DK167193B1

DK167193B1 - Analogifremgangsmaade til fremstilling af muramylpeptider eller salte deraf

Info

Publication number: DK167193B1
Application number: DK337883A
Authority: DK
Inventors: Albert Hartmann; Oskar Wacker; Gerhard Baschang; Lajos Tarcsay
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1982-07-23
Filing date: 1983-07-22
Publication date: 1993-09-13
Also published as: NZ205002A; CA1243305A; ES8607980A1; PL243132A1; DD210058A5; ES8504676A1; FI832639A0; IE831727L; FI832639A7; JPS5933296A; ES539505A0; SU1299516A3; PT77081B; PL142641B1; IL69292A0; ZA835357B; EP0099578B1; NO167746C; ATE23536T1; PL142775B1

Description

i DK 167193 B1

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangs-raåde til fremstilling af hidtil ukendte muramylpeptider med den almene formel <jH2-OR6 4 i\o )·! <h-or1> (i) R-0 Vf 1/ jJ/rTi 2

R-CH (D) NH-C-R

5 \ «.) (D) ' (Uj) ?H

\-N-CH-C-NH-CH-CH_-CH0-C-X-Y-C-NH-CH-CH-0-F-0-CH

II I5I7 II I 2 1 S il 0RR 0 A»® 0 0 ° 0 OR V.

9^c-o-ch * fol, l*(sn) o R10Å> hvori rI, 0g r6 hver for sig betyder hydrogen eller lavalkanoyl, R^ betyder C(1-4)-alkyl, hydroxymethyl eller phenyl, r3 betyder hydrogen eller methyl, R5 betyder hydrogen eller C( 1-3)-alkyl, r7 betyder usubstitueret 10 eller med hydroxy, mercapto eller methylthio substitueret C(1-3)-alkyl, r8 betyder hydrogen eller lavalkyl, X betyder oxygen eller gruppen NH, Y betyder C(l-4)-alkyl-iden, og R9 og R10 hver for sig betyder C( 11-17)-alkyl eller C(11-17)-alkenyl, eller salte deraf.

15 Forbindelserne med formlen I har i tilfælde af asymmetrisk substitution ved C-R^ (D)-, ved C-R^ (L)-, ved C-C-OR^ (D)-, i gruppen Y (D- og ved C-l i D-glucoseresten a- og/eller β-konfiguration, dvs. forbindelserne med formlen I kan foreligge som rene anomere eller som anomerblandinger.

DK 167193 B1 2

O

Til karakterisering af konfigurationen ved det midterste C-atom i glyceroldelen anvendes stereospecifik. numerering af C-atomerne i glyceroldelen, svarende til IUPAC reglerne og karakteriseret ved præfikset "sn". Det øverste C-atom i 5 Fischer-projektionen af den lodrette carbonkæde, hvor hydr-oxygruppen ved C-2 står til venstre, tildeles nummeret 1.

Ved de omhandlede forbindelser er phosphorsyregruppen ved C-atomet 3 bundet i betydningen af den stereospecifikke nummerering .

10

Det ovenfor og i det følgende anvendelse udtryk "lav" betegner grupper med 1-7, især 1-4 carbonatomer.

Lavalkanoyl er f.eks. propionyl, butyryl eller hexanoyl, 15 i første række acetyl.

Lavalkyl er f.eks. n-propyl, n-butyl, isobutyl, sek-butyl, tert-butyl, endvidere n-pentyl, n-hexyl eller n-heptyl, i første række methyl, ethyl eller isopropyl.

20 2

Mere detaljeret betyder en alkylgruppe R især methyl, når 3 3 R betyder methyl, eller ethyl, når R betyder hydrogen, 5 7 en alkylgruppe R især methyl, en alkylgruppe R især methyl, g ethyl eller isopropyl, og en alkylgruppe R især -alkyl, 25 fortrinsvis ligekædet C^_^-alkyl, i første række n-butyl.

Med hydroxy, mercapto eller methylthio substitueret C. ,-7 ~ alkyl R er især hydroxymethyl eller 1-hydroxyethyl, mercap-tomethyl eller 2-methylthio-ethyl.

30

En alkylidengruppe Y er en divalent gruppe, i hvilken de to bindinger udgår fra samme carbonatom, fortrinsvis en gruppe bundet i 1,1-stillingen, såsom især methylen eller ethyliden, endvidere propyliden eller isobutyliden.

35 DK 167193 B1 3

O

9 10

En C^^_^y-alkylgruppe R eller R er en ligekædet eller forgrenet, især dog ligekædet gruppe, i første række en ligekædet gruppe med et ulige antal carbonatomer, såsom n-undecyl eller n-tridecyl, i allerførste række en ligekædet C15_17~ 5 alkylgruppe med et ulige antal carbonatomer, dvs. n-hepta-decyl eller i allerførste række n-pentadecyl.

9 10

En Cll-17 -alkenylgruppe R eller R er især hepta-8(Z)-decenyl.

10

Den over oxygen til phosphoratomet bundne proton er sur og kan let fraspaltes med baser og ombyttes med en anden kation. Ved en pH-værdi på 7 foreligger forbindelserne med formlen I derfor helt eller overvejende på saltform.

15 Disse salte er ligeledes omfattet af opfindelsen. Især omfatter opfindelsen farmaceutisk anvendelige, ugiftige salte af forbindelserne med formlen I. Disse salte er i første række metal- eller ammoniumsalte, såsom alkalimetal- og jordalkalimetal-, f.eks. natrium-, kalium-, 20 magnesium- eller calciumsalte, samt ammoniumsalte eller salte med egnede organiske aminer, såsom lavalkylaminer, f.eks. triethylamin. Til isolering eller rensning kan der også anvendes farmaceutisk uegnede salte. Til terapeutiske formål anvendes dog de farmaceutisk anvende-25 lige, ugiftige salte, og disse foretrækkes derfor.

14 6

De omhandlede forbindelser, hvori R , R og R betyder hydrogen, er omfattet af EP-patentansøgningen med publikations- nummeret 0025.495 og kan ligesom forbindelserne med form-14 6 30 len I, hvori R , R og/eller R betyder lavalkanoyl, anvendes som immunostimulatorer. I forhold til de i ovennævnte EP-patentansøgning forpublicerede forbindelser har de omhandlede forbindelser kraftigt formindskede, uønskede bivirkninger, især er de langt mindre, dvs. praktisk taget slet ikke, 35 pyrogene. Dette har stor betydning, da indgiften af en pyrogen forbindelse i visse tilfælde kan medføre et termisk chok, hvorfor en sikker anvendelighed kun sikres under konstant DK 167193 B1 4 lægeopsyn, og endvidere må bestemte indgiftsformer, såsom intravenøs indgift, lades ude af betragtning.

5

Afprøvningen for pyrogenitet kan gennemføres under anvendelse af den i europæisk farmakopé, bind 2, side 56-59 (1971), anførte forskrift på kaniner. Ved afprøvning ifølge denne forskrift kan f.eks. selv ved subkutan indgift af en høj do-10 sis, såsom 30 mg/kg N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (C )-n-butylester-(C )-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glyce-cc Ύ ro-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid-natriumsalt (forbindelse I), ikke konstateres nogen pyrogen virkning. Ved intravenøs applikation gennemføres ovennævnte pyroge-15 nitetstest på følgende måde:

Rektaltemperaturen hos grupper på tre SPF-chinchilla bastardkaniner registreres hvert 30. minut ved hjælp af et automatisk apparatur (Hewlett Packard type 3052 A). Kaninerne holdes ved en stuetemperatur på 18 ± 2°C, en 20 relativ luftfugtighed på 60 ± 10% og en lysperiode på 14 timer pr. dag. Når rektaltemperaturen hos hver kanin er registreret 3 gange fastlægges begyndelsestemperaturen som gennemsnitsværdien af de sidste to rektaltemperatu-rer, hvorefter der administreres 1 mg/kg af forsøgsfor-25 bindeisen i form af en opløsning i fysiologisk saltopløsning i auricularvenen på hver enkelt kanin. Derefter bestemmes temperaturen yderligere syv gange over et tidsrum på i alt 3 timer. Kaninens begyndelsestemperatur trækkes fra den højeste temperatur, som registreres i 30 løbet af disse 3 timer for hver enkelt kanin.

Som forsøgsforbindelser anvendes de nedenfor anførte forbindelser A-K.

DK 167193 B1 5 A = natriumsaltet af N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglut-aminyl-L-alanin-2-( 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydr-oxyphosphoryloxy)-ethylamid, 5 B = natriumsaltet af N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glut- amyl-(Ca)-methylester-(Cy)-L-alanin-2-(1,2-dipalmit-oy1-sn-glycero-3-hydroxyphosphory1oxy)-ethylamid, C = natriumsaltet af N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glut- amyl-(Ca)-n-butylester-(Cy)-L-alanin-2-(1,2-dipalmit-10 oyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid, •D = natriumsaltet af N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glut- amyl-(Ca)-tert.butylester-(Cy)-L-alanin-2-(1,2-dipalmit-oyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid, E = natriumsaltet af N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glut-15 aminsyre-(C,y)-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid, F = natriumsaltet af N-propionyl-demethylmuramyl-L-alan-yl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-gly-cero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid, 20 G = natriumsaltet af N-propionyl-demethylmuramyl-L-alan-yl-D-glutamyl-(Ca)-methylester-()-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid, H = natriumsaltet af N-propionyl-demethylmuramyl-L-alan- yl-D-glutamyl-(Ca)-n-butylester-()-L-alanin-2-(1,2-di-25 palmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid, I = natriumsaltet af N-propionyl-demethylmuramyl-L-alan- yl-D-glutamyl-(Ca)-tert.butylester-(Cy)-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid og DK 167193 B1 6 K = dinatriumsaltet af N-propionyl-demethylmuramyl-L-al- anyl-D-glutaminsyre- (Cy) -L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy) -ethylamid.

5 Forbindelserne A og F er beskrevet i henholdsvis eksempel 4 og 12 i beskrivelsen til EP-patentansøgning nr.

025.495, og forbindelserne B, C, D, E, G, Η, I og K er beskrevet i henholdsvis eksempel nr. 11, 1, 12, 17, 13, 15, 14 og 16 i nærværende beskrivelse. Forbindelse A 10 kendt fra beskrivelsen til ovennævnte EP-patentansøgning er strukturelt nærmest beslægtet med forbindelserne B, C, D og.E, og forbindelse F kendt fra beskrigvelsen til ovennævnte EP-patentansøgning er strukturelt nært beslægtet med forbindelserne G, Η, I og K, idet den eneste 15 strukturforskel skyldes definitionen af substituenten i forbindelserne ifølge opfindelsen.

Summen af temperaturforskellene bestemt som beskrevet ovenfor for de tre kaniner er anført i nedenstående tabel I.

20 Tabel 1

Forbindelse Temperaturstigning (0C) A 2,0 B 1,0 C 1,1 25 D 0,42 E 0,55 F 1,14 G 0,48 30 H 0,69 I 0,65 K 0,33 DK 167193 B1 7

Det fremgår af de ovenfor anførte forsøgsdata, at temperaturstigningen fremkaldt af forbindelserne B, C, D og E er ca. 20 til ca. 50% af temperaturstigningen fremkaldt 5 ved hjælp af forbindelse A, og at temperaturstigningen fremkaldt af forbindelserne G, Η, I og K er ca. 30 til ca. 60% af temperaturstigningen fremkaldt af forbindelse F.

Disse resultater illustrerer tydeligt, at forbindelserne 10 B, C, D, E, G, Η, I og K adskiller sig væsentligt fra de kendte sammenligningsforbindelser A og F med hensyn til toksikologiske bivirkninger.

De omhandlede forbindelser kan anvendes som beskrevet i be-25 skrivelsen til EP-patentansøgning nr. 0025.495.

Da de omhandlede forbindelser har en udmærket forenelighed, er de dog især egnede til profylakse og terapi af infektionssygdomme, hvorved der opnås en kraftig virkning ikke blot i 20 tilfælde af bakterieinfektioner, men også i tilfælde af virusinfektioner. Denne sidste egenskab er ikke tidligere beskrevet og har stor praktisk betydning, da farmaceutiske præparater til behandling af virusbetingede sygdomme hidtil kun har været tilgængelige i helt utilstrækkeligt omfang. Det er 25 først og fremmest bemærkelsesværdigt, at de omhandlede forbindelser har lang profylaktisk eller terapeutisk virkningsvarighed på mange dage op til nogle uger efter en enkelt applikation, samt at de omhandlede forbindelser har et bredt virknings spektrum mod sygdomsfremkaldende vira.

30

Muramylpeptiderne med formlen I kan især anvendes til profylakse og terapi af sygdomme, som fremkaldes af de nedenfor nærmere betegnede vira [angående nomenklatur henvises til J.L.Melnick, Prg.med.Virol, 2J5, 214-232 (1980) og 28, 208-221 35 (1982)]: DNA-vira med kubisk symmetri og nøgent nukleokapsid, DNA-vira med omhyllet virion samt RNA-vira med kubisk og med helikal symmetri for kapsidet.

DK 167193 B1 8

Fortrinsvis anvender man forbindelserne med formlen I i tilfælde med DNA-vira med omhyllet virion og kubisk symmetri for kapsidet, i tilfælde med RNA-vira med kubisk symmetri for kapsidet og nøgen virion og i tilfælde a'f RNA-vira med 5 helikal symmetri for kapsidet, hvori nukleokapsidomhylningen findes ved overflademembranen, men også i tilfælde af adeno-viridae, poxviridae og coronaviridae, såsom især humane coronavira.

I første række anvender man forbindelserne med formlen I i 10 tilfælde af herpesviridae, picornaviridae og myxovara, men også i tilfælde af mastadenovira, såsom især humane adeno-vira, i tilfælde af chordopoxvirinae, såsom hovedsagelig orthopoxvira, såsom især f.eks. vacciniavira, i tilfælde af reoviridae, fortrinsvis (især humane) rotavira, samt i 15 tilfælde af caliciviridae og rhabdoviridae, såsom i første række vesiculovira fra mennesker samt fra heste, kvæg og svin.

Hovedsagelig anvender man forbindelserne med formlen I i tilfælde af alfaherpesvirinae, , rhinovira, cardiovira og orthomyxoviridae, men også i tilfælde af betaherpesvirinae, 20 såsom især humane cytomegalovira, i tilfælde af aphthovira, i første række apthovira fra klovdyr, såsom hovedsagelig fra kvæg, samt i tilfælde af paramyxoviridae, såsom i første række pneumovira, f.eks. respiratoriske syncitialvira hos mennesker, og såsom ligeledes morbillivira eller paramyxovira, 25 såsom f.eks. humane parainfluenzavira, herunder sendaivira.

I allerførste række anvender man forbindelserne med formlen I i tilfælde af simplexvira, f.eks. humane Herpes simplex vira af typen 1 og 2, i tilfælde af humane encephalomyocarditisvira og i tilfældde af influenzavira, såsom hovedsagelig influenza 30 A og influenza B vira, f.eks. de i eksemplerne anførte vira.

Muramylpeptiderne med formlen I kan anvendes til profylakse eller terapi af virusinfektionerne, idet de indgives enteralt eller parenteralt, i første række sammen med egnede hjælpeeller bærestoffer. Fortrinsvis indgives forbindelserne på DK 167193 B1 9

O

slimhuden, f.eks. intranasal, rektalt eller vaginalt, eller på øjets bindehud, eller oralt. Den antivirale virkning indtræder dog også ved indgift på anden måde, f.eks subkutan, intravenøs, intramuskulær eller ved apllikation på den nor-5 male hud.

Hvilken indgiftsmåde, der er mest velegnet, afhænger bl.a. af arten af den pågældende virus. Eksempelvis er i tilfælde af respiratoriske vira intranasal indgift at foretrække i 10 mange tilfælde. Doseringen af det aktive stof afhænger bl.a. af den pågældende varmblodede dyreart, organismens modstandsevne, indgiftsmåden og arten af den pågældende virus.

De omhandlede forbindelser har den yderligere meget interes-15 sante egenskab, at de hæmmmer dannelsen af metastaser ved nogle tumorer, især i lungen, hvilket kan påvises ved forsøg med B16-BL6-melanom-modellen og i tilfælde af Lewis lun-carcinomer, hvor indgift i liposomer er særlig fordelagtig.

20 Opfindelsen angår især fremstillingen af forbindelser med formlen I, hvori mindst én af grupperne R1, og R8 betyder lavalkanoyl.

Opfindelsen angår hovedsagelig fremstillingen af forbin-25 delser med formlen I, hvori Ri, r4 og R8 uafhængigt af hinanden betyder hydrogen eller C]__3-alkanoyl, r2 betyder Ci_2-alkyl eller hydroxymethyl, R8 betyder hydrogen eller methyl, R8 betyder hydrogen eller methyl, r7 betyder Ci_3-a.lkyl eller hydroxymethyl, R8 betyder hydrogen eller 30 Ci_4-alkyl, X betyder oxygen eller gruppen NH, Y betyder Ci_3-alkyliden, og R^ og R1^ hver for sig betyder lige-kædet Cn_i7-alkyl eller des-carbonyl-oleoyl, og deres salte.

35 i første række angår opfindelsen fremstillingen af forbindelser med formlen I, hvori R1, R^ og R8 hver for sig betyder hydrogen eller acetyl, R^ betyder methyl eller ethyl, r3 betyder hydrogen eller methyl, R8 betyder hydrogen eller methyl, R7 betyder Ci_3~alkyl, R8 betyder DK 167193 B1 10 hydrogen eller Ci_4~alkyl, X betyder oxygen eller gruppen NH, Y betyder Ci_2~alkyliden/ og R^ og R^-0 uafhængigt af hinanden betyder ligekædet 1-17-alkyl med et 5 ulige antal carbonatomer eller des-carbonyl-oleoyl, og deres salte.

Især angår opfindelsen fremstillingen af de ovenfor anførte forbindelser med formlen I, hvori R8 betyder en af de nævnte alkylgrupper, og/eller hvori R^·, R4 og R^ bety-10 der hydrogen, og deres salte.

Især angår opfindelsen fremstillingen af forbindelser med formlen I, hvori R1, R4 og R^ betyder hydrogen, R2 betyder methyl eller ethyl, R8 betyder hydrogen, når R2 betyder ethyl, eller methyl, når R2 betyder methyl, R5 15 betyder hydrogen eller methyl, R^ betyder hydrogen eller methyl, R? betyder C^_2~alkyl, når R8 betyder ligekædet Ci_4~alkyl, X betyder oxygen eller gruppen NH, Y betyder ethyliden, og R^ og R-*-0 uafhængigt af hinanden betyder ligekædet Ci5-i7-alkyl med et ulige antal carbonatomer, 20 og deres salte.

I allerførste række angår opfindelsen fremstillingen af de ovennævnte forbindelser med formlen I, hvori R8 betyder methyl, R5 betyder hydrogen, R8 betyder n-butyl, X betyder gruppen NH, og/eller R^ nøjagtig som R1^ betyder 25 n-pentadecyl, og deres salte, samt de i eksemplerne anførte forbindelser med formlen I.

De hidtil ukendte forbindelser med formlen I og deres salte kan fremstilles på i og for sig kendt måde.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at 30 man a) omsætter en forbindelse med formlen DK 167193 B1 11 (jM2OR6 (h’°r1) aiI) • i L-L2 hvori substituenterne har de ovenfor anførte betydninger og tilstedeværende funktionelle grupper med undtagelse af 5 den frie hydroxygruppe i 3-stillingen eventuelt foreligger på beskyttet form, idet 3-hydroxygruppen eventuelt foreligger på reaktionsdygtig form, med en forbindelse med formlen 7 V5*8 t Y fo Z-CH-C-N -CH-C-NH-CH-CH-CH--C-X-Y-C-NH-CH -CH -0-P-0-CH„ 13 II 15 (L) lX 11 11 2 2 11 2 R °R }° CD) 0 (L)° (V*

(IV) R

α r 2 (en)

\0s u R

10 hvori Z betyder en eventuelt på reaktionsdygtig form foreliggende hydroxygruppe, og de øvrige substituenter har de ovenfor anførte betydninger, idet dog de i en forbindelse med formlen IV tilstedeværende funktionelle grupper med undtagelse af Z eventuelt foreligger på 15 beskyttet form, eller med et salt deraf og fraspalter eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper eller b) omsætter en forbindelse med formlen DK 167193 B1 12 R6OOi2

i-O

l/‘ \j 1 K n /1 (H,OR ) (V) H0 "Å /I IL· R3-Ck (D) \ r (d/^(d) r (L) \x i C- N- CH-C- / NH-CH-CH.-Oh-C- \ X-Y-C- J \ OH II I g 17 11 ( I 1 Z I! ? II f °; R0 Vv 0 (. °)J\ s r q hvori s, r og q hver for sig betyder 0 eller 1, og Rf betyder lavalkyl eller en carboxylbeskyttelsesgruppe, og 5 de øvrige substituenter har de ovenfor anførte betydninger, idet dog de i en forbindelse med formlen V tilstedeværende frie funktionelle grupper med undtagelse af den i reaktionen deltagende gruppe eventuelt foreligger på beskyttet form, eller et reaktionsdygtigt carboxyl-10 syrederivat deraf med en forbindelse med formlen

(L) (D) \ (L)jj OH

i7 8 Λ. V o} 2 lv . )c° °r- y jT r9>-o-|h

(TI) oN

r10' hvori t, u og v hver for sig betyder 0 eller 1, og sub-stituenteme har de ovenfor angivne betydninger, under den forudsætning, at t, u og v er 1, når i forbindelsen 15 med formlen V q er 0, at t er 0, u er 1, og v er 1, når q er 1, og r er 0, at u er 0, og v er 1, når q er 1, r er 1, og s er 0, eller at v er 0, når q, r og s er 1, eller DK 167193 B1 13 et salt eller et reaktionsdygtigt derivat deraf og fraspalter eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper eller 5 c) omsætter en forbindelse med formlen <j:H2-0Rb 3 r/' i if 2

R-CH (D) NH-C-R

\ CD (D) (Dft S 0H\ NC-N-CH-C-NH-CH-CH--CH--C-X-Y-C-NH-CH0-CH.,- i o-p- '.oh - II 1517 II I 2 2 II 2 2 u } 0 R R ° a 8 ° V 5 y

tf or N

hvori w betyder 0 eller 1, og substituenterne har de ovenfor anførte betydninger, idet dog frie funktionelle grupper med undtagelse af den i reaktionen deltagende 10 gruppe eventuelt foreligger på beskyttet form, eller et salt eller et reaktionsdygtigt phosphorsyrederivat af en sådan syre med formlen VII, hvori w er 1, med en forbindelse med formlen V,o*10 H- ^r\o-CH2i-CH24 (VKI) \ s m l*(sn) 15 hvori substituenterne har de ovenfor anførte betydninger, og m er 0 eller 1, under den forudsætning, at m er 1, når i forbindelsen med formlen VII w er 0, eller at m er 0, når w er 1, eller med et salt eller et reaktionsdygtigt phosphorsyrederivat af en syre med formlen VIII, hvori m 20 er 1, og fraspalter eventuelt tilstedeværende beskyttel- DK 167193 B1 14 sesgrupper eller d) omsætter et rekationdygtigt derivat af en forbindelse med formlen jH2-0R6 R4-oN?_,/j <K,0R1) (VII) 5 E3-c/(D) L-C-R2 \ ft·) 0>) (L)0 /"or'n / 0-P- V ·

- 0RR 0 Λ 8 0 V B J

o OR ' ' W

hvori w er 0 eller 1, og substituenteme har de ovenfor angivne betydninger, idet dog de i en forbindelse med formlen VII tilstedeværende frie funktionelle grupper med undtagelse af den i reaktionen deltagende gruppe even-10 tuelt er beskyttet med let fraspaltelige beskyttelsesgrupper, under den forudsætning, at et reaktionsdygtigt derivat med formlen VII, hvori w er 0, er et sådant, hvor den endestillede hydroxygruppe foreligger på reaktionsdygtig, forestret form, og under den 15 forudsætning, at det reaktionsdygtige derivat af en forbindelse med formlen VII, hvori w er 1, er et salt, med et reaktionsdygtigt derivat af en forbindelse med formlen V9 10 Y \/ f Ψ\ II mit) H- / 0-P- Vo-CH2-CH-CH2-0 \ Vd l*(sn) DK 167193 B1 15 hvori substituenterne har de ovenfor anførte betydninger, og m er 0 eller 1, under den forudsætning, at m er 1, når i forbindelsen med formlen VII w betyder 0,"og det reak-5 tionsdygtige derivat af en forbindelse med formlen VIII er et salt, eller at m er 0, når w er 1, og det reaktionsdygtige derivat af en forbindelse med formlen VIII er et sådant, hvor den endestillede hydroxygruppe foreligger på reaktionsdygtig, forestret form, og fraspal-10 ter eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper, eller e) omsætter en forbindelse med formlen jH2-0R6 /' °\ I 1 4 '\ 0 A (H,0R ) (I3t) ' R -Q 1/ r3-c/(d) L-c-r2

\ (L) (D) (L)j[ OH

i'ufrS’rø1H^H2'CH2l"X"Y"C'rø'CH2‘ra2^-°-Cfi2· 0 R r o c 0 q o' X0H o 9)c-0-Ch R iH2l*Csn) 0 R10/\ hvori substituenteme har de ovenfor anførte betydninger, idet i en forbindelse med formlen IX tilstedeværende frie 15 funktionelle grupper med undtagelse af den i reaktionen deltagende gruppe eventuelt foreligger på beskyttet form, eller et reaktionsdygtigt carboxyl syrederivat af en forbindelse med formlen IX med en lavalkanol r8-oh, hvori R?, betyder lavalkyl, eller et reaktionsdygtigt derivat 20 deraf, og fraspalter eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper eller f) oxiderer en forbindelse med formlen DK 167193 B1 16 ch2-or6 4 C /i (Hi0r1) <X> 3 Λ~\ * 2 R -CH (D) NH-C-R n \ (L) (D) (Dg

\-N-CH-C-NH-CH-CH„-CH,-C-X-Y-C-NH-CH -CH_-0-P-0-CHo II 1517 11 I IT

0RR 0 A 8 o cr or %

JC-O-CH

R9^ ill, l’ (sn) o

Rl0A) hvori R^l betyder hydrogen eller en beskyttelsesgruppe, og de øvrige substituenter har de ovenfor anførte betyd-5 ninger, idet i en forbindelse med formlen X tilstedeværende frie funktionelle grupper eventuelt foreligger på beskyttet form, eller en tautomer af denne forbindelse med et oxidationsmiddel og fraspalter eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper eller 10 g) fraspalter under samtidig omdannelse af furanose til pyranose beskyttelsesgrupperne i en furanoseforbindelse med formlen r20och2 19_ R 0--/ 17 / ^.~~0R (XI)· r3-c(Ud) ^ l18 \ (o 0» tt) o ™ C-N-CH-C->m-Ca-CH,-CH,-C-X-Y-C-lIH-CH2-CR2-0-P-0-CH2 II I5I7 II I ft n °rV° A»« 8 0 ° \-o-ch R ia l’(sn) I 2 o r1oAo DK 167193 B1 17 hvori r!7 betyder hydrogen eller en let fraspaltelig hydroxybeskyttelsesgruppe, og R18 betyder 5 R2-B-NH-, hvori R2 har den ovenfor nævnte betydning, eller r!7 Qg R18 sammen betyder en med C-atomets fri valens til oxygen bundet divalent beskyttelsesgruppe med formlen 10 R2-å=N-, hvori R2 har den ovenfor anførte betydning, og Qg r20 betyder en let fraspaltelig hydroxybeskyttelsesgruppe, eller R1^ 0g r20 sammen betyder en divalent hydroxy-15 beskyttelsesgruppe, og de øvrige substituenter har de ovenfor anførte betydninger, eller i et salt deraf, eller h) fraspalter beskyttelsesgruppen eller -grupperne i en forbindelse med formlen I, hvori mindst én af grupperne Ri, R2, R^, r6, r7 eller R8 foreligger på beskyttet form, 20 og de øvrige substituenter har de ovenfor anførte betydninger, eller i et salt deraf, eller i) hydrolyserer en forbindelse med formlen O!2-0R6

•"''O

(b,or1) wii) 3 I i? 2

R -CH (D) NH-C-R

N. (L) (D) (L)fl ^ C-N-CH-C-KH-CH-CH_-CH_-C-X-Y-C-NH-CH_-CHo-0-P-0-CH- ii i 5 i 7 il i 2 2 5 2 2 Λ 2 0 rV 0 £ o 0 0 <A)R8 0 R CH, l'(sn) I 2 0

Rl0A)

O

DK 167193 B1 18 hvori A betyder et halogenatom, og de øvrige substi- tuenter har de ovenfor anførte betydninger, og, om ønsket, efter gennemførelse af en af fremgangsmåderne

a-i) omdanner en fremstillet forbindelse med formlen I

til et salt deraf eller et fremstillet salt til et andet 5 salt.

Fremgangsmåde a (sammenblanding af sukkerdel og sidekæde):

Beskyttelsesgrupper, deres indføring og fraspaltning er eksem-10 pelvis beskrevet i "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, London, New York 1973, og "Methoden der orga-nischen Chemie", Houben-Weyl, 4.udgave, bd. 15/1, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart 1974. Det er karakteristisk for beskyttelsesgrupper, at de let kan fraspaltes, dvs. uden at 15 der forløber uønskede sidereaktioner, f.eks. solvolytisk, reduktivt, fotolytisk eller under fysiologiske betingelser.

Hydroxybeskyttelsesgrupper er f.eks. acylgrupper, såsom eventuelt, f.eks. med halogen, substitueret lavalkanoyl, såsom 20 2,2-dichloracetyl, eller acylgrupper af kulsyrehalvestere, især tert-butyloxycarbonyl, eventuelt substitueret benzyl-oxycarbonyl, f.eks. 4-nitro-benzyloxycarbonyl, eller di-phenylmethoxycarbonyl, eller 2-halogen-lavalkoxycarbonyl, såsom 2,2,2-trichlorethoxycarbonyl, endvidere trityl eller 25 formyl, eller organiske silyl- eller stannylgrupper, endvidere let fraspaltelige forethrende grupper, såsom tert-lav-alkyl, f.eks. tert-butyl, 2-oxa- eller 2-thia-aliphatiske eller -cycloaliphatiske carbonhydridgrupper, i første række 1- lavalkoxylavalkyl eller 1-lavalkylthio-lavalkyl, f.eks.

30 methoxymethyl, 1-methoxyethyl, 1-ethoxyethyl, 1-methylthio- methyl, 1-methylthioethyl eller 1-ethylthioethyl, eller 2- oxa- eller 2-thiacycloalkyl med 5-6 ringatomer, f.eks. tetrahydrofuryl eller 2-tetrahydropyranyl eller tilsvarende thiaanaloge, samt eventuelt substitueret 1-phenyllavalkyl, 35 såsom eventuelt substitueret benzyl eller diphenylraethyl, hvor der som substituenter i phenylgrupperne f.eks. kan foreligge halogen, såsom chlor, lavalkoxy, såsom methoxy, og/el-ler nitro.

O

19 DK 167193 B1

En forbindelse med formlen III, hvori 3-hydroxygruppen foreligger på reaktionsdygtig form, er f.eks. en metaloxyforbin-delse, som f.eks. kan fremstilles ved omsætning af en forbindelse med formlen III med en stærk base, såsom et alkalimetal-5 hydrid eller -amid, eller en forbindelse, hvori 3-hydroxygrup-pen foreligger på reaktionsdygtigt forestret form.

Reaktionsdygtigt forestret hydroxy er f.eks. med en stærk 10 uorganisk eller organisk syre forestret hydroxy, såsom med en mineralsyre, f.eks. en hydrogenhalogenidsyre, såsom hydro-genchloridsyre, hydrogenbromidsyre eller hydrogeniodidsyre, endv-idere svovlsyre, eller en halogensvovlsyre, f.eks. fluorsvovlsyre, eller med en stærk organisk sulfonsyre, såsom en 15 eventuelt, f.eks. med halogen, såsom fluor, substitueret lav-alkansulfonsyre eller en aromatisk sulfonsyre, f.eks. en eventuelt med lavalkyl, såsom methyl, halogen, såsom brom, og/el-ler nitro substitueret benzensulfonsyre, f.eks. en methan-sulfon-, trifluormethansulfon- eller p-toluensulfonsyre, 20 forestret hydroxy.

Fortrinsvis gennemføres reaktionen således, at man omsætter en 3-metaloxy-forbindelse med formlen III med en forbindelse 25 med formlen IV, hvori Z betyder en af de ovenfor beskrevne reaktionsdygtige forestrede hydroxygrupper. Endvidere kan man også omsætte en forbindelse med formlen III, hvori 3-hydroxy-gruppen foreligger på reaktionsdygtigt forestret form, med en forbindelse med formlen IV, hvori Z betyder metaloxy som 30 beskrevet ovenfor.

Fremgangsmåde b (S^^-reaktioner) : 35 Reaktionsdygtige carboxylsyrederivater af en forbindelse med formlen V er reaktionsdygtige estere, anhydrider eller amider.

O

DK 167193 B1 20

Aktiverede estere af syrer er især ved bindingscarbonatornet i den forestrende gruppe umættede estere, f.eks. af vinyl-estertypen, såsom egentlige vinylestere (som man f.eks. kan fremstille ved omestring af en tilsvarende ester med vinyl-5 acetat, den aktiverede vinylester-metode), carbamoylvinyl-estere (som man f.eks. kan fremstillé ved behandling af den tilsvarende syre med et isoxazoliumreagens, 1,2-oxazolium-eller Woodward-metoden), eller 1-lavalkoxyvinylestere (som man f.eks. kan fremstille ved behandling af den tilsvaren-10 de syre med et lavalkoxyacetylen, ethoxyacetylen-metoden) , eller estere af amidinotypen, såsom Ν,Ν'-disubstituerede amidinoestere (som man f.eks. kan fremstille ved behandling af den tilsvarende syre med et egnet N,N'-disubstitueret carbodiimid, f.eks. Ν,Ν'-dicyclohexylcarbodiimid, carbodiimid-15 metoden), eller Ν,Ν-disubstituerede amidinoestere (som man f.eks. kan fremstille ved behandling af den tilsvarende syre med et Ν,Ν-disubstitueret ayanamid, cyanamid-metoden) , egnede arylestere, især med elektrontiltrækkende substituen-ter passende substituerede phenylestere (som man f.eks. kan 20 fremstille ved behandling af den tilsvarende syre med en passende substitueret phenol, f.eks. 4-nitrophenol, 4-methyl-sulfonyl-phenol, 2,4,5-trichlorphenol, 2,3,4,5,6-pentachlor-phenol eller 4-phenyldiazophenol, i nærværende af et kondensationsmiddel, såsom N,N' -dicyclohexyl-carbodiimid, den akti-25 verede arylester-metode) , cyanmethylestere (som man f.eks. kan fremstille ved behandling af den tilsvarende syre med chloracetonitril i nærværelse af en base, cyanmethylestermetoden) , thioestere, især eventuelt, f.eks. med nitro, substituerede phenyl-thioestere (som man f.eks. kan fremstille 30 ved behandling den tilsvarende syre med eventuelt, f.eks. med nitro, substituerede thiophenoler, f.eks. ved hjælp af anhydrid- eller carbodiimid-metoden, den aktiverede thiol-ester-metode), eller amino- eller amidoestere (som man f.eks. kan fremstillede ved behandling af den tilsvarende syre med 35 en N-hydroxy-amino- eller N-hydroxy-amido-forbindelse, f.eks. N-hydroxy-succinimid, N-hydroxy-piperidin, N-hydroxy-phthal-

O

DK 167193 B1 21 imid eller 1-hydroxy-benztriazol, f.eks. ved anhydrid- eller carbodiimid-metoden, den aktiverede N-hydroxy-ester-metode) .

Reaktionsdygtige anhydrider kan være symmetriske eller for-5 trinsvis blandede anhydrider af disse syrer, som f.eks. anhydrider med uorganiske syrer, såsom syrehalogenider, især syrechlorider (som man f.eks. kan fremstille ved behandling af den tilsvarende syre med thionylchlorid, phosphorpenta-chlorid eller oxalylchlorid, syrechloridmetoden), azider (som 10 man f.eks. kan fremstille ud fra en tilsvarende syreester over det tilsvarende hydrazid og behandling af dette med salpetersyrling, azidmetoden) , anhydrider med kulsyrehalvderivater,, såsom med tilsvarende estere, f.eks. kulsyrelavalkyl-halvestere (som man f.eks. kan fremstille ved behandling af 15 den tilsvarende syre med halogen-, såsom chlormyresyre-lav- alkylestere eller med en l-lavalkoxycarbonyl-2-lavalkoxy-l,2-dihydro-quinolin, f.eks. l-lavalkoxycarbonyl-2-ethoxy-l,2-dihydroguinolin, den blandede O-alkyl-kulsyreanhydrid-metode) , eller anhydrider med dihalogeneret, især dichloreret phos-20 phorsyre (som man f.eks. kan fremstille ved behandling af den tilsvarende syre med phosphoroxychlorid, phosphoroxychlorid-metoden), eller anhydrider med organiske syrer, såsom blandede anhydrider med organiske carboxylsyrer (som man f.eks. kan fremstille ved behandling af den tilsvarende syre med et even-25 tuelt substitueret lavalkan- eller phenylalkancarboxylsyre-halogenid, f.eks. phenyleddikesyre-, pivalinsyre- eller tri-fluoreddikesyrechlorid, den blandede carboxylsyreanhydrid-metode) eller med organiske sulfonsyrer (som man f.eks. kan fremstille ved behandling af et salt, såsom et alkalimetal-30 salt, af den pågældende syre med et egnet organisk sulfon-syrehalogenid, såsom lavalkan- eller aryl-, f.eks. methan-eller p-toluensulfonsyrechlorid, den blandede sulfonsyre-anhydrid-metode), samt symmetriske anhydrider (som man f.eks. kan fremstille ved kondensation af den tilsvarende syre i 35 nærværelse af et carbodiimid eller af 1-diethylaminopropin, den symmetriske anhydrid-metode) .

O

DK 167193 B1 22

Egnede cycliske amider er især amider med femleddede diaza-cyliske forbindelser af aromatisk karakter, såsom amider med imidazoler, f.eks. imidazol (som man f.eks. kan fremstille ved behandling af den tilsvarende syre med Ν,Ν-carbonyldi-5 imidazol, imidazolid-metoden), eller pyrazoler, f.eks. 3,5-dimethyl-pyrazol (som man f.eks. kan fremstille over syre-hydrazidet ved behandling med acetylacetone, pyrazolid-meto-den.

10

Derivater af syrer med formlen V kan også dannes in situ. Således kan man f.eks. danne Ν,Ν'-disubstituerede amid-inoestere in situ, idet man omsætter blandingen af udgangsmaterialet med formlen VI og syren med formlen V i 15 nærværelse af et egnet N,Ν'-disubstitueret carbodiimid, f.eks. N,N’-dicyclohexylcarbodiimid. Endvidere kan man danne amino- eller amidoestere af syrer med formlen V i nærværelse af udgangsmaterialet med formlen VI, som skal acyleres, idet man omsætter blandingen af de tilsvarende 20 syre- og amino-udgangsstoffer i nærværelse, af et Ν,Ν'-di-substitueret carbodiimid, f.eks. N,N'-dicyclohexylcarbo-diimid, og en N-hydroxy-amin eller et N-hydroxy-amid, f.eks. N-hydroxysuccinimid, eventuelt i nærværelse af en egnet base, f.eks. 4-dimethylamino-pyridin.

25

Et derivat af forbindelsen med formlen VI, hvori den i reaktionen deltagende aminogruppe foreligger på reaktionsdygtig form, kan f.eks. fremstilles ved omsætning med et phosphit, såsom diethylchlorphosphit, ethylen-30 chlor-phosphit, 1,2-phenylen-chlor-phosphit, ethyl-di-chlor-phosphit eller tetraethylpyrophosphit. En reaktionsdygtig form af en forbindelse med formlen VI er f.eks. også et carbaminsyrehalogenid eller et isocyanat, idet den i reaktionen deltagende aminogruppe i en forbin-35 delse med formlen VI foreligger bundet til halogencarb-onyl, f.eks. chlorcarbonyl, eller foreligger som isocyan-atgruppe, idet i sidstnævnte tilfælde kun sådanne forbindelser med formlen I er tilgængelige, som bærer et hydro-

O

23 DK 167193 B1 genatom ved nitrogenatomet i den ved reaktionen dannede amidgruppe.

Fortrinsvis omsætter man et reaktionsdygtigt carboxylsy-5 rederivat af en forbindelse af formlen V med en forbindelse med formlen VI, hvori den i reaktionen deltagende amino- eller hydroxygruppe foreligger på fri form.

10 Eventuelt kan man også omsætte et salt, f.eks. et cæsiumsalt, af en forbindelse med formlen V, hvori g og r er 1, og s er 0, med en forbindelse med formlen VI, hvori X betyder oxygen, v er 1, og u og t er 0, idet den i reaktionen deltagende hydroxygruppe foreligger på reaktionsdygtig forestret 15 form.

Endelig kan man også omsætte en fri syre med formlen V med en forbindelse med formlen VI, hvori den i reaktionen deltagende gruppe foreligger på aktiveret form.

20

Acyleringen af en forbindelse med formlen VI eller et reaktionsdygtigt derivat deraf med en forbindelse med formlen V eller et reaktionsdygtigt syrederivat deraf kan gennemføres på i og for sig kendt måde, idet reaktionsbetingelserne i 25 første række afhænger af arten af det anvendte acylerings-middel, sædvanligvis i nærværelse af et egnet opløsningseller fortyndingsmiddel eller en blanding af sådanne og, om nødvendigt i nærværelse af et kondensationsmiddel, som f.eks. ved anvendelse af et anhydrid som acyleringsmiddel eventuelt 30 også kan være et syrebindende middel, under afkøling eller opvarmning, f.eks. i et temperaturområde på ca. -30 til ca. 150°C, i en lukket reaktionsbeholder og/eller i en indifferent gasatmosfære, f.eks. en nitrogenatmosfære.

35

O

DK 167193 B1 24

Udgangsforbindelserne med formlerne V og VI er kendte forbindelser eller kan fremstilles på i og for sig kendt måde, f.eks. analogt med de i denne beskrivelse beskrevne fremgangsmåder .

5

Fremgangsmåde c (phosphorsyrediester-dannelse):

Et reaktionsdygtigt phosphor syrederivat af en syre med form-10 len VII eller VIII er f.eks. et mono- eller bisanhydrid med en stærk syre, især en mineralsyre, såsom fortrinsvis en hydrogenhalogenidsyre, især hydrogenchloridsyre. Den anden sure. phosphorsyregruppe kan foreligge som sådan, som anhydrid som beskrevet ovenfor eller på forestret form, idet der som 15 forestrende grupper foretrækkes sådanne, som efter endt omsætning mellem forbindelserne med formlerne VII og VIII regio-selektivt atter kan fraspaltes, f.eks. methylestergruppen, der kan fraspaltes f.eks. ved basisk forsæbning, eller især hydrogenolytisk fraspaltelige grupper, f.eks. benzyl- eller 20 phenylestergrupper, idet benzylestergrupper f.eks. kan fraspaltes i nærværelse af palladiumkatalysatorer, såsom palladium på kul, og phenylestergrupper f.eks. i nærværelse af platin- eller blandede platin-palladium-katalysatorer.

25 Dannelsen af reaktionsdygtige phosphorsyrederivater kan også gennemføres in situ i nærværelse af forbindelser, som med phosphor syre eller dens monoestere er i stand til at indgå mindst intermediært reaktionsdygtige forbindelser med anhydrid- eller enolesteragtig karakter, f.eks. i nærværelse 30 af p-toluensulfonsyrechlorid, cyanurchlorid, N-alkyl-5-phenyl-isoxazoliumsalte, ethoxyacetyler eller fortrinsvis trichlor-acetonitril eller især et carbodiimid, såsom hovedsagelig dicyclohexylcarbodiimid. Eksempelvis kan man omsætte en phos-phorsyremonoester med formlerne VII eller VIII med overskud 35 af alkohol med formlerne VII eller VIII i nærværelse af den flerdobbelte, f.eks. femdobbelte, molære mængde dicyclohexylcarbodiimid i nærværelse eller fraværelse af én tertiær amin.

O

25 DK 167193 B1 Når de to sure grupper i en phosphorsyremonoester foreligger som anhydrid med en hydrogenhalogenidsyre, kan man først foruden triesteren også få phosphorsyrediester-halogenider, der derefter kan hydrolyseres til diestere med vand, med vandafgi-5 vende midler eller ved opvarmning med tertiære alkoholer, f.eks. tert-butanol eller tetrahydropyranol.

Når man går ud fra et phosphorsyremonoester-dihalogenid, f.eks. et phosphorsyremonoester-dichlorid, gennemfører man 10 fortrinsvis omsætningen i nærværelse af en tertiær amin, såsom pyridin, lutidin eller quinolin, idet en yderligere aktivering af esterchloridet fremkaldes ved hjælp af dimethyl-formamid.

15 En foretrukket udførelsesf om for fremgangsmåde c er omsætningen af et phosphorsyremonoester-dichlorid med den tilsvarende alkohol i nærværelse af en tertiær amin, efterfulgt af hydrolysen af det først dannede phosphorsyrediesterhalogenid.

20 Fremgangsmåde d (nukleofil substitution ved hjælp af phosphat) :

Reaktionsdygtige forestrede hydroxygrupper er de ved fremgangsmåde a anførte grupper, fortrinsvis chlorid, bromid eller iodid.

25

Som salte af forbindelserne med formlen VII eller VIII anvender man med henblik på den tilsigtede nukleofile substitut ions reaktion især reaktionsdygtige salte, f.eks. salte, såsom sølvsalte, som kan danne et tungtopløseligt bundfald 30 med den nukleofile fraspaltningsgruppe i reaktanten, f.eks.

en af de ovenfor anførte halogenidioner, eller salte med stor kation, f.eks. cæsiumsalte, hvori phosphatgruppens nukleofili-tet er forhøjet. Til forhøjelse af phosphatgruppens nukleo-filitet kan modionen også være rumligt fjernet, f.eks. ved 35 tilsætning af kompleksdannere, såsom kroneethere, f.eks.

18-krone-6. Ved anvendelse af 18-krone-6 kan man gennemføre reaktionen med et kaliumsalt.

O

DK 167193 B1 26

En foretrukket udførelsesform for fremgangsmåde d er omsætningen af sølvsaltet af en phosphorsyremonoester med formlen VII eller VIII, hvori den ene af de to sure grupper er beskyttet med en let fraspaltelig beskyttelsesgruppe, f.eks. en af 5 de ved fremgangsmåde c beskrevne, f.eks, som benzyl- eller phenylester, med en reaktionsdygtigt forestret alkohol med formlen VII eller VIII, hvori OH-gruppen er substitueret med chlor, brom eller iod. Efter endt omsætning fraspaltes beskyttelsesgruppen, f.eks. en benzyl- eller en phenylesterbe-10 skyttelsesgruppe ved hydrogenering som beskrevet ved fremgangsmåde c..

Fremgangsmåde e (forestrinq): 15 Reaktionsdygtige carboxylsyrederivater af en forbindelse med formlen IX er reaktionsdygtige estere, anhydrider eller amider analogt med de ved fremgangsmåde b beskrevne eller carb-oxylsyresalte.

20 Beskyttelsesgrupper er f.eks. de ovenfor anførte. Et reak-

O

tionsdygtigt derivat af en lavalkanol R -OH er f.eks. en sådant med, f.eks. som ovenfor beskrevet, reaktionsdygtigt forestret hydroxygruppe, f.eks. en af de nedenfor anførte forbindelser.

25

Fortrinsvis gennemføres omsætningen på den måde, at et carb-oxylsyresalt, f.eks. et cæsiumsalt, af en forbindelse med

O

formlen IX omsættes med lavalkanolen R -OH, hvori hydroxy-gruppen foreligger på reaktionsdygtigt forestret form. Even-30 tuelt kan man forestre et reaktionsdygtigt carboxylsyrederi-

Q

vat af en forbindelse med formlen IX med lavalkanolen R -OH med fri OH-gruppe.

Forestringen af frit carboxyl med den Ønskede alkohol fore-35 tages fortrinsvis i nærværelse af et egnet kondensationsmiddel. Almindelige kondensationsmidler er f.eks. carbodiimider, f.eks. N,Ν’-diethyl-, Ν,Ν'-dipropyl- N,Ν'-dicyclohexyl- eller N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, egnede carbo-

O

27 DK 167193 B1 nylforbindelse, f.eks. carbonyldiimidazol, eller 1,2-oxazolium-forbindelser, f.eks. 2-ethyl-5-phenyl-l,2-oxazolium-3'-sulfo-nat og 2-tert-butyl-5-methyl-isoxazoliuin-perchlorat, eller en egnet acylaminoforbindelse, f.eks. 2-ethoxy-l-ethoxycarbonyl-5 1,2-dihydro-quinolin. Kondensationsreaktionen gennemføres for trinsvis i et vandfrit reaktionsmedium, fortrinsvis i nærværelse af et opløsningsmiddel eller fortyndingsmiddel, f.eks. methylenchlorid, dimethylformamid, acetonitril eller tetra-hydrofuran, og, om nødvendigt, under afkøling eller opvarm-10 ning og/eller i en indifferent gasatmosfære.

Endvidere kan man omsætte en fri carboxylsyre med formlen IX

3 med .det reaktionsdygtige derivat af en lavalkanol R -OH. Egnede derivater af denne art er eksempelvis tilsvarende diazo-15 forbindelser, såsom eventuelt substituerede diazolavalkaner, f.eks. diazomethan, diazoethan, diazo-n-butan eller diphenyl-diazomethan. Disse reagenser anvendes i nærværelse af egnede indifferente opløsningsmidler, såsom et aliphatisk, cyclo-aliphatisk eller aromatisk carbonhydrid, f.eks. hexan, cyclo-20 hexan, benzen eller toluen, et halogeneret aliphatisk carbonhydrid, f.eks. methylenchlorid, eller en ether, såsom en dilavalkylether, f.eks. diethylether, eller en cyclisk ether, f.eks. tetrahydrofuran eller dioxan, eller en opløsningsmiddelblanding, og, afhængigt af diazoreagenset, under afkøling, 25 ved stuetemperatur eller under svag opvarmning, endvidere, om nødvendigt, i en lukket beholder og/eller under en indifferent gasatmosfære, f.eks. en nitrogenatmosfære.

Andre egnede midler til forestring af en carboxylgruppe i en 30 forbindelse med formlen IX er estere af tilsvarende alkoholer, i første række sådanne med stærke uorganiske eller organiske syrer, såsom mineralsyrer, f.eks. hydrogenhalogenidsyrer, såsom hydrogenchloridsyre, hydrogenbromidsyre eller hydrogen-iodidsyre, endvidere svovlsyre eller halogensvovlsyre, f.eks.

35 fluorsvovlsyre, eller stærke organiske sulfonsyrer, såsom eventuelt, f.eks. med halogen, såsom fluor, substituerede lav-alkansulfonsyrer, eller aromatiske sulfonsyrer, såsom f.eks. eventuelt med lavalkyl, såsom methyl, halogen, såsom brom,

O

DK 167193 B1 28 og/eller nitro substituerede benzensulfonsyrer, f.eks. methan-sulfonsyre/ trifluormethansulfonsyre eller p-toluensulfonsyre. Sådanne estere er bl.a. lavalkylhalogenider, dilavalkylsulfa-ter, såsom dimethylsulfat, endvidere fluorsulfonsyreestere, 5 såsom fluorsulfonsyrelavalkylestere, f.eks. fluorsulfonsyre-methylester, eller eventuelt halogensubstituerede methansul-fonsyrelavalkylestere, f.eks. trifluormethansulfonsyremethyl-ester. De anvendes sædvanligvis i nærværelse af et indifferent opløsningsmiddel,· såsom et eventuelt halogeneret, f.eks.

10 chloreret, aliphatisk, cycloaliphatisk eller aromatisk car- bonhydrid, f.eks. methylenchlorid, en ether, såsom dioxan eller tetrahydrofuran, eller en blanding deraf. Fortrinsvis anvendes egnede kondensationsmidler, såsom alkalimetalcarbona-ter eller -hydrogencarbonater, f.eks. natrium- eller kalium-15 carbonat eller -hydrogenearbonat (sædvanligvis sammen med et sulfat), eller organiske baser, såsom sædvanligvis sterisk hindrede trilavalkylaminer, f.eks. N,N-diisopropyl-N-ethyl-amin (fortrinsvis sammen med halogensulfonsyrelavalkylestere eller eventuelt halogensubstituerede methansulfonsyrelavalkyl-20 estere), idet omsætningen gennemføres under afkøling, ved stuetemperatur eller under opvarmning, f.eks. ved temperaturer fra ca. -20 til ca. 50°C, og, om nødvendigt, i en lukket beholder og/eller i en indifferent gasatmosfære, f.eks. en nitrogenatmosfære .

25

Andre midler til forestring af en carboxylgruppe i en forbindelse med formlen IX er tilsvarende trisubstituerede oxonium-salte (såkaldte Meerweinsalte) eller disubstituerede carbeni-um- eller haloniumsalte, hvori substituenterne er de for-30 ethrende grupper, eksempelvis trilavalkyloxoniumsalte, samt dilavalkoxycarbenium- eller dilavalkylhaloniumsalte, især de tilsvarende salte med komplekse fluorholdige syrer, såsom de tilsvarende tetrafluorborater, hexafluorphosphater, hexafluor-antimonater eller hexachlorantimonater. Sådanne reagenser er 35 29 DK 167193 B1

O

f.eks. trimethyloxonium- eller triethyloxonium-hexafluoranti-monat, -hexachlorantimonat, -hexafluorphosphat eller -tetra-fluorborat, dimethoxycarbeniumhexafluorphosphat eller dimethyl-bromoniumhexafluorantimonat. Disse forethringsmidler anvendes 5 fortrinsvis i et indifferent opløsningsmiddel, såsom en ether eller et halogeneret carbonhydrid, f.eks. diethylether, tetra-hydrofuran eller methylenchlorid, eller i en blanding deraf, om nødvendigt i nærværelse af en base, såsom en organisk base, f.eks. en, fortrinsvis sterisk hindret, trilavalkylamin, 10 f.eks. N,N-diisopropyl-N-ethyl-amin, og under afkøling, ved stuetemperatur eller under svag opvarmning, f.eks. ved en temperatur fra ca. -20 til ca. 50°C, om nødvendigt i en lukket beholder og/eller i en indifferent gasatmosfære, f.eks. en nitrogenatmosfære.

15

Fremgangsmåde f (oxidation):

Forbindelserne med formlen X foreligger i overvejende grad på den tautomere form, hvori en proton er bundet direkte til 20 phosphor. Oxidationen kan f.eks. gennemføres med vandig ka-liumpermanganat ved temperaturer omkring 0°C. I vandigt medium kan der som oxidationsmiddel også anvendes alkalimetal-iodater, -periodater og -hypochloriter, pereddikesyre,' N-chlor—4-methyl-benzen-sulfonsyreamid og andre.

25

Fremgangsmåde g ([furanose —> pyranose3-omdannelse);

Som beskyttelsesgrupper anvender man f.eks. de ovenfor anførte. Divalente hydroxybeskyttelsesgrupper er især eventuelt 30 substituerede alkyliden- eller cycloalkylidengrupper. Alky-liden er især lavalkyliden, såsom isopropyliden, og cyclo-alkyliden er i første række cyclopentyliden eller cyclohexy-liden. Som substituenter i alkylidengrupperne kan især nævnes aromatiske grupper, f.eks. phenylgrupper.

35 0 DK 167193 B1 30

Fraspaltningen af de nævnte beskyttelsesgrupper i almindelighed og fraspaltningen ifølge fremgangsmåde g i særdeleshed gennemføres på i og for sig kendt måde ved hjælp af solvolyse, især hydrolyse, alkoholyse eller acidolyse, eller i nogle 5 tilfælde også ved forsigtig reduktion, eventuelt trinvis eller samtidigt. Silylbeskyttelsesgrupper fraspaltes fordelagtigt med fluorider, f.eks. tetraethylammoniumfluorid.

Ved en særligt foretrukket udførelsesform for fremgangsmåde g 19 20

10 går man ud fra forbindelser med formlen XI, hvori R og R

sammen betyder en eventuelt substitueret alkyliden- eller 17 18 cycloalkylidengruppe, og R og R sammen betyder gruppen 2 ' R -C=N-. I dette tilfælde gennemføres spaltningen, der især er egnet til fremstilling af N-benzoyl-forbindelser med form-15 len I, med fortyndet syre, bedst ved en pH-værdi på 2-4, f.eks. 3, som enbeholderreaktion ligeledes på i og for sig kendt måde, f.eks. med en sur ionbytter, især en sur ionbytter med sulfonsyregrupper, såsom "Amberlite"® IR-120 (en styrenharpiks med stærkt sure sulfogrupper) eller "Dowex"®50 20 (polystyrensulfonsyrer) eller en stærk uorganisk eller organisk syre, såsom saltsyre, hydrogenbromidsyre, svovlsyre eller en sulfonsyre, f.eks. methansulfonsyre, eller en eventuelt i den aromatiske ring substitueret phenylsulfonsyre, såsom p-toluensulf onsyre, eller tri fluoreddikesyre. Når om-25 sætningen gennemføres i nærværelse af vand, fås en fri hydr-oxygruppe i 1-stillingen.

Fremgangsmåde h (fraspaltning af beskyttelsesgrupper) : 30 Fraspaltningen af beskyttelsesgrupper fra en forbindelse med formlen I gennemføres på samme måde som beskrevet ved fremgangsmåde g.

35 31 DK 167193 B1

O

Fremgangsmåde i (hydrolyse af phosphorsyrediester-halogenider) : I en forbindelse med formlen XII betyder A et halogen, såsom brom eller iod, i allerførste række dog chlor.

5

Hydrolysen gennemføres med vand eller et vandafgivende middel, fortrinsvis ved forhøjet temperatur, f.eks. mellem 30 og 95°C.

Udgangsstofferne kan eksempelvis fremstilles ved chlorering 10 af de tilsvarende phosphorsyrlingdiestere, f.eks. med frit chlor.

De til gennemførelsen af de ovenfor beskrevne fremgangsmåder nødvendige udgangsmaterialer er kendte forbindelser eller 15 hidtil ukendte forbindelser, som kan fremstilles på i og for sig kendt måde, f.eks. analogt med en af de ovenfor beskrevne fremgangsmåder.

Saltene af forbindelserne med formlen I dannes for det meste 20 ved oparbejdning, f.eks. ved dialyse mod en pufferopløsning med pH-værdi 7. De kan fremstilles på i og for sig kendt måde. Således kan man danne salte af forbindelser med formlen I f.eks. ved behandling med metalforbindelser, såsom alkalimetalsalte af egnede organiske carboxylsyrer, f.eks. natri-25 umsaltet af α-ethyl-capronsyre, eller med uorganiske alkalimetal- eller jordalkalimetalforbindelser, såsom tilsvarende hydroxider, carbonater og hydrogencarbonater, såsom natriumeller kaliumhydroxid, -carbonat eller -hydrogencarbonat, eller tilsvarende calciumforbindelser eller med ammoniak eller 30 egnede organiske aminer, idet der fortrinsvis anvendes støkiometriske mængder eller et lille overskud af det saltdan-ende middel.

35

O

DK 167193 B1 32

Blandinger af isomere kan adskilles på i og for sig kendt måde, f.eks. ved fraktioneret krystallisation, kromatografi, osv. i de enkelte isomere, racemater f.eks. under dannelse af derivater med optisk aktive forbindelser og adskillelse 5 af de således dannede diastereomereblandinger i de optisk aktive antipoer.

De ovenfor beskrevne fremgangsmåder, inklusive fremgangsmåderne til fraspaltning af beskyttelsesgrupper og de yderligere 10 foranstaltninger, gennemføres på i og for sig kendt måde, f.eks. i nærværelse eller fraværelse af opløsnings- eller fortyndingsmidler, om nødvendigt i nærværelse af kondensationsmidler eller katalysatorer, ved formindsket eller forhøjet temperatur, f.eks. i et temperaturområde på fra ca. -20 15 til ca. 150°C, i en lukket beholder og/eller i en indifferent gasatmosfære, f.eks. en nitrogenatmosfære.

Ved disse omsætninger skal der under hensyntagen til alle i molekylet forekommende substituenter om nødvendigt, f.eks.

20 ve(f[ tilstedeværelse af let hydrolyserbare grupper, anvendes særligt skånsomme reaktionsbetingelser, såsom korte reaktionstider, milde syrer eller basiske midler i lave koncentrationer, støkiometriske mængdeforhold, egnede katalysatorer, opløsningsmidler, temperatur- og/eller trykbetingelser.

25

Opfindelsen angår også sådanne udførelsesformer for fremgangsmåden, ved hvilken et udgangsmateriale dannes under reaktionsbetingelserne eller anvendes i form af et reaktionsdygtigt derivat eller salt. Man anvender fortrinsvis 30 sådanne udgangsforbindelser, som ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fører til de ovenfor beskrevne særligt foretrukne forbindelser.

Forbindelserne med formlen I eller deres salte kan anven-35 des i form af farmaceutiske præparater, som indeholder en farmakologisk virksom mængde aktivt stof, eventuelt sammen DK 167193 B1 33 o med farmaceutisk anvendelse bærestoffer, som er egnede til enteral, f.eks. oral eller rektal, eller parenteral indgift, og som kan være uorganiske eller organiske, faste eller flydende. Således anvender man tabletter eller gelatinekapsler, som indeholder det aktive stof sammen med

O

fortyndingsmidler, f.eks. lactose, dextrose, saccharose, mannitol, sorbitol, cellulose og/eller glycerol, og/eller smøremidler, f.eks. kiseljord, talkum, stearinsyre eller salte deraf, såsom magnesium- eller calciumstearat, og/eller 10 polyethylenglycol. Tabletter kan ligeledes indeholde bindemidler, f.eks. magnesiumaluminiumsilicat, stivelse, såsom majsstivelse, hvedestivelse eller risstivelse, gelatine, methylcellulose, natriumcarboxymethylcellulose og/eller poly-vinylpyrrolidon og, om ønsket, desintegreringsmidler, f.eks.

15 stivelse, agar, alginsyre eller et salt deraf, såsom natrium-alginat, og/eller bruseblandinger, eller adsorptionsmidler, farvestoffer, smagsstoffer og sødemidler. Endvidere kan man anvende de farmakologisk virksomme forbindelser i form af præparater til parenteral indgift eller i form af infusions-20 opløsninger. Sådanne opløsningsmidler er fortrinsvis isotoni-ske vandige opløsninger eller suspensioner, idet disse f.eks. ved lyofiliserede præparater, som indeholder det aktive stof alene eller sammen med et bæremateriale, f.eks. mannitol, kan fremstilles før brugen. De farmaceutiske præparater kan 25 være steriliserede og/eller indeholde hjælpestoffer, f.eks.

konserveringsmidler, stabiliseringsmidler, fugtemidler og/eller emulgeringsmidler, opløselighedsfremmende stoffer, salte til regulering af det osmotiske tryk og/eller puffere. De farmaceutiske præparater, som om ønsket kan indeholde andre 30 farmakologiske virksomme stoffer, såsom antibiotika, fremstilles på i og sig kendt måde, f.eks. ved anvendelse af konventionelle blandings-, granulerings-, dragérings-, opløsnings- eller lyofiliseringsfremgangsmåde, og de indeholder 35

O

DK 167193 B1 34 fra ca. 0,01% til 99%, især fra ca. 0,01% til ca. 10%, i første række mellem 0,1 og 5% af det aktive stof, idet en koncentration af aktivt stof under 1% er særligt egnet til topiske præparater.

5

Til profylakse og terapi af virusinfektioner er følgende topiske indgiftsformer særligt velegnede: cremer, salver eller pastaer med et indhold af aktivt stof på 0,001 til 1, især fra 0,01 til 0,1, f.eks. 0,05%, f.eks. salver til intranasal 10 applikation eller læbestifter, eller vandige opløsninger med et indhold af aktivt stof på fra 0,001 til 1, især 0,05 til 0,5, f.eks. 0,1% fortrinsvis isotoniske, sterile og fysiologisk forenelige opløsninger, f.eks. øjendråber, fortrinsvis i mikrobeholdere til én gangs anvendelse, eller spraypræparater 15 til anvendelse i mundhulen og svælget.

Særligt egnede farmaceutiske præparater er de i eksemplerne beskrevne.

20 Cremer er olie-i-vand-emulsioner, som indeholder mere end 50% vand. Som olieformige grundlag anvender man i første række fedtalkoholer, f.eks. lauryl-, cetyl- eller stearylalkohol, fedtsyrer, f.eks. palmitin- eller stearinsyre, flydende til faste voksarter, f.eks. isopropylmyristat, uldvoks eller bi-25 voks, og/eller carbonhydrider, f.eks. vaseline (petrolatum) eller paraffinolie. Som emulgatorer kan anvendes overfladeaktive stoffer med overvejende hydrofile egenskaber, såsom tilsvarende ikke-ionogene emulgatorer, f.eks. fedtsyreestere af polyalkoholer eller ethylenoxidaddukter afaf, såsom poly-30 glycerolfedtsyreestere eller polyoxyethylensorbitan-fedtsyre- estere (Tween"®), endvidere polyoxyethylen-fedtalkoholethere eller -fedtsyreestere, eller tilsvarende ioniske emulgatorer, såsom alkalimetalsalte af fedtalkoholsulfater, f.eks. natri umlaurylsulf at, natriumcetylsulfat eller natriumstearyl-35 sulfat, som man almindeligvis anvender i nærværelse af 35 DK 167193 B1

O

fedtalkoholer, f.eks. cetylalkohol eller stearylalkohol. Tilsætninger til vandfasen er bl.a. midler til forhindring af udtørring af cremen, f.eks. polyalkohol, såsom glycerol, sorbitol, propylenglycol og/eller polyethylenglycoler, end-5 videre konserveringsmidler, duftstoffer, osv.

Salver er vand-i-olie-emulsioner, som indeholder op til 70%, fortrinsvis dog fra ca. 20 til ca. 50% vand eller vandig fase. Som fedtfase anvendes i første række carbonhydrider, f.eks.

10 vaseline, paraffinolie og/eller hårde paraffiner, der til forbedring af vandbindingsevnen fortrinsvis indeholder egnede hydroxyforbindelser, såsom fedtalkoholer eller estere, f.eks. cetylalkohol eller uldvoksalkoholer, f.eks. uldvoks. Emulgatorer er tilsvarende lipofile stoffer, såsom sorbitan-fedtsyre-15 estere (Spans”®), f.eks. sorbitanoleat og/eller sorbitan- isostearat. Tilsætninger til vandfasen er f.eks. fugtigheds-bevarende midler, såsom polyalkoholer, f.eks. glycerol, propylenglycol, sorbitol og/eller polyethylenglycol, samt konserveringsmidler, duftstoffer, osv.

20

Fedtsalver er vandfri og indeholder som grundlag især carbon-hydrider, f.eks. paraffin, vaselin og/eller flydende paraffiner, endvidere naturlige eller partielsyntetiske fedtstoffer, f.eks. kokosfedtsyretriglycerid, eller fortrinsvis hær-25 dede olier, f.eks. hydrogeneret jordnødolie eller ricinusolie, endvidere fedtsyrepartialestere af glycerol, f.eks. glycerolmono- og -distearat, samt f.eks. de i sammenhæng med salverne anførte fedtalkoholer, som forøger vandoptagelses-evnen, emulgatorer og/eller tilsætningsstoffer.

30

Pastaer er cremer og salver med sekretabsorberende pudderbe-standdele, såsom metaloxider, f.eks. titandioxid eller zinkoxid, endvidere talkum og/eller aluminiumsilicater, som har til opgave at binde tilstedeværende fugtighed eller sekret.

35 DK 167193 B1 36

Skim afgives fra trykbeholdere og er på aerosolform foreliggende flydende olie-i-vand-emulsioner, hvor der som drivmiddel anvendes halogenerede carbonhydrider, f.eks. chlor-fluorlavalkaner, f.eks. dichlordifluormethari og dichlor-5 tetrafluorethan. Som oliefase anvendes bl.a. carbonhydrider, f.eks. paraffinolie, fedtalkoholer, f.eks. cetylalkohol, fedtsyreestere, f.eks. isopropylmyristat, og/eller andre voksarter. Som emulgatorer anvender man bl.a. blandinger af sådanne med overvejende hydrofile egenskaber, såsom poly-10 oxyethylensorbitanfedtsyreestere ("Tweens"®), og sådanne med overvejende lipofile egenskaber, såsom sorbitanfedtsyre-estere ("Spans"®). Dertil kommer de gængse tilsætningsstoffer, _såsom konserveringsmidler, osv.

Tinkturer og opløsninger indeholder for det meste et vandigt-15 ethanolisk grundlag, der bl.a. er tilsat polyalkoholer, f.eks. glycerol, glycoler, og/eller polyethylenglycol som fugtighedsbevarende midler til formindskelse af fordampningen og genfedtende stoffer, såsom fedtsyreestere med lave polyethylenglycoler, dvs. i vandig blanding opløselige lipo-20 file stoffer som erstatning for de fedtstoffer, som fjernes fra huden med ethanolet, og, om nødvendigt, andre hjælpemidler og tilsætningsmidler.

Fremstillingen af de topisk anvendelige farmaceutiske præparater gennemføres på i og for sig kendt måde, f.eks. ved 25 opløsning eller suspendering af det aktive stof i grundlaget eller om nødvendigt i en del deraf. Ved forarbejdning af det aktive stof som opløsning opløses dette i reglen inden emulgeringen i den ene af de to faser. Ved forarbejdning som suspension blandes det aktive stof efter emulgeringen med en 30 del af grundlaget, hvorpå det blandes med resten af præparat-bestanddelene.

Doseringen af det aktive stof afhænger af forskellige faktorer, såsom indgiftsmåden, arten af det pågældende individ, individets modstandskraft samt i afgørende grad af arten af 35 den sygdom, som skal behandles. Således ligger de daglige DK 167193 B1 37 indgiftsdoser ved oral applikation til varmblodede dyr eller mennesker med en legemsvægt på ca. 70 kg mellem ca. 0,0001 og 0,1 g, idet der til forhindring af metastasedannelse efter fjernelse af primærtumoren i første række anvendes en dose-5 ring på mindre end 0,001 g.

Til forebyggelse af virusinfektioner indgives en enkelt dosis på fra ca. 0,5 til ca. 50, fortrinsvis fra 25 til 15, f.eks.

7 mg aktivt stof til et varmblodet dyr eller menneske med en legemsvægt på ca. 70 kg. I perioder med forhøjet smittefare 10 gentages indgivelsen af denne dosis med 1-3 ugers mellemrum, f.eks. hveranden uge.

Den terapeutiske dosis til varmblodede dyr eller mennesker med en legemsvægt på ca. 70 kg ligger i tilfælde af en virusinfektion mellem 1 og 50 mg, fortrinsvis mellem 5 og 20 mg, 15 f.eks. ved 10 mg, især ved oral indgift. Doseringen ved intra-nasal indgift er op til en faktor 10 lavere. Efter behov gentages indgivelsen af hexopyranoseforbindelserne med formlen X med nogle dages mellemrum, f.eks. 1-3 dage, indtil der indtræder en bedring af sygdomsbilledet.

20 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nærmere i de efterfølgende eksempler 1-2 og 11-17. Rf-værdierne er bestemt under anvendelse af kiselgeltyndtlagsplader fra firmaet Merck, Forholdet mellem komponenterne i de anvendte elueringsmiddel-blandinger er angivet i rumfangsdele (r/r).

25 Eksempel 1.

3,60 g (5,66 mmol) N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre-(Ca)-n-butylester (0,6 mol I^O) og 0,88 g (7,54 mmol) N-hydroxy-succinimid opløses under omrøring i 20 ml af en blanding af chloroform og methanol (4:1) . Der tilsættes 1,60 g (7,54 mmol) 30 fast dicyclohexylcarbodiimid, hvorpå der i løbet af 4 timer ved stuetemperatur kontinuerligt og dråbevis tilsættes en opløsning af 3,7 g (4,72 mmol) L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn- DK 167193 B1 38 glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid-natriumsalt i 40 ml chloroform. Efter yderligere 1 time inddampes reaktionsopløsningen kraftigt på en rotationsfordamper, hvorefter der tilsættes 200 ml dioxan og lyofiliseres.

5 Råproduktet suspenderes i 100 ml chloroform, der tilsættes 600 ml ethylacetat, og hele blandingen omrøres i 1 time i et isbad. Det uopløselige dicyclohexylurinstof frafiltreres, og filtratet inddampes til tørhed. Remanensen renses på 700 g kiselgel 60 reneste (Merck, kornstørrelse: 70-230 mesh 10 ASTM) på en søjle med en diameter på 4,5 cm og en længde på 80 cm i systemet chloroformimethanol:vand = 70:30:5. Til dette formål opløses materialet i 14 ml elueringsmiddel, hvorefter det sættes på søjlen. Efter et forløb på 2 gange 500 ml blanding opsamles fraktoner på 10 ml. Det i fraktioner-15 ne 133-152 og 153-236 indeholdte materiale samles hver for sig og underkastes en diafiltrering. Ved hovedfraktionen går man frem på følgende måde: Materialet opløses i 300 ml dob-belt-destilleret vand, opvarmes kort til 40°C, og efter afkøling fjernes det uopløste dicyclohexylurinstof ved centri-20 fugering. Den ovenstående væske sættes til en dialysecelle (Amicon Corporation, Danvers, Massachussets, 01932 USA, model 402, ultrafilter PM 10/76 mm 0, inert, ikke-ionisk polymer på polysulfonbasis, gennemsnitsporestørrelse 10 Å) og dialyseres ved 507 kPa mod 1,5 liter dobbelt-destilleret vand, 25 0,5 liter phosphatpuffer/natriumchlorid (begge 0,1 molær, 1:1, pH-værdi = 7) og 1,5 liter vand til væsken er chloridfri.

Det indre dialysat (70 ml) sterilfiltreres gennem et milli-porefilter (0,2 y.) og lyofiliseres. Man får N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl-(C )-n-butylester-(C )-L-alanin-2-(1,2-

GC Y

30 dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy) -ethylamid-natriumsalt (3,4 mol H„0) i form af et farveløst pulver med ΛΛ _ ^ [a]D = +14 +1° (c = 0,44, vand), Rf = 0,37 (chloroform:methan-oljvand = 70:30:5) og Rf = 0,64 (ethylacetat:n-butanol:pyri-din:eddikesyre:vand = 42:21:21:6:10).

DK 167193 B1 39 C63H115°20N5PNa ’ 3,41 H2° (1381'63)

Beregnet: C 54,77 H 8,94 N 5,07 P 2,24 H20 4,71

Fundet: C 54,3 H 9,1 N 5,6 P 2,3 H20 4,7 C63H115°20N5PNa (1316,59) 5 Beregnet: Na 1,75

Fundet: Na 1,57

Udgangsmaterialet fremstilles på følgende måde: 5,5 g (8,1 mmol) 4,6-O-isopropyliden-N-acetyl-muramyl-L-alanyl- D-glutaminsyre-(C )-n-butylester-(C )-benzylester, opløst (x y 10 i 60 ml 60%'s eddikesyre, henstår natten over ved stuetemperatur. Den svagt gullige opløsning inddampes til ca. det halve rumfang på en rotationsfordamper ved 30°C, hvorefter der tilsættes 300 ml dioxan og lyofiliseres. 4,8 g (ca. 7,5 mmol) af råproduktet opløst i 100 ml af en blanding af dimethoxy-15 ethan og vand (9:1) tilsættes 0,8 g palladiumoxid-på-kul-katalysator (10%'s), og blandingen behandles med hydrogen i 4 timer. Katalysatoren frasuges, filtratet inddampes til tørhed, og remanensen renses ved 2 gange kromatografering på kiselgel 60 (Merck, 1:200, 10 og 5 ml fraktioner) i systemet 20 chloroform:methanol:vand = 70:30:5. Fraktionerne indeholdende produktet hældes sammen, og opløsningsmidlet fordampes. Råproduktet, som til dels foreligger i fom af natriumsaltet (fra kiselgel), opløses i 40 ml dobbeltdestilleret vand og sættes på en grundigt forrenset, stærkt sur ionbytter fDowex"® 25 50 W X8 50/100 mesh, H-form), og søjlen eftervaskes med i alt 100 ml dobbeltdestilleret vand. Eluatet filtreres gennem et millipore-filter (0,2 y) og lyofiliseres. Man får 3,7 g (69% af det teoretiske) N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamin« syre-(C^)-n-butylester som farveløst pulver, der indeholder 30 0,6 mol vand med [a]3^ = +45 +1° (c = 1,142 methanol),

Rf = 0,23 (chloroform:methanol:vand = 70:30:5) og Rf = 0,40 (n-butanol:eddikesyre:vand = 75:7,5:21).

Udgangsmaterialet fremstilles på følgende måde: DK 167193 B1 40 4,4 g (11 mmol) N-acetyl-4,6-O-isopropyliden-muraminsyre-natriumsalt (2,5 mmol/g) suspenderes i 60 ml absolut di-methylformamid. Under god omrøring tilsættes 4,4 g (11 mmol) 5 L-alanyl-D-glutaminsyre- (Ca) -n-butylester- (C^) -benzylester-hydrochlorid, 2,53 g (22 mmol) N-hydroxysuccinimid og derefter 2,5 g (12,1 mmol) dicyclohexylcarbodiimid, hvorpå blandingen omrøres ved stuetemperatur natten over. Til oparbejdning fortyndes suspensionen med 100 ml ethylacetat, 10 og efter omrøring i 1/2 ved 0°C frafiltreres det uopløste materiale (dicyclohexylurinstof, natriumchlorid) . Filtratet inddampes i høj vakuum ved 30°C, remanensen optages i 400 ml ethylacetat, og der ekstraheres med 10 gange 50 ml dobbelt-destilleret vand. Efter tørring af den organiske fase og 15 fordampning af opløsningsmidlet fås 5,6 g N-acetyl-4,6-0- isopropyliden-L-alanyl-D-glutaminsyre-(C )-n-butylester-(C ) -

α 20 o Y

benzylester som et amorft pulver med ; [a)D = ^ (c = 0,732, methanol),

Rf = 0,87 (chloroform:methanol:vand = 70:30:5) og 20 Rf = 0,83 (n-butanol:eddikesyre:vand = 75:7,5:21) .

Udgangsmaterialet fremstilles på følgende måde:

Til 5,6 g (12,1 mtnbl) N-tert-butyloxycarbonyl-L-alanyl-D-glut-aminsyre-(C )-n-butylester-(C )-benzylester, opløst i 20 ml

^ I

absolut ethylacetat, sættes dråbevis under god omrøring og 25 udelukkelse af fugtighed 50 ml 4,5 N HCl i absolut ethylacetat, og blandingen henstår i 1 time ved 0°C. Den gullige opløsning inddampes ved stuetemperatur til ca. 20 ml, hvorpå der tilsættes 150 ml dioxan og lyofiliseres. Man får 4,75 g (97% af det teoretiske) L-alanyl-D-glutaminsyre-(Ca)-n-butylester-30 (C^)-benzylester-hydrochlorid i form af en farveløs olie med [a]p® = +19 +1° (c = 0,313, methanol),

Rf = 0,58 (chloroform:methanol:vand = 70:30:5) og

Rf = 0,56 (ethylacetat: n-butanol :pyridin: vand = 42:21:6:10).

Udgangsproduktet fremstilles på følgende måde: DK 167193 B1 41

Til 8,5 g (25,8 mmol) D-glutaminsyre-(Ca)-n-butylester-(0γ)-benzylester-hydrochlorid og 7,4 g (25,8 mmol) N-tert-butyloxycarbonyl-L-alanin--N-hydroxysuccinimidester, opløst 5 i 150 ml absolut dimethylformamid, sættes 2,6 g (25,8 mmol) N-methyl-morpholin, og blandingen henstår i 20 timer ved stuetemperatur. Den klare gule opløsning inddampes i høj-vakuum ved 30°C, den halvfaste remanens optages i 500 ml ethylacetat, hvorefter der ekstraheres med 7 gange 50 ml 10 vand. Den organiske fase tørres over vandfrit natriumsulfat. Efter fordampning af ethylacetatet fås en remanens, som renses ved kromatografering på 600 g kiselgel 60 (Merck, kornstørrelse 70-230 mesh ASTM) i systemet chloroform:methanol = 98:2. Materialet indeholdt i fraktionerne 36-82 sam-15 les og tørres. Man får N-tert-butyloxycarbonyl-L-alanyl-D-glutaminsyre-(C )-n-butylester-(C )-benzylester i form af θ’ ΛΛ Y _ en farveløs olie med [a]^ = +7 + 1 (c = 0,315, dimethyl- formamid),

Rf = 0,73 (chloroform-isopropanol:eddiksyre = 70:8:2) og 20 Rf = 0,75 (n-butanol:eddikesyre:vand = 75:7,5:21).

Udgangsmaterialet fremstilles på følgende måde:

Til 11,0 g (30 mmol) N-tert-butyloxycarbonyl-D-glutaminsyre-(C)-n-butylester-(C )-benzylester, opløst i 25 ml absolut

et Y

ethylacetat, sættes i kulden og under omrøring og udelukkel-25 se af fugtighed 25 ml 4 N HC1 i absolut ethylacetat, og blandingen henstår i 1 time. De letflygtige bestanddele fordampes ved 25°C, den olieformige remanens optages i 150 ml absolut diethylether, og opløsningen inddampes atter. Dette gentages 3 gange. Den olieformige remanens tørres over natron-30 asbest i halvvakuum. Man får D-glutaminsyre-(C )-n-butylester-

O Λ O

(Cy)-benzylester-hydrochlorid med [a]^ = -9 + 1° (c = 0,646, methanol).

Rf = 0,82 (chloroform:methanol:vand = 70:30:5) og

Rf = 0,68 (ethylacetat:n-butanol:pyridin:eddikesyre:vand = 35 42:21:21:6:10).

Udgangsmaterialet fremstilles på følgende måde: DK 167193 B1 42 20,0 g (64,6 mmol) N-tert-butyloxycarbonyl-D-glutaminsyre-(C^)-benzylester opløses i 750 ml absolut tétrahydrofuran, der tilsættes 21,05 g (64,6 mmol) cæsiumcarbonat (Fluka, 5 purum), opløst i 80 ml vand, hvorefter blandingen inddampes ved vandstrålevakuum til tørhed. Remanensen optages i 200 ml absolut dimethylformamid, opløsningsmidlet fordampes, og denne operation gentages. Den efter tørring i højvakuum fremkomne krystallinske remanens opløses i 1 liter absolut di-10 methylformamid, og der tilsættes dråbevis under omrøring 13,3 g (97 mmol) n-butylbromid. Den efter 18 timers omrøring ved stuetemperatur dannede suspension filtreres, filtratet inddampes til det halve rumfang, hvorefter der tilsættes 1 liter ethylacetat og ekstraheres grundigt med 10 15 gange 100 ml vand. Den organiske fase tørres over natriumsulfat og inddampes. Den olieformige remanens optages i 100 ml diethylether og bringes til krystallisation ved tilsætning af 1800 ml petroleumsether og henstand ved -10°C. Krystalmassen frasuges, vaskes og tørres. Man får N-tert-butyloxycarbo-20 ny 1-D-glutaminsyre-(Ca)-n-butylester-(C^)-benzylester i form af farveløse nåle med smp. 70-71°C, [a]j^ = 20 + 1° (c = 1,149, methanol) ,

Rf = 0,77 (chloroform:isopropanol:eddikesyre = 30:8:2) og Rf = 0,92 (ethylacetat:n-butanol:pyridin:eddikesyre:vand = 25 42:21:21:6:10), hvis fremstilling kort er beskrevet af P.Lefrancier og E.Lederer, Fortschritte d. Chem. org. Naturst. 40, 1-47, side 13 (1980) .

Det som udgangsmateriale anvendte L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-30 sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy) -ethylamid fremstilles på følgende måde: 13,25 g (14,9 mmol) N-tert-butyloxycarbonyl-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy) -ethylamid sættes under omrøring til 170 ml af en til 0°C afkølet bian- DK 167193 B1 43 ding af trifluoreddikesyre og methylenchlorid (1:3) (r/r), hvorved der dannes en klar opløsning. Efter 2 1/2 times henstand ved stuetemperatur inddampes reaktionsopløsningen ved 30°C på en rotationsfordamper. Til den halvfaste remanens 5 sættes til fjernelse af overskud af trifluoreddikesyre flere portioner på 100 ml methylenchlorid, og der foretages ind-dampning for hver tilsætning. Efter udrivning af remanensen med 5 gange 100 ml absolut diethylether og dekantering af den ovenstående væske får man en let filtrerbar suspension.

10 Suspensionen sugefiltreres, det faste materiale vaskes først med diethylether, derpå med 2 gange 100 ml varmt acetone, hvorefter det tørres ved vandstrålevakuum ved 60-70°C. Man får 10,9 g L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxy-phosphoryloxy)-ethylamid i form af farveløse krystaller med 15 smp. 138-147°C, [<x]p° = +30 + 1° (c = 1, chloroform:methanol:vand = 70:30:5),

Rf = 0,14 (chloroform:methanol = 7:3) og

Rf = 0,40 (chloroform:methanol:vand = 70:30:5) .

Det således fremstillede produkt omdannes til natriumsaltet 20 på følgende måde: 3,82 g (5 mmol) L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid opløses i 100 ml af en blanding af chloroform og methanol (7:3) ved kortvarig opvarmning til 35°C. Opløsningen afkøles, og der tilsættes dråbevis forsig-25 tigt 5 ml 1 N natriumhydroxidopløsning. Den klare opløsning inddampes til ca. 1/3 af det oprindelige rumfang, og efter tilsætning af 200 ml dioxan foretages lyofilisering. Man får L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphory 1-oxy)-ethylamid-natriumsalt som et løst pulver.

30 Eksempel 2.

Analogt med den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde fremstilles de i eksemplerne 3-10 anførte forbindelser samt følgende forbindelser: DK 167193 B1 44 N-Acetyl-muramyl-N-methyl-L-alanyl-D-glutamyl- (Ca) -ethyl-ester- (<Ζγ) -L-alanin-2- (l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxy-phosphoryloxy) -ethylamid-natriumsalt, N-acetyl-desmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (C^) -methyl-5 ester-(C^)-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxy-phosphoryloxy) -ethy lamid-natriumsalt, N-acetyl-muramyl-L-seryl-D-glutamyl- (C^) -n-butylester- (C ) -L-alanin-2- (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryl-oxy)) -ethylamid-natriumsalt, 10 N-acetyl-muramyl-L-cysteinyl-D-glutamyl- (Ca) -n-butylester-(C )-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphos-phoryloxy) -ethylamid-natriumsalt, N-acetyl-muramyl-L-methionyl-D-glutamyl- (Ca) -n-butylester-(C )-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphos-15 phoryloxy) -ethylamid-natriumsalt, N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (Ca) -n-butylester- (C^) -L-alanin-2-(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryl-oxy)-ethylamid-natriumsalt, N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (C ) -n-butylester- (C ) - ** i 20 L-alanin-2-{1,2-distearoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryl-oxy)-ethylamid-natriumsalt, N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamyl-(C )-n-butylester-(C ) -

CC Y

L-alanin-2-(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid-natriumsalt, 25 N-benzoyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (C ) -n-butylester- (C ) - u* i L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryl-oxy)-ethylamid-natriumsalt, N-glycolyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (C^) -n-butylester-(C^)-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphos-30 phoryloxy) -ethylamid-natriumsalt og N-acetyl-1,4,6-0-triacetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (Ca) -n-butylester-(C^)-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy) -ethylamid-natriumsalt.

Eksempel 3.

DK 167193 B1 45 Øjendråber

Sammensætning N-Acetyl-muramyl-L-a-aminobutyryl-D-glutamyl-5 (C )-n-butylester-(C )-L-alanin-2-(1,2-dipal-

M· I

mitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)- ethylamid-natriumsalt (forbindelse II) 0,10 mg

Borsyre 30,00 mg

Natriumtetraborat -lOI^O 0,10 mg 10 Benzalkoniumchlorid 0,20 mg

Vand til injektion ad 1,0 ml

Fremstilling I en del af den ovenfor anførte mængde vand til injektionsbrug opløses under aseptiske betingelser og under omrøring i 15 borsyre, natriumtetraborat og benzalkoniumchlorid ved stuetemperatur. Derefter opløses forbindelse II i den således fremstillede opløsning, og der tilsættes vand til injektionsbrug til et slutrumfang på 1,0 ml.

Opløsningen eller en del eller et multiplum deraf filtreres 20 gennem et membranfilter og fyldes på en renset beholder.

Egnede beholdere er f.eks.

- beholdere af fleksibelt kunststof (å 5 ml eller 10 ml) med dråbeindsats, - beholder af glas (å 5 ml eller 10 ml) med dråbepipette af 25 glas eller kunststof og en elastomer pipettesuger eller - plasténgangsdosispipetter (indhold 1-2 dråber).

DK 167193 B1 46

Eksempel 4.

Ikke-vandig enkeltdosis til næseapplikation Sammensætning N-Propionyl-desmethyl-muramyl-L-alanyl-D-glut-5 amyl-(Ca)-n-butylester-(0γ)-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryl-oxy)-ethylamid-natriumsalt (forbindelse III) 0,03 mg

Miglyol 812 ad 30,00 mg

Fremstilling 10 0,03 mg forbindelse III opløses under aseptiske betingelser i 29,97 mg Miglyol 812.

Denne opløsning fyldes i en almindelig éngangsnæseapplikator, f.eks. en applikator som beskrevet i US-patentskrift nr. 3.739.951, som inden anvendelsen anbringes på en drivmiddel-15 dåse.

Eksempel 5.

Næsedråber

Sammensætning I II

N-Acetyl-muramyl-L-valyl-D-glutamyl- 20 (C )-n-butylester-(C )-L-alanin-2- ct y (I,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxy-phosphoryloxy) -ethylamid-natriumsalt (forbindelse IV) 1,15 mg 0,10 mg

Thiomersal 0,02 mg 25 Natriummonohydrogenphosphat*2^0 0,30 mg 0,30 mg

Natriumdihydrogenphosphat-12^0 10,10 mg 10,10 mg

Benzalkoniumchlorid — 0,10 mg

Ethylendiamintetraeddikesyre-dinatri- umsalt (EDTA) 0,50 mg- 0,50 mg DK 167193 B1 47

I II

Natriumchlorid 3,70 mg 4,50 mg

Demineraliseret vand 988,30 mg 987,60 mg pH-værdi: 5,0+0/3 5,0+0,3

5 Frysepunktsænkning At -0,51°C -0,56°C

Fremstilling I en del af den ovenfor anførte mængde demineraliseret vand opløses under omrøring natriumdihydrogenphosphat, dinatrium-hydrogenphosphat, natriumchlorid, thiomersal og EDTA-dinatri-10 umsalt ved stuetemperatur.

I denne opløsning opløser man derefter forbindelse IV, hvorefter den resterende mængde demineraliseret vand tilsættes.

Opløsningen eller en del eller et multiplum deraf filtreres gennem et membranfilter og fyldes på en renses beholder. Eg-15 nede beholdere er f.eks.

a) glas eller kunststofbeholdere (å 5 ml eller 10 ml), som er forsynet med en pipette af glas eller kunststof med en elastomer pipettesuger, b) deformerbare kunststofflasker med et stigrør og et sprøjte- 20 hoved af kunststof, c) enkeltdosisbeholdere af kunststof (indhold 2-3 dråber) eller d) glas eller kunststofflasker, som er forsynet med en normeret pumpedoseringssprøjte af kunststof (uden drivgas).

DK 167193 B1 48

Eksempel 6.

Gel S ammens ætn ing N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (Ca) -5 n-butylester-(C^)-L-alanin-2-(1,2-dilauroyl- sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy) -ethylamid-natriumsalt (forbindelse V) 0/01 g

Glycerol 85% 10,00 g

Metfcylparaben 0,12 g 10 Propylparaben 0,03 g

Natriumcarboxylmethylcellulose (høj viskositet) 2,50 g

Demineraliseret vand 87,34 g

Fremstilling

Methyl- og propylparaben opløses i en del af det varme de-15 mineraliserede vand. Derefter indarbejdes natriumcarboxymethyl-cellulosen under kraftig omrøring i den dannede opløsning. Slimet kvældes under omrøring. Efter afkølingen tilsættes glycerolet og en opløsning af det aktive stof (forbindelse V) i resten af vandet.

20 Eksempel 7.

Creme

Sammensætning N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (Ca) -n-butylester-(Ογ)-L-alanin-2-(1-palmitoyl-25 2-oleoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy) - ethylamid-natriumsalt (forbindelse VI) 0,10 g

Sorbitanmonostearat 0,60 g

Cetylalkohol 3,00 g

Isopropylpalmitat 2,00 g 30 Methylparaben 0,12 g DK 167193 B1 49

Paraffinolie, tyktflydende 10,00 g PEG (20)-Sorbitanmonostearat 4,40 g

Propylparaben 0,03 g 70%'s opløsning af krystallinsk sorbitol i 5 demineraliseret vand 6,00 g

Stearinsyre 9,00 g

Demineraliseret vand 64,67 g

Fremstilling

Fedtfasen bestående af sorbitanmonostearat, cetylalkohol, 10 stearinsyre, PEG (20)-sorbitanmonostearat, isopropylpalmitat og paraffinolie sammensmeltes. Derefter opløses methyl- og propylparaben i en del af det varme demineraliserede vand. Sorbitolopløsningen sættes til vandfasen. Ved ca. 75°C sættes derefter vandfasen under omrøring til fedtfasen. Creme-15 grundlaget henstår derefter til afkøling under omrøring.

Ved ca. 40°C tilsættes en opløsning af det aktive stof (forbindelse VI) i den resterende mængde vand til cremegrundlaget.

Eksempel 8.

Næsesalve 20 Sammensætning N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (CQ) -methylester-(C^)-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero- 3 -hydroxypho sphoryloxy) -ethy lamid-natriumsalt (forbindelse VII) 0,03 g 25 Paraffinolie, tyktflydende 20,00 g

Hvid vaseline 30,00 g

Uldfedt, vandfrit 40,00 g

Demineraliseret vand 19,97 g

Fremstilling 30 Fedtfasen bestående af paraffinolie, vaseline·og uldfedt sam- DK 167193 B1 50 mensmeltes. Den vandige opløsning af det aktive stof indarbejdes i fedtfasen ved ca. 50°C.

Eksempel 9.

Hudsalve 5 Sammensætning N-Propionyl-desmethylmuramyl-L-alanyl-D-glut-amyl-(c )-n-butylester- (C )-glycin-2-(1,2-di-

u I

palmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy) -ethylamid-natriumsalt (forbindelse VIII) 0,25 g 10 Sorbitansesquioleat 10,00 g

Hvidt bivoks 5,00 g

Cetylalkohol 2,50 g

Methylparaben 0,15 g

Paraffinolie, tyktflydende 20,00 g 15 Propylparaben 0,02 g

Stearylalkohol 2,50 g

Hvid vaseline 40,00 g

Demineraliseret vand 19,58 g

Fremstilling 20 Fedtfasen bestående af sorbitansesquioleat, hvidt bivoks, cetylalkohol, paraffinolie, stearylalkohol og hvid vaseline sammensmeltes. Derefter opløses methyl- og propylparaben varmt i størsteparten af vandet. Ved ca. 80°C indarbejdes vandfasen i fedtfasen. Ved ca. 40°C tilsættes en opløsning 25 af det aktive stof (forbindelse VIII) i den resterende mængde vand til det således fremstillede salvegrundlag.

Eksempel 10.

DK 167193 B1 51 Læbestift

Sammensætning N-Acetyl-muramyl-N-methyl-L-alanyl-D-glutamyl- 5 (C )-n-butylester-(C ) -L-alanin-2-(1,2-dipalmit-— y oyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy) -ethylamid-natriumsalt (forbindelse IX) 1,00 g

Polyethylenglycol med gennemsnitsmolekylvægt 400 15,00 g

Polyethylenglycol med gennemsnitsmolekylvægt 1000 83,00 g 10 Polyethylenglycol med gennemsnitsmolekylvægt 4000 1,00 g

Fremstilling

Det aktive stof finfordeles i polyethylenglycolsmelten. Den sejtflydende smelte hældes i et egnet stifthylster og henstilles til størkning.

15 Eksempel 11.

3,50 g (6,9 mmol) N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre-(Ca)-methylester og 1,20 g N-hydroxysuccinimid opløses i 50 ml af en blanding af dimethylformamid, isopropanol og chloroform (1:3:6, r/r), der tilsættes 2,10 g (19,35 mmol) 20 dicyclohexylcarbodiimid, hvorefter blandingen omrøres under udelukkelse af fugtighed i 1 time ved stuetemperatur. Til suspensionen sættes 50 ml ethylacetat, hvorefter der omrøres i 30 minutter i isbad, og det uopløselige dicyclohexylurin-stof frafiltreres. Filtratet inddampes til ca. 40 ml på en 25 rotationsfordamper, hvorefter den aktive ester udfældes 2 gange ved tilsætning af 150 ml absolut diethylether, frafiltre-res og tørres, hvorved man får esteren med N-hydroxysuccinimid med Rf = 0,43 (chloroform:methanol:vand = 70:30:5) .

3,43 g (4,4 mmol) L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-30 hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid suspenderes i-45 ml chloroform og sættes dråbevis ved 40°C til 0,86 ml (6,1 mmol) tri- DK 167193 B1 52 ethylamin opløst i 5 ml chloroform i løbet af 5 minutter, hvorved der dannes en klar opløsning. Til denne sættes dråbevis under kraftig omrøring og under udelukkelse af fugtighed i løbet af 5 minutter en opløsning af den oven-5 for beskrevne aktive ester i 100 ml af en blanding af dimethylformamid, chloroform og dioxan (1:14:6, r/r). Efter 2 1/2 times omrøring ved stuetemperatur inddampes den let uklare opløsning på en rotationsfordamper (30°C) til tørhed. Råproduktet renses på kiselgel 60, reneste kvalitet, Merck, 10 kornstørrelse 70-230 mesh ASTM, i systemet chloroform: methanol:vand =70:30:5 (5 ml fraktioner). Fraktionerne (DC) indeholdende produktet hældes sammen. Efter fordampning af opløsningsmidlet fås en remanens, som opløses i 250 ml dob-belt-destilleret vand og renses analogt med den i eksempel 1 15 beskrevne fremgangsmåde ved diafiltrering (AMICON-rørecelle, type 402, ultrafilter PM 30/76 mm 0). Den i cellen tilbageblevne opløsning filtreres gennem et millipore-filter (0,2 μ) og lyofiliseres. Man får N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glut-amyl-(C )-methylester-(C )-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-

\X I

20 glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid-natriumsalt*2,96 mmol H2O i form af et farveløst pulver med [α]^ = +11 +1° (c = 0,285, 10%rs eddikesyre), Rf = 0,25 (chloroform:methanol:vand -70:30:5) og Rf = 0,39 (ethylacetat:n-butanol:pyridin:eddike-syre:vand = 42:21:21:6:10).

25 Udgangsforbindelsen fremstilles på følgende måde: 7,7 g (21,2 mmol) L-alanyl-D-glutaminsyre-(C^)-methylester-(0γ)-benzylester-hydrochlorid og 8,96 g (23,3 mmol) N-acetyl- 4,6-O-isopropyliden-muraminsyre-natriumsalt omsættes som beskrevet i eksempel 1 under anvendelse af dicyclohexylcarbo-30 diimid/N-hydroxysuccinimid-metoden. Råproduktet spaltes uden yderligere rensning i 100 ml 60%'s eddikesyre. Efter omrøring i 5 1/2 time ved stuetemperatur inddampes opløsningen kraftigt, hvorefter der tilsættes vand, hvorpå opløsningen atter inddampes kraftigt, og efter tilsætning af 100 ml dioxan fore-35 tages lyofilisering. Remanensen renses på 600 g kiselgel 60 DK 167193 B1 53 i systemet chloroform:methanol:vand = 70:30:5 (7 ml fraktioner) (2 gange).

Fraktionerne indeholdende det ønskede materiale hældes sammen/ og opløsningsmidlet fordampes. Som remanens fås 5 N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre-(Ca)-methylester-(C^)-benzylester i form af et farveløst skum med Rf = 0,63 (chloroform:methanol:vand = 70:30:5).

6/0 g (10 mmol) N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre-(c )-methylester-(C )-benzylester, opløst i en blanding af

^ I

10 l/2-dimethoxyethan og vand (95:5) (r/r), hydrogeneres i nærværelse af 0,6 g palladium-på-kul~katalysator (10%'s) i I 1/2 time ved normaltryk. Katalysatoren frafiltreres, og filtratet inddampes under formindsket tryk ved stuetemperatur. Remanensen renses på 400 g kiselgel 60 i systemet chloro- 15 form:methanol:vand = 70:30:5 (10 ml fraktioner) som beskrevet ovenfor. Fraktionerne, som indeholder produktet, hældes sammen, og opløsningsmidlet fordampes. Remanensen, der delvis foreligger i form af Na-saltet, afsaltes på samme måde som beskrevet i eksempel 1 med 50 ml "Dowex"® ‘50 W X8 (50/100 20 mesh, Η-form, stærk sur kationbytter). Filtratet filtreres gennem et millipore-filter (0,45 y) og lyofiliseres. Man får N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre- (C ) -methyl- α 20 ester (1,27 mol 1^0) som farveløst pulver med [a]^ = +47 + 1° (c = 1,249, methanol), 25 Rf = 0,08 (chloroform:methanol:vand = 70:30:5),

Rf = 0,30 (acetonitril:vand = 3:1) og

Rf = 0,43 (ethylacetat:eddikesyre:vand:methanol = 67:10:23:12) .

Eksempel 12.

9,4 g (11,1 mmol) N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre-30 (C )-tert-butylester omdannes analogt med den i eksempel 11 beskrevne fremgangsmåde til den aktive ester, som derpå omsættes med 6,48 g (8,2 mmol) L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethyl-amid på-den i eksempel II beskrevne måde i nærværelse af triethylamin. Råproduktet DK 167193 B1 54 suspenderes i 250 ml dobbeltdestilieret vand og opvarmes kortvarigt til 37°C. Blandingen omrøres i 15 minutter i isbad, det uopløselige dicyclohexylurinstof frafiltreres, og filtratet underkastes diafiltrering som beskrevet i eksem-5 pel 1 (AMICON-rørecelle 402, ultrafilter PM 30/76 mm 0).

Den i cellen tilbageblevne opløsning (120 ml) lyofiliseres, og produktet kromatograferes på sædvanlig måde på 550 g kiselgel 60. Det ønskede materiale samles, opløses i 200 ml dobbeltdestilleret vand (pH-værdi 7), sterilfiltreres 10 (0,45 y) og lyofiliseres. Man får N-acetyl-muramyl-L-alanyl- D-glutamyl-(C )-tert-butylester-(C )-L-alanin-2- (1,2-dipal-α i mitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid-natrium-salt i form af et farveløst pulver indeholdende 3,4 mol vand og med [a]^ = +14 +1° (c = 0,817, 10%'s eddikesyre), 15 Rf = 0,29 (chloroform:methanol:vand = 70:30:5) og

Rf = 0,53 (ethylacetat:n-butanol:pyridin:eddikesyre:vand = 42:21:21:6:10).

Det som udgangsmateriale anvendte muramyldipeptidderivat fremstilles analogt med den i eksempel 1 beskrevne fremgangs-20 måde ved omsætning af N-acetyl-4,6-O-isopropyliden-muramin-syre-natriumsalt og L-alanyl-D-glutaminsyre-(Ca)-tert-butylester- (0γ) -benzylester under anvendelse af dicyclohexylcarbo-diimid/N-hydroxysuccinimid-metoden. Efter sur fraspaltning af isopropylidengruppen med 60%'s eddikesyre og efter fjer-25 nelse af benzylgruppen ved katalytisk hydrogenering analogt med den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde får man N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre-(C )-tert-butylester i form O Λ af farveløst pulver med [a]p = +44 + 1° (c = 1,004, methanol), Rf = 0,20 (chloroform:methanol:vand = 70:30:5) og 30 Rf = 0,41 (acetonitril:vand = 3:1).

Det som udgangsmateriale anvendte dipeptidderivat fremstilles på følgende måde: 38,3 g (63,5 mmol) N-[2-(4-biphenylyl)-propyloxycarbonyl]-L-alanyl-D-glutaminsyre-(C ) -tert-butylester-(c -)-benzylester CL Ύ DK 167193 B1 55 opløses i 700 ml af en blanding af trifluorethanol og vand (9:1) (r/r), og ved dråbevis tilsætning af 1,23 N saltsyre i samme opløsningsmiddel (1 rumfangsdel koncentreret saltsyre og 9 rumfangsdele trifluorethanol) sænkes "pH"-værdien 5 til 1,5 (2 1/2 time, forbrug 51,66 ml, dvs. 81% af det teoretiske) . Den svagt gullige opløsning inddampes til knapt 100 ml på en rotations fordamper i vands trå levakuum ved 30°C, hvorefter der tilsættes 200 ml dioxan, og blandingen frysetørres. Den halvfaste remanens optages i 30 ml absolut di-10 ethylether, og der foretages udfældning ved 0-5°C ved tilsætning af 150 ml petroleumsether under omrøring. Blandingen henstår i kulden (-20°C), dekanteres, og dette gentages 2 gange. Den olieformige remanens optages til sidst i 100 ml tert-butanol, lyofiliseres, og remanensen tørres over natron-15 asbest (Merck) i højvakuum.

Man får L-alanyl-D-glutaminsyre-(C )-tert-butylester-(C )-

Ct j benzylester-hydrochlorid som et stærkt hygroskopisk pulver med [a]p° = +7 + 1° (c = 1,630, chloroform),

Rf = 0,60 (chloroform:methanol:vand = 70:30:5) og 20 Rf = 0,45 (n-butanol:eddikesyre:vand = 10:1:2,8).

Den beskyttede forbindelse fremstilles på følgende måde:

Til en til 0°C afkølet opløsning af 65,96 g (0,2 mol) D-glut-

aminsyre-(C )-tert-butylester-(C )-benzylester-hydrochlorid Ct Y

og 65,47 g (0,2 mol) N-[2-(4-biphenylyl)-propyloxycarbonyl]-25 L-alanin i 650 ml absolut dimethylformamid sættes under omrøring 22 ml (0,24 mol) N-methylmorpholin og til sidst 59,11 g (0,24 mol) 2-ethoxy-N-ethoxycarbonyl-l,2-dihydro-quinolin (EEDQ). Efter omrøring i 10 timer ved stuetemperatur inddampes den gule opløsning på en rotationsfordamper ved 30°C.

30 Remanensen optages i 1 liter ethylacetat, ekstraheres med 5 gange 200 ml vand, vandfasen reekstraheres med 0,5 liter ethylacetat, og de sammenblandede organiske faser tørres.

Det efter fordampning af opløsningsmidlet fremkomne råprodukt (150 g) renses ved kromatografering flere gange på 35 kiselgel 60 (1:20) med ethylacetat. Man får N-[2-(4-biphenyl- DK 167193 B1 56 yl) -propyloxycarbonyl-L-alanyl-D-glutaminsyre- (c ) -tert-butylester-(C^)-benzylester i form af en farveløs olie med [a]j^ = -14 + 1° (c = 1,625, ethylacetat) ,

Rf = 0,73 (chloroform:isopropanol:eddikesyre' = 70:8:2) og 5 Rf = 0,51 (toluen:ethylacetat = 1:1).

Det som udgangsmateriale anvendte D-glutaminsyre-(C^)-tert-butylester- (<2γ) -benzylester-hydrochlorid fremstilles på samme måde som det i litteraturen beskrevne L-derivat [R.Roeske, J.Org.Chem. 2J3, 1251 (1963)] ved omsætning af 10 D-glutaminsyre-(C^)-benzylester med isobuten i en blanding af 1,4-dioxan og svovlsyre i form af farveløse nåle med smp. 108-109°C, [a]^° = -16 +1° (c = 1,235, ethanol),

Rf = 0,84 (chloroform:methanol:vand = 70:30:5) og

Rf = 0,64 (ethylacetat-n-butanol:pyridin:eddikesyre:vand = 15 42:21:21:6:10).

Eksempel 13.

Til en opløsning af 4,62 g (6,05 mmol) L-alanin-2-(1,2-di-palmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid i 100 ml af en blanding af chloroform, isopropanol og vand 20 (70:30:2) sættes dråbevis under omrøring ved 15°C i løbet af 10 minutter 14,52 ml (7,26 mmol) 0,5 molær triethylaminopløs-ning i en blanding af chlorform, isopropanol og vand (70:30:2).

Derefter tilsættes i løbet af 20 minutter 6,0 g (7,26 mmol) N-propionyl-desmethyl-muramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre- (Ca) -25 methylester-(0γ)-N-hydroxysuccinimidester, som stadig indeholder noget dicyclohexylurinstof, i 4 portioner på 1,5 g i fast form, hvorved opløsningen bliver kendeligt mere uklar.

Efter ca. 15 minutters omrøring ved 15°C fjernes kølebadet, og blandingen omrøres i yderligere 2 1/2 time ved stuetempe-30 ratur. Derefter inddampes den således dannede uklare reaktionsopløsning i vakuum ved 30°C. Råproduktet (10,75 g) suspenderes derpå i 170 ml dobbeltdestilleret vand (pH-værdi 5,5), suspensionen indstilles på pH-værdien 6,0 ved tilsæt- DK 167193 B1 57 ning af 0,3 ml triethylamin, uopløselige bestanddele (di-cyclohexylurinstof) frafiltreres, og filtratet lyofiliseres i højvakuum.

Det således dannede lyofilisat opløses i 300 ml dobbelt-5 destilleret vand, og opløsningen inddampes i en AMICON-dia-lysecelle (model 402, ultrafilter PM 10/76 mm 0) ved 405 kPa til et rumfang på 75 ml, hvorefter det filtreres chlorid-frit mod 250 ml phosphatpuffercnatriumchlorid (begge 0,1 molær, -1:1, pH-værdi 7) og 1750 ml dobbeltdestilleret vand.

10 Den i cellen tilbageblevne opløsning (ca. 75 ml) filtreres derpå gennem to milliporefiltre (NALGENE S, 0,45 μ og 0,2 μ) anbragt efter hinanden, og den således fremkomne klare farveløse opløsning lyofiliseres i højvakuum.

Man får 7,36 g stadig urent N-propionyl-desraethylmuramyl-L-15 alanyl-D-glutamyl-(Ca) -methylester-(C^)-L-alanin-2-(1,2-di-palmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid-na-triumsalt som et farveløst pulver, som yderligere renses ved Craig-fordeling med en blanding af carbontetrachlorid, chloroform, methanol og 0,5%'s natriumchloridopløsning (7:17:18:6).

20 Efter 547 trin findes det ønskede produkt i fraktionerne 160-220, K = 0,58. De produktholdige fraktioner hældes sammen og inddampes til tørhed i vakuum uden opvarmning (afkøling) .

Man får et farveløst pulver, som stadig indeholder natrium-chlorid. Til fjernelse af natriumchloridet opløses produktet 25 i 600 ml dobbeltdestilleret vand, hvorefter opløsningen filtreres chloridfri i en AMINCON-dialysecelle (model 402, ultra-filter PM 30/76 mm 0) ved 405 kPa først til et indre rumfang på i alt 50 ml og derpå med i alt 1750 ml dobbeltdestilleret vand.

Den i cellen tilbageblevne opløsning (ca. 50 ml) sterilfiltreres der-30 på gennem to på hinanden følgende milliporefiltre (NALGENE S, 0,45 μ og 0,2 μ), hvorpå opløsningen lyofiliseres i højvakuum.

Man får N-propionyl-desmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (C ) -methylester- (C ) -L-alanin-2- (1,2-dipalmit‘oyl-sn-glycero-cc y DK 167193 B1 58 3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid-natriumsalt som et farve- 20 løst pulver, som indeholder 1,90 mol vand, og med [a]D = +3,7 +1° (c = 0,672, chloroform), [a]^° = +1,7 + 0,1° (c = 1,044, vand), 5 Rf = 0,42 (chloroform:methanol;vand = 70:30:5) og

Rf = 0,62 (ethy1acetat:n-butanol:pyridin:eddikesyre:vand = 42:21:21:6:10).

Udgangsmaterialet kan fremstilles på følgende måde: 5,12 g (10,1 mmol) N-propionyl-desmethylmuramyl-L-alanyl-10 D-glutaminsyre-a-methylester optages i 100 ml af en blanding af chloroform og isopropanol (7:3), hvorefter stoffet opløses fuldstændigt ved tilsætning af 10 ml dimethylformamid.

Til denne opløsning sættes 2,68 g (13 mmol) dicyclohexylcarbo-diimid og 1,50 g (13 mmol) N-hydroxysuccinimid, og den således 15 dannede klare, farveløse opløsning omrøres 1 1/2 time ved stuetemperatur, hvorpå den henstår i 17 timer ved 4°C.

Til den således dannede suspension sættes 400 ml diethylether, hvorefter blandingen omrøres ved stuetemperatur i yderligere 1 time.

20 Derpå frasuges det krystallinske produkt, hvorefter det ef-tervaskes med diethylether og tørres i vakuum over phosphor-pentoxid.

Man får rå N-propionyl-desmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamin-syre-(C ) -methylester-(C )-N-hydroxysuccinimidester i form ^ i 25 af farveløse krystaller, der hovedsagelig stadig indeholder noget dicyclohexylurinstof og anvendes uden yderligere rensning med

Rf = 0,46 (chloroform:methanol = 5:1) og Rf = 0,72 (chloroform:methanol = 7:3).

30 Udgangsmaterialet fremstilles på følgende måde: DK 167193 B1 59

En opløsning af 13,0 g (21,75 mmol) N-propionyl-desmethyl-muramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre- (Ca) -methylester- (c^) -ben-zylester i 250 ml af en blanding af dimethoxyethan og vand (20:1) hydrogeneres med 2,5 g 10%'s palladium-på-kul-kata-5 lysator i 1 time ved stuetemperatur og normaltryk.

Katalysatoren frafiltreres, filtratet inddampes i vakuum til tørhed, og den fremkomne remanens optages 3 gange i 50 ml vand, hvorpå der hver gang på ny inddampes.

Remanensen opløses i ca. 100 ml dobbeltdestilieret vand, 10 opløsningen filtreres gennem et milliporefilter (NÅLGENE S, 0,2 ]i) , hvorefter den lyofiliseres i højvakuum.

Man får N-propionyl-desmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre-α-methylester (0,68 mol vand) som et farveløst lyofilisat med [<x]£° = +14,9 + 0,1° (c = 1,067, methanol), 15 Rf = 0,78 (chloroform:methanol:vand = 70:30:5) og

Rf = 0,57 (e thy 1 aceta t: n-bu tanol: py ri din: eddikesyre: vand = 42:21:21:6:10).

Udgangsmaterialet kan fremstilles på følgende måde:

En opløsning af 20,7 g (32,46 mmol) 4,6-0-isopropyliden-N-20 propionyl-desmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre- (C^) -methylester- (<3γ) -benzylester i 400 ml 60%'s eddikesyre omrøres i 21 timer ved stuetemperatur, hvorefter den inddampes i vakuum ved 30°C, og den fremkomne remanens tilsættes 100 ml vand og inddampes, hvilket gennemføres i alt 3 gange. Råpro-25 duktet renses derefter ved søjlekromatografi på 1000 g kiselgel (60 reneste kvalitet, Merck, 0,063-0,200 mm) i systemet methylenchlorid:methanol = 83:15 (15 ml fraktioner). Fraktionerne 207-290 hældes sammen og inddampes i vakuum ved 30°C.

30 Man får N-propionyl-desmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre-(C )-methylester-(C )-benzylester, som indeholder 0,24 mol vand,

Cl Y

DK 167193 B1 60 med [a]j^ +16 + 0,1° (c = 1,463, methanol),

Rf = 0,24 (chloroform:methanol = 9:1),

Rf = 0,55 (chlorofornumethanol = 5:1) og

Rf = 0,94 (chlorofornumethanol:vand = 70:30:5) .

5 Udgangsmaterialet fremstilles på følgende måde:

Til en suspension af 13,2 g (35,77 mmol) 4,6-O-isopropyliden-N-propionyl-desmethylmuraminsyre-natriumsalt i 200 ml di-methylformamid sættes ved stuetemperatur under omrøring 9,6 g (46,5 mmol) dicyclohexylcarbodiimid, 5,35 g (46,5 mmol) N-10 hydroxysuccinimid og 12,8 g (35,77 mmol) L-alanyl-D-glutamin-syre-(C )-methylester-(C )-benzylester-hydrochlorid, og bian-dingen omrøres i 21 timer ved stuetemperatur.

Til den således fremkomne hvide suspension sættes 200 ml ethyl-acetat, hvorefter der omrøres i 1 time ved 0°C, det krystal-15 linske produkt (dicyclohexylurinstof) frasuges, eftervaskes med iskold ethylacetat, og filtratet inddampes i vakuum ved 30°C.

Den således fremkomne remanens optages i 300 ml ethylacetat, og der vaskes 2 gange efter hinanden med 50 ml 2 N citron-20 syre, 50 ml vand, 50 ml 10%'s natriumhydrogencarbonatopløs-ning og 50 ml vand.

Ethylacetatfaserne hældes sammen, tørres over natriumsulfat, filtreres og inddampes i vakuum.

Man får 4,6-O-isopropyliden-N-propionyl-desmethylmuramyl-L- 25 alanyl-D-glutaminsyre-(C )-methylester-(C )-benzylester med

Cl Y

Rf = 0,65 (chlorofornumethanol = 9:1) og Rf = 0,86 (chlorofornumethanol = 5:1) .

De to udgangsprodukter fremstilles på følgende måde:

Til en opløsning af 20,3 g (48,0 mmol) N-tert-butyloxycarbo- DK 167193 B1 61 nyl-L-alanyl-D-glutaminsyre- (Ca) -methylester- (C^) -benzyl-ester [P.Lefrancier, M.Derrien, I.Lederman, F.Nief, J.Choay og E.Lederer, Int.J.Peptide Protein Res. 11, 289-296 (1978)] i 100 ml absolut ethylacetat sættes ved 0°C'100 ml af en ca.

5 5 N HCl-opløsning i absolut ethylacetat, hvorpå der omrøres i 2 timer ved 0°C.

Den gullige opløsning inddampes derpå i vakuum, hvorefter den fremkomne remanens optages i 100 ml absolut ethylacetat,

Dette gentages. Efter digerering med 2 gange 100 ml absolut 10 diethylether tørres remanensen i højvakuum, og man får L-alanyl-D-glutaminsyre- (C ) -methylester- (C ) -benzylester- α · 20 hydrochlorid, som indeholder 0,31 mol vand, med [α]D = +18,6 + 0,1° (c = 0,043, methanol),

Rf = 0,72 (chloroform:methanol:vand = 70:30:5), 15 Rf = 0,44 (chloroform:methanol = 5:1) og Rf = 0,31 (chloroform:methanol = 9:1).

En opløsning af 34,4 g (73,8 mmol, 2,14 mmol/g, indeholder noget natriumchlorid) la-O-benzyl-4,6-O-isopropyliden-des-methylmuraminsyre-natriumsalt i 340 ml vand hydrogeneres ved 20 konstant pH-værdi på 7,1 med 6,0 g 10%'s palladiumkul-katalysator i 23 timer ved stuetemperatur og normaltryk.

Katalysatoren frafiltreres, filtratet inddampes ved pH-værdi-en 7,1 i vakuum ved 30°C, og den dannede remanens tørres i højvakuum over phosphorpentoxid.

25 Man får 4,6-O-isopropyliden-N-propionyl-desmethylmuraminsyre-natriumsalt som et farveløst pulver med Rf = 0,50 (chloroform:methanol:vand = 70:30:5) og Rf = 0,66 (acetonitril:vand = 3:1).

Udgangsmaterialet fremstilles på følgende måde: 30 Til en opløsning af 14,3 g (32,7 mmol) la-O-benzyl-4,6-0- isopropyliden-N-propionyl-desmethylmuraminsyre-methylester i 130 ml methanol sættes 24,4 ml (48,7 mmol) 2 N natrium DK 167193 B1 62 hydroxidopløsning, og blandingen omrøres i 1 1/2 time ved stuetemperatur.

Derefter indstilles den dannede klare, svagt gule opløsning med 1 N saltsyre på pH-værdien 7,0, hvorefter opløsningen 5 inddampes i vakuum ved 30°C.

Efter tørring over phosphorpentoxid får man la-O-benzyl-4,6-O-isopropyliden-N-propionyl-desmethylmuraminsyre-natrium-salt i form af farveløse krystaller med Rf = 0,67 (chloroform:methanol:vand = 70:30:5) og 10 Rf = 0,74 (acetonitril:vand = 3:1).

Udgangsproduktet fremstilles på følgende måde:

Til en suspension af 6,75 g (224,7 mmol) natriumhydrid i 120 ml absolut tetrahydrofuran sættes dråbevis ved 5°C under nitrogen og omrøring i løbet af 5 minutter en opløsning af 15 31,3 g (85,65 mmol) la-0-benzyl-2-desoxy-4,6-0-isopropyliden- 2-propionamido-a-D-glucopyranosid i 200 ml absolut tetrahydrofuran, hvorved temperaturen stiger til 20°C.

Den således fremkomne suspension omrøres i yderligere 2 timer ved 40°C, afkøles til 0°C, hvorpå den under nitrogen og om-20 røring i løbet af 30 minutter sættes dråbevis til en til -15°C afkølet opløsning af 20,7 g (135,77 mmol) bromeddike-syremethylester i 95 ml absolut tetrahydrofuran.

Den således fremstillede suspension omrøres i yderligere 3 timer ved 0-5°C, hvorefter der tilsættes 20 ml methanol og 25 20 ml tetrahydrofuran. Blandingen indstilles på pH-værdien 6 med 4,5 ml iseddike, hvorefter den inddampes i vakuum ved 30°C.

Remanensen opløses derefter i 200 ml methylenchlorid, og den dannede opløsning vaskes med 3 gange 125 ml vand. Methylen-chloridfaserne hældes sammen, tørres over natriumsulfat, fil-30 treres og inddampes i vakuum ved 30°C.

DK 167193 B1 63

Man får et råprodukt i form af svagt gule krystaller, som renses ved søjlekromatografi på 500 g neutralt aluminiumoxid (Woelm N, super 1) med ethylacetat som elueringsmid-del (10 ml fraktioner). Fraktionerne 14-36 hældes sammen 5 og inddampes i vakuum.

Man får la-O-benzyl-4,6-0-isopropyliden-N-propionyl-des-methylmuraminsyre-methylester i form af farveløse krystaller med smp. 121-123°C (fra diethylether:petroleumsether = 1:2) med [ct]^° = +146,9 + 0,1° (c = 0,849, chloroform) og 10 Rf = 0,67 (chloroform:methanol = 9:1).

Eksempel 14.

Analogt med den i eksempel 13 beskrevne fremgangsmåde fremstilles ud fra 5,525 g (6,43 mmol) rå (indeholder noget di-cyclohexylurinstof) N-propionyl-desmethylmuramyl-L-alanyl-D- 15 glutaminsyre-(C )-tert-butylester-(C ) -N-hydroxysuccinimid-

Ct Y

ester og 3,78 g (4,95 mmol) L-ålanin-2-(1,2-dipalraitoyl-sn- glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid, N-propionyl-des- methylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (Ca) -tert-butylester- (<2γ) - L-alanin-2- (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryl- 20 oxy)-ethylamid-natriumsalt i form af et farveløst pulver, 20 o som indeholder 2,64 mol vand, med [a]^ = +2,5 + 0,1° (c = 0,649, vand), [a]^ = +5,8 + 0,1° (c = 0,694, chloroform) og Rf = 0,60 (chloroform:methanol:vand = 70:30:5).

Udgangsmaterialet fremstilles på følgende måde: 25 Analogt med den i eksempel 13 beskrevne fremgangsmåde fremstilles ud fra 3,44 g (6,15 mmol) N-propionyl-desmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre-a-tert-butylester, 1,68 g (8,14 mmol) dicyclohexylcarbodiimid og 0,94 g (8,14 mmol) N-hydroxysuccinimid rå N-propionyl-desmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre-30 (Ca)-tert-butylester-(c )-N-hydroxysuccinimidester i form af farveløse krystaller, der endnu indeholder hovedsagelig noget dicyclohexylurinstof, og som anvendes uden yderligere rens- DK 167193 B1 64 ning, med Rf = 0,61 (chloroform:methanol:vand = 70:30:5).

Udgangsmaterialet fremstilles på følgende måde:

En opløsning af 5,1 g (7 mmol) la-O-benzyl-N-propionyl-desmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre-(Ca)-tert-butylester-5 (C^)-benzylester i 100 ml af en blanding af dimethoxyethan og vand (9:1) hydrogeneres med 1,5 g 5%'s palladium-på-kul (E 101 N, Degussa) som katalysator i 20 timer ved stuetemperatur og normaltryk. Efter 20 timers forløb frafiltreres katalysatoren, hvorpå hydrogeneringen fortsættes som beskrevet 10 ovenfor med 1,5 g frisk katalysator 1 26 timer. Derefter frafiltreres katalysatoren, og filtratet inddampes i vakuum ved 30°C.

Den fremkomne remanens opløses i en blanding af 100 ml methy-lenchlorid og 5 ml isopropanol, til opløsningen sættes 500 ml 15 af en blanding af diethylether og petroleumsether (3:2), hvorefter der omrøres i 1 time ved stuetemperatur.

Derefter frasuges det udfældede produkt og eftervaskes med diethylether. Man får N-propionyl-desmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre-a-tert-butylester i form af et farveløst pul-20 ver, som indeholder 0,52 mol vand, med [a]^ = +20,2 + 0,1° (c = 0,902, vand)

Rf = 0,32 (chloroform:methanol:vand = 70:30:5) og Rf = 0,54 (acetonitril:vand = 3:1).

Udgangsmaterialet fremstilles på følgende måde: 25 Analogt med den i eksempel 13 beskrevne fremgangsmåde fremstilles ud fra 7,3 g (9,5 mmol) la-0-benzyl-4,6-0-isopropyl-iden-N-propionyl-desmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre-(C )-tert-butylester-(C )-benzylester og 150 ml 60%'s eddike-

GC Y

syre la-O-benzyl-N-propionyl-desmethylmurainyl-L-alanyl-D-30 glutaminsyre-(C )-tert-butylester-(C )-benzylester i form af

^ O

farveløse krystaller med smp. 152-153 C (fra methanol:vand = DK 167193 B1 65 1:5) med [a]^° = +68,9 + 0,1° (c = 0,991, methanol),

Rf = 0,40 (chloroform:methanol =9:1) og Rf = 0,70 (acetonitril:vand = 3:1).

Udgangsmaterialet fremstilles på følgende måde: 5 Analogt med den i eksempel 13 beskrevne fremgangsmåde fremstilles ud fra 4,65 g (9,62 mmol, 2,066 mmol/g, indeholder noget natriumchlorid) la-0-benzyl-4,6-0-isopropyliden-N-propi-onyl-desmethylmuraminsyre-natriumsalt, 2,38 g (11,54 mmol) dicyclohexylcarbodiimid, 1,33 g (11,54 mmol) N-hydroxysuccin-10 imid og 3,86 g (9,62 mmol) L-alanyl-D-glutaminsyre-(Ca)- tert-butylester-(C^)-benzylester-hydrochlorid, Ια-0-benzyl- 4,6-O-isopropyliden-N-propionyl-desmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre-(C )-tert-butylester-(C )-benzylester, som

ΛΑ Y

indeholder 0,31 mol vand, med [a]^ = +38,4 +0,1° (c = 1,086, 15 methylenchlorid),

Rf = 0,86 (acetonitril:vand =3:1) og Rf = 0,83 (chloroform:methanol = 9:1).

Eksempel 15.

Analogt med den i eksempel 13 beskrevne fremgangsmåde frem-20 stilles ud fra 3,07 g (4 mmol)rå (indeholder noget dicyclo-hexylurinstof) N-propionyl-desmethylmuramyl-L-alanyl-D-glut-aminsyre-(C )-n-butylester-(C )-N-hydroxysuccinimidester og

(X Y

2,37 g (3,1 mmol) L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid, N-propionyl-desmethylmuramul-25 L-alanyl-D-glutamyl-(Ca)-n-butylester-(Ογ)-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy) -ethylamid-natriumsalt i form af et farveløst pulver, som indeholder 2,93 mol vand, med [a3^ =+6,9 + 0,1° (c = 0,504, methylenchlorid, 30 Rf = 0,65 (chloroform:methanol:vand = 70:30:5) og Rf = 0,63 (chloroform:methanol = 7:3).

Udgangsmaterialet fremstilles på følgende måde: DK 167193 B1 66

Analogt med den i eksempel 13 beskrevne fremgangsmåde fremstilles ud fra 2,2 g (3,9 mmol) N-propionyl-desmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre-a-n-butylester, 1,2 g (5,8 mmol) dicyclohexylcarbodiimid og 0,69 g (5,8 mmol)’ N-hydroxysuccin-5 imid rå N-propionyl-desmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre-(C )-n-butylester-(C)-N-hydroxysuccinimidester i form af

VA I

farveløse krystaller, der stadig indeholder hovedsagelig noget dicyclohexylurinstof, og som anvendes uden yderligere rensning med 10 Rf = 0,66 (chloroform:methanol:vand = 70:30:5).

Udgangsmaterialet fremstilles på følgende måde:

Analogt med den i eksempel 14 beskrevne fremgangsmåde (hydrogeneringstid 20 minutter) fremstilles ud fra 7,3 g (11,3 mmol) N-propionyl-desmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre- (Ca) -15 n-butylester- (<3γ) -benzylester N-propionyl-desmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre-a-n-butylester i form af et farveløst pulver, som indeholder 0,88 mol vand, med [a]p = +16,4 + 0,1° (c = 0,959, vand)

Rf = 0,61 (methylenchlorid:methanol:vand = 70:30:5) og 20 Rf = 0,52 (acetonitril:vand = 3:1) .

Udgangsmaterialet fremstilles på følgende måde:

Analogt med den i eksempel 13 beskrevne fremgangsmåde fremstilles ud fra 9,5 g (13,97 mmol) 4,6-O-isopropyliden-N-des- methylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre- (C ) -n-butylester- (C ) - ex y 25 benzylester og 120 ml 60%'s eddikesyre N-propionyl-desmethyl- muramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre- (C ) -n-butylester- (C ) -ben- α 20 ^ zylester, der indeholder 0,41 mol vand, med [a]D = +15,7 + 0,1° (c = 1,019, methanol),

Rf = 0,23 (methylenchlorid:methanol = 9:1), 30 Rf = 0,45 (methylenchlorid:methanol = 5:1) og

Rf = 0,82 (methylenchlorid:methanol:H20 = 70:30:5).

Udgangsmaterialet fremstilles på følgende måde: DK 167193 B1 67

Analogt med den i eksempel 13 beskrevne fremgangsmåde fremstilles ud fra 3,81 g (10,76 mmol, 2,72 mmol/g, indeholder stadig natriumchlorid) 4,6-O-isopropyliden-N-propionyl-des-methylmuraminsyre-natriumsalt, 2,44 g (11,83 mmol) dicyclo-5 hexylcarbodiimid, 1,36 g (11,83 mmol) N-hydroxysuccinimid og 4,3 g (10,76 mmol) L-alanyl-D-glutaminsyre-(Ca)-n-butyl-ester-(C^)-benzylester-hydrochlorid, 4,6-o-isopropyliden-N-propionyl-desmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre-(C )-n-butylester-(C^)-benzylester med [a]p = +10,6 + 0,1 10 (c = 0.928, methanol),

Rf = 0,81 (methylenchloridrmethanol:vand = 70:30:5) og Rf = 0,57 (methylenchlorid:methanol = 5:1).

Eksempel 16.

Til en opløsning af 2,85 g (2,09 mmol) ifølge eksempel 14 15 fremstillet N-propionyl-desmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamyl-(Cfl) -tert-butylester- ((3γ) -L-alanin-2- (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy) -ethylamid-natriumsalt i 112 ml absolut methylenchlorid sættes 28 ml trifluoreddike-syre, og blandingen omrøres i 3 timer ved stuetemperatur.

20 Den farveløse, klare opløsning inddampes derefter i vakuum ved 30°C, og den fremkomne remanens optages i methylenchlorid og inddampes. Dette gentages flere gange.

Man får 3,0 g farveløs olie, som opløst i 350 ml phosphat-puffer/natriumchlorid (begge 0,1 molær, 1:1, pH-værdi 7) 25 filtreres i en AMICON-dialysecelle (model 402, ultrafilter PM 30/76 mm 0) ved 405 kPa. Derefter filtreres chloridfrit mod i alt 2,1 liter dobbeltdestilleret vand. Den i cellen tilbageblevne opløsning (ca. 50 ml) lyofiliseres i høj-vakuum.

30 Man får et farveløst lyofilisat, som yderligere renses ved søjlekromatografi på 260 g kiselgel (60 reneste kvalitet, Merck, 0,063-0,200 mm) i systemet chloroform:methanol:vand (70:30:5) (10 ml fraktioner).

DK 167193 B1 68

Fraktionerne 90-260 hældes sammen og inddampes i højvakuum uden opvarmning (afkøling) til tørhed. Remanensen optages i 250 ml dobbeltdestilleret vand og inddampes i en AMICON-dialysecelle (model 402, ultrafilter PM 30/76 mm 0) ved 5 405 kPa først til ca. 50 ml, hvorefter der filtreres chlorid- frit mod 250 ml phosphatpuffer/natriumchlorid (begge 0,1 molær, 1:1, pH-værdi 7) og derefter mod 1750 ml dobbeltdestilleret vand. Den i cellen tilbageblevne opløsning sterilfiltreres derefter gennem 2 milliporefiltre (NALGENE S, 0,45 μ 10 og 0,2 μ) og lyofiliseres i højvakuum.

Man får N-propionyl-desmethylmuramyl-L-alanyl-D-glutamin- syrer (0γ) -L-alanin-2- (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxy- phosphoryloxy) -ethylamid-dinatriumsalt som et farveløst hy~ 20 groskopisk pulver, der indeholder 4,80 mol vand, med [a]^ = 15 -6,1 + 0,1° (c = 0,489, methylenchlorid:ethanol = 1:1),

Rf = 0,28 (ethylacetat:n-butanol: py ri din: eddikesyre: vand = 42:21:21:6:10) og

Rf = 0,62 (acetonitril:vand = 3:1).

Eksempel 17.

20 4,5 g (34 mmol) ifølge eksempel 12 fremstillet N-acetyl- muramyl-L-alanyl-D-glutamyl-(C )-tert-butylester-(C )-L- (X Ύ alanin-2- (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryl-oxy)-ethylamid-natriumsalt, som er tørret i højvakuum over phosphorpentoxid, opløses i 75 ml tørt dichlormethan.

25 Opløsningen afkøles til 0°C, hvorefter der under omrøring og udelukkelse af fugtighed tilsættes 25 ml vandfri tri-fluoreddikesyre, og opløsningen henstilles til opvarmning til stuetemperatur. Efter 2 1/2 times forløb inddampes den klare, farveløse opløsning kraftigt ved stuetemperatur på 30 en rotations fordamper (ca. 10 ml) , hvorpå der tilsættes 100 ml dichlormethan og atter inddampes. Dette gentages flere gange. Den tilbageblevne olie optages i 100 ml tert-butanol og lyofiliseres. Råproduktet renses ved kromatografi på 400 g kiselgel 60 i systemet chloroform :methanol: vand 35 (70:30:5). Kromatograferingsprocessen gentages. Det i frak- DK 167193 B1 69 tionerne 92-172 indeholdte materiale opløses i 100 ml dob-beltdestilleret vand og renses på samme måde som i eksempel 1 ved diafiltrering (AMICON-rørecelle 402, ultrafilter PM 10/76 mm 0) . Den i cellen tilbageblevne opløsning 'filtreres gennem 5 et milliporefilter (0,2 y) og lyofiliseres.

Man får N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre—(C^)-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid-dinatriumsalt, indeholdende 4,89 mol vand, i form af farveløst, løst pulver med [a]= +10 +1° (c =0,675, 10 methanol),

Rf = 0,08 (chloroform:methanol:vand = 70:30:5),

Rf = 0,15 (ethylacetat:n-butanol:pyridin:eddikesyre:vand = 42:21:21:6:10) og

Rf = 0,30 (chlorform:methanol:vand:eddikesyre = 70:40:9:1).

15 Eksempel 18.

Alveolære rottemakrofager udvindes ved lungevask, anbringes på plader og inkuberes in vitro i 24 timer enten med liposo- mer, som er tilsat det aktive stof, eller med det aktive stof i fysiologisk saltopløsning (phosphatpufret saltopløs- 125 20 ning, PBS). Der tilsættes I-markerede tumorceller og inkuberes i yderligere 72 timer. Derefter afvaskes de dræbte tumorceller, og antallet af tilbageblevne levende tumorceller bestemmes på grundlag af deres radioaktivitet. Makrofag-akti-veringen bedømmes ud fra cytotoksiciteten, dvs. efter antal-25 let af dræbte dyr ved forsøgets afslutning. Den specifikke cytotoksicitet [%] beregnes på følgende måde: cmp i tumorceller inkuberet med makrofager og 100 1 - aktivt stof-

cmp i tumorceller inkuberet med makrofager og PBS

Yderligere detaljer vedrørende den ovenfor beskrevne testmetode er anført i I.J.Fidler et al., J.Biol.Response Modifiers 1, 30 43-55 (1982). I nedenstående tabel anføres forsøgsresultater DK 167193 B1 70 for følgende aktive stoffer: I N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (Ca) -n-butylester-(C^) -L-alanin-2- (l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxy-phosphoryloxy) -ethylamid-natriumsalt, 5 II N-propiony1-normuramyl-L-alanyl-D~glutamyl-(C^)-n-butyl- ester-(<3γ)-L-alanin-2-(l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy) -ethylamid-natriumsalt, III N-propionyl-normuramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (C ) -n-methylester-(<3γ)-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero- 10 3-hydroxyphosphoryloxy) -ethylamid-natriumsalt og IV N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (Ca) -tert-butyl-. ester-(C )-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid-natriumsalt.

Specifik cytotoksicitet [%] 15 Aktivt Aktivt stof i 0,2 ml PBS Aktivt stof i 100 yg lipo-stof somer pr. 0,2 ml yg/kultur ' yg/kultur 0,02 0,2 2 20 0,02 . 0,2 2 20 I 39 59 56 51 44 II 21 48 74 10 23 11 20 III 3 81 47 64 76 79 IV 23 18 20 64 68 52

Eksempel 19.

Fremstilling af 1000 tabletter indeholdende 0,5¾ aktivt stof

Sammensætning pr. 1000 tabletter 25 N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamyl- (C ) -methyl-ester-(c )-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero- 3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid-natriumsalt 0,5 g

Formalet lactose 43,0 g DK 167193 B1 71

Majsstivelse 52,0 g "Pharmacoat" 603® (hydroxypropylmethylcellulose, 3,0 g indeholdende 28-30% methoxygrupper, Shinetsu Chemical Company, Tokyo, Japan) 5 "Aerosil"®(kolloidt siliciumdioxid, Degussa, 1,0 g

Frankfurt, Forbundsrepublikken Tyskland)

Magnesiumstearat 0,5 g

Fremstilling

Det aktive stof og 15 g lactose forblandes. Den således frem-10 stillede forblanding sammenblandes med 28 g lactose og 47 g majsstivelse. Med denne blanding og en vandig opløsning af Pharmacoat fremstilles en granuleringsklar masse, som granuleres, tørres og formales. Granulaterne blandes med 5 g majssti velse, Aerosil og magnesiumstearat og presses til 1000 tab-15 letter med en vægt på 100 mg pr. tablet.

De pressede tabletter kan forsynes med et mavesaftresistent overtræk på kendt måde.

Eksempel 20.

Aktivt stof i form af et lyofiliseret tørt stof 20 1 mg N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamyl-(Ca)-methylester- (Cy)-L-alanin-2-(l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryl)-ethylamid-natriumsalt og 500 mg mannitol (pyrogenfrit) opløses i vand til injektionsbrug, og opløsningen sterilfiltreres gennem et membranfilter. Under aseptiske betingelser fyldes den 25 sterilfiltrerede opløsning i en steriliseret glasampul eller i et hætteglas, hvorpå der frysetørres. Efter lyofiliseringen lukkes ampullen, og i tilfælde af et hætteglas forsynes dette med et gummielastisk lukke og aluminiumskappe.

Claims

1. Analogi fremgangsmåde til fremstilling af mur- amylpeptider med den almene formel <jH2-OR6 (HjOR1) ^ R4-0>i ./ 3 yηi s 2 R -CH (D) NH-C-R \ (L) (D) ' (L)fl ?H

5 XC-N-CH-C-NH-CH-CH_-CH--C-X-Y-C-NH-CH„-CH_-0-P-0-CH. 11151711 i 2 2 » 11 2 οΛ 0 A 8 0 0 (f OR U\ R CH2l*(sn) 0 R10/\ hvori R^, og R® hver for sig betyder hydrogen eller lavalkanoyl, R^ betyder C(1-4)-alkyl, hydroxymethyl eller phenyl, R® betyder hydrogen eller methyl, R5 betyder hydrogen eller C(1-3)-alkyl, b7 betyder usubstitueret 10 eller med hydroxy, mercapto eller methylthio substitueret C(1-3)-alkyl, R® betyder hydrogen eller lavalkyl, X betyder oxygen eller gruppen NH, Y betyder C(1-4)-alkyl-iden, og R® og R-*-® hver for sig betyder C( 11-17)-alkyl eller 0(11-17)-alkenyl, eller salte deraf, kendetegnet 15 ved, at man a) omsætter en forbindelse med formlen <jH2OR6 R^(f ,/^ <H,0Rl> <UI) • i LXr2 DK 167193 B1 73 hvori substituenterne har de ovenfor anførte betydninger og tilstedeværende funktionelle grupper med undtagelse af den frie hydroxygruppe i 3-stillingen eventuelt forelig-5 ger på beskyttet form, idet 3-hydroxygruppen eventuelt foreligger på reaktionsdygtig form, med en forbindelse med formlen

7 V0*8 r Y r> ~ Z-CH-C-N -CH~C-NH-CH-CHoCH_-C-X-Y-C-NH-CH_-CH_-0-P*-0-rao i3lU5<L)8 5 S Ά R ° R (D) ° (L)° V 9>'°T (IV) R . Lv(sn) x i hvori Z betyder en eventuelt på reaktionsdygtig form 10 foreliggende hydroxygruppe, og de øvrige substituenter har de ovenfor anførte betydninger, idet dog de i en forbindelse med formlen IV tilstedeværende funktionelle grupper med undtagelse af Z eventuelt foreligger på beskyttet form, eller med et salt deraf og fraspalter 15 eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper eller b) omsætter en forbindelse med formlen r6och2 ι/' \ 1 K p /1 (HjOR; (V). H0 X /I Lv R3-(/ (d) \ Γ &)/"(D) ( <L) V\ ' C- N- CH-C- (NH-CH-CH--CH,-C- \ X-Y-C- J \ OH II i c 17 II I 1 1 II / II f °;R0V/v °l°jyJ s r q hvori s, r og g hver for sig betyder 0 eller V, og betyder lavalkyl eller en carboxylbeskyttelsesgruppe, og DK 167193 B1 74 de øvrige substituenter har de ovenfor anførte betydninger, idet dog de i en forbindelse med formlen V tilstedeværende frie funktionelle grupper med undtagelse af 5 den i reaktionen deltagende gruppe eventuelt foreligger på beskyttet form, eller et reaktionsdygtigt carboxylsy-rederivat deraf med en forbindelse med formlen /f ft) -) ft) \ (L)fl Ί OH H - I <?s~ ??«"} ®-ch2ch2-o-|-o-™ \r R 0 {«· J JT u ” νΛ'“ Elc/ hvori t, u og v hver for sig betyder 0 eller 1, og 10 substituenterne har de ovenfor angivne betydninger, under den forudsætning, at t, u og v er 1, når i forbindelsen med formlen V g er 0, at t er 0, u er 1, og v er 1, når q er 1, og r er 0, at u er 0, og v er 1, når g er 1, r er 1, og s er 0, eller at v er 0, når q, r og s er 1, eller 15 et salt eller et reaktionsdygtigt derivat deraf og fraspalter eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper eller c) omsætter en forbindelse med formlen <|:k2-or6 / n N Ch.or1) rSVJ i/ (VID r3-c/(d) L-c-r2 \ (L) (D) (L)J /°HN\ C-N-CH-C-NH-CH-CH--CH.-C-X-Y-C-NH-CH--CH - ( 0-P- ,0H II 1517 II I 2 2 II 2 2 II /

0. R 0 A 8 0 V J cr or x DK 167193 B1 75 hvori w betyder 0 eller 1, og substituenterne har de ovenfor anførte betydninger, idet dog frie funktionelle grupper med undtagelse af den i reaktionen deltagende 5 gruppe eventuelt foreligger på beskyttet form, eller et salt eller et reaktionsdygtigt phosphorsyrederivat af en sådan syre med formlen VII, hvori w er 1, med en forbindelse med formlen v9 M η- (cK-LcK-i (mi) V 8 ) \ /m l'(sn) 10 hvori substituenterne har de ovenfor anførte betydninger, og m er 0 eller 1, under den forudsætning, at m er 1, når i forbindelsen med formlen VII w er 0, eller at m er 0, når w er 1, eller med et salt eller et reaktionsdygtigt phosphorsyrederivat af en syre med formlen VIII, hvori m 15 er 1, og fraspalter eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper eller d) omsætter et rekationdygtigt derivat af en forbindelse med formlen pI2-0R6 λ- * Ko A (H-0R) mi) R -0 /Y 1/ 3 _/\ ] I !l 2 R -CK (D) RH-C-R \ (L) (D) (L)fl /"?H\ C-N-CH-C-NH-CH-CH,-CH--C-X-Y-C-NH-CH.-CH-- ( 0-P- ,0H ' Π I5I7 I' I 2 2 II 2 2 11 J 0RR 0 A s 0 V AV8 \ A DK 167193 B1 76 hvori w er 0 eller 1, og substituenterne har de ovenfor angivne betydninger, idet dog de i en forbindelse med formlen VII tilstedeværende frie funktionelle grupper med 5 undtagelse af den i reaktionen deltagende gruppe eventuelt er beskyttet med let fraspaltelige beskyttelsesgrupper, under den forudsætning, at et reaktionsdygtigt derivat med formlen VII, hvori w er 0, er et sådant, hvor den endestillede hydroxygruppe foreligger på reaktions-10 dygtig, forestret form, og under den forudsætning, at det reaktionsdygtige derivat af en forbindelse med formlen VII, hvori w er 1, er et salt, med et reaktionsdygtigt derivat af en forbindelse med formlen V* ov /0 H- .CiVc^-LcH^ (VI1I) >· s m I*(sn) 15 hvori substituenterne har de ovenfor anførte betydninger, og m er 0 eller 1, under den forudsætning, at m er 1, når i forbindelsen med formlen VII w betyder 0, og det reaktionsdygtige derivat af en forbindelse med formlen VIII er et salt, eller at m er 0, når w er 1, og det 20 reaktionsdygtige derivat af en forbindelse med formlen VIII er et sådant, hvor den endestillede hydroxygruppe foreligger på reaktionsdygtig, forestret form, og fraspalter eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper, eller 25 e) omsætter en forbindelse med formlen DK 167193 B1 77 <j^2-OR6 A °\, -i A K o /1 (H’0R } (IX)' r -o >y i/ 3 / Π S 2 R -CH (D) NH-C-R \ (L) (D) (L)O OH C-N-CH-C-NH-CH-CH,-CH,-C-X-Y-C-NH-CHo-CHo-0-P-0-CH . II 1517 » I 2 2 U 2 2 i, 2 O R3R O /C O q O7 OH 0. R CH2l'(sn) O R10/\ hvori substituenterne har de ovenfor anførte betydninger, idet i en forbindelse med formlen IX tilstedeværende frie 5 funktionelle grupper med undtagelse af den i reaktionen deltagende gruppe eventuelt foreligger på beskyttet form, eller et reaktionsdygtigt carboxylsyrederivat af en forbindelse med formlen IX med en lavalkanol R§-OH, hvori R?, betyder lavalkyl, eller et reaktionsdygtigt derivat 10 deraf, og fraspalter eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper eller f) oxiderer en forbindelse med formlen j!H2-0R6 * /1 (η·οε1) 00 r-ο yj i/ 3 i 8 2 R -CH (D) NH-C-R 21 \ (L) (D) (Dfl °R XC-N-CH-C-NH-CH-CHo-CH--C-X-Y-C-NH-CHo-CH0-0-P-0-CH. II 1517 II i 2 2 II 22 2 o rV o xl 0 o oAor8 V JC-0-CH ΈΓ £k~ l! (sn) I ^ o R10/\ DK 167193 B1 78 hvori betyder hydrogen eller en beskyttelsesgruppe, og de øvrige substituenter har de ovenfor anførte betydninger, idet i en forbindelse med formlen X tilstede-5 værende frie funktionelle grupper eventuelt foreligger på beskyttet form, eller en tautomer af denne forbindelse med et oxidationsmiddel og fraspalter eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper eller g) fraspalter under samtidig omdannelse af furanose til 10 pyranose beskyttelsesgrupperne i en furanoseforbindelse med formlen ώ20__ R OCH ’ 19Λ K R 0 / ^ 17 (n °R »i). X! 1/ r3-c|Ud) ^ i18 \ (L) (D) (L)J) OH C-N-CH-C-NH-CH-CHo-CH<,-C-X-Y-C-NH-CH«-CH--0-P-0-CH_ II 1517 II I 2 2 u 2 2 II 2

0 R κ 0 XL e 0 0 <A>R8 0 R9>°t R CH2l'(sn) 0 RI0/\ hvori r!7 betyder hydrogen eller en let fraspaltelig hydroxybeskyttelsesgruppe, og r!8 betyder

15 O R2-6-NH-, hvori R2 har den ovenfor nævnte betydning, eller r!7 0g R18 sammen betyder en med C-atomets fri valens til oxygen 20 bundet divalent beskyttelsesgruppe med formlen R2-6=N-, hvori R2 har den ovenfor anførte betydning, og r19 Qg r20 betyder en let fraspaltelig hydroxybeskyttelsesgruppe, DK 167193 B1 79 eller og R1^ sammen betyder en divalent hydroxybe-skyttelsesgruppe, og de øvrige substituenter har de ovenfor anførte betydninger, eller i et salt deraf, eller 5 h) fraspalter beskyttelsesgruppen eller -grupperne i en forbindelse med formlen I, hvori mindst én af grupperne rI, R1, r4, r6^ r7 ener R2 3 4 foreligger på beskyttet form, og de øvrige substituenter har de ovenfor anførte betydninger, eller i et salt deraf, eller 10 i) hydrolyserer en forbindelse med formlen <jB2-OR5 6

3. S 2 R -CH (D) KH-C-R \ (L) (D) (L)J^ i C-N-CH-C-fffi-CH-CH0-CH_“C-X-Y-C-NH-CH -CH -0-P-0-CH II I s 17 H I 2 2 R 2 2 π 2

0. R 0 XL o 0 0 (f\)R7 8 0 9^c-o-ch R iM2lr(sn> 0 r9A> hvori A betyder et halogenatom, og de øvrige substituenter har de ovenfor anførte betydninger, og, om ønsket, efter gennemførelse af en af fremgangsmåderne a-i) omdan-15 ner en fremstillet forbindelse med formlen I til et salt deraf eller et fremstillet salt til et andet salt. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 2 man fremstiller forbindelser med formlen I, hvori R^, r4 3 og r6 hver for sig betyder hydrogen eller C(1-3)-alkan- 4 20 oyl, R1 betyder C( 1-2)-alkyl eller hydroxymethyl, R2 be 5 tyder hydrogen eller methyl, R3 betyder hydrogen eller 6 methyl, b7 betyder C(1-3)-alkyl eller hydroxymethyl, R2 7 betyder hydrogen eller C(1-4)-alkyl, X betyder oxygen 8 eller gruppen NH, Y betyder C(1-3)-alkyliden, og R2 og 9

25 R13 hver for sig betyder ligekædet C(11-17)-alkyl eller DK 167193 B1 80 descarbonyl-oleoyl, eller salte deraf.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved,, at man fremstiller forbindelser med formlen I, hvori R^-, R^ 5 og hver for sig betyder hydrogen eller acetyl, r2 betyder methyl eller ethyl, r3 betyder hydrogen eller methyl, R^ betyder hydrogen eller methyl, R? betyder C(l-3)-alkyl, betyder hydrogen eller C(l-4)-alkyl, X betyder oxygen eller gruppen NH, Y betyder C(1-2)-alkyl-10 iden, og r9 og R^-O hver for sig betyder ligekædet C(11-17)-alkyl med et ulige antal carbonatomer eller descarbonyloleoyl, eller salte deraf.

4. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 1-3, kendetegnet ved, at man fremstiller forbindelser med formlen

15 I, hvori R^ betyder den i krav 1-3 anførte alkylgruppe, eller salte deraf.

5. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 1 og 4, kendetegnet ved, at man fremstiller forbindelser med formlen I, hvori mindst én af grupperne Ri, R^ og R^ betyder 20 lavalkanoyl, eller salte deraf.

6. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 1-4, kendetegnet ved, at man fremstiller forbindelser med formlen I, hvori r1, r4 og R^ betyder hydrogen, eller salte deraf. 1 Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at 25 man fremstiller forbindelser med formlen I, hvori R^, R^ og R^ betyder hydrogen, R^ betyder methyl eller ethyl, r3 betyder hydrogen, når R^ betyder ethyl, eller methyl, når betyder methyl, R^ betyder hydrogen eller methyl, R? betyder C(l-2)-alkyl, R^ betyder ligekædet C(l-4)-alkyl, 30. betyder oxygen eller gruppen NH, Y betyder ethyliden, og R^ og R^0 hver for sig betyder ligekædet C(15-17)-alkyl med et ulige antal carbonatomer, eller salte deraf. DK 167193 B1 81

8. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 1-7, kende tegnet ved, at man fremstiller forbindelser med formlen I, hvori r3 betyder methyl, eller salte deraf.

9. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 1-8, kende tegnet ved, at man fremstiller forbindelser med formlen I, hvori r5 betyder hydrogen, eller salte deraf.

10. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 1-9, kende tegnet ved, at man fremstiller forbindelser med formlen 10 I, hvori X betyder gruppen NH, eller salte deraf. II. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 1-10, kendetegnet ved, at man fremstiller forbindelser med formlen I, hvori R^ og R1^ betyder n-pentadecyl, eller salte deraf.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man fremstiller N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamyl-(Cq, )-n-butylester-()-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-gly-cero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid, N-propionyl-des-methyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamyl-(Ca)-n-butylester-(Cy)-20 L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphor-yloxy)-ethylamid, N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamyl-(Ca)-methylester-(Cy)-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-gly-cero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid eller N-propionyl-desmethyl- muramyl-L-alanyl-D-glutamyl-( Cq,)-methylester-25 (ΰγ)^-3ΐαηίη- 2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxy-phosphoryloxy)-ethylamid eller salte deraf.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man fremstiller N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre-(0γ)-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxy-30 phosphoryloxy)-ethylamid eller N-propionyl-desmethyl- muramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre-(C^)-L-alanin-2-(1,2-dipalmi toyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy ) -ethylamid eller et salt deraf.