DK169563B1 - Enhedsscreeningsanordning for gram-negativ bakteriuri samt fremgangsmåde til fremstilling heraf - Google Patents

Description

i DK 169563 B1

Den foreliggende opfindelse angår en enhedsscreeningsanordning for gram-negativ bakteriuri samt en fremgangsmåde til fremstilling deraf.

Udtrykket "gram-negativ bakteriuri" refererer til 5 urinvejsinfektioner af gram-negativ etiologi. Urinvejsinfektioner opdeles i fire kategorier på basis af symptomer, tilbagefald og komplikationsfaktorer. Akut ukompliceret gram-negativ bakteriuri kan forsvinde spontant, men efterfølges i reglen af vedvarende eller tilbagevendende bak-10 teriuri, som kan kræve længere tids medikamentel terapi. De tre andre kategorier af bakteriuri kan, hvis de ikke behandles, føre til nyreinfektion eller døden. Medens gram--negativ bakteriuri er almindelig udbredt og svækkende, kan de dermed forbundne symptomer være vanskelige at skelne, 15 idet de giver en type såkaldte asymptomatiske patienter.

Selv om man ved en dyrkning af en urinprøve kan påvise koncentrationer på 104 bakterier pr. ml prøve, en koncentration, der undertiden anvendes som grænsen for normalt indhold af gram-negative bakterier, er dyrkningsresultaterne ikke til 20 rådighed de første 18-24 timer. Påvisningen kræver trænet personale og er kostbar at opnå. Mikroskopisk undersøgelse er hurtigere, idet den kun kræver ca. 45 minutter, men undersøgelsen er kun følsom over for 105 bakterier pr. ml og kræver også anvendelse af øvet personale. Ingen af metoderne 25 kan betragtes som screeningsmetoder. En screeningsmetode, der er hurtig, bekvem og omkostningsvenlig, ville være særlig nyttig til afprøvning i stor skala af en befolkningsgruppe, såsom skolebørn eller militært personel.

"Limulus Amebocyte Lysate"-(LAL)-prøven er baseret 30 på anvendelsen af et lysat afledt fra et naturligt materiale ekstraheret fra en bestemt krabbeart. Det har for nylig vist sig, at lysatet indeholder proenzymer og et naturligt substratkoagulogen. Lysatkaskaden aktiveres ved hjælp af endotoksin, en komponent i cellevæggen 35 hos gram-negative bakterier. Aktiveringen af kaskaden resulterer naturligt i dannelsen af en gel som afslutning.

DK 169563 ΒΊ 2

En anordning/ som består af et transparent rør, der indeholder reagenser til LAL-geleringsprøven, er blevet omtalt til bestemmelse af endotoksin i EP offentliggørelsesskrift nr. 0.121.868. En hvilken som helst væskeprøve kan 5 analyseres.

Forekomsten af endotoksin i urin har også været relateret til tilstedeværelsen af bakteriuri med instrumenter, som kan påvise den uklarhed, der er resultatet af aktiveringen af "Limulus Amebocyte Lysate"-enzymkaskaden ved hjælp 10 af endotoksin. Uklarhedsgraden efter aktiveringen af kaskaden ved hjælp af endotoksin måles og bringes i relation til tilstedeværelsen af bakteriuri. Påvisningsgrænsen anføres at være 105 bakterier pr. ml prøve. På grund af de høje omkostninger til det nødvendige apparatur kan denne frem-15 gangsmåde imidlertid ikke betragtes som en screeningsmetode.

I den senere tid har man kunnet få syntetiske peptidsubstrater indeholdende chromogene eller fluorogene grupper, som kan spaltes af det koagulationsenzym, der produceres, når LAL-kaskaden aktiveres ved hjælp af endotoksin. Der er 20 blevet omtalt en række forskellige syntetiske substrater, jfr. f.eks. GB patentskrift nr. 1.547.747 og us patentskrift nr. 4.188.264. I almindelighed har en sekvens på to aminosyrer, glycin-arginin, vist sig at være kritisk for spaltning af en chromogen eller fluorogen fraspaltelig gruppe ved 25 hjælp af koagulationsenzymet. Fraspaltelige afgående grupper, såsom nitrophenyl, methylcoumarin-derivater, p-(N,N-diethyl-amino)anilin og indoxyl, er blevet omtalt. JP patentskrift nr. 56.42597 beskriver måling af endotoksin i en hvilken som helst legemsvæske, herunder urin, med et substrat, hvis 30 spaltningsprodukt kan reagere med l-naphthol-2-sulfonsyre, så at der fremkommer en blå farve.

Chromogene eller fluorogene substrater har overvejende været anvendt ved prøver for endotoksin i intravenøse opløsninger og i blod. Målinger i blod har været relateret til DK 169563 B1 3 bakteriæmi (bakterieinfektion i blodet). Endotoksinbestem-melse i blod kompliceres af tilstedeværelsen af inhibitorer i LAL-kaskaden. De fleste patentskrifter og andre litteraturkilder drejer sig enten om eliminering af disse interfere-5 rende faktorer eller om nye syntetiske substrater, jfr. f.eks. EP offentliggørelsesskrift nr. 0.080.649 rettet på fjernelsen af forstyrrende faktorer ved måling af endotoksin. Skriftet omtaler anvendelsen af den pågældende fremgangsmåde til fjernelse af forstyrrende faktorer ved bestemmelsen af 10 bakteriuri.

JP patentansøgning nr. 56.35994 angår et apparat til bestemmelse af endotoksin, hvilket apparat indeholder en del med en enzymprecursor, som er blevet adskilt fra lysatet, og en del med et optisk måleligt peptidsubstrat indesluttet 15 i en separat beholder.

En chromogen LAL-opløsningsbestemmelse er beskrevet af Nachum og Berzofsky i J. Clin. Microbiology 21, nr. 5, 759-763 (1985) til bestemmelse af mindst 105 gram-negative bakterieceller pr. milliliter til diagnosticering af gram-20 negativ bakteriuri ved hjælp af M.A. Whittaker, Bioproducts', Walkeville, MD-sæt (QCL-1000). Ved bestemmelsen i henhold til den nævnte artikel fortyndes urinprøver inden bestemmelsen med pyrogenfrit vand; denne fortynding er påkrævet til undertrykkelse af urinens naturlige farve til undgåelse af 25 interferens ved afløsning af bestemmelsesresultatet.

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes der en enhedsscreenings- eller prøveanordning i fast form, der er følsom overfor en urinprøve med mindst 105 gram-negative bakterier pr. ml. Ikke blojt er der ifølge opfindelsen til-30 vejebragt en screeningsanordning, der kan anvendes til bestemmelse af et klinisk signifikant bakterieniveau til diagnosticering af urinvejsinfektioner, men analyseresultatet kan aflæses enten visuelt eller med instrumenter. Dette er betydningsfuldt, eftersom praktisk taget alle andre scree-35 ningsmetoder fordrer en eller anden type instrumentation, idet resultaterne ikke kan aflæses visuelt.

4 DK Ί 69563 6Ί

Opfindelsen skal illustreres nærmere ved hjælp af tegningen, på hvilken fig. 1 viser en grafisk fremstilling af data samlet ved hjælp af den her omhandlede reagensglas/prøveanordnings-5 metode. Prøveanordningen fremstilles med et chromogent LAL--substrat indeholdende 3-aminoindol som fraspaltelig gruppe og en farvestabiliserende polymer. Den grafiske fremstilling er en computer-afsætning af reflektionskoefficient (procent reflektans), %R, som funktion af bølgelængde, λ. Farveudvik-10 lingen i prøveanordningen overvåges hvert 45. sekund efter kontakt med en reagensglasblanding fremstillet med en negativ urinprøve fastsat til at indeholde 104 celler. E. coli pr. ml.

Den punkterede linie viser prøveanordningens reflek-15 tionskoefficient (reflektans) umiddelbart efter kontakt (tid = 0). De afbrudte linier viser reflektionskoefficienten 45 og 90 sekunder senere. De fuldt optrukne linier, som overlapper, viser reflektionskoefficienten mellem 135 og 225 sekunder. Reflektionskoefficienten i % fra anordningen 20 aftager, efterhånden som farvemængden stiger. Fig. 1 viser, at der opnås stabil farve på 135 sekunder (ca. 2 minutter).

Den grafiske fremstilling viser resultaterne fra pkt. 3, side 23-24.

Fig. 2 er en grafisk fremstilling, der viser reflek-25 tionskoefficientdata samlet med en enhedsanordning i fast form. Reflektionskoefficienten i procent ved 405 nm udtrykkes som K/S, hvor K er absorptionskoefficienten, og S er spredningskoefficienten. Beregningen af K/S ud fra %R foretages med Kubelka-Munk-ligningen. Værdien af K/S tiltager, efter-30 hånden som farvemængden, der udvikles i anordningen, stiger. K/S er afsat som funktion af tiden (t) i sekunder. Efter inkubation af den kontaktede prøveanordning i 7 minutter ved 37°C følges reflektionskoefficienten ved 405 nm i 6 minutter. Enhedsprøveanordningen fremstilles ved forbehand-35 ling af papir med "Gantrez"® AN 119, der fås fra GAF Corp.,

New York, N.Y. og imprægnering af det forbehandlede papir DK 169563 B1 5 med lysat fra Associates of Cape Cod, puffer og et i handelen værende p-nitroanilid-substrat. Strimlerne dyppes i bakterie--saltvandsopløsninger. De fuldt optrukne linier i fig. 2 viser resultaterne af blindforsøg; de afbrudte linier viser 5 105 E. coli pr. ml, og de punkterede linier viser 106 E.

coli pr. ml. Drastiske forøgelser af K/S eller farve udvises af sådanne strimler, der er dyppet i de sidstnævnte prøver. Fig. 2 viser, at enhedsprøveanordningen kan give resultater, der skelner mellem negative prøver og dem, der indeholder 10 105 gram-negative bakterier. Den grafiske fremstilling viser resultaterne fra pkt. 4, side 24-25.

Opfindelsen angår således en enhedsscreeningsanordning for gram-negativ bakteriuri til bestemmelse af tilstedeværelsen af mindst 105 gram-negative bakterier pr. ml af en 15 urinprøve under anvendelse af den nedenfor angivne fremgangsmåde samt en fremgangsmåde til fremstilling af den omhandlede prøveanordning for gram-negativ bakteriuri.

Screeningsfremgangsmåden for gram-negative bakterier til bestemmelse af tilstedeværelsen af mindst 104 gram-nega-20 tive bakterieceller pr. ml af en urinprøve udføres ved, at (a) en ufortyndet urinprøve, der skal afprøves, sættes til et reagensglas indeholdende hesteskokrabbe-amebocytlysat og en første puffer, der kan holde pH indenfor pH-inter-vallet fra 6,3 til 7,5, så at der dannes en reagensglasblan- 25 ding, hvori lysatkoncentrationen er mindst 3,5 mg pr. ml af den dannede reagensglasblanding, (b) reagensglasblandingen inkuberes i tilstrækkelig lang tid til at aktivere lysatet, (c) en prøveanordning bringes i kontakt med den ak-30 tiverede reagensglasblanding, idet prøveanordningen omfatter en bærermatrix, hvori der er inkorporeret et syntetisk peptidsubstrat indeholdende en chromogen eller fluorogen afgående gruppe, der kan fraspaltes af det aktiverede lysat, og en anden puffer, der kan holde pH indenfor pH-intervallet 35 fra 8,0 til 8,9,

UK ΙΟΰΟΟι3 D I

6 (d) den i kontakt bragte prøveanordning fjernes, og (e) koncentrationen af den fraspaltede afgående gruppe bestemmes.

Denne screeningsfremgangsmåde er bekvem, billig og 5 er tilstrækkelig følsom til påvisning af koncentrationer på 104 gram-negative bakterier pr. ml urinprøve, en koncentration, som anses for klinisk signifikant, men som ofte findes hos asymptomatiske patienter.

Enhedsscreeningsanordningen ifølge opfindelsen, der 10 er af den ovenfor angivne art, er ejendommelig ved, at den omfatter (I) en bærermatrix og (II) en prøvesammensætning, der er inkorporeret i bærermatrixen, hvilken sammensætning omfatter hesteskokrabbe- 15 amebocytlysat, en divalent kation, et syntetisk peptidsubstrat med en chromogen eller fluorogen afgående gruppe, der kan fraspaltes af lysatet, en pufferkomponent, der kan holde pH indenfor et pH-interval fra 7,5 til 8,5, samt en stabiliserende komponent, der kan stabilisere lysatet.

20 Denne screeningsanordning i fast form er særlig egnet til screening af store befolkningsgrupper og har en følsomhed svarende til dyrere, tidsrøvende anordninger, der findes på markedet.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling 25 af den her omhandlede enhedsscreeningsanordning er ejendommelig ved, at den omfatter følgende trin: (A) en bærermatrix inkorporeres med en stabiliserende komponent, der kan stabilisere hesteskokrabbe-amebocytlysat, (B) tørring og 30 (C) inkorporering i den tørrede matrix af en prøve sammensætning omfattende hesteskokrabbe-amebocytlysat, en divalent kation, et syntetisk peptidsubstrat med en chromogen eller fluorogen afgående gruppe, der kan fraspaltes af lysatet, og en pufferkomponent, der kan holde pH indenfor et 35 pH-interval fra 7,5 til 8,5, og (D) tørring.

DK 169563 B1 7

Eftersom bakteriuri er så fremherskende hos befolkningen, er mange fremgangsmåder blevet udviklet for at påvise og diagnosticere dens forekomst. For øjeblikket findes der ingen screeningsmetode til bakteriuri, som er følsom over 5 for tilstedeværelsen af 104 gram-negative bakterier pr. ml ufortyndet urinprøve ved hjælp af LAL-kaskaden med et syntetisk substrat. Der findes heller ikke nogen enhedsprøveanordning i fast form, der er egnet til at påvise forekomsten af mindst 105 gram-negative bakterier pr. ml ufortyndet 10 urinprøve ved hjælp af LAL-kaskaden med et syntetisk substrat .

Prøven til påvisning af bakteriuri er baseret på den naturlige enzymkaskade, der forekommer i hestesko-krabbe-amebocytlysat. Hesteskokrabbe-amebocylysat kan 15 fås fra Limulus- eller Tachypleus-arten af krabben. Li-mulus-arten er en vestlig hesteskokrabbeart, og Limulus-lysat fås fra Associates of Cape Cod, Woods Hole, MA.

Dette er den foretrukne lysatkilde, eftersom den har vist· sig at have en ensartet kvalitet og kan fås i kon-20 centreret form, der kan anvendes i forbindelse med opfindelsen. Selv om man har ment, at lysat-kaskaden er for følsom over for tilstedeværelsen af endotoksin til at udgøre en anvendelig prøve for bakteriuri, tilvejebringer opfindelsen to systemer, der er omhyggeligt ud-25 formede til at give en positiv indikation af tilstedeværelsen af en tærskelkoncentration af gram-negative bakterier i en urinprøve, en koncentration, der anses for at være tegn på en infektion med gram-negative bakterier i urinvejene.

30 A. Normale endotoksinkoncentrationer i urin

For at kunne anvendes skal en screeningsmetode tilvejebringe en positiv indikation af en tærskelkoncentration af en analyt, der signalerer et muligt medicinsk problem, uden at give et uacceptabelt højt antal falske 35 positive prøver. Almindeligvis kræves en opfølgning efter et positivt resultat med en screeningsmetode. En DK 169563 ΒΊ δ screeningsmetodes anvendelighed beror derfor på dens mulighed for at udgøre en hurtig, bekvem og billig fremgangsmåde til konstatering af, hvorvidt der må udføres mere kostbare prøver. Med hensyn til bakteriuri skal en vel-5 lykket screeningsmetode give en positiv indikation af en ønsket koncentration af gram-negative baktierier pr. ml urinprøve uden at give en falsk positiv indikation, når der blot forekommer en normal koncentration af sådanne bakterier.

10 Selvom både instrumentale uklarhedsmålinger og gram-farvning har en følsomhed på 10^ celler pr. ml, mener nogle lægelige autoriteter, at påvisning af 104 celler pr. ml vil muliggøre udpegning af nogle asymptomatiske patienter eller patienter, hvis symptomer er vanskelige at 15 forbinde med bakteriuri. Disse patienter kunne hjælpes i de tidlige stadier af bakteriel infektion, men kan gå tabt med de for tiden til rådighed stående screeningsmetoder, såsom nitritreagensstrimler, der påviser forekomst af nitrat-reducerende bakterier (en klasse gram-negative bakterier) 20 eller leukocyt-reagensstrimler, som påviser leukocytter, der produceres af organismen på grund af en infektion.

Nachum og Berzofsky, J. Clin. Microbiology 21, nr.

5, 759-763 (1985) har vist, at normal urin kan indeholde op til 20 nanogram frit endotoksin pr. ml, en koncentration, 25 der ville vise tilstedeværelsen af 103 gram-negative bakterier pr. ml. Resultater med geleringsprøven understøtter disse resultater. Denne baggrund påvirker hverken den her omhandlede reagensglas/prøveanordningsmetode eller enhedsprøveanordningssystemet . Reagensglas/prøveanordningsmetoden 30 udføres under sådanne betingelser, at den bliver ufølsom over for sådanne endotoksinniveauer, og enhedsprøveanordningen påviser ikke frit endotoksin.

B. Reacensolas/orøveanordnincsmetoden

Der er som nævnt tilvejebragt en screeningsmetode 35 til bakteriuri, hvilken metode er følsom over for 104 gramnegative bakterier pr. ml ufortyndet urinprøve. Ved frem- DK 169563 B1 9 gangsmåden sættes den ufortyndede urinprøve til et reagensglas, der indeholder lysat og en første puffer, og der blandes og inkuberes i tilstrækkelig lang tid til at aktivere lysatet over for tilstedeværelsen af 104 gram-negative bak-5 terieceller pr. ml prøve. Dannelsen af koagulationsenzymet ved hjælp af LAL-kaskaden efter kontakt med endotoksin omtales her som aktivering. En prøveanordning, der omfatter en bærematrix, hvori der er inkorporeret en anden puffer og et syntetisk peptidsubstrat, bringes i kontakt med den ak-10 tiverede reagensglasblanding. Prøveanordningen fjernes derpå, og anordningens påviselige respons konstateres. Syntetiske substrater, der indeholder fluorogene eller chromogene fraspaltelige grupper, kan anvendes. Imidlertid foretrækker man som påviseligt respons farve, eftersom resultatet af 15 prøven derpå kan bestemmes enten visuelt eller instrumentelt ved hjælp af refleksionskoefficienten (reflektansen).

Ved at regulere lysatkoncentrationen, inkubationstiden og -temperaturen kan bestemmelsen gøres følsom overfor 104 gram-negative bakterier pr. ml urinprøve uden at påvise det 20 normale baggrundsbakterieniveau på 103. For at kunne opnå et meningsfuldt resultat for 104 celler, bør der anvendes en ren mellemstrøms-urinprøve.

1. Reagensglas fa) Lvsatet. Lysatet kan fås i lyophiliseret form 25 fra Associates of Cape Cod. Lysatmængden i reagensglasset skal være stor nok til at give en koncentration på 3,5-7 mg lysat pr. ml dannet reagensglasblanding, efter at prøven er sat til reagensglasset.

fb) Divalent kation. Til aktivering af lysatkaskaden 30 kræves en divalent kation. I handelen værende lysatpræparater indeholder calciumion som stabilisator i tilstrækkelig mængde til at aktivere lysatet. Eventuelt kan det være ønskeligt at tilsætte yderligere kation. Den divalente kation kan vælges blandt kationerne af calcium, magnesium, strontium 35 og mangan; calciumkationen foretrækkes. Hvis der anvendes en kation-frit lysatpræparat, skal der tilføjes divalent

UK I 0900*5 D I

10 kation.

(c) Første puffer. Den første puffer skal kunne modstå en pH-ændring i pH-intervallet fra 6,3 til 7,5. Natriumeller kaliumphosphat kan anvendes til at fremstille en fore-5 trukken første puffer til aktiveringstrinnet. Valg af en sådan egnet første puffer ligger inden for fagmandens kunnen.

2. Prøveanordning til reagensglas/prøveanordninosmetoden

Prøveanordningen er sammensat af en bærermatrix, hvori der er inkorporeret et syntetisk peptidsubstrat indeholdende 10 en chromogen eller fluorogen fraspaltelig gruppe, der kan fraspaltes ved hjælp af det aktiverede lysat, en puffer nr.

2, der kan modstå en pH-ændring i pH-intervallet fra 8,0 til 8,9, når den bringes i kontakt med reagensglasblandingen. Eventuelt kan der være inkorporeret en sur polymer, der kan 15 stabilisere den fraspaltede gruppe og/eller en divalent kationgruppe.

(a) Bærermatrix. Bærermatrixen kan være et hvilken som helst stof, hvori der kan inkorporeres de nødvendige komponenter, når blot stoffet er i det væsentlige indifferent 20 i forhold til disse komponenter, porøst og/eller absorberende med hensyn til urinprøven. Udtrykket "bærermatrix" refererer til enten sugende eller ikke-sugende matrixer, som er uopløselige i og opretholder deres strukturelle integritet, når de udsættes for vand eller andre fysiologiske væsker.

25 En foretrukken bærermatrix er papir, i reglen filtrerpapir af høj kvalitet, såsom det, der fås fra Whatman®, Clifton, N.J.

Inkorporering kan ske ved en hvilken som helst metode, såsom neddypning, spredning eller sprøjtning, der tillader, 30 at substratet og den anden puffer inkorporeres i bærermatrixen. Dette kan ske ved at imprægnere en papirbærermatrix med en vandig opløsning, der indeholder substratet og den anden puffer, hvorefter den tørres. Tørring kan ske på en hvilken som helst måde, der ikke på skadelig måde påvirker 35 den inkorporerede sammensætning, i reglen ved hjælp af en luftovn. Det tørrede papir kan derefter udskæres og monteres DK 169563 B1 11 på den ene ende af en understøtning, f.eks. en stiv eller halvstiv polystyrenfilmstrimmel. Når papiret skal monteres på polystyrenen, kan dette gøres ved hjælp af dobbeltsidigt adhæsivt tape, såsom det, der fås fra 3M Co., St. Paul, 5 Minnesota. Understøtningen udgør et passende håndgreb, der letter anvendelse af prøven.

(b) Syntetisk substrat. Selv om dannelsen af det naturlige slutpunkt for kaskaden, gelering, har været anvendt til at påvise bakteriuri, kan kvantitative resultater derpå 10 kun opnås ved hjælp af kostbart udstyr, der måler lysspredning. Omkostningerne ved dette udstyr gør de prøver, der for øjeblikket står til rådighed, uegnede til rutinescreening. Desuden er det blevet rapporteret, at lysspredningsmetoders følsomhed er 105 celler pr. ml.

15 Det er mere ønskeligt at anvende et syntetisk sub strat, som kan give et let skelneligt kolorimetrisk eller fluorometrisk slutpunkt. På markedet findes en række chromo-gene eller fluorogene LAL-substrater til endotoksin-LAL--prøver, og de kan anvendes sammen ved den her beskrevne 20 screeningsmetode.

Fluorogene substrater for LAL fås fra Peninsula Labs, Belmont, California, og indeholder N-methylcoumarin som fraspaltelig gruppe. Disse kan anvendes sammen med urinprøver, eftersom urins naturlige fluorescerende baggrund er 25 for lav til at bevirke signifikant interferens med prøvens ønskede følsomhed.

Chromogene syntetiske substrater er særligt foretrukne, eftersom farve kan bestemmes enten med forholdsvis enkelt og billigt apparatur eller, hvad der er mere bekvemt, visuelt 30 ved sammenligning med egnede farvekort, som udleveres til brugeren. De eneste chromogene substrater, der fås på markedet, indeholder p-nitroanilin som fraspaltelig gruppe, hvilket giver en gul farve, når den spaltes af det aktiverede lysat. Det har overraskende vist sig, til trods for det 35 frembragte gule slutpunkt, at disse p-nitroanilin-holdige substrater kan anvendes med held til at opnå den ønskede 12

UIV I0£700*5 D I

følsomhed med en urinprøve i reagensglas/prøveanordnings-systemet. Eftersom kliniske urinprøver imidlertid kan være stærkt farvede, f.eks. urin med høj massefylde, foretrækkes anvendelse af syntetiske substrater, der kan danne en anden 5 farve end gul.

Egnede chromogene substrater har den almene formel B-{A1}n-A2“G1y"Ar9"1 10 hvor n er tallet 0 eller 1, A^ er valin eller leucin, A2 er leucin eller serin,

Gly er glycin.

Arg er arginin, 15 B er en blokerende gruppe for den endestillede aminogruppe, og I er en chromogen indikatorgruppe.

De blokerende grupper t-butyloxycarbonyl, a-cetyl, benzoyl eller tosyl er fortrukne, idet t-butyl-20 oxycarbonyl (tBOC) er særlig fortrukket. Der kan anvendes andre ækvivalente aminosyresekvenser, men i reglen foretrækkes sådanne, der har en glycin-arginin-sekvens, der støder op til den fraspaltelige afgående gruppe.

De foretrukne chromogene.indikatorgrupper er 25 sådanne, hvor I har en af formlerne 1^ og l2

"øcT r/Y

*1 (I1> /7C\ (I2> 30 · VC—/ hvor Y er en hydroxy- eller aminogruppe, X er svovl, nitrogen eller oxygen, R1 er en lavere alkyl-, aryl-, amido- eller cya-nogruppe, og 35

O

DK 169563 B1 13 1*2 kan være en enkelt eller flere substitu- enter, der er ens eller forskellige, såsom hydrogen, lavere alkyl, aryl eller fortrinsvis elektron-fjernende grupper, såsom chlor og 5 nitro.

Indikatorgruppen er bundet til arginin ved hjælp af Y, så at der dannes en amid- eller esterbinding, der kan spaltes ved indvirkning af det koagulationsenzym, der dannes sammen med aktivering af lysatet.

10 Lavere alkylgrupper er alkylgrupper med 1-4 carbonatomer. Omfattet af betydningen "lavere alkyl" er methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, sek.-butyl og tert.butyl. Grupperne kan eventuelt være substituerede^ forudsat, at substitueringerne ikke griber ind i den en-15 zymatiske spaltning af amid- eller esterbindingen.

Udtrykket "aryl" har den normale betydning, der er velkendt for fagmænd inden for syntetisk organisk kemi, dvs. en organisk gruppe afledt fra et aromatisk carbonhy-drid ved fjernelse af ét atom, f.eks. phenyl fra benzen.

20 En sådan substituent kan eventuelt også være substitueret forudsat, at eventuelle substituenter ikke griber ind i den enzymatiske spaltning af ester- eller amidbindingen af koagulationsenzymet. Disse substrater er i reglen substrater for arginin-specifikke proteaser. Imid-25 lertid er koncentrationen af sådanne proteaser i urin så lav, at den ikke griber ind i bakteriuriprøvens følsomhed.

Et særlig foretrukkent chromogent substrat er

30 t-BOC-Leu-Gly-Arg-NH |T

H

✓ hvor indikatorgruppen I og bindingsgruppen Y danner 3-35 -aminoindol.

14 Når 3-aminoindol-substratet anvendes, skal der inkorporeres en koblingskomponent i prøveanordningen for at få et kolorimetrisk respons. Egnede koblings-komponenter er diazonium-forbindelser, såsom 2-methoxy-5 -4-morpholinobenzen-diazonium-chlorid, 2,4-dichlorbenzen-diazonium, 2,6-dichlorbenzen-diazonium, 5-chlor-2-meth-oxybenzen-diazonium ("Past Red RC") og 2,3'-dimethylazo-benzen-diazonium ("Past garnet GBC"). Diazo-saltet 2--methoxy-4-morpholinobenzen-diazonium-chlorid (MMBD) fo-10 retrækkes. Prøveanordningøn, der således fremstilles og anvendes, bliver lyserød, når urinprøven, der bringes i kontakt hermed, indeholder 104 bakterieceller pr. ml. En vinrød farve ses, når bakteriekoncentrationen er 106 celler pr. ml.

15 (cl Anden puffer. Den anden puffer skal kunne modstå en pH-ændring i pH-intervallet fra 8,0 til 8,9. En foretrukken puffer er tris (hydroxymethyl) aminomethan (almindelig kendt som TRIS).

(d) Sur polymer. For at opnå en farvestabil 20 prøve ved hjælp af reagensglas/prøveanordningsmetoden kan en sur polymer, der kan stabilisere den fraspaltede afgående gruppe, inkorporeres i bærermatrixen. Egnede forbindelser omfatter forbindelser såsom methylvinyl-ether og maleinsyre, der fås under varemærket "Gantrez"® 25 hos GAF, New York, N.Y. Når man anvender det foretrukne 3-aminoindol-substrat med et diazoniumsalt i en papirbærer, der er forbehandlet med "Gantrez'®, fås et purpurfarvet slutpunkt, som er stabilt i dagevis.

(e) Divalent kation. Der kan eventuelt inkor-30 poreres yderligere divalent kation i bæreren. Lignende kationer som dem, der anvendes i lysat-aktiveringstrinnet, kan også anvendes på dette stadium. Calciumion foretrækkes.

(3) Anvendelse 35 En alikvot mængde af en ren, midtstrøms opfan get urinprøve kommes i reagensglasset, der indeholder en DK 169563 B1

O

15 første puffer og tilstrækkeligt lysat til at give en slut-koncentration på fra 3,5 til 7 mg/ml dannet reagensglasblanding. Reagensglasblandingen inkuberes i tilstrækkelig tid til at aktivere lysatet, og prøveanordnin-5 gen, der er inkorporeret som tidligere beskrevet, bringes i kontakt med den inkuberede blanding. Den kontaktede prøveanordning fjernes, og koncentrationen af den fraspaltede afgående gruppe bestemmes enten visuelt eller ved hjælp af apparatur. Der anvendes normale sterile proce-10 durer, men en forbehandling af prøven er unødvendig.

Den nødvendige aktiveringstid afhænger af den prøvefølsomhed, der ønskes. En prøve, der er følsom over for 104 bakterier pr. ml prøve, kræver længere inkuba- 5 tionstid end en prøve, der kun er følsom over for 10 15 bakterier. Imidlertid må aktiverings tiden ikke være så lang, at der opstår følsomhed for baggrundsforurening. Aktivering sker hurtigere ved forhøjede temperaturer end ved stuetemperatur. Når der f.eks. anvendes et lysat, der fås fra Associates of Cape Cod, er inkubation i 15 minutter 20 ved 37°C eller 45 minutter ved stuetemperatur (25°C) således nødvendig til aktivering for at få en prøve, der 4 er følsom over for 10 E.coli pr. ml ufortyndet urin.

En prøve, der er følsom over for 105 celler pr. ml urin, kan fås med en inkubationstid på 30 minutter ved 25°C.

25 Fastsættelsen af den tid og temperatur, der er nødvendig for at opnå en ønsket følsomhed, ligger inden for en fagmands kunnen under hensyn til det her anførte.

Koncentrationen af den fraspaltede afgående gruppe kan bestemmes i løbet af 2-5 minutter, efter at 30 prøveanordningen er bragt i kontakt med den aktiverede reagensglasblanding. Når der er inkorporeret 3-araino-indol-sub’strat og diazoniumforbindelse i en bærer, der ' ikke er forbehandlet med en stabilisator for den afgående 3-aminoindol-gruppe, kan den dannede farve stabilise-35 res ved at dyppe den omsatte prøveanordning i en 25%'s (volumen) eddikesyreopløsning.

DK 169563 B1 16

Reagensglas/prøveanordningssystemet giver en prøve med større følsomhed over for tilstedeværelsen af gram-negative bakterier i en urinprøve end hidtil rapporteret for prøver, der findes på markedet. Desuden kan 5 prøven udføres på mindre end én time, selv om der anvendes inkubation ved stuetemperatur.

B. Enhedsprøveanordning i fast form

Der kan fremstilles en enhedsprøveanordning med et syntetisk substrat til LAL-prøven, som giver samme 10 følsomhed over for bakteriuri (105 celler pr. ml urin) som de fremgangsmåder, der for tiden er tilgængelige under anvendelse af LAL-geleringsprøven, og som kræver kostbart udstyr. Enhedsprøveanordningen er sammensat af en bærer-matrix, hvori der er inkorporeret en prøvesammensætning 15 bestående af lysat, en divalent kation, et syntetisk substrat, en pufferkomponent og en lysat-stabiliserende komponent. Enhedsprøveanordningssystemet udgør en hurtig, bekvem og billig pr#ve, der er særlig egnet til screening af store befolkningsgrupper.

20 Bærermatrixen kan være en hvilken som helst af de tidligere beskrevne, når den blot kan rumme tilstrækkelige reagenser, især lysat, til at give en prøve med den ønskede følsomhed. Sugende matrixer, især papir, foretrækkes. Inkorporering i og tørring af matrixen kan 25 ske på en hvilken som helst af de tidligere beskrevne måder. En lysatkoncentration i inkorporationsopløsningen på ca. 15 mg/ml foretrækkes. Et særligt interessant a-spekt ved en enhedsprøveanordning, i hvilken der anvendes en papirmatrix, er, at den ikke reagerer på tilste-30 deværelsen af frit endotoksin, men er følsom over for tilstedeværelse af 105 gram-negative bakterier pr. ml u-rin . Denne anomali understreger vanskeligheden ved at overføre de endotoksin-prøvesystemer, der for øjeblikket står til rådighed, til et enheds-prøveanordningssystem i 35 fast form.

O

DK 169563 B1 17

Lysatet, divalent kation og syntetiske substrater er tidligere blevet beskrevet. Foretrukne syntetiske substrater er de på markedet værende, der tidligere er blevet omtalt, med p-nitroanilin som afgående gruppe.

5 For at opnå en enhedsprøveanordning inkorporeres en pufferkomponent, der kan modstå en pH-ændring i pH-området fra pH 7,5 til pH 8,5, fortrinsvis 7,5-8,0. Tris--(hydroxymethyl)-aminomethan er en foretrukken pufferkomponent .

10 Foruden de ovenfor omtalte prøvekomponenter, når alle de komponenter, der er nødvendige for en chromo-gen LAL-prøve, er inkorporeret i en bærermatrix, såsom papir, er det nødvendigt at tilføje et stabiliseringsmiddel, som stabiliserer proenzymerne i lysatet. Denne 15 stabiliseringskomponent kan være en neutral eller negativt ladet polymer og kan vælges blandt gelatine-inter-polymere af methylvinylether og maleinsyreanhydrid eller polymere af ethylenglycol og isooctylphenylether. Interpolymerene kan gengives ved formlen 20 H R ; i --C =C CH—CH-- . ΛΛ — _ n hvor R er C^^^g-alkyl, ether, acetat eller benzyl, og n er et helt tal fra 2 til det samlede antal gentagelsesenheder i polymeren.

30 En foretrukken interpolymer er poly(methylvi ny lethoxymaleinsyreanhydrid) , der fås fra GAF, New York, N.Y., under navnet "Gantrez" ^ Polyethylenglycol-p--isooctylphenylether kan gengives ved formlen 35 ?H3 i3 r\

CH3C(CH3)2CH2 - C —^ y—0(CH2CH20)xH

ch3 DK 169563 Bl 18

En foretrukken polyethylenglycol-p-isooctyl-phenylether fås under navnet "Triton1^X-100 fra Rohm &

Haas, Philadelphia, PA. Den stabiliserende komponent inkorporeres fortrinsvis i papirmatrixen før inkorpore-5 ring af lysatet.

Ved brug dyppes enhedsprøveanordningen i en ufortyndet urinprøve. Enhedsanordningen inkuberes derpå ved 37°C i et lukket kammer i 15-20 minutter, fortrinsvis med en negativ kontrol. Som tidligere anført 10 kan inkubationens varighed og temperatur varieres. I-midlertid foretrækkes en temperatur på 37°C frem for en lavere temperatur, f.eks. 25°C. En hvilken som helst farvegrad, der er højere end kontrollens, viser, at prøven er positiv. Parve kan stabiliseres med henblik på 15 senere aflæsning ved at dyppe strimlen i 25 eller 50%'s (volumen) eddikesyre. Der anvendes normale sterile procedurer, men der kræves ingen forbehandling af prøven.

Prøven bør være en ren, midtstrøms opfanget urinprøve. Enhedsprøveanordningen reagerer ikke på frit endotoksin 20 i en vandig opløsning, selv om den fungerer således, at 5 den kan skelne tilstedeværelsen af 10 bakterier fra en negativ prøve.

De følgende eksempler beskriver udførte forsøg, hvoraf pkt. 4 illustrerer opfindelsen.

25 1 35 DK 169563 B1 19 o

Der anvendes følgende forkortelser: t-BOC tert.butyloxycarbonyl DMF dimethylformamid

Arg arginin

Leu leucin 5 , .

Gly glycm L- venstredrejende MS massespektrometri FAB hurtigt atombombardement (ved MS) 10 22 o

[a] p optisk rotation ved 22 C

ved en bølgelængde for D-linien for natrium på 5898 Å CBz carbobenzyloxy 1. Fremstilling af standardpræparater - E. coli-skråkulturer fås fra Quality Assurance Department i Ames Division, Miles Laboratories, Inc.

10 ml næringsvæske inokuleres med E.coli og inkuberes ved 37°C i 16-18 timer. Denne vækstperiode giver i 20 reglen 1010 E.coli pr. ml næringsvæske. Den faktiske E.coli-koncentration bestemmes ved at fortynde næringsvæsken 7 og 8 gange og udstryge lOO^uliter af hver fortynding på blodagarplader. Eftersom hver organisme kun producerer én koloni, fås antallet af organismer i 100 25 pliter fortynding ved at tælle de kolonier, der viser sig på agaren efter inkubation natten over ved 37°C.

Den mængdebestemte næringsvæske anvendes til at fremstille passende E.coli-fortyndinger til LAL-prø-ven og anvendes inden for én uge. Denne metode sikrer 30 en ensartet mængde frit endotoksin i næringsvæsken mod at spredes under vækst og/eller celledød.

2. · Fremstilling af foretrukkent chromogent substrat

Alle de aminosyrer, der anvendes ved syntesen, har venstredrejende konfiguration.

35

O

DK 169563 B1 20 3-Aminoindol (I)

En rundbundet kolbe på 250 ml udstyret med en kondensator, et tørrerør og en yderligere tilsætningstragt skylles med argon i 15 minutter. Derpå anbringes 1,3 g (57 mmol) natrium, der er frisk skåret i små styk-ker, og lO^uliter vandfri ethanol i den rundbundede kolbe efterfulgt af tildrypning af 9 ml vandfri ethanol. Når tilsætningen af vandfri ethanol er afsluttet, og reaktionsblandingens milde tilbagesvaling er aftaget, opvarmes reaktionsblandingen til mild tilbagesvaling i 15 minutter. Derpå fjernes varmekilden, og der tilsættes 5 g (45 mmol) indol. Reaktionsblandingen omrøres, indtil al indol er opløst. Der tildryppes 12 ml isoamylnitrit (89 mmol), som er tørret med vandfrit kaliumcarbonat før brug, i løbet af et tidsrum på 30 minutter. Reaktionsblandin-15 gen omrøres ved stuetemperatur under argon natten over.

Reaktionsblandingen inddampes for at fjerne alkohol, og der tilsættes 100 ml destilleret vand. Den opnåede blanding opvarmes til kogning, tinder argon til-2Q dryppes en opløsning af 30 g (540 mmol) kaliumhydroxid og 23 g (132 mmol) natriumdithionit i 125 ml destilleret vand. Der begynder at fraskilles et mørkegrønt fast stof, og opløsningen får en lysere farve og bliver til sidst gul. Efter tilsætningen af kaliumhydroxid/natri-umdithionit-opløsningen tilsættes 100 ml destilleret vand, og reaktionsblandingen opvarmes til kogning i 10 minutter. Det mørkegrønne faste stof filtreres fra den varme opløsning under argon. Gule krystaller i pladeform skilles ud fra det gule filtrat ved afkøling under ar-30 gon. De gule krystaller opsamles og omkrystalliseres fra varmt vand, hvilket giver 2,7 g lysbeige krystaller, I (udbytte-48%), smeltepunkt 120°C (bliver mørke), MS (FAB, M+ = 132, 100%) .

35

O

DK 169563 B1 21 t-BOC-L-Leu-Gly (II)

En opløsning af 5 g (20 mmol) t-BOC-L-Leucin og 2,3 g (20 mmol) N-hydroxysuccinimid i 25 mol vandfri dimethylformamid afkøles under argon i isbad.

_ Der tilsættes 4,5 g (22 mmol) dicyclohexylcar- 5 bodiimid, og reaktionsblandingen omrøres i isbad i 3 timer. Der tilsættes en opløsning af 1,5 g (20 mmol) gly-cin og 3,4 g (400 mmol) natriumbicarbonat i 48 ml destilleret vand, og den opnåede blanding får lov at varme 1Q langsomt op til stuetemperatur og omrøres natten over.

Det hvide faste stof udskilles og filtreres fra, og filtratet justeres til pH 3 med 6N saltsyre. Derpå ekstra-heres opløsningen to gange med ethylacetat. Ethylacetat-ekstrakten tørres over vandfrit magnesiumsulfat og ind-15 dampes først på roterende fordamper og derpå under højt vakuum. Inddampningen giver 8 g olieremanens. Efter · lynchromatografi ved hjælp af 170 g silicagel og CH2C12/ CH^OH/NH^OH = 80:20:2 efter volumen som elueringsopløs-ningsmiddel fås 2,73 g hvidt fast stof, der er t-BOC-L-2o -Leu-Gly-ammoniumsalt. Ca. 2,3 g af ammoniumsaltet opløses i 20 ml destilleret vand, og opløsningen indstilles ?å pH 3 med 6N saltsyre. Den frie syre ekstrahe-res to gange med ethylacetat (ialt 100 ml). Ethylace-tatopløsningen tørres over magnesiumsulfat, inddampes 25 °9 giver 2,1 g hvidt fast stof, II, smp, 116-117,5°C, MS

(FAB, M + 1 a 289), [α]22β = -28,2° (C = 1,15, CH3OH).

Analyse: Beregnet for ci3H24N2°5: C 54,15, H 8,39, N 9,71.

Fundet: C 54,26, H 8,37, N 9,62.

30

Ne-CBz-N/vrnitro-L-Arg-3-indolylamid (III)

Under argon afkøles en opløsning af 13,4 g ' (37,8 mmol) Na-CBz-N^j-nitro-L-arginin og 5,3 ml (37,8 mmol) triethylamin i 82 ml vandfri dimethylformamid til 35 -20°C i et methanol/tøris-bad. Der tilsættes 5 ml (37,8 mmol) isobutylchlorformiat, og reaktionsblandingen omrø-

O

DK 169563 B1 22 res ved -20°C i 45 minutter. Derpå tilsættes 2,80 g (21,2 mmol) 3-aminoindol, og den opnåede blanding får lov at varme langsomt op til stuetemperatur og omrøres natten over. Der sættes destilleret vand til reaktionsblandin-5 gen, og der tilsættes 5%'s natriumbicarbonat, indtil pH 9 er nået. Derpå ekstraheres opløsningen to gange med ethylacetat (250 ml). Ethylacetatekstrakten tørres over vandfrit magnesiumsulfat og inddampes, hvilket giver en lys brunliggrøn olieremanens. Olien underkastes lynchro-1Q matografi med 170 g silicagel og CH2C12/CH30H = 95:5 efter volumen som elueringsopløsningsmiddel. Omkrystallisation fra CH2C12/CH30H giver som udbytte 5,18 g (53%) hvide krystaller, III, smeltepunkt 202-203°C, MS (FAB, M + 1 = 468), [d]22d = + 13,1 (C = 1,08, DMF).

15 Analyse: Beregnet for C22H25N7°5: C 56,52, H 5,39, N 20,97.

Fundet: C 56,32, H 5,40, N 20,77.

L-Arg-3-indolylamid . 2HOAc (IV) 2o 0,93 g (20 mmol) Nq-CBz-N^-nitro-L-Arg-3-indo- lylamid opløses i 25 ml vandfri ethanol og 25 ml iseddike under forsigtig opvarmning, hvilket giver en lysegul opløsning. Derpå tilsættes 500 mg 10%’s palladium på carbon (Pd/C), og blandingen hydrogeneres under 3,52 2' 25 kg/cm hydrogengas i 15 timer. Blandingen filtreres, og filtratet inddampes, hvilket giver en lysegrøn olieremanens. Efter lynchromatografi med 63 g silicagel og CH2C12/CH30H = 1:1 efter volumen som elueringsopløsningsmiddel fås 300 mg lysebrunt fast stof som anført i 30 overskriften. Udbytte 37%, MS (FAB, M + 1 = 289).

Analyse: Beregnet for C^H2QNg0.2H0Ac.3H20: C 46,75, H 7,41, N 18,17 Fundet: C 46,73, H 7,12, N 17,93.

35

O

DK 169563 B1 23 t-BOC-L-Leu-Gly-L-Arg-3-indolylamid (V)

Under argon afkøles en opløsning af 158 mg (0,55 mmol) t-BOC-L-Leu-glycin og 0,077 ml triethylamin (0,55 mmol) i 1,6 ml vandfri dimethylformamid til -20°C 5 i et methanol/tøris-bad. Der tilsættes 0,070 ml (0,55 mmol) isobutylchlorformiat, og den opnåede reaktionsblanding omrøres ved -20°C i 25 minutter. Der tilsættes en opløsning af 200 mg (0,49 mmol) L-Arg-3-indolyl-amid.2HOAc og 0,070 ml (0,49 mmol) triethylamin i 1,1 10 ml vandfrit dimethylformamid,og den fremkomne reaktionsblanding får lov at varme langsomt op til stuetemperatur og omrøres natten over. Der sættes destilleret vand til reaktionsblandingen, og opløsningen justeres til pH 7,2 med 5%'s natriumhydroxid. Opløsningen inddampes 15 derpå, hvilket giver en olieremanens, som efter lynchro-matografi ved hjælp af C^Clg/CH^OH/NH^OH = 80:20:5 efter volumen som elueringsopløsningsmiddel omkrystalliseres fra CH30H/H20, hvilket giver 200 mg hvidt fast stof som nævnt i overskriften, udbytte 67%, smeltepunkt 20 125°C (blødgøres), MS(FAB, M + 1 = 559), [a]22D = -25,2° (C - 1,06, CH^OH); højt resolutionsmassespektrum (positiv ion-måde):

Beregnet for ^21^42^8^5 + ^ = 559,33559

Fundet: = 559,33563.

25 3. Reagensglas/prøveanordningssystem

Et reagensglas, der er egnet til brug ved reagens-glas/prøveanordningsmetoden med 100 mikroliter urinprøve fremstilles ved at sætte 50^,uliter 100 mM phosphat-30 puffer og 1,7 mg lysat, der fås fra Associates of Cape Cod, Woods Hole, MA, til reagensglasset. "Wh'atma^' 31 ET-papir dyppes i en 2%'s (w/w) vandig-opløsning af' "Gantre^· AN-119, der fås fra GAF,· New York, N.Y., pufret mellem pH 8 og 9 med tris(hydroxymethylJaminomethan. Der-35 på tørres papiret i en luftovn ved 50°C i 10 minutter.

Det tørrede forbehandlede papir dyppes i en opløsning, DK 169563 B1 24

O

puf ret til pH 8,7, indeholdende 10 mM calciumion/ 1 inM indolsubstrat (V) og 0,24 mM 2-methoxy-4-morpholino-benzen-diazoniumchlorid. Det dobbelt præparerede papir tørres igen ved 50°C.

5 En lOOyUliter alikvot mængde af en rent opta get urinprøve anbringes i reagensglasset, og reagensglasblandingen, der dannes, inkuberes ved 37°C i 15 minutter. Prøveanordningen, der dannes ved at fiksere et stykke af det dobbelt tørrede og imprægnerede papir på 10 en plastunderstøtning som håndgreb, dyppes i den inkuberede reagensglasblanding og fjernes. To minutter efter kontakt med blandingen aflæses farveudviklingen i den reagerede prøveanordning. Resultaterne er vist grafisk i fig. 1. Systemet kan påvise 10^ celler pr. ml.

15 Prøveanordningen antager mørkere nuancer purpurrødt, efterhånden som E.coli-koncentrationen forøges til 10^ celler pr. ml. Farveudviklingen ophører hovedsagelig efter ca. 2 minutter. Sammenlignelige resultater opnås, når reagensglasblandingen inkuberes ved 25°C (stuetem-20 peratur) i 45 minutter. Der opnås sammenlignelig følsomhed (10^) med Eaton og Dikemari^ 205-papir som-bærer.

4. Enhedsprøveanordning i fast form

En enhedsprøveanordning i fast form, der er 5 følsom over for tilstedeværelsen af mindst 10 celler 25 pr. ml urin;fremstilles på følgende måde. Eaton og Dike- man® 205-papir dyppes i en 2%'s opløsning af "Gantrez'® AN 119 fra GAF, New York, N.Y. justeret til pH ca. 7,5 med natriumhydroxid. Det forbehandlede papir tørres ved 50°C i mindst 10 minutter. Der fremstilles enJLy-30 satopløsning ved at rekonstituere lysat ("Pyrotelr**1 fra Associates of Cape Cod) i en vandig opløsning pufret til ca. pH 7,8 med 50 mM Tris-puffer. Opløsningen indehol- ' (r! der også ca. 1,1 mM "Spectrozymé-'" LAL-substrat fra American Diagnostica, Greenwich, CT. "Spectroenzymi^' er 35 et tripeptid med p-nitroanilin som afgående gruppe (a-

O

DK 169563 B1 25 cetyl-D-h^xahydrotyrosin-glycin-arginin-p-nitroanilin). "Pyrotelr^'-tilberedningen indeholder calciumion og andre stabilisatorer.

Det tørrede forbehandlede papir dyppes i ly-5 satopløsningen og tørres igen ved 50°C i ca. 10 minutter. Det dobbelt tørrede og imprægnerede papir skæres i rektangulære små stykker og fikseres på en polystyrenunderstøtning med dobbeltsidigt klæbestof. Anordningen bringes i kontakt med en urinprøve, fjernes og inkube-10 res ved 37°C i ca. 15 minutter, og der aflæses en reflektionskoefficient. Resultaterne, der ses i fig. 2, viser enhedsprøveanordningens evne til at skelne 10^ celler pr. ml fra en negativ prøve. Lignende resultater er opnået med "Mallinkrod^'-substrat i "Color Lysate Chemistry"-15 sættet.

Eksperimentelle forsøg på at anvende prøveanordningen med opløsninger, der kun indeholder frit en-dotoksin, viser, at enhedsprøveanordningen ikke er følsom over for frit endotoksin.

20 25 1 35

Claims (4)

1. Enhedsscreeningsanordning for gram-negativ bak-teriuri til bestemmelse af tilstedeværelsen af mindst 105 gram-negative bakterier pr. ml af en urinprøve under anven- 5 delse af en fremgangsmåde, ved hvilken (a) en ufortyndet urinprøve, der skal afprøves, sættes til et reagensglas indeholdende hesteskokrabbe-amebocytlysat og en første puffer, der kan holde pH indenfor pH-interval-let fra 6,3 til 7,5, så at der dannes en reagensglasblan- 10 ding, hvori lysatkoncentrationen er mindst 3,5 mg pr. ml af den dannede reagensglasblanding, (b) reagensglasblandingen inkuberes i tilstrækkelig lang tid til at aktivere lysatet, (c) en prøveanordning bringes i kontakt med den ak-15 tiverede reagensglasblanding, idet prøveanordningen omfatter en bærermatrix, hvori der er inkorporeret et syntetisk peptidsubstrat indeholdende en chromogen eller fluorogen afgående gruppe, der kan fraspaltes af det aktiverede lysat, og en anden puffer, der kan modstå en pH-ændring i pH-inter-20 vallet fra 8,0 til 8,9, (d) den i kontakt bragte prøveanordning fjernes, og (e) koncentrationen af den fraspaltede afgående gruppe bestemmes, kendetegnet ved, at anordningen omfatter 25 (I) en bærermatrix og (II) en prøvesammensætning, der er inkorporeret i bærermatrixen, hvilken sammensætning omfatter hesteskokrabbe-amebocytlysat, en divalent kation, et syntetisk peptidsubstrat med en chromogen eller fluorogen afgående gruppe, der 30 kan fraspaltes af lysatet, en pufferkomponent, der kan holde pH indenfor et pH-interval fra 7,5 til 8,5, samt en stabiliserende komponent, der kan stabilisere lysatet.

2. Enhedsscreeningsanordning ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den stabiliserende komponent er 35 valgt blandt gelatine, interpolymere af methylvinylether og maleinsyreanhydrid og polyethylenglycol-p-isooctylphenyl- DK 169563 B1 27 ether.

3. Enhedsscreeningsanordning ifølge et hvilket som helst af kravene 1 og 2, kendetegnet ved, at den chromogene afgående gruppe er p-nitroanilin. 5

4. Fremgangsmåde til fremstilling af en enhedsscree ningsanordning for gram-negativ bakteriuri ifølge krav 1-3, kendetegnet ved, at den omfatter følgende trin: (A) en bærermatrix inkorporeres med en stabiliserende komponent, der kan stabilisere hesteskokrabbe-amebocytlysat, 10 (B) tørring og (C) inkorporering af den tørrede matrix med en prøvesammensætning omfattende hesteskokrabbe-amebocytlysat, en divalent kation, et syntetisk peptidsubstrat med en chromogen eller fluorogen afgående gruppe, der kan fraspaltes af lysa- 15 tet, og en pufferkomponent, der kan holde pH indenfor et pH-interval fra 7,5 til 8,5, og (D) tørring.