JPH06341993A - グラム陰性細菌尿症のスクリーニング用一体化試験具 - Google Patents

グラム陰性細菌尿症のスクリーニング用一体化試験具

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JPH06341993A
JPH06341993A JP5268883A JP26888393A JPH06341993A JP H06341993 A JPH06341993 A JP H06341993A JP 5268883 A JP5268883 A JP 5268883A JP 26888393 A JP26888393 A JP 26888393A JP H06341993 A JPH06341993 A JP H06341993A
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Angela A Michaels
アンゲラ・エー・ミハエルス
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 尿試料中のグラム陰性細菌の存在を１０5 細
胞/ml の検出感度で測定するための（ａ）担体マトリッ
クス；及び（ｂ）担体マトリックスに包含された試験組
成物からなる一体化されたグラム陰性細菌尿症スクリー
ニング用試験具であって、該組成物がカブトガニ・アメ
ボサイト・ライセート、二価陽イオン、該ライセートに
より開裂されうる発色性又は発蛍光性脱離基を有する合
成ペプチド基質、pHを７．５から８．５の範囲に保ちう
る緩衝剤成分及びライセートを安定化することができる
安定化成分を含む試験組成物であることを特徴とする試
験具。 【効果】 本発明によれば、グラム陰性細菌尿症の迅速
・簡便なスクリーニングが可能になる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、グラム陰性菌について
尿試料をスクリーニングするために有用な一体化固体状
試験具及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】「グラ
ム陰性細菌尿症」という表現は、グラム陰性菌が原因と
なっておこる尿路感染に言及するのに使用される。尿路
感染は、症状、再発及び複雑にからみ合う因子に基づい
て４つのカテゴリーに分類される。合併症のない急性の
グラム陰性細菌尿症は自然に消えるかもしれないが、通
常それに続いて執ような又は再発性の細菌尿症がおこ
り、長期にわたる薬剤療法が必要となることもある。他
の３つのカテゴリーの細菌尿症は、もし治療されなけれ
ば腎感染又は死をもたらすかもしれない。更に加えて、
グラム陰性細菌尿症は、体中に拡がり体を衰弱させて
も、それに伴う症候は識別するのが難しく、いわゆる無
症候性の患者の部類となることもある。
【０００３】尿試料の培養は試料１ml当り１０4 個の細
菌濃度を検出することができ、この濃度は正常なグラム
陰性菌含有量のカットオフとして時々使われるものであ
るが、培養結果は少なくとも１８〜２４時間は得られ
ず、熟練した人員を必要とし、結果を得るには費用がか
かる。顕微鏡検査はより迅速で約４５分を必要とする
が、１ml当り１０5 個の細菌にしか感度を示さず、また
熟練した人員を必要とする。いずれの方法もスクリーニ
ング法としては考えられなかった。迅速で便利で費用の
かからないスクリーニング法は、学童や軍人のような集
団における大規模な検査に特に有用であろう。
【０００４】リムルス・アメボサイト・ライセート〔Li
mulus Amebocyte Lysate（ＬＡＬ）〕試験は、あるカニ
の種から抽出した天然物質由来のライセートの使用に基
づく。このライセートは前酵素と天然の基質凝固原を含
有することが最近判明した。このライセートのカスケー
ドはグラム陰性菌の細胞壁の一成分であるエンドトキシ
ンにより活性化される。このカスケードの活性化によ
り、当然のこととしてゲル終点の形成がおこる。
【０００５】ゲル化ＬＡＬ試験のための試薬を含む透明
管からなる装置が、ヨーロッパ特許第０ １２１ ８６
８号においてエンドトキシンを測定するために開示され
ている。任意の試験体液を分析できる。エンドトキシン
が尿中に存在することは、またエンドトキシンによるリ
ムルス・アメボサイト・ライセート酵素カスケードの活
性化がもたらす濁度を検出することができる計器を用い
て、細菌尿症が存在することと関連づけられている。エ
ンドトキシンによるこのカスケードの活性化後の濁度の
程度が測定され、細菌尿症の存在と関連づけられてい
る。検出限界は試料１ml当り１０5 個の細菌であると報
告されているが、必要な装置が高価であるためにこの方
法はスクリーニング法としては考えられない。
【０００６】最近、発色性もしくは発蛍光性基を含有す
る合成ペプチド基質が使用されるようになってきたが、
これらはＬＡＬカスケードがエンドトキシンにより活性
化される際に生成される凝固酵素により開裂されうるも
のである。種々の合成基質が開示されている。例えば、
英国特許第１，５４７，７４７号及び米国特許第４，１
８８，２６４号を参照されたい。一般に、２つのアミノ
酸の配列、グリシン−アルギニンが、凝固酵素による発
色性又は発蛍光性脱離基の開裂に必要不可欠であること
が判明している。ニトロフェニル、メチルクマリン誘導
体、ｐ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン）アニリン及びイン
ドキシルのような開裂しうる脱離基が開示されている。
日本特許公報第５６−４２５９７号は、尿をはじめとす
るあらゆる体液内のエンドトキシンの測定について開示
しているが、その測定には開裂生成物が１−ナフトール
−２−スルホン酸と反応して青色を呈する基質が用いら
れる。
【０００７】発色性又は発蛍光性基質は、主に静脈中の
溶液及び血液中のエンドトキシンの試験に用いられてい
る。血液中での測定は細菌血症（血中の細菌感染）に関
連づけられている。血中のエンドトキシン測定は、ＬＡ
Ｌカスケードの阻害物質が存在するために複雑である。
大部分の特許や文献資料は、この妨害因子の除去か新し
い合成基質のいずれかを目指したものである。例えば、
エンドトキシンの測定に必要とされる妨害因子の除去を
目指しているヨーロッパ特許出願第０ ８０６４９号を
参照されたい。この明細書には、開示されている妨害因
子除去法を細菌尿症の測定に応用することが述べられて
いる。
【０００８】特開昭第５６−３５９９４号はエンドトキ
シンの測定用装置を開示しているが、この装置はライセ
ートから分離されている酵素前駆体を有する部分と、隔
離された容器に密封された光学的に測定可能なペプチド
基質を有する部分を含んでいる。
【０００９】ザ・フィットテーカー、エム・エー、バイ
オプロダクツ、ウオークヴィル、エムディ・キット（th
e Whittaker, M. A., Bioproducts, Walkeville, MD ki
t)（ＱＣＬ−１０００）を用いて、グラム陰性細菌尿症
の診断のための１ml当り１０5 個のグラム陰性菌細胞の
測定用の発色性ＬＡＬ溶液試験が開示されている〔ナッ
カム及びベルゾフスキー（Nachum and Berzofsky), J.
Clin. Microbiol., 759-763, 1985 〕。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、尿試料１ml当
り１０5 個の細菌に対して感度を有する固体状試験具を
提供するものである。本発明は、尿試料１ml当り少なく
とも１０5 個のグラム陰性菌の測定のための一体化試験
具及びその製造方法を提供する。
【００１１】本発明の一体化固体状グラム陰性細菌尿ス
クリーニング試験具は、尿試料中のグラム陰性細菌の存
在を１０5 細胞/ml の検出感度で測定するための（ａ）
担体マトリックス；及び（ｂ）担体マトリックスに包含
された試験組成物からなる一体化されたグラム陰性細菌
尿症スクリーニング用試験具であって、該組成物がカブ
トガニ・アメボサイト・ライセート、二価陽イオン、該
ライセートにより開裂されうる発色性又は発蛍光性脱離
基を有する合成ペプチド基質、pHを７．５から８．５の
範囲に保ちうる緩衝剤成分及びライセートを安定化する
ことができる安定化成分を含む試験組成物であることを
特徴とする試験具である。
【００１２】この一体化固体状試験具は大規模な集団群
をスクリーニングするのに特に便利なフォーマットであ
り、現在市販されている、より費用がかかりしかも時間
を要するフォーマットと同等の感度を有する。細菌尿症
は広く一般に蔓延しているので、その存在を検出し診断
するための多くの方法が開発されている。合成基質との
ＬＡＬカスケードを利用する、非希釈尿試料１ml当り少
なくとも１０5 個のグラム陰性菌の存在を検出するのに
適切な固体状一体化試験具は現在のところない。
【００１３】本発明の細菌尿症の検出試験は、カブトガ
ニ・アメボサイト・ライセート中に存在する天然酵素カ
スケードをベースにしている。カブトガニ・アメボサイ
ト・ライセートは、カニのリムルス（Limulus)属又はタ
キプリウス（Tachypleus）属の種から得ることができ
る。リムルス属の種はカブトガニの西部の種であり、リ
ムルス・ライセートは、アソシエーツ・オブ・ケープ・
コッド、ウッズ・ホール、マサチューセッツ（Associat
es of Cape Cod, Woods Hole, MA) から容易に入手でき
る。これはいつも変らぬ品質でありかつ本発明に有用な
濃縮形で入手できるので、好ましいライセート源であ
る。
【００１４】ライセートカスケードは、エンドトキシン
の存在に対してあまりに感度が高すぎるため、細菌尿症
に対して有用な試験を行うことができないと信じられて
きたが、本発明は、尿試料中の閾値濃度のグラム陰性菌
の存在を陽性表示として与えるよう注意深く設計された
フォーマットを提供するものであり、この濃度は尿道の
グラム陰性菌感染を示すものであると考えられる。
【００１５】Ａ．尿中エンドトキシンの正常濃度 有用であるためには、スクリーニング法は、許容しがた
い程高いまちがった陽性表示を与えることなしに、しか
し医学上の問題がおこる可能性を示す信号となる、分析
対象物の閾値濃度を陽性表示として示すものでなければ
ならない。通常、スクリーニング法により陽性結果が出
ると、その後にそれを更に詳しく検査する操作が必要と
される。従って更に費用のかかる試験を行わねばならな
い場合には、スクリーニング法が有用であるかどうか
は、迅速で便利で費用のかからない測定方法を提供する
ことができるかどうかにかかっている。細菌尿症にとっ
て好結果を生むスクリーニング法は、単に正常な濃度の
グラム陰性菌が存在するに過ぎない場合に誤った陽性表
示を示すことなく、尿試料１ml当り所望濃度のグラム陰
性菌について陽性表示を示すものでなければならない。
【００１６】計器による濁度測定及びグラム染色の両者
は、１ml当り１０5 個の細胞に対して感度を有するが、
１ml当り１０4 個の細胞の検出を行えば、ある無症候患
者又は症候性であっても細菌尿症ときめるのはむずかし
い患者を正確に診断できるであろうとある医学の権威者
達は信じている。これらの患者は、もし１０4 個の検出
が可能な診断法を用いていれば細菌感染の初期段階で助
けられたであろうが、硝酸塩還元性細菌（グラム陰性菌
の一種）の存在を検出する亜硝酸塩試薬片又は感染のた
めに体により生成される白血球を検出する白血球試薬片
のような現在利用しうるスクリーニング法では見逃され
てしまうことがある。
【００１７】ナッカム及びベルゾフスキー（Nachum and
Berzofsky; J. Clin. Microbiol.,759-763, 1985)
は、正常尿は１ml当り２０ngに達する量の遊離エンドト
キシンを有することがあり、この濃度は１ml当り１０3
個のグラム陰性菌の存在を示すことになることを発見し
た。ゲル化試験での結果はこれらの発見を裏付けるもの
である。このバックグラウンドは本出願人の発明の一体
化フォーマットに影響を与えない。本発明の一体化試験
具は遊離エンドトキシンを検出しない。
【００１８】Ｂ．一体化固体状試験具 一体化固体状試験具は、ＬＡＬゲル化試験を用い、かつ
細菌尿に対して、高価な装置を必要とする現在利用しう
る方法と同一の感度（尿１ml当り１０5 個の細胞）を示
すＬＡＬ試験用の合成基質を用いて調製することができ
る。この一体化試験具は、ライセート、二価陽イオン、
合成基質、緩衝剤成分及びライセートの安定化成分から
なる試験組成物を包含せしめた担体マトリックスからな
る。一体化試験具フォーマットは大規模な集団のスクリ
ーニングに特に適切な、迅速、便利、安価な試験を提供
する。
【００１９】ａ．ライセート ライセートはアソシエーツ・オブ・ケープ・コッド（As
sociates of Cape Cod）から、凍結乾燥された形で得る
ことができる。 ｂ．二価陽イオン ライセートカスケードの活性化のためには二価陽イオン
が必要である。市販されているライセート調製物は、ラ
イセートを活性化するのに十分な量のカルシウムイオン
を安定剤として含有する。場合により更に別の陽イオン
を添加するのが望ましい場合もある。二価陽イオンは、
カルシウム、マグネシウム、ストロンチウム及びマンガ
ンの陽イオンから選択することができるが、カルシウム
陽イオンが好ましい。もし陽イオンを含まないライセー
ト調製物を用いる場合には、二価陽イオンを添加すべき
である。 ｃ．担体マトリックス 担体マトリックスは、必須成分に対して実質的に不活性
で、多孔性及び／又は尿試料に対して吸収性である限
り、必須成分を包含せしめることができるものならば、
いずれの物質でもよい。「担体マトリックス」という表
現は、水又は他の生理学的液体に接触させた際、不溶で
あり、かつその構造は完全にもとのままを保つような吸
水性又は非吸水性マトリックスのいずれをも指す。好ま
しい担体マトリックスは、紙、通常はワットマン、クリ
フトン、ニュージャージー（Whatman, Clifton, N. J.)
から入手できるもののような高級ロ紙である。
【００２０】包含は、浸漬、塗布又は噴霧等の任意の方
法によっても行うことができる。これは試薬溶液を紙担
体マトリックスに含浸せしめ、次いで乾燥することによ
り行うことができる。乾燥は包含組成物に悪影響を及ぼ
さない任意の方法、通常は空気炉によって行うことがで
きる。乾燥された紙を次に裁断し、次いで支持体部材、
例えば、硬質又は半硬質ポリスチレンフィルム細片の一
端に貼付けることができる。ポリスチレン上への紙の貼
付は、スリーエム・カンパニー、セントポール、ミネソ
タ（３Ｍ Co., St. Paul, Minnesota)から市販されてい
るもののような両面粘着テープを用いて行うことができ
る。支持体部材は便利な把手となり試験具を使い易くす
る。
【００２１】担体マトリックスは、十分な試薬、特にラ
イセートを保持して所望の感度を示す試験を提供するこ
とができるならば、先に述べたもののいずれでもよい。
吸収性マトリックス、特に紙が好ましい。マトリックス
の包含及び乾燥は先に述べたいかなる方法でも行うこと
ができる。包含溶液中のライセートの濃度は１ml当り約
１５mg（mg／ml）であるのが好ましい。紙マトリックス
を用いる一体化試験具の特に興味ある特徴は、遊離エン
ドトキシンの存在に対しては応答せず、しかし尿１ml当
り１０5 個のグラム陰性菌の存在に対しては感度を示す
ことである。この異常性は、現在利用しうるエンドトキ
シン試験フォーマットを一体化固体状試験具フォーマッ
トに移行させるのがむずかしいことを強調するものであ
る。
【００２２】ｄ．合成基質 天然のカスケード終点の形成、ゲル化が細菌尿の検出に
用いられているが、光散乱の測定用の高価な装置を用い
てはじめて定量結果が得られる。この装置が高価なため
に、現在利用しうる試験法は定期的に行われるスクリー
ニングには適切でないものになっている。更に光散乱法
の感度は１ml当り細胞１０5 個と報告されている。
【００２３】容易に判別しうる比色性又は蛍光測定性終
点をもたらすことができる合成基質を用いることがより
望ましい。多くの発色性又は発蛍光性ＬＡＬ基質がエン
ドトキシンＬＡＬ試験用に市販されており、本発明によ
り提供されるスクリーニング法に用いることができる。
【００２４】ＬＡＬ用の発蛍光性基質は、ペニンスラ・
ラボラトリーズ、ベルモント、カリフォルニア（Penins
ula Labs. Belmont, California)から入手することがで
き、この基質は脱離基としてＮ−メチルクマリンを含有
する。尿の元々の蛍光性バックグラウンドが、この試験
に必要とされる感度に有意の障害をおこすにはあまりに
低いので、これらは尿試料に用いることができる。
【００２５】発光性合成基質は特に好ましく、これは、
比較的簡単なかつ安価な計器測定によっても、又は使用
者に用意された適切な色チャートとの比較により、更に
より便利な目視によっても色を測定することができるた
めである。市販されているただ一つの発色性基質は、活
性化されたライセートにより開裂する際、黄色を呈する
ｐ−ニトロアニリンを脱離基として含有する。これらの
脱離基としてｐ−ニトロアニリンを含有する基質は尿試
験体に対し所望の感度に達するが、臨床尿、例えば、高
比重尿は高度に着色しているので、黄色以外のある色を
呈することができる合成基質を用いるのが好ましい。
【００２６】有用な発色性基質は、一般式： Ｂ−（Ａ1 )n−Ａ2 −Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｉ 〔式中、ｎは整数０又は１であり；Ａ1 はバリン又はロ
イシンであり；Ａ2 はロイシン又はセリンであり；Ｇｌ
ｙはグリシンであり；Ａｒｇはアルギニンであり；Ｂは
末端アミノ酸の閉塞基であり；Ｉは発色性指示基であ
る〕で示される。
【００２７】閉塞基としては、ｔ−ブチルオキシカルボ
ニル、アセチル、ベンゾイル又はトシルが好ましく、ｔ
−ブチルオキシカルボニル（ｔＢＯＣ）が特に好まし
い。他の同等のアミノ酸配列を有するものを用いること
ができるが、一般に開裂可能脱離基に隣接してグリシン
−アルギニン配列を有するものが好ましい。
【００２８】好ましい発色性指示基は、Ｉが式：
【００２９】
【化１】
【００３０】〔式中、Ｙはヒドロキシ基又はアミド基で
あり；Ｘは硫黄、窒素又は酸素から選ばれたものであ
り；Ｒ1 は低級アルキル、アリール基、アミド基又はシ
アノ基であり；Ｒ2 は単一又は複数個の水素、低級アル
キル、アリール又は好ましくは塩素、ニトロ等の電子吸
引性基の同一又は異なる基である〕で示されるＩ1 又は
Ｉ2 から選択されるものである。
【００３１】指示基はＹを介してアルギニンに連結し
て、ライセートの活性化で形成された凝固酵素の働きに
より開裂しうるアミド結合又はエステル結合を形成す
る。
【００３２】低級アルキル基は炭素数１〜４のアルキル
基である。低級アルキルの意味に含まれるものとして
は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ
−ブチル、sec −ブチル及びtert−ブチル基がある。こ
れらの基は、置換によりアミド結合又はエステル結合の
酵素開裂を妨害しないという条件で、置換されていても
されていなくてもよい。
【００３３】用語「アリール」は、合成有機化学者に周
知の普通の意味を有し、すなわち、芳香族炭化水素から
１個の原子の除去により誘導される有機基、例えば、ベ
ンゼンから誘導されるフェニルである。かかる置換基も
また、いずれの置換基も凝固酵素によるエステル結合又
はアミド結合の酵素開裂を妨害しないという条件で、置
換されていてもよいし非置換でもよい。これらの基質
は、一般にアルギニン特異性プロテアーゼ類に対する基
質である。しかしながら、尿中の前記プロテアーゼ類の
濃度は極めて低いので細菌尿性試験の感度に悪影響を与
えることはない。
【００３４】特に好ましい発色性基質は、
【００３５】
【化２】
【００３６】前記式中、指示基Ｉ及び連結基Ｙが３−ア
ミノインドールを形成するものである。
【００３７】３−アミノインドール基質を用いる場合に
は、比色応答をなすためにカップリング成分を試験具に
包含せしめなければならない。適切なカップリング成分
は、ジアゾニウム化合物、例えば、２−メトキシ−４−
モルホリノベンゼンジアゾニウムクロリド、２，４−ジ
クロロベンゼンジアゾニウム、２，６−ジクロロベンゼ
ンジアゾニウム、５−クロロ−２−メトキシベンゼンジ
アゾニウム（ファーストレッドＲＣ）及び２，３´−ジ
メチルアゾベンゼンジアゾニウム（ファーストレッドＧ
ＢＣ）である。ジアゾ塩、２−メトキシ−４−モルホリ
ノベンゼンジアゾニウムクロリド（ＭＭＢＤ）が好まし
い。このような発色性基質は１ml当り１０4 個の細菌を
含む尿試料と接触すると桃色に変化し、１ml当り１０6
個の細菌を含む場合はワイン色を呈する。
【００３８】他に好ましい合成基質としては、脱離基と
してｐ−ニトロアニリンを有する先に開示した市販品が
ある。
【００３９】ｅ．緩衝剤 一体化試験具を調製するためには、約pH７．５から約pH
８．５、好ましくは７．５から８．０のpH範囲にpHを保
ちうる緩衝剤成分を包含させる。トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタンが好ましい緩衝剤成分である。
【００４０】ｆ．安定化成分 上記の試験成分に加えて、ＬＡＬ発色性試験に必要なす
べての成分が担体マトリックス、例えば紙に包含される
場合は、ライセート中の前酵素を安定化する安定化試薬
を添加することが必要である。この安定化成分は中性又
は陰性に帯電したポリマーであってもよく、メチルビニ
ルエーテル及び無水マレイン酸のゼラチン・共重合体(g
elatin inter polymers)又はエチレングリコールとイソ
オクチルフェニルエーテルのポリマーから選択すること
ができる。この共重合体は、式：
【００４１】
【化３】
【００４２】〔式中、ＲはＣ1 〜Ｃ18のアルキル、エー
テル、酢酸塩又はベンジルであり、ｎは２からポリマー
の繰り返し単位の総数までの整数〕により示すことがで
きる。
【００４３】好ましい共重合体は、ポリ（メチルビニル
エトキシマレイン酸無水物）であり、ジーエーエフ、ニ
ューヨーク、ニューヨークからGantrez （商標名）とし
て入手できる。ポリエチレングリコール−ｐ−イソオク
チルフェニルエーテルは、式：
【００４４】
【化４】 により示すことができる。
【００４５】好ましいポリエチレングリコール−ｐ−イ
ソオクチルフェニルエーテルは、Triton（商標名）Ｘ−
１００としてローム・アンド・ハース、フィラデルフィ
ア、ペンシルバニア (Rohm & Haas、 Philadelphia、 PA)
から入手できる。安定化成分は、ライセートの包含に先
立って紙マトリックスに包含せしめることが好ましい。
【００４６】使用に当っては、一体化試験具を非希釈尿
試料に浸漬する。一体化試験具を、次に３７℃で密閉室
中で１５分〜２０分、好ましくは陰性の対照(Negative
control)と共にインキュベートする。
【００４７】先に示したようにインキュベートの継続時
間及び温度はライセートを活性化するのに十分なもので
あり変りうる。しかしながら３７℃はより低い温度、例
えば２５℃よりも好ましい。対照におけるものより色調
のより高いものはいずれも試料が陽性であることを意味
する。後での読取りのために、試験片を２５〜５０％
（容量）の酢酸に浸漬することにより色を安定化するこ
とができる。普通の滅菌操作が用いられるが、試料の前
処理は必要ではない。試料は清浄な中間流尿とすべきで
ある。一体化試験具は陰性試料と１０5 個の細菌の存在
とを判別する機能を有するが、水溶液中の遊離エンドト
キシンに対しては応答しない。
【００４８】次の実施例は実施された実験について述べ
ている。実施例は本発明を説明するために役立つが、そ
の範囲を制限するものとして解釈されるべきものではな
く、その範囲は特許請求の範囲によってのみ定義され
る。当業者は、組成物の成分及び反応パラメーターにつ
いて、望ましいように変更、置き換え及び変化させるこ
とができるであろう。
【００４９】
【実施例】次の省略形が用いられる： g グラム mmol ミリモル mM ミリモル濃度 ml ミリリットル μl マイクロリットル ℃ 摂氏 mp 融点 ｔ−ＢＯＣ tert−ブチルオキシカルボニル ＤＭＦ ジメチルホルムアミド Ａｒｇ アルギニン Ｌｅｕ ロイシン Ｇｌｙ グリシン Ｌ− 左旋性 ＭＳ 質量分析 ＦＡＢ 高速原子衝撃（ＭＳとして） 〔α〕22 D ２２℃におけるナトリウム５８９８オング
ストロームのＤ線の波長での旋光度 ＣＢｚ カルボベンジルオキシ psi １平方インチ当りのポンド（１psi は１平
方センチメートル当り０．０７０４キログラムの圧力に
相当する）
【００５０】１．標準物の調製 E. coli （大腸菌）斜面培養（slant ）は、ザ・クオリ
ティ・アシュアランス・デパートメント・オブ・エイム
ズ・ディビジョン（the Quality Assurance Department
of Ames Division ）、マイルスラボラトリーズ社（ M
iles Laboratories, Inc. ）から入手した。養分肉汁１
０mlにE. coli を接種し、３７℃で１６〜１８時間イン
キュベートした。この成長時間により通常貯蔵肉汁１ml
当り約１０10個のE. coli が生成する。実際のE. coli
濃度は、肉汁を７〜８倍に希釈し、次いで各希釈物１０
０μl を血液寒天平板上で画線培養を行うことにより測
定した。各微生物は１個の集落（colony）を生成するの
で、希釈物１００μl 中の微生物の数は、一晩３７℃で
インキュベーションを行った後、寒天上に現れる集落を
計測することにより得られる。計量された貯蔵肉汁を用
いてＬＡＬ試験用に適切なE. coli 希釈物を調製し、１
週間以内に用いた。この操作により、成長及び／又は細
胞死中の剥離を防いで、貯蔵肉汁中の遊離エンドトキシ
ンの量を一定のものに確保することができた。
【００５１】２．好ましい発色性基質の調製 合成に用いた全てのアミノ酸は左旋性配置を有してい
た。３−アミノインドール（Ｉ） 冷却器、乾燥管及び添加ロートを備えた２５０ml丸底フ
ラスコに１５分間アルゴンを吹き込んだ。次にナトリウ
ム（１．３g 、５７mmol、新たに小片に刻んだもの）及
び無水エタノール１０mlを丸底フラスコに入れ、次いで
無水エタノール９mlを滴下した。無水エタノールの添加
が終了し反応混合物の穏やかな還流がおさまったところ
で反応混合物を加熱して１５分間穏やかに還流させた。
次に加熱源を除去し、次いでインドール（５g 、４５mm
ol）を添加した。全てのインドールが溶解するまで反応
混合物を攪拌した。使用に先立ち無水炭酸カリウム上で
乾燥したイソアミルニトリル（１２ml、８９mmol）を３
０分間にわたって滴下した。反応混合物を室温でアルゴ
ン下に一晩攪拌した。反応混合物を濃縮してアルコール
を除去し、次いで蒸留水（１００ml）を添加した。得ら
れた混合物を加熱沸騰させた。アルゴン下で、蒸留水１
２５ml中の水酸化カリウム（３０g 、５４０mmol）及び
亜二チオン酸ナトリウム（２３g 、１３２mmol）の溶液
を滴下した。暗緑色固体が分離しはじめ、次いでこの溶
液はより淡い色に変わり、最終的に黄色になった。水酸
化カリウム／亜二チオン酸ナトリウム溶液の添加後、蒸
留水１００mlを添加し、次いで反応混合物を加熱して１
０分間沸騰させた。暗緑色固体をアルゴン下で熱溶液か
らろ別した。アルゴン下で冷却すると、黄色ろ液から平
板状の黄色結晶が分離した。黄色結晶を収集し、次いで
熱水から再結晶すると淡いベージュ色の針状結晶（Ｉ）
２．７g （収率４８％）が得られた。 mp １２０℃（暗色に変化した） ＭＳ（ＦＡＢ、Ｍ+ ＝１３２，１００％）
【００５２】ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ （II） アルゴン下で、無水ジメチルホルムアミド２５モル中の
ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−ロイシン（５g 、２０mmol）及びＮ−
ヒドロキシスクシンイミド（２．３g 、２０mmol）の溶
液を氷浴中で冷却した。ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド（４．５g 、２２mmol）を添加し、次いで反応混合物
を氷浴中で３時間攪拌した。蒸留水４８ml中のグリシン
（１．５g 、２０mmol）及び炭酸水素ナトリウム（３．
４g 、４００mmol）の溶液を添加し、次いで得られた混
合物を放置して徐々に室温まで暖め、次いで一晩攪拌し
た。分離してきた白色固体をろ別し、次いでろ液を６規
定の塩酸を用いてpH３に調整した。次に溶液を酢酸エチ
ルで２回抽出した。酢酸エチル抽出物を無水硫酸マグネ
シウム上で乾燥し、次いでまず回転蒸発器で次に高真空
下で濃縮した。濃縮物は油状残渣８g となった。シリカ
ゲル１７０g 及び溶離溶媒としてＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＣＨ3
ＯＨ／ＮＨ4 ＯＨ（８０／２０／２ 容量比）を用いる
フラッシュ・クロマトグラフィを行うと白色固体のｔ−
ＢＯＣ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙのアンモニウム塩２．７３
g が得られた。このアンモニウム塩約２．３g を蒸留水
２０ml中に溶解し、次いで溶液を６規定塩酸を用いてpH
３に調整した。遊離酸を酢酸エチルで２回（全量１００
ml）抽出した。酢酸エチル溶液を硫酸マグネシウム上で
乾燥し、濃縮すると白色固体（II）２．１g が得られ
た。 mp １１６〜１１７．５℃ ＭＳ（ＦＡＢ、Ｍ＋１＝２８９） 〔α〕22 D ＝−２８．２°（Ｃ＝１．１５，ＣＨ3 Ｏ
Ｈ） 質量分析 Ｃ13Ｈ24Ｎ2 Ｏ5 として 計算値：Ｃ，５４．１５；Ｈ，８．３９；Ｎ，９．７１ 実験値：Ｃ，５４．２６；Ｈ，８．３７；Ｎ，９．６２
【００５３】Ｎα−ＣＢｚ−Ｎω−ニトロ−Ｌ−Ａｒｇ
−３−インドリルアミド（III ） アルゴン下で、無水ジメチルホルムアミド８２ml中のＮ
α−ＣＢｚ−Ｎω−ニトロ−Ｌ−アルギニン（１３．４
g 、３７．８mmol）及びトリエチルアミン（５．３ml、
３７．８mmol）の溶液をメタノール−ドライアイス浴中
で−２０℃まで冷却した。イソブチルクロロホルメイト
（５ml、３７．８mmol）を添加し、次いで反応混合物を
−２０℃で４５分間攪拌した。次に３−アミノインドー
ル（２．８０g 、２１．２mmol）を添加し、次いで得ら
れた混合物を放置して徐々に室温まで暖め、一晩攪拌し
た。蒸留水を反応混合物に添加し、５％炭酸水素ナトリ
ウムをpH９に達するまで添加した。次にこの溶液を酢酸
エチル（２５０ml）で２回抽出した。酢酸エチル抽出物
を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濃縮すると、淡褐
緑色の油状残渣が得られた。この油状物質をシリカゲル
１７０g 及び溶離溶媒としてＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＣＨ3 ＯＨ
（９５：５ 容量比）を用いるフラッシュ・クロマトグ
ラフィにかけた。ＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＣＨ3 ＯＨから再結晶
すると白色結晶（III ）５．１８g （収率５３％）が得
られた。 mp ２０２〜２０３℃ ＭＳ（ＦＡＢ、Ｍ＋１＝４６８） 〔α〕22 D ＝＋１３．１°（Ｃ＝１．０８，ＤＭＦ） 質量分析 Ｃ22Ｈ25Ｎ7 Ｏ5 として 計算値：Ｃ，５６．５２；Ｈ，５．３９；Ｎ，２０．９
７ 実験値：Ｃ，５６．３２；Ｈ，５．４０；Ｎ，２０．７
７
【００５４】Ｌ−Ａｒｇ−３−インドリルアミド・２Ｈ
ＯＡｃ （IV） 穏やかに加熱しながらＮα−ＣＢｚ−Ｎω−ニトロ−Ｌ
−Ａｒｇ−３−インドリルアミド（０．９３g 、２０mm
ol）を無水エタノール２５ml及び氷酢酸２５mlに溶解す
ると淡黄色溶液が得られた。次に１０％の炭素担持パラ
ジウム（Ｐｄ／Ｃ、５００mg）を添加し、次いでこの混
合物を水素ガス５０psi （１立方センチメートル当り
３．５２キログラム）下で１５時間水素添加した。混合
物をろ過し、次いでろ液を濃縮すると淡緑色油状残渣が
得られた。シリカゲル６３g 及び溶離溶媒としてＣＨ2
Ｃｌ2 ／ＣＨ3 ＯＨ（１：１ 容量比）を用いるフラッ
シュ・クロマトグラフィにかけると淡褐色固体（IV）３
００mgが得られた。（収率３７％） ＭＳ（ＦＡＢ、Ｍ＋１＝２８９） 質量分析 Ｃ14Ｈ20Ｎ6 Ｏ・２ＨＯＡｃ・３Ｈ2 Ｏとし
て 計算値：Ｃ，４６．７５；Ｈ，７．４１；Ｎ，１８．１
７ 実験値：Ｃ，４６．７３；Ｈ，７．１２；Ｎ，１７．９
３
【００５５】ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ａ
ｒｇ−３−インドリルアミド （Ｖ） アルゴン下で、無水ジメチルホルムアミド１．６ml中の
ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−Ｌｅｕ−グリシン（１５８mg、０．５
５mmol）及びトリエチルアミン（０．０７７ml、０．５
５mmol）の溶液をメタノール−ドライアイス氷浴中で−
２０℃まで冷却した。イソブチルクロロホルメート
（０．０７０ml、０．５５mmol）を添加し、次いで得ら
れた混合物を−２０℃で２５分間攪拌した。無水ジメチ
ルホルムアミド１．１ml中のＬ−Ａｒｇ−３−インドリ
ルアミド・２ＨＯＡｃ（２００mg、０．４９mmol）及び
トリエチルアミン（０．０７０ml、０．４９mmol）の溶
液を添加し、次いで得られた反応混合物を放置して徐々
に室温まで暖め、次いで一晩攪拌した。蒸留水を反応混
合物に添加し、次いでこの溶液を５％水酸化ナトリウム
を用いてpH７．２に調整した。次にこの溶液を濃縮する
と油状残渣が得られ、これを溶離溶媒としてＣＨ2 Ｃｌ
2 ／ＣＨ3 ＯＨ／ＮＨ4 ＯＨ（８０：２０：５容量比）
を用いるフラッシュ・クロマトグラフィにかけ、次いで
ＣＨ3 ＯＨ／Ｈ2 Ｏから再結晶すると白色固体（Ｖ）２
００mg（収率６７％）が得られた。mp １２５℃（軟
化） ＭＳ（ＦＡＢ、Ｍ＋１＝５５９） 〔α〕22 D ＝−２５．２°（Ｃ＝１．０６，ＣＨ3 Ｏ
Ｈ） 高分解能質量スペクトル （陽イオン型） Ｃ27Ｈ42Ｎ8 Ｏ5 ＋１として 計算値：５５９．３３５５９ 実験値：５５９．３３５６３
【００５６】３．一体化固体状試験具 尿１ml当り少なくとも１０5 個の細菌の存在に対して感
度を示す一体化固体状試験具を次のようにして製造し
た。イートン及びダイクマン２０５紙を、水酸化ナトリ
ウムで約pH７．５に調整した、ジーエーエフ、ニューヨ
ーク、ニューヨークから得たGantrez （商標名）ＡＮ１
１９の２％溶液中に浸漬した。この前処理を施した紙を
５０℃で少なくとも１０分間乾燥した。ライセート溶液
を、５０mMトリス緩衝剤を用いて約pH７．８に緩衝化さ
れた水溶液中にライセート〔アソシエーツ・オブ・ケー
プ・コッドから得たピロテール（Pyrotell）〕を再構成
することにより調製した。この溶液はまた、アメリカン
・ダイアグノスチカ、グリーンウィッチ、コネチカット
（American Diagnostica, Greenwich, CT ）から得た約
１．１mMのスペクトロザイム（Spectrozyme ）ＬＡＬ基
質をも含んでいる。スペクトロザイムは、脱離基として
ｐ−ニトロアニリンを有するトリペプチド（アセチル−
Ｄ−ヘキサヒドロチロシン−グリシン−アルギニン−ｐ
−ニトロアニリン）である。ピロテール調整物はカルシ
ウムイオン及び他の安定化剤を含む。前処理を施した乾
燥紙をライセート溶液に浸漬し、次いで５０℃で約１０
分間乾燥した。２回乾燥−包含を施した紙を小長方形に
裁断し、ポリスチレン支持体に両面接着テープを用いて
貼付した。試験具を尿試料と接触させ、取り出し、３７
℃で約１５分間インキュベートし、次いで反射率読み取
りを行った。第１図に示した結果は、本発明の一体化試
験具が１ml当り１０5 個の細胞を含む試料と陰性試料と
を判別する能力を有することを示している。ザ・カラー
・ライセート・ケミストリー・キット（the Colar Lysa
te Chemistry kit）中のマリンクロット（Mallinkrodt
）基質を用いても同様の結果が得られている。遊離エ
ンドトキシンだけを含む溶液と共に試験具を用いること
を実験的に試みたが、一体化試験具は遊離エンドトキシ
ンには感度を示さないことが示された。
【００５７】第１図は、一体化固体状試験具を用いて集
めた反射率のデータを示すグラフである。４０５nmにお
けるパーセント反射率をＫ／Ｓとして表しており、ここ
でＫは吸光度係数、Ｓは散乱係数である。％ＲからのＫ
／Ｓの算出はクベルカ−ムンク（Kubelka-Munk）式を用
いて行った。Ｋ／Ｓの値は、試験具に発現した色量が増
加するにつれて増加する。Ｋ／Ｓは時間（ｔ）（秒）に
対してプロットされている。接触した試験具を７分間３
７℃でインキュベートした後、４０５nmにおける反射率
を６分間追跡した。一体化試験具は、ジーエーエフ・コ
ープ、ニューヨーク、ニューヨーク（GAF Corp., New Y
ork, NY ）から入手したGantrez （商標名）ＡＮ１１９
で紙を前処理し、次いで前処理を施した紙にアソシエー
ツ・オブ・ケープ・コッド（Associates of Cape Cod）
から得られたライセート、緩衝液及び市販のｐ−ニトロ
アニリド基質を含浸せしめることにより製造した。試験
片を、塩分を含んだ細菌溶液に浸漬した。第１図の実線
は陰性菌の含有量を示し、断続線は１ml当り１０5 個の
E. coli を含むもの及び点線は１ml当り１０6 個のE. c
oli を含むものを表す。Ｋ／Ｓ又は色の劇的増加は後者
の試料に浸漬した試験片にみられた。第１図は、一体化
試験具によれば陰性試料と１０5 個のグラム陰性菌を含
むものとの間では異なる結果をもたらすことを示してい
る。このグラフは実施例３．の結果を反映したものであ
る。本発明の精神又は範囲を逸脱することなしに多く
の、上記したような本発明の修正及び変更がなされても
よいことは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】一体化固体状試験具を用いた反射率のグラフ。

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 尿試料中のグラム陰性細菌の存在を１０
    5 細胞/ml の検出感度で測定するための（ａ）担体マト
    リックス；及び（ｂ）担体マトリックスに包含された試
    験組成物からなる一体化されたグラム陰性細菌尿症スク
    リーニング用試験具であって、該組成物がカブトガニ・
    アメボサイト・ライセート、二価陽イオン、該ライセー
    トにより開裂されうる発色性又は発蛍光性脱離基を有す
    る合成ペプチド基質、pHを７．５から８．５の範囲に保
    ちうる緩衝剤成分及びライセートを安定化することがで
    きる安定化成分を含む試験組成物であることを特徴とす
    る試験具。
  2. 【請求項２】 ライセートが、リムルス・アメボサイト
    ・ライセートである請求項１記載の試験具。
  3. 【請求項３】 脱離基が発色性である請求項１記載の試
    験具。
  4. 【請求項４】 二価陽イオンが、カルシウム、マグネシ
    ウム、ストロンチウル及びマンガンの陽イオンから選択
    される請求項１記載の試験具。
  5. 【請求項５】 安定化成分が、ゼラチン、メチルビニル
    エーテル及び無水マレイン酸の共重合体又はポリエチレ
    ングリコールｐ−イソオクチルフェニルエーテルから選
    択される請求項１記載の試験具。
  6. 【請求項６】 発色性脱離基がｐ−ニトロアニリンであ
    る請求項３記載の試験具。
  7. 【請求項７】 尿試料中のグラム陰性細菌の存在を１０
    5 細胞/ml の検出感度で測定するための一体化グラム陰
    性細菌尿症スクリーニング用試験具の製造法であって、
    （ａ）担体マトリックスに、カブトガニ・アメボサイト
    ・ライセートを安定化しうる安定化成分を包含せしめ；
    （ｂ）乾燥し；かつ（ｃ）乾燥マトリックスに、カブト
    ガニ・アメボサイト・ライセート、二価陽イオン、該ラ
    イセートにより開裂されうる発色性又は発蛍光性脱離基
    を有する合成ペプチド基質及びpHを７．５から８．５の
    範囲に保ちうる緩衝剤成分を含む試験組成物を包含せし
    め；次いで（ｄ）乾燥する各工程からなることを特徴と
    する製造法。
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