom man på det tidspunkt om ønsket modificerer tilførslen lidt af substrat i overensstemmelse med ændringen i vækstraten.

OC

I det følgende skal gives en kortfattet gennemgang af figurerne 2 til 5, som er diagrammer visende vækstraten som funktion af tiden:

Fig. 2, som angår stammen CNRZ 269, viser en høj vækstra-te af størrelsesordenen 0,77 under de første 3 timer. Efter 5 timer og 30 minutters forløb er lactatindhold nået op på 30- g/1, og fra dette øjeblik har man modificeret tilførelsen af vand ved at forøge den med ca. 50 %, hvilket har haft den virkning at reducere ammoniakkoncentra-35 DK 166591 B1 14 tionen, hvorved der sikres en tilførsel af ammoniak til fermenteringsbeholderen, som er egnet til at holde denne koncentration på 30 g/1, som svarer til en vækstrate på 0,39 fra tidspunktet 5 timer og 30 minutter til 8 timer.

5 Man bemærker, at ultrafiltreringen er sat i gang en lille smule efter 4 timer. Efter fermenteringens afslutning er den opnåede koncentration af bakterier 32 g bakterietørstof pr. Tcg kultur. Substratseffektivitetsfaktoren er 7,5 kg lactose pr. kg bakterietørstof.

10 På fig. 3, som angår stammen CNRZ 116, bemærker man en høj vækstrate af størrelsesordenen 0,71 pr. time under de første 4 timer. Efter 5 timer har indholdet af lactat nået 24 g/1, og fra dette øjeblik har man modificeret 15 tilførslen af vand, idet man forøger den med 98 %, hvilket har til effekt at reducere ammoniakkoncentrationen, og således sikre en tilførsel af ammoniak til fermenteringsbeholderen, som er i stand til at holde denne koncentration på 24 g/1, som svarer til en vækstrate på 0,30 * 20 i timen fra tiden 5 timer til 9 timer. Man bemærker, at ultrafiltreringen er igangsat en lille smule før tiden 5 timer. Man har forøget tilførselshastigheden af substrat med 7 % før den 7. time. Efter fermentering var bakteriekoncentrationen 20 g bakterietørstof pr. kg kultur. Sub-25 strateffektivitetsfaktoren er 8,4 kg lactose pr. kg bak terietørstof .

På fig. 4, som angår bakteriestammen NCDO 1119, bemærker man en høj vækstrate af størrelsesordenen 0,70 under de 30 første 4 timer. Ved den 6. time har lactatindholdet nået 28 g/1, og fra dette tidspunkt ændrer man tilførslen af * vand, ved at forøge den med 66 %, hvilket har haft til virkning at reducere koncentrationen af ammoniak, og således sikre en tilførsel af ammoniak til fermenteringsbe-35 holderen, som er i stand til at holde denne koncentration på 28 g/1, som svarer til en vækstrate på 0,32, fra den 6. time tdl den 11. time. Man bemærker, at ul traf iltre- 15 DK 166591 B1 ringen er blevet iværksat hen imod den 7. time. Ved fermenteringens afslutning er bakteriekoncentrationen 26 g bakterietørstof pr. kg kultur. Substrateffektivitetsfaktoren er 9,2 kg lactose pr. kg bakterietørstof.

5 På fig. 5, som angår stammen CNRZ 125, bemærker man en høj vækstrate af størrelsesordenen 0,80 under de 5 første timer. En lille smule før den 8. time nåede lactatindhol-det 32 g/1, og fra dette tidspunkt modificerede man til-10 førsien af vand, idet man forøgede den med ca. 42 %, hvilket havde til effekt at reducere ammoniakkoncentrationen og på denne måde sikre en tilførsel af ammoniak til fermenteringsbeholderen, som var i stand til at vedligeholde denne koncentration på 32 g/1, hvilket svarer 15 til en vækstrate på 0,26, fra den 8. time til den 12. time. Man bemærker, at ultrafiltreringen blev iværksat før den 7. time. Efter fermenteringens afslutning er bakteriekoncentrationen 18 g bakterietørstof pr. kg kultur. Substrate'ffektivitetsfaktoren er 7,9 kg lactose pr. kg 20 bakterietørstof.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen finder anvendelse ved dyrkning af mikroorganismer især ved dyrkningen af mælkesyrebakterier til mange forskellige anvendelser inden for 25 osteindustrien, druevinindustrien etc.

30 35

Claims (10)

1. Fremgangsmåde til dyrkning af mikroorganismer, hvor 5 man til et i forvejen podet kulturmedium sætter næringssubstrat *og et neutraliseringsmiddel, som er beregnet til at holde kulturmediets pH konstant, alt fortyndet med vand, og hvor man på kulturmediet gennemfører ultrafiltrering til delvis fjernelse af et dannet, inhiberende 10 middel under i det mindste en del af mikroorganismernes udviklingsfase, idet man sikrer en vækstrate for mikroorganismerne i kulturmediet udvisende en høj værdi i en første fase af begyndelsesudviklingen samt i en efterfølgende fase en moderat og konstant værdi, kende-15 tegnet ved, at man: a) holder pH på 5,5-7,5 under hele dyrkningsfasen; b) regulerer tilførslen af substrat og af vand i forhold 20 til tilførslen af neutraliseringsmiddel ved en stadig analyse af koncentrationen af det inhiberende middel, som er resultatet af neutraliseringsmidlets virkning; c) indfører alle nævnte komponenter direkte i en fermen- 25 teringsbeholder under hele fremstillingen; d) holder den moderate vækstrate mellem 0,10 og 0,50; e) bestemmer påbegyndelsen af dyrkningsfasen med moderat 30 vækstrate ved opnåelse af en kritisk koncentration af det inhiberende middel i kulturmediet svarende til den maximalt tilladelige koncentration ved den valgte moderate vækstrate, og 35 f) styrer i det mindste den væsentlige fase af ultrafiltreringen således, at der opretholdes et konstant rumfang af kulturmediet, hvori den samlede mængde dyrkede mikro- DK 166591 B1 organisme befinder sig.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den mere moderate vækstrate er mellem 0,15 og 5 0,45. -

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den mere moderate vækstrate er mellem 0,20 og 0,40. 10

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den mere moderate vækstrate er mellem 0,30 og 0,35.

5. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-4, ken detegnet ved, at mængden af substrat og vand holdes på konstante værdier i forhold til mængden af neutraliseringsmiddel under den første udviklingsfase med høj vækstrate samt på andre indbyrdes forholdsvaerdier under 20 hele den efterfølgende udviklingsfase med mere moderat vækstrate, under hvilken den relative mængde af vandet forøges desto mere, jo svagere man vælger den maximalt tilladelige koncentration af inhiberende middel.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man før ultrafiltreringen gennemfører en forudgående udviklingsfase af kulturmediet med voksende rumfang ud fra et begyndelsesrumfang, indtil man opnår det maximale rumfang, hvorpå man iværksætter ultrafiltreringen. 30

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at ultrafiltreringen først bevirker en rumfangsreduktion af kulturmediet, hvorpå der opretholdes en konstant middelværdi af dette således reducerede rumfang af 35 kulturmediet. DK 166591 B1

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at man, når ultrafiltreringen er afsluttet, fortsætter tilførslerne til kulturmediet indtil opnåelse af et niveau, der svarer til det maximale rumfang. 5

9. Fremgangsmåde til dyrkning af mælkesyrebakterier, hvor man til et i forvejen podet kulturmedium sætter nærings-substrat, der med fordel indeholder lactose og gær, og ammoniak eller natriumhydroxid, der udgør et neutralise- 10 ringsmiddel, som er beregnet til at holde kulturmediets pH på en konstant værdi, alt fortyndet med vand, og hvor man underkaster kulturmediet ultrafiltering til delvis fjernelse af dannet ammonium- eller natriumlactat under i hvert fald en del af udviklingsfasen for mælkesyrebakte-15 rierne, og hvorved man sikrer sig en vækstrate for bakterierne i‘kulturmediet udvisende en høj værdi i en første fase af begyndelsesudviklingen samt i en efterfølgende fase en mere moderat og konstant værdi, kendetegnet ved, at man: 20 a) holder pH i kulturmediet på en værdi mellem 6 og 7; b) regulerer tilførslen af substrat og af vand i forhold til tilførsel af ammoniak eller natriumhydroxid forudre- 25 guleret, som angivet under a), ved en stadig analyse af koncentrationen af ammonium- eller natriumlactat fremkommet ved ammoniakkens eller natriumhydroxidets virkning på * den under lactosenedbrydningen dannede mælkesyre; 30 c) indfører alle nævnte komponenter direkte i en fermenteringsbeholder under hele fremstillingen; d) holder den moderate vækstrate mellem 0,10 og 0,50; 35 e) bestemmer påbegyndelsen af dyrkningsfasen med mere moderat vækstrate ved opnåelse af en kritisk koncentration af ammonium- eller natriumlactat i kulturmediet, idet den DK 166591 B1 kritiske ammoniumlactatkoncentration er på mellem 19 g/1 for en vækstrate på 0,50 og 54 g/1 for en vækstrate på 0,10, og'· 5 f) styrer i det mindste den væsentlige fase af ultrafiltreringen således, at der opretholdes et konstant rumfang af kulturmediet, hvori den samlede mængde dyrkede mikroorganismer befinder sig.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetégnet ved, at lactosekoncentrationen i kulturmedier under udviklingsfasen med mere moderat vækstrate er på mellem 50 g/1 (svarende til en vækstrate på 0,10) og 18 g/1 (svarende til en vækstrate på 0,50), og at gærekstraktkoncen-15 trationen er på mellem 8 g/1 (svarende til en vækstrate på 0,10) og 18 g/1 (svarende til en vækstrate på 0,50), idet ammoniakkoncentrationen er mellem 0,5 N (svarende til en vækstrate på 0,10) og 0,18 N (svarende til en vækstrate på 0,50). 20 25 30 35