DK169732B1

DK169732B1 - E. coli ATCC 39170 indeholdende plasmidet pCR2001, plasmidet pCR2001 og fremgangsmåde til fremstilling af kalve-prorennin uden de første 5 aminosyrer

Info

Publication number: DK169732B1
Application number: DK377182A
Authority: DK
Inventors: Teruhiko Beppu; Takeshi Uozumi; Katsuhiko Nishimori
Original assignee: Teruhiko Beppu
Priority date: 1981-08-24
Filing date: 1982-08-23
Publication date: 1995-01-30
Also published as: IE822018L; IE53555B1; DE3277631D1; JPS5832896A; EP0073029A3; BR8204898A; DK377182A; ATE30741T1; EP0073029A2; CA1340214C; EP0073029B1

Description

i DK 169732 B1

Den foreliggende opfindelse angår E. coli ATCC 39170 indeholdende plasmidet pCR2001, plasmidet pCR2001 og fremgangsmåde til fremstilling af kalve-prorennin uden de første 5 aminosyrer.

5 Kalve-prorennin er et proenzym-protein, der udskilles af den fjerde mave i kalven i løbet af nogle få uger efter fødslen, og det er præcursor for det mælkekoagulerende enzym, rennin (chymosin), der er uundværligt ved fremstillingen af ost. Rennin udskilles fra mucosa 10 i den fjerde kalvemave og er en sur protease med 323 aminosyrerester. Prorennin, præcursoren for rennin, er et enzym-protein med 363 aminosyrerester og en molekylvægt på ca. 40.000, og det overføres i det mælkekoagulerende enzym rennin autokatalytisk under sure betin-15 gelser.

I de senere år har produktionen af rennin ikke været i stand at leve op til behovet, og der har været anvendt en erstatning i form af mikrobiel løbe. Følgelig er der stor industriel betydning i tilførslen af 20 store mængder rennin eller prorennin.

Rekombinant DNA teknologi refererer til teknikken ved indføring i vektor-plasmidet af en egnet værtsmikroorganisme, cDNA med genetisk information, ved hjælp af hvilken der kan dannes et nyttigt stof; dannelse af 25 et rekombinant plasmid; og anvendelse af nævnte værtsor ganisme indeholdende det rekombinante plasmid til produktion af nævnte nyttige stof. Sådan rekombinant DNA teknologi har udviklet sig hurtigt i de senere år, og f. eks. er en teknik til fremstilling af nyttige stoffer, 30 såsom væksthormonet interferon ved hjælp af Escherichia coli som værtsorganisme under udvikling.

2 DK 169732 B1

Kloningen af det strukturelle gen for prorennin er nu blevet undersøgt i alle sekvenser. Arbejde.rne er omhandlet i følgende litteratur:"Abstracts of the Annual Meeting of the Japanese Agricultural Chemistry Society", p 5 408 i 1980, "Proceedings of the IVth International

Fermentation Symposium", p 179 F-21-5(L) i 1980, "Abstracts of the Annual Meeting of the Japanese Agricultural Chemistry Society", p 259 og p 569 i 1981 og "Agric. Biol. Chem." 44, (6), p. 1373 - 1381 (1980).

10 Det er imidlertid hidtil ikke lykkedes at fuldende klo- ningen af kloner, som har i det væsentlige'hele sekvensen af det strukturelle gen for prorennin, og som ventes at være i stand at producere kalve-prorennin..

Ued kloningerne i ovennævnte litteratur er der opnået 15 stammer, der udviser positiv hybridisering; ikke desto mindre indeholder de ikke hele cDNA for prorennin, men delsegmentet af cDNA med delsekvensen for det strukturelle gen for prorennin med en længde på ca. 0,2 Md.

Som følge af videre studier, der vil blive forklaret de-20 taljeret i den foreliggende beskrivelses eksempler, er det nu lykkedes at fremstille en klon, som indeholder et rekombinant plasmid med det i væsentlige hele sekvensen for det strukturelle prorennin-gen som bekræftet ved hybrid-bremset translationsforsøg, og som 25 er i stand til at producere kalve-prorennin.

Det er lykkedes at konstruere et rekombinant plasmid omfattende kalve-prorennin-cDNA og at opnå værtsmikroorganismer med dette rekombinante plasmid. Hidtil ukendte mikroorganismer med dette hidtil ukendte rekombinan-30 te plasmid tilhører P2-niveauet (hvoraf deponering ikke accepteres af Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology Japan) og en art, f.eks. Escherichia coli C r~m~ (pTACRl), som opbevares af Fermentation Laboratory, Agricultural Chemistry 3 DK 169732 B1

Faculty of Agriculture, the University of Tokyo.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe et rekombinant plasmid omfattende kalve-pro-rennin-cDNA og endvidere en værtsmikroorganisme med dette 5 rekombinante plasmid.

Det tilsigtes endvidere med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af kalve-prorennin som mangler de- 5 første aminosyrer, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav 3's 10 kendetegnende del angivne.

Prorennin-mRNA (messenger RNA) ekstraheres fra den fjernede kalvemave i løbet af nogle få uger efter fødslen, og et komplementært enkeltstrenget DNA syntetiseres under anvendelse af den omvendte transcriptase-metode med 15 nævnte mRNA som skabelon, hvilken skabelon derpå fjernes ved alkalisk behandling. Fra det enkeltstrengede DNA opnået som anført i det foregående syntetiseres, et dobbeltstrenget cDNA under anvendelse af f. eks. DNA polymerase I eller omvendt transscriptase. Ved metoden, der 20 gør brug af nuclease SI, fjernes kun hårnålestrukturen selektivt fra det dobbeltstrengede cDNA til dannelse af det dobbeltstrengede cDNA. Derpå knyttes der til begge 3'-ender deraf poly-dG(deoxyguanin)-homopolymer ved TdT (terminal deoxynucleotidyltransferase)-metoden.

25 På den anden side behandles et egnet vektorplasemid, så som E. coli-vektor pBR322, med restriktionsenzym Sal I til tilvejebringelse af lineær pBR322 DNA, og derpå repareres begge 3'-ender af en enkeltstrenget del af det lineære pBR322 ved anvendelse af DNA-polymerase I 30 metode. Til de reparerede 3'ender knyttes poly(dC)- homopolymer ved TdT-metoden.

DK 169732 B1 il

Det lineære pBR322 DNA med tilknytning poly(dC)homo-polymer ved 3'-enderne blandes med det dobbeltstrengede cDNA med tilknyttet poly(dG)-homopolymer ved 3'-ender-ne, og blandingen hærdes til dannelse af et rekombinant 5 plasmid omfattende kalve-prorennin-cDNA.

Derpå behandles E. coli med calciumsalte, foretrukkent koldt, og der blandes med rekombinant plasmid til dannelse af transformante stammer af E. coli.

Kloner med indsat DNA ved Sal I stedet udvælges efter 10 den metode, der gør brug af lægemiddel-resistens for vektorplasmider. For at vælge kloner, der har prorennin- cDNA, blandt de udvalgte i det foregående foretages kolo- ni-hybridisering under anvendelse af radioaktivt mærket „ 125 32 prorennin-specifikt mRNA, såsom I-mRNA eller p-mRNA, 15 som prøve. Emne-stammer af værtsorganisme, der muligvis omfatter kalve-prorennin-cDNA, frasigtes ved den hy-brid-bremsede-translationsmetode for tilstedeværelsen af det indsatte strukturelle gen for prorennin. Som det vil blive vist i eksemplerne senere er der tilvejebragt 20 kloner med i det væsentlige hele prorennins strukturelle gen som bekræftet ved den hybrid-bremsede translations-metode. Endvidere er tilstedeværelsen af basesekvens svarende til aminosyresekvensen i prorennin-N-terminus blevet bekræftet efter metoden af Maxam og Gilbert.

25 Skønt der i den forudgående beskrivelse er omhandlet en udførelsesform for opnåelse af rekombinant plasmid og værtsmikroorganisme indeholdende samme kan adskillige variationer anvendes med hensyn til udførelsen.

En udførelsesform for opfindelsen forklares nærmere ^ i det følgende.

DK 169732 Bl 5

I. Isolering af prorennin-mRNA

Prorennin-mRNA ekstraheres fra mucosa af den fjerde kalvemave i løbet af nogle få uger efter fødslen. Ekstraktion kan udføres efter en modifikation af UCHIyama's 5 metode (H. Uchiyama, T. Uozumi, T. Beppu og K. Arima,

Agr. Biol. Chem. 44, p. 1373 - 1381, 1980). F. eks. samles mucosa fra den fjerde kalvemave og pulveriseres ved lav temperatur, idet al RNA ekstraheres derfra ved phenolmetoden, foretrukkent i nærværelse af bentonit.

10 En vandig ekstrakt indeholdende polymer RNA behandles med et fældningsmiddel, såsom lithiumchlorid, og bundfaldet indeholdende den polymere RNA samles. Fra en vandig opløsning indeholdende de polymere RNA-bundfaid, som således fremstillet kan poly(A)-hale-RNA-fraktioner in-15 deholdende prorennin-mRNA skilles og samles ved affinitets- chromatografi under anvendelse af et adsorberingsmid-del, såsom poly(U)-Sepharose eller oligo(dT)Sepharose. Navnlig poly(A)mRNA-fraktionerne indeholdende prorennin-mRNA adsorberes selektivt på adsorberingsmidlet, 20 og ribosomal RNA og andre urenheder elueres og fjernes via adsorberingskolonnen. Eluering med en vandig form-amidopløsning giver en vandig formamidopløsning indeholdende prorennin-mRNA. Ovennævnte operationer gentages foretrukkent flere gange.

25 I overensstemmelse med en kendt procedure underkastes de fraktioner, der indeholder prorennin-mRNA, saccharose-densitetgradientcentrifugering og således molekylvægts fraktionering, idet fraktioner, prorennin-mRNA-fraktioner, der har en molekylvægt centreret ved en sedimentationskon-30 stant på 15s kan samles. mRNA-frakt ionerne afprøves ved in vitro proteinsyntese for deres kodningsaktivitet.

Disse fraktioneringsoperationer kan gentages et antal gange, om ønsket.

6 DK 169732 B1

II. Fremstilling af prorennin-cDNA

Under anvendelse af den omvendte transcriptasemetode med ovennævnte prorennin mRNA som skabelon syntetiseres det komplementære enkeltstrengede DNA af nævnte mRNA, 5 og det enkeltstrengede cDNA af prorennin kan derpå op nås efter fjernelse af skabelon-mRNA ved alkalisk behandling. F. eks. omsættes prorennin-mRNA med den omvendte transcriptase i nærværelse af fire slags deoxy-nucleotid-triphosphater (dXTP'er) og også oligo (dT) 10 som primer, og det komplementære enkeltstrengede DNA, der er komplekst med nævnte prorennin-mRNA, kan syntetiseres. Det resulterende materiale opvarmes ved ca. 70 °C i nærværelse af alkali til fjernelse af skabelon-mRNA ved destruktion, og således fremstilles det enkeltstren-15 gede prorennin-cDNA.

Det enkeltstrengede prorennin-cDNA omsættes derpå med DNA polymerase I eller en omvendt transcriptase i nærværelse af dXTP'er til dannelse af et komplementært dobbeltstrenget cDNA. Da det dobbeltstrengede cDNA 20 har hårnålestruktur, omsættes cDNA med nuclease SI, som er i stand til selektivt at afskære hårnålestrukturen, og efter fjernelse deraf kan det komplette pro-rennin-specifikke dobbeltstrengede cDNA syntetiseres.

III. Afsnøring af prorennin-cDNA og vektorplasmid 25 Komplementær deoxynucleotidyl-homopolymer tilknyttes ved begge 3'-ender af det i det foregående syntetiserede komplette prorennin-specifikke dobbeltstrengede cDNA.

Et egnet værtsvektorplasmid afskæres ved ønskede steder, og til det resulterende lineære DNA knyttes den 30 homopolymere ved begge 3'-ender. F. eks. kan poly(dG)- homopolymer knyttes til begge 3'-ender af nævnte prorennin dobbeltstrengede cDNA ved omsætningen med TDT i nærværelse af dGTP (deoxyguanosintriphosphat). På den 7 DK 169732 B1

anden side omsættes et egnet vektorplasmid, såsom vek-torplasmid pBR322 af E. coli med restriktionsenzym Sal I endonuclease til dannelse af lineært pBR322 DNA. Begge 3'-ender af den enkeltstrengede del af det lineære 5 plasmid DNA repareres ved omsætning med DNA polymerase I

i nærværelse af fire slags deoxynucleotidtriphosphater (dXTP'er), og til de reparerede ender kan der knyttes poly(dC)homopolymer ved omsætning med TdT i nærværelse af deoxycytosintriphosphat (dCTP).

10 Ifølge opfindelsen kan der på følgende måde fremstilles et rekombinant plasmid indeholdende kalve-prorennin-cDNA.

Det prorennin-specifikke dobbeltstrengede cDNA med poly(dg)-polymer tilknyttet ved 3'-enderne, såsom det i det foregående fremstillede, blandes med lineær pBR322 DNA med 13 poly(dC)homopolymer knyttet til de reparerede 3'-en- der, og efter hærdning af blandingen er DNA både knyttet til ved poly(dC)halen af sidste DNA og den komplementære poly(dG)hale af den forudgående. Således kan det rekombinante plasmid indeholdende i det væsentlige 20 hele længden af prorennin-strukturgenet syntetiseres.

IV. Transformation af værtsmikroorganismen og detektering af kloner indeholdende rekombinant plasmid omfat-tende kalve-prorennin-cDNA_

En værtsmikroorganisme, såsom E. coli C 600 r~m_, be-25 handles med calciumsalte og blandes derpå med det re kombinante plasmid omfattende kalve-prorennin-cDNA til inkorporering af det rekombinante plasmid i E. coli, hvorved der således dannes transformanter. Kloner med det rekombinante plasmid omfattende prorennin-30 cDNA udvælges fra transformanterne.

Når f. eks. prorennin-cDNA indsættes ved Sal I stedet i pBR322, forventes transformanterne med det rekombinante plasmid omfattende kalveprorennin-cDNA at være ampi-cillin-resistente og tetracyclin-følsomme. På en præliminær 8 DK 169732 B1 måde kan de ønskede transformanter skelnes fra dem, der er ampicillin-resistente og tetracyclin-resistente, på grund af forskellen i resistens over for ampicillin og tetracyclin. For at adskille de rigtige transformanter, der 5 har rekombinant plasmid, fra dem, der forventes at have samme, udføres kolonihybridisering og hybrid-bremset translation. Kolonihybridiseringen kan foretages ved

en kendt metode, hvor det prorennin-specifikke mRNA

125 32 125 mærkes med radioaktiv I eller p, og Ι-mRNA el-32 10 ler p-mRNA anvendes som probe. Ved denne kolonihybri disering identificeres kloner, der udviser positiv hy-bridisering, og de afprøves yderligere ved den kendte hybrid-bremsede translation for tilstedeværelsen af det indsatte strukturelle gen for prorennin.

15 De følgende eksempler forklarer opfindelsen nærmere.

EKSEMPEL

(1) Ekstraktion og rensning af prorennin-messenger-RNA (mRNA)_

Slimhinden fra to kalve-løbemaver (fjerde mave) (to 20 uger efter fødsel) (ca. 140 g) blev pillet af, vasket med en afkølet Tris-HCl-pufferopløsning (0,1 M,’ pH 9,0) indeholdende 0,025 M EDTA, 0,1 M NaCl og 1» SDS, de-hydratiseret i acetone/tøris, frosset, og pulveriseret med en homogenisator. Pulveret blev suspenderet i puf-25 feropløsning (1 liter) indeholdende bentonit, og dertil blev der sat et blandet opløsningsmiddel (1 liter) omfattende phenol, chloroform og isoamylalkohol (50:50:1), og efter omrøring blev der centrifugeret, og den øvre vandige fase blev fraskilt. Efter gentagelse af sam-30 me operation 6 gange blev lithiumchlorid sat til den endelige vandige fase for at frembringe en slutkon-centration på 2 M. Efter henstand natten over ved 4 °C blev bundfaldet samlet ved centrifugering og opløst 9 DK 169732 B1 i 60 ml 0,1 x SSC (150 mM NaCl og 15 mM natriumcitrat). De samme operationer blev gentaget en gang til, og til den resulterende opløsning blev der sat to volumener ethanol til udfældning af polymer RNA, hvilket blev 5 gentaget tre gange.

Det endelige bundfald blev opløst i vand (6 ml), og dertil blev sat 4 volumener af en Tris HCl-pufferopløsning (pH 7,5) indeholdende 0,01 M EDTA, 0,7 M NaCl og 25% formamid. Opløsningen blev passeret gennem en poly-(U)-10 Sepharose 4B kolonne (volumen 30 ml), og kolonnen blev vasket med ovennævnte pufferopløsning (30 ml). Efter vask med 30 ml af pufferopløsningen blev det adsorberede mRNA elueret med en vandig opløsning (pH 7,5) indeholdende 0,01 M EDTA, 0,2% SDS, 90% formamid og 0,01 M kalium-15 phosphat. Eluatet blev dialyseret mod destilleret vand, og efter tilsætning af ethanol blev der udfaldet RNA indeholdende mRNA. Bundfaldet blev efter opløsning centrifugeret i 13 timer ved 50.000 x g i 5 - 20% saccha-rose-densitetsgradienter. Fraktioner indeholdende pro-20 rennin mRNA (120 ^ug RNA med en molekylvægt centreret ved 15s) blev opsamlet. Disse fraktioner blev afprøvet in vitro i et proteinsyntesesystem under anvendelse af renninreticulycyt-lysat, og det blev bekræftet, at fraktionerne havde en sådan kodningsaktivitet, at 25 de kan danne prorennin, og mængden deraf overskrider 70% af de totale translationsprodukter.

(2) Fremstilling af prorennin-cDNA

For at syntetisere enkeltstrenget cDNA ved anvendelse af prorennin-mRNA som skabelon blev en opløsning (400 30 ^ul) indeholdende følgende bestanddele inkuberet ved 42 °C i 1 time: mRNA (30^u), AMV omvendt transcirptase (140 enheder), oligo(dT)12 - 13 (1,6 yj), fire slag deoxynucleotid-triphosphater (hver 0,5 mM), Actino-mycin D (40 ^ug), NaCl (60 mM), MgC^ (6 mM), DTT 35 (2 mM) og Tris-HCl (50 mM, pH 8,3). Reaktionsblandin- 10 DK 169732 B1 gen blev ekstraheret med phenol, udfældet med ethanol, opløst i 0,3 N NaOH og opvarmet ved 68 °C i 15 minutter til ødelæggelse af skabelon-mRNA. Påfølgende gelfiltrering gennem Sephadox G-50 gav 240 ng af det en-5 keltstrengede cDNA. For at syntetisere det dobbelt strengede cDNA ved anvendelse af ovennævnte enkelt-strengede cDNA blev en opløsning (240 ^ul) indeholdende følgende bestanddele inkuberet ved 25 °C i 4 timer: enkeltstrenget cDNA (200 ng), DNA-polymerase-10 fragment A (18 enheder, 4 slags deoxynucleotid-triphos- phater (hver 1 mM), MgC^ (4 mM), β-mercaptoethanol (0,5 mM) og Tris-HCl (30 mM, pH 7,5). Reaktionsproduktet blev ekstraheret med phenol og udfældet med ethanol. Bundfaldene blev behandlet med 80 enheder nuclease.SI 15 ved 40 °C i 90 minutter i en opløsning ( 200 yul, pH 4,6) indeholdende natriumacetat ( 30 mM), NaCl (50 mM) og ZnSO^ (1 mM), og hårnålestrukturen blev fjernet ved dekomponering. Det resulterende produkt blev centrifugeret i 5 - 30%'s saccharose-densitetsgradienter ved 20 95.000 x g i 12 timer til fremstilling af 100 ng af det dobbeltstrengede cDNA med en middelmolekylevægt på 0,7 Md.

(3) Hærdning af prorennin cDNA og vektorplasmid

Ovennævnte prorennin-cDNA (0,05 pmol) blev inkuberet 25 ved 37 °C i 6 minutter i en opløsning A. (120 ^ul) indeholdende 80 enheder terminal-deoxynucleotidyl-transferase, dGTP (0,06 yummol), MgCl^ (5 mM) og HEPES-NaOH (10 mM, pH 7,1), og (dG)-homopolymer blev således knyttet til 3'-ender i cDNA.

30 På den anden side blev vektorplasmid pBR322 afskåret ved Sal I endonuclease til dannelse af lineært DNA, og det lineære DNA blev inkuberet med DNA-polyme-rase (fragment A) i nærværelse af fire slags deoxynu-cleotid-triphosphater til reparation af de enkeltstren-35 gede ender. Således opnået DNA (0,5 pmol) blev inku- 11 DK 169732 B1 beret ved 25 °C i 10 minutter i en opløsning D (120 yul) indeholdende 24 enheder terminal-deoxynucleotidyl-trans-ferase, dCTP (0,04 ^ummol), CoCl^ (1 mM), kaliumcacodylat (100 mM) og Tris-HCl (30 mM, pH 7,6), og (dC)-homopo-5 lymer blev således knyttet til 3'-ender af DNA.

Reaktionsblanding A (120 ^ul) og reaktionsblanding B (24 yul) blev blandet sammen ved 0 °C efter standsende in-kuberinger i både blanding A og B ved tilsætning af EDTA. Produktet blev ekstraheret med phenol og udfældet med 10 ethanol. Bundfaldet blev opløst i en 100 mM Tris-HCl- opløsning (7,6) indeholdende EDTA 81 mM) og NaCl (100 mM) ved en koncentration på 0,3 ^ug pr. ml, og der blev opvarmet ved 68 °C i 2 timer og gradvis afkølet til stuetemperatur med en afkølingshastighed på 5 °C 15 pr. 30 minutter. Således blev prorennin-cDNA med (dG)-homopolymer tilknyttet og pBR322-DNA med (dC)-homopolymer knyttet sammen ved hærdning.

(4) Transformation af E. coli med hærdet DNA og udvæl-qelse af ioner indeholdende prorennin-cDNA_

20 Transformation af E. coli ved anvendelse af hærdet DNA

opnåeligt i proces (3) blev foretaget efter en konventionel metode, der involverer anvendelse af calciumbehandling. E. coli C60Or m~ transformeret således og 804 trans-formanter blev valgt på L-næringsagarplader indeholdende 25 30 yug/ml ampicillin. Derpå blev der blandt 804 kolo nier valgt transformanter, der var ampicillin-resistente og tetracyclin-følsomme på samme medium indeholdende 10 yug/ml tetracyclin. Det totale antal af sådanne kolonier var 622. De 622 transformanter blev podet på Milli-30 pore filtre som et net, der blev knyttet til L-nærings- agarmediet indeholdende 30 ^ug/ml ampicillin. Kolonier dyrket på filtrene blev vasket, behandlet med protease og opvarmet i vakuum ved 80 °C i 2 timer efter behandling med 95%'s ethanol og chloroform, der således 35 fikserede DNA fra hver koloni på filtrene.

12 DK 169732 B1

Tre filtre blev fremstillet samtidigt, og hvert filter blev underkastet koloni-hybridisering på følgende måde: Filter (1) blev hybridiseret med prorennin-mRNA mærket med I som probe; filter (2) blev efter be- 5 handling med overskud af ribosomal rRNA hybridiseret 125 med samme I rRNA; og filter (5) blev hybridiseret 125 med Ι-rRNA. Ved sammenligning af alle tre filtre blev kloner indeholdende rDNA først fjernet, og 30 kloner antagelig indeholdende prorennin-cDNA blev 10 opnået. Rekombinant plasmider (DNA) blev opnået fra 125 disse 30 kloner ved I-rRNA-ligevægtscent'rifugering.

Hvert plasmid blev hybridiseret med prorennin mRNA opnået fra den foregående proces (1) og afprøvet for in vitro proteinsyntese i reticulocyt-lysat’systemet for at se, 15 om det inhiberer prorennin-syntesen. Ved denne hybrid- bremsede translationsmetode blev der bestemt 10 kloner med indhold af prorennin-cDNA.

(5) Karakteristika for det klonede prorennin-cDNA

pTACRl plasmid DNA blev ekstraheret fra en af klonerne 20 (102-B-stamme) behandlet med Sal I endonuclease og under kastet agarose-gelelektroforese.

Således indsat DNA-fragment svarende til omtrent hele længden af prorennin-cDNA blev iagttaget som værende til stede. Basesekvensen for dette indsatte DNA-frag-25 ment blev bestemt efter metoden af Maxam og Gilbert.

Som det vil ses af det følgende har basesekvensen svarende til aminosyresekvensen prorennin-n-terminus vist sig at være til stede i det indsatte DNA-fragment.

51 -GCT GAG ATC ACT AGG AT C CCT CTG

Ala Glu Ile Thr Arg Ile Pro Leu TAC AAA GGC-3'

Tyr Lys Gly 13 DK 169732 B1

De plasmid-DNA'er, der blev opnået fra klonerne, og som definitivt indeholdt prorennin-cDNA, blev analyseret efter Maxam- og Gilbert-metoden for basesekvensen. Som følge af basesekvensbestemmelsen viste det 5 sig, at ud af 1.095 baser svarende til hele sekvensen for prorennin-cDNA omfatter plasmid pTACR 102B6 fra første base svarende til prorennin-n-terminus op til 890. base, og plasmid pTACR 103C2 omfatter fra den 771. base op til den 1.095. base svarende til prorennin-c-ter-10 minus.

Plasmid pCR 1.001 indeholdende hele længden af prorennin-cDNA blev konstrueret på følgende måde. pTACR 102B6 og pTACR 103C2 blev behandlet med Sal I til opnåelse af DNA-fragmenter. Hvert DNA-fragment blev nedbrudt med 15 exonuclease til afskæring af ca. 150 baser fra begge 3'-ender. Det fra pTACR 102B6 afledte fragment blev skåret med Κρη I, og det fragment, der var afledt fra pTACR 103C2 blev skåret med Barn HI. Begge fragmenter blev derefter hærdet til fremstilling af fragment (a).

20 Uafhængigt deraf blev der fremstillet et lille frag ment (b) ved behandling af pTACR 102B6 med Eco RI plus Κρη I. På lignende måde blev der fremstillet et stort fragment (c) ved behandling af pTACR 103C2 med Eco RI plus Barn HI. Alle tre fragmenter (a), (b) og (c) 25 blev blandet, hærdet og knyttet sammen ved hjælp af T4 DNA ligase. pCRIOOl konstrueret på denne måde indeholder det komplette cDNA svarende til hele aminosyre-sekvensen i prorennin. Basesekvensen omfattende den stoppende codon deraf er illustreret i det følgende.

14 DK 169732 B1 £> Η t-3 1-3 HH O O O — i—1

ca > 3*0 ^<> >·<> wh> „ HD

3 0 3 Η 3 0 3 O o C O — H 3 H

KO Ω O K H CO H KO O O

H-> Η O 3* H H (D O H H > H >

B O ^ O (D i-3 0 3 O— to to i-3 CO

o O O 00 1-3 O O OO OO H> H > OO O Η O Η Η O HO H i-3

3 0 3 O Ot< O—OD >< O *< O (DO

O

> O Cn H K > K H KO H > 3 0 C0roOtov<> 3* H (D H 3*0 iQ O om 3 —>£» cn O (DO C H 3 0 o Η K H >0 h > OO KO >>

O 3* H , , CO > H i-3 HO fD H M O

oroo — ^OO co k: o co iq o o >Ω 03 1-3 1-3 O O OO n> ca > ar i-3 *< > h> h> η h O CO O M o co co oo

KO 1-3 1-3 KO < O >Ω KO

1-5 O 1-50 ro β O 3 . CQ > 1-5 O-to OO KSO co HO Ό O O i-3 o

>> <0 OO >0 K 13 m KO

i~iO B 3 HO HO ET t-3 — „ 03

tQ> H > *< O OO fD O CO

K > KO H > cn > H KO i-3 1-3 1<> 3 0 3*0 ΟΏ— Æa- fD 1-β 1<> m O OO i-iO 1-50OC0 ι-5θ 00 1-3 OO t-3 KO to < O OO K> O O fD O Μ O—O Oi-3 H> HK > Ι-5Ω 1-51-3 O O O H O 30 O CO >

ODi-3 H > so K O KO K > OO

(D O H i-3 — cn t-sO ΠΩ ω>< > HO

no ro o o o o oo o co > *< o H> ω H H OO KO OO K> 3* O — to ><! > H> oo O 1-5 H> i<>

3 O o 3 O 30 O C O 30 CO O

K 3 O 1-3 O O Η OO CO H

3* 1-3. KJ O H > 3*0 H> 0 O

fD O CQ O oeo η O 30 151-3 OO K > K i-3 >> HH KO — £ . H > voi< > 3* i-3 CQ > i<> (D i-3 ° 30 om o ro o 30 1-51-3 co

H

H>> CO > H > HH O O — o3>>

HB > (DO 3*0 i<> HOOl-iO

030 i-s O 30 30 !-< O ιΏ O

H

KO >> <o KO—o m> K I> (DH CO > 3 H OHOHH >·< > co 3 H HO co ro o cao to oo > o ko — to >o cn > >o

HO HO fD H O CO > fD O HO

O 30 CO Ό5 H 30 30 K > oh— co kh cn> on> ko

·<> K<Oo3'H O O (DO (DH

COO COO fD H 3 H 30 CO

OJ

KO— ^ K > > O OO K > K> 3 O O >< > CQ > H > 1<> OO CQ> ΌΟ 30 CfiO cao 15 DK 169732 B1

(O HQ > O tr* O ΩΩ ^ S ίϊ Q

P m h h O (0i-3 η O tr O — o ro H

ocn ro o co ko « ^ o e o oo oo >o >o-q <g HO h> h o cn > O ron roo

KO 3 > ro O V O H O

cn t> O >0 tn 1-3 — to <Ω O 1-3 ho cn> ro O o ro H roo η h ro o hs o ι-t > h o 3 o roo H> f1 O — coOO HH 551 H i-3 ro Η o H > C* H W > > roo co co ro o co tn o

>0 — S ^ f-3 HH ^ > Hg *f S

tn > o S' H K > C" O HH ^ >

frjo roo i-sO 3 o ro h *~iO

hd o tnt-3 cn H HH < O hOO

ι-i o roo roo κ > roH cohoh 0Ω ht O hi O 3 Η Η O OK O—g en h3 <0 hH> 5* o H t> O H > roo roH HH HQ > * σο hi o p3 ro > ro o ofl-o — g 3 >>

HH HH DO HOO Ή > OO

K > K > hi o ΟΊ H t> sfc> HH HQ

ι-i o ht o oo o c > — co ro o ko o

HH s > H<0 H h3 OO

K > roH co ro H cn :r h h> roo

hiO ri- O OHO-— (&. roo -)0 hiCJ

o H > to > O H h3 > O OO S> tro o to > ro r t3 cn > h> 2 h<> o*d O — o OH ΌΟ 30 Γΐ-η o

ΙΟΩΟ > > > o OO 2 Q

Ni H O CTi 3 O CA > HO -jQ Η·> OK O — cr\ iQ O Ό O KO 3 !> -* Ω o cn h p>> s> > H> <q oq

ro o cn > cn > HH PJH HO

t-iO 3 i-3 co roo H> KO

tr o oo 2 > £2 22 2h — oo m H i_i O roH roh3 HO HH co CO KO rf O CO KO φΟο tuo oo s > oo icq^tr'o

h-> h> ro 1-3 ho roH — rfs-roH

[13 O 30 ri-O KO co O CO

HH OO >> S> cn ™> 2o

nO h> cn > roH — oroO HO

133 O CO CO rr O o hj O KO

CO cn D? D> > t n > O H> Η Η H

ron roo hi o — er» ho c* Q ω 3· >

HO hi O ώ O o ro O 3 0 O hi H

^ o S> m 530 HH HOO >0 hi o roH — toH> k > cn h > J2 5? OO ri-OoenO 30 030 ΌΟ <1 O o tr O 3* O HHO 00 *- £? ro h — co roH roH ~j 3 o h> 3*0 HOCJCO KO .000 CO 30 H> H > H < O tn h HQ <0 s* o s* o voro-H roQ 30 ch

hi hi o · OHO 3 0 O O HO

16 DK 169732 B1 •ti t-3 h :> > Ω a O co > Ω c n a i-3 Η* t-3 οι > n O — O F Ω © *3 on on Ό>-3 onoon f o Ω t-3 > O O co cn > n 1-5 (οΩη *< Ω o > f > — mon η ω f > tn t-3 D ^ CO o i-i n tn t-3 o ~ Ω i-3 > ΩΩ vo *0 t-3 tn> to Ω Ω ΩΩ an fo—to a t-3 o ω uif> f > η n >c n o o t-3 η o ocn 3 ω W > ^£> F > > O to > Ω ΩΩ t-3 t-3 0 Ω — co ‘-N > tn > -J cn > F O *<> n t-3 o οι > ^ n o»c n >c 1-3 ι-i n ΩΏ 2 > toH> n> Ω Ω t-3 t-3 F Ω Oi-3 F t-3 ' ΗΩ η Ω >·< ο ri- ω οοη on ><η ό ω -ο ►ti t-3 ω t-3 t-3 >Ω FO Ω ι-3 ΩΩ—ο a 1-3 F>< > tn > Ο ΐ-3 ►< Ω ο οη ο η ο ό ο cn ω t3 3 η ό ωηη ►«η η·Γ3 >> ηη— ω F > tin ►< Ω Cn > F > Ο a ί-3 03Ω 0> 05 Ω 3η 3 Ω οη C0 Ω> 13 η D? Ω Μ >—to > Ω ι-3 > οω ο t-3 ω > f ι-3 ο f η an η t-3 cn On on on η t3

CO

VO

p> > >ti Ω—*. FO ΩΩ FO > Ω 05 > nnoot-3 H> 0 t-3 in > 3 t-3 on co 3 n cn όω

F

an — E* co 1-3 cq> >n >n in > e->~on oo f ο tn > on OS t3 ° η Ο η Ω 01 η ·ΌΩ nt-3 in t-3 >Ω t-3 t-3 H> t-3 > to < Ω on i—1 n t<> i— t-3 an >&. © t-3 η η on nO Ot-3 η Ω o f Ω — to o ΩΩ t-3 t-3 2 > ΩΩ to Ο Ω ' >-3 > F > *< > O t3 F Ω ο\ΗΩ si ΪΠ 3 Ω nt-3 rt-O t< > o»< Ω — co η Ω o F > t-3 > tti O to > Ω Π3 > M > >< :» an no co f ο co an f 1-3 os > nn 00 0 © o—1&. η n on 0 t-31-3 in > ω t-3 > t-3 > cn t-3 tn > no on oanvoan on on Ό Ω nn ont-3—ο η > ηΩ ηΩ ο h> u-on co nn ' f > nn F t-3 to :—1 > to Ot-3 f > ,c> f ω on 03?* — σι FΩ 3 Ω on t< t-3 0 u> F O F D> O CO >> FO cn >£ O t-3 O 05 > © t-3 01 > ot-3 ©1-3

o C Ω— to Ό O FO 30 CO FO

2^Ω ΟΩ ΩΩ t-3 t-3 ΩΩ CO-J

> O < O

M O ft) 1-3

Si) O !—1 <-3 TJ i-3 kJ > 3* i-3 0) > (i) o 1-3 > H > tro H1-3 n o ro o

U) Η > Η Γ> O

σ\ H i-3 o n O

en ro O — eo ifl > en

M

h3 O O o * O M > — ^

> C O O

1-3 i-3 *< 5* 1-5 1-3

i-3 1-3 )< > n O

W CO !> en ro o

o t-i O

< O O 1-3 t-* O

*ϋ 1-3 tr h3 ro i-3 > o ro > ts o

H

no g tafl ° > O H O ro o > > ro >

3 O

> > ro ;> 3 o f o ro f-3 c o

C o-ro i-3 H> O

oj O O i—1 cn H O o OK O — co o

t3 O ro i-3 c O

18 DK 169732 B1

Sammenbinding af pTACR102B6 og pTACR103C2 kan også udføres på den i det følgende angivne måde. Navnlig kan sammenbindingen gøre af brug af plasmid pTACR5 som et bindeled, hvilket plasmid indeholder fra basestedet 5 før.Kpn I stedet (fra nr. 249 til 254) op til stedet efter Barn HI (fra nr. 1013 til 1018). pTACR5 kunne afledes fra en af de 10 prorennin-cDNA-holdige kloner opnået i proces (4). DNA-fragment (d), der skulle indsættes, blev fremstillet ved behandling af pTACR 102B 6 med 10 Hind III plus Κρη I. Fragment (e) indeholdende 760 baser (plus sidekæde) blev fremstillet ved behandling af pTACR 5 med Κρη I plus Bam HI under dets delvise nedbrydning. Fragment (f) blev fremstillet ved behandling af pTACR103C2 med Bam HI plus Hind III. De tre fragmenter har termini komplementære til hinanden, og disse 15 blev hærdet til dannelse af det lineære DNA omfattende (d)-(e)-(f). Efter hærdning blev det cycliske DNA pCRIOOl konstrueret ved behandling med T4 DNA ligase.

Det komplette prorennin-cDNA indeholdt i plasmid pCRIOOl blev kædet til lac-promotorregionen af E. coli lactose operon med rammen fastholdt, og således blev pCR2001 20 konstrueret. pCR2001 blev indsat i E. coli C600r”m~ ved transformation. Den plasmidholdige mikroorganisme betegnes E. coli CR1 (r-m-, thr-, leu”, thi-; pCR2001) og er blevet deponeret ved ATCC som ATCC nr. 39170 (deponeret den 4. august 1982).

25 Konstruktionen af pCR2001 er vist detaljeret i det følgen de.

(1) Plasmid pBH20 [K. Itakura, T. Hirose, R. Crea, A. D. Riggs, H. L. Heyneker, F. Bolivar, H. W. Boyery Science, 198, 1056 (1977)] indeholder lac-promotoren af E. coli lactose operon, det ribosom-bindende sted 30 deraf og en del af n-terminus for β-galactocider. Pias- 19 DK 169732 B1

mid pBH20 blev behandlet med Eco RI til dannelse af et lineært DNA, som blev underkastet DNA-polymerase I. Den terminale enkeltstrengede DNA-del bliver således dobbeltstrenget. Decanucleotid indeholdende Bam HI sted blev 5 knyttet til DNA i begge ender ved påvirkning af T4--DNA

ligase, og DNA blev yderligere behandlet med Bam HI plus Sal I.

(2) Enten pTACR 102 B6 eller pCRIOOl blev behandlet med Bam HI plus Κρη I til fremstilling af et DNA-fragment 10 omfattende fra Bam HI stedet (nr. 15) i prorennin- cDNA-basesekvensen op til Κρη I stedet (nr. 253).

(3) pCR 1001 blev behandlet med Κρη I plus Sal I. til dannelse af et DNA-fragment omfattende fra Κρη I stedet (nr. 254) af prorennin-cDNA op til det terminale 15 Sal I sted.

Hvert DNA-fragment opnået via trin (1), (2) og (3) blev hærdet sammen, og efter hærdning kunne det cycliske DNA pCR 2011 konstrueres ved behandling med T4 DNA ligase.

20 (6) Fremstilling af prorennin ved hjælp af E. coli

Et vandigt medium (L medium) med følgende sammensætning blev fremstillet:

Bestanddel_q/liter

Bacto-trypton (DIFC0) 10

Bacto-gærekstrakt (DIFC0) 5

Natriumchlorid 10 pH 7,2 20 DK 169732 B1

Stammen E. coli CR1 blev dyrket ved 37 °C under rystning i et næringsmedium indeholdende 30 ^,ug pr. ml ampicillin og 1 mM IPTG (isopropylthio-p-D-galactosid). Celler blev høstet ved centrifugering ved 10.000 x g, når propage- 5 riagen nåede maksimum. Cellerne blev derpå ødelagt ved lydbehandling, og der blev opnået en cellefri ekstrakt.

Prorennin-proteinet i ekstrakten blev målt ved radioimmu^ noprøvemetoden under anvendelse af prorennin-antistof mær-125 ket med I. Som følge af målingen viste det sig, at ca.

10 1.000 molekyler prorennin-protein blev dannet pr. celle værtsmikroorganisme.

Ekstrakten blev passeret gennem en fastfase-antistof-kolonne fremstillet af anti-prorennin-Sepharose 4B, og det adsorberede protein blev efter eluering afprø-15 vet på et SDS-polyacrylamid-gelelektrophenogram.

Molekylvægten af produktet blev således bekræftet som svarende til prorennins.

Claims

1. Mikroorganismen E. coli ATCC 39170 indeholdende plas-5 midet pCR2001.

2. Plasmidet pCR2001.

3. Fremgangsmåde til fremstilling af kalve-prorennin uden 10 de første 5 aminosyrer, kendetegnet ved, at den genteknologisk fremstillede mikroorganisme -E. coli ATCC 39170 dyrkes i et næringsmedium, hvorefter det dannede kalve-prorennin udvindes. 15 20 25 30 35