JPS60188093A - 枯草菌に於ける形質発現プラスミド - Google Patents
枯草菌に於ける形質発現プラスミドInfo
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- JPS60188093A JPS60188093A JP59044900A JP4490084A JPS60188093A JP S60188093 A JPS60188093 A JP S60188093A JP 59044900 A JP59044900 A JP 59044900A JP 4490084 A JP4490084 A JP 4490084A JP S60188093 A JPS60188093 A JP S60188093A
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- Japan
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- plasmid
- fragment
- prochymosin
- bacillus subtilis
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12N9/6481—Pepsins (3.4.23.1; 3.4.23.2; 3.4.23.3)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は枯草菌に於ける形質発現ベクターに関する。よ
り詳しくは、Ｅｔｎｒ プロモーターの制曲１下、異種
遺伝子を枯卑ｍ宿主中に発現する発現プラスミドに関す
る。更に、Ｅおｒプロモーターを利用した発現プラスミ
ドによりプロキモシンｃ Ｄ Ｎ Ａを枯草菌中に発現
する方法にも関する。
り詳しくは、Ｅｔｎｒ プロモーターの制曲１下、異種
遺伝子を枯卑ｍ宿主中に発現する発現プラスミドに関す
る。更に、Ｅおｒプロモーターを利用した発現プラスミ
ドによりプロキモシンｃ Ｄ Ｎ Ａを枯草菌中に発現
する方法にも関する。
枯Ｊｐｉ、菌は、遺伝学的、生化学的によく研究された
菌であり、人や動物に寄生性がなく、病原性もない。又
、枯！、菌は歯体外に生産蛋白質を分泌する性質が’＋
！Ｉｉい。これは特に組み換えＤＩＶＡ技術によって、
異種遺伝子産物を菌体外に分泌させることが可能である
。従って、枯草菌は遺伝子操作を行なう上で安全で有用
な宿主であると考えられている。しかしながら、枯草菌
を宿主として、異槙遺伝子を発現させた成功例は、大腸
菌の場合と比べて非常に少ない。枯草菌中では、プラス
ミドが不安定であることや、枯草菌特有の強力なグロテ
アーゼなどがその主な原因である。
菌であり、人や動物に寄生性がなく、病原性もない。又
、枯！、菌は歯体外に生産蛋白質を分泌する性質が’＋
！Ｉｉい。これは特に組み換えＤＩＶＡ技術によって、
異種遺伝子産物を菌体外に分泌させることが可能である
。従って、枯草菌は遺伝子操作を行なう上で安全で有用
な宿主であると考えられている。しかしながら、枯草菌
を宿主として、異槙遺伝子を発現させた成功例は、大腸
菌の場合と比べて非常に少ない。枯草菌中では、プラス
ミドが不安定であることや、枯草菌特有の強力なグロテ
アーゼなどがその主な原因である。
本発明の一つの目的は枯草菌中で真補遺伝子を発現させ
ることでメリ、その為に新しい宿主ベクター系を開発す
ることである。
ることでメリ、その為に新しい宿主ベクター系を開発す
ることである。
本発明のさらなる目的はエリスロマイシン耐性ＬＥｒ）
遺伝子のプロモーターを有する枯草菌中で形質発現可能
な発現ベクターを作成することである。
遺伝子のプロモーターを有する枯草菌中で形質発現可能
な発現ベクターを作成することである。
本発明の別の目的は前記の発現ベクターを用いて仔牛グ
ロキモシンの遺伝子を枯草菌中で発現させることである
。
ロキモシンの遺伝子を枯草菌中で発現させることである
。
本発明の上記目的及び史に多くの他の目的ならびに利点
は、以下の記載から一層明らかとなるであろう。
は、以下の記載から一層明らかとなるであろう。
プロキモシンは仔牛第４冑から得られチーズ製造の除に
牛乳を凝固させるのに用いられる一４！ｆｌのグロテア
ーゼであるキモ７ンの前駆体蛋白質である。プロキモシ
ンは分子ｈｔ４万、アミノ酸残基数３６５よりなり、そ
のＮ末端４２個のアミノ酸よりなるペグチドが自己消化
により切断されてキモシンを生成する。最近では微生物
起源の凝乳酢累が見い出されて、キモシンに代替しつつ
あるが、チーズ工業における仔牛キモシンに対する潜仕
的需要は依然として大きい。従って、仔牛キモシンを組
換えＤＩＶＡ技術を用いて微生物に生殖させることは遺
伝子工学の笑用面での目標のひとつと考えられる。
牛乳を凝固させるのに用いられる一４！ｆｌのグロテア
ーゼであるキモ７ンの前駆体蛋白質である。プロキモシ
ンは分子ｈｔ４万、アミノ酸残基数３６５よりなり、そ
のＮ末端４２個のアミノ酸よりなるペグチドが自己消化
により切断されてキモシンを生成する。最近では微生物
起源の凝乳酢累が見い出されて、キモシンに代替しつつ
あるが、チーズ工業における仔牛キモシンに対する潜仕
的需要は依然として大きい。従って、仔牛キモシンを組
換えＤＩＶＡ技術を用いて微生物に生殖させることは遺
伝子工学の笑用面での目標のひとつと考えられる。
組換えＪ） Ｎ Ａ技術を用いて、プロキモシンを大腸
菌宿主に生産させた例は過去に数々報告されている。例
えば、自前ら、Ｇｅｎｅ、１９．３３’１（ｉ９８２）
Ｈ材間１１Ｅ１５Ｂ−３２８９６（別府輝彦）；特開ｕ
１！１ｓ７−ｚ４１，２８？号（コラポラテイプ・リサ
ーテ）；フケ−」昭５８−９．６８７号（セルチック・
リミテッド）；などである。又、ロ蹄疫つィルス主費抗
原（Ｋ、 Ｉｆ ａｒｄｙら、Ｎａｔｕｒｅ。
菌宿主に生産させた例は過去に数々報告されている。例
えば、自前ら、Ｇｅｎｅ、１９．３３’１（ｉ９８２）
Ｈ材間１１Ｅ１５Ｂ−３２８９６（別府輝彦）；特開ｕ
１！１ｓ７−ｚ４１，２８？号（コラポラテイプ・リサ
ーテ）；フケ−」昭５８−９．６８７号（セルチック・
リミテッド）；などである。又、ロ蹄疫つィルス主費抗
原（Ｋ、 Ｉｆ ａｒｄｙら、Ｎａｔｕｒｅ。
２９３．４８１ （１９８１）、β−インターフエｏ
ｙ （Ｓ、 Ｃｈａ？１．ｇら、Ｍｏ１ｅｃｂｂｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄＧｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉ
ｏ？Ｌｉｎ Ｂａｃｉｌｌｉ、 −Ａｃａｄｅｍｉｃｐ
ｒｅｓｓ、１９８２．ｐ、１５９）などが枯草菌を宿主
として生成されている。
ｙ （Ｓ、 Ｃｈａ？１．ｇら、Ｍｏ１ｅｃｂｂｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄＧｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉ
ｏ？Ｌｉｎ Ｂａｃｉｌｌｉ、 −Ａｃａｄｅｍｉｃｐ
ｒｅｓｓ、１９８２．ｐ、１５９）などが枯草菌を宿主
として生成されている。
本発明によれば次の工程よりなるプロキモシンの生産方
法が提供される。
法が提供される。
ａ）７’ロキモシン遺伝子を、プロモーターｅ含む枯草
頃ベクター系にリーディングフレームラ合せて挿入し発
現プラスミドを形成させること、ｂ）形成された発現プ
ラスミドを形質性候により宿阜菌宿主に尋人し形質転換
株を得ること、ｃｌイ’）られた形賀私儀株から架剤ｎ
ｔｌ性株を選択すること、ｄ）該薬剤耐性株を宋養培地
で’ｔｆ養すること、及びｅ）得られた培養９勿がらプ
ロキモンン全回収することから々るプロキモシンの生殖
方法。
頃ベクター系にリーディングフレームラ合せて挿入し発
現プラスミドを形成させること、ｂ）形成された発現プ
ラスミドを形質性候により宿阜菌宿主に尋人し形質転換
株を得ること、ｃｌイ’）られた形賀私儀株から架剤ｎ
ｔｌ性株を選択すること、ｄ）該薬剤耐性株を宋養培地
で’ｔｆ養すること、及びｅ）得られた培養９勿がらプ
ロキモンン全回収することから々るプロキモシンの生殖
方法。
ＥＴ ブロモ−タートクロキモシンｃＤＩＶＡに含有し
、Ｊプロモーターの制−下でプロキモシンを宿主細胞内
で発現できる発現プラスミドも本発明に包含される。
、Ｊプロモーターの制−下でプロキモシンを宿主細胞内
で発現できる発現プラスミドも本発明に包含される。
本発明はさらに、新規なプラスミドの６１￥ ｄ方法、
それらのプラスミドで形質私儀された微生物、そして前
述の方法で生産されたプロキモシンを包含する。
それらのプラスミドで形質私儀された微生物、そして前
述の方法で生産されたプロキモシンを包含する。
以下に好適な夾施態様を例示して本発明を祝明する。
宿主枯草菌
枯草菌の中で、普ｊｌｌ 、野性株は異種遺伝子の菌体
内浸入に対する防御機構を有し、異榎ｆａｔ伝子のみを
切断する制限酵素がその役割を担っている。
内浸入に対する防御機構を有し、異榎ｆａｔ伝子のみを
切断する制限酵素がその役割を担っている。
従って、制限系の欠損した変異株か宿主として通してい
る。本発明では、好ましくはＡｉａｒｂａｒｇ１６８株
由来の１３．ａｕｂｔｉｌｉｓ ＲＭ １２５ （αｒ
１７＋ｌｅｕ、ｒ −、ｒｎ−１制限修飾欠損株が利用
できる（魚住ら、Ｍｏｌｅｃｏｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、
、１５２ 、６５ （１９Ｔ？）１ 。
る。本発明では、好ましくはＡｉａｒｂａｒｇ１６８株
由来の１３．ａｕｂｔｉｌｉｓ ＲＭ １２５ （αｒ
１７＋ｌｅｕ、ｒ −、ｒｎ−１制限修飾欠損株が利用
できる（魚住ら、Ｍｏｌｅｃｏｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、
、１５２ 、６５ （１９Ｔ？）１ 。
ベクター
枯草菌のベクターとして現在汎用されているのはＳ ｔ
ａｐｈｙＬｏｃｏｃｃｕｓ 由来の薬剤耐性シラスミド
９ｐＵＢ ｌ ｌ Ｏ＜、に、、Ｌｒ、３．９Ｍ−ｄ）
、ｐＥ ｌ ９４ ’（Ｅ デ、Ｌ４Ｍｄ） 、ｐＣ
１９４（（１’、ｎＬｒ、ＬＯηｔ ｎｄｌの３柚である。特に、ｐＥ１９４は、その全塩基
配列が決定されており、リーディングフレームを考慮し
たＤＮＡのつなぎかえに適している。
ａｐｈｙＬｏｃｏｃｃｕｓ 由来の薬剤耐性シラスミド
９ｐＵＢ ｌ ｌ Ｏ＜、に、、Ｌｒ、３．９Ｍ−ｄ）
、ｐＥ ｌ ９４ ’（Ｅ デ、Ｌ４Ｍｄ） 、ｐＣ
１９４（（１’、ｎＬｒ、ＬＯηｔ ｎｄｌの３柚である。特に、ｐＥ１９４は、その全塩基
配列が決定されており、リーディングフレームを考慮し
たＤＮＡのつなぎかえに適している。
本発明で？よ、好ましくはρＥ１９４の一種であるｐＨ
ＷＩ （Ｃｒ、Ｅ ｒ、４．３Ｋｂ）（Ｓ、 Ｈｏｒｉ
ｎｏｕｃｈｉｍ ｍ ら、Ｊ、Ｈａｃｔｅｒｉｏｌ、、１５０．８０４１ （
１９８２））が利用できる。ｐｌｉＷＩ中のＥｒプロモ
ーターは、その培基配列が；１１ｆ述の如く決γビされ
ており、低ａ厩のＥ （エリスロマイシン）により誘導
効果？もつ。プラスミド中のＥ、ｒＩｔｒ遺伝子は分子
電２万９千ノ２ ａ Ｓ ＲＩＶ Ａ ｌ ｆル（）Ｊ
Ｗ［（不明細普中２９に蛋白という）をコードしており
、２９に蛋白はＥ、７□丁グロモーターにより誘嗜的に
合成される。
ＷＩ （Ｃｒ、Ｅ ｒ、４．３Ｋｂ）（Ｓ、 Ｈｏｒｉ
ｎｏｕｃｈｉｍ ｍ ら、Ｊ、Ｈａｃｔｅｒｉｏｌ、、１５０．８０４１ （
１９８２））が利用できる。ｐｌｉＷＩ中のＥｒプロモ
ーターは、その培基配列が；１１ｆ述の如く決γビされ
ており、低ａ厩のＥ （エリスロマイシン）により誘導
効果？もつ。プラスミド中のＥ、ｒＩｔｒ遺伝子は分子
電２万９千ノ２ ａ Ｓ ＲＩＶ Ａ ｌ ｆル（）Ｊ
Ｗ［（不明細普中２９に蛋白という）をコードしており
、２９に蛋白はＥ、７□丁グロモーターにより誘嗜的に
合成される。
出発グラスミド
ｐＭｃ１３ｔａ６ （Ａ ｒ、ｌａｃ’２Ｙ、ｔａ、９
Ｋｂ）［Ｍ、 Ｊ、 Ｃａｓａｄａｂａｎら、Ｊ、 Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏＬ、 。
Ｋｂ）［Ｍ、 Ｊ、 Ｃａｓａｄａｂａｎら、Ｊ、 Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏＬ、 。
１４３．９７１ （１９８０））、ｐＨＶ’ｌ （Ｃｎ
、、ｒ。
、、ｒ。
Ｅｒ、４．ａＫｌ＋）［前述した〕及びｐ ＣＲ７０１
（Ａｒ、 ｐｒｏｃｈｙｍｏｓｉｎ 、 ５．３４に６
） （清水ら、農芸化学会大会要旨集（１９８３）ｐ、
１０；微工研ＦＥＩＩＭ ＢＰ２６４号のＥ、 ｃｏＬ
ｉ ｃ６００ｒ−ｍ −（ｐＣ１？７０１）株中に導入
されている〕ｋ が例示できる。
（Ａｒ、 ｐｒｏｃｈｙｍｏｓｉｎ 、 ５．３４に６
） （清水ら、農芸化学会大会要旨集（１９８３）ｐ、
１０；微工研ＦＥＩＩＭ ＢＰ２６４号のＥ、 ｃｏＬ
ｉ ｃ６００ｒ−ｍ −（ｐＣ１？７０１）株中に導入
されている〕ｋ が例示できる。
プラスミドｐ Ｉｉ Ｆ Ｉの２９に蛋白遺伝子（７３
２、ｂｐ）内には、・ＡＴＣ開始コドンから下流１２５
ｂｐの位１６に九−位、２２１３ｐ位にＢｃ１位１．５
’９７１ＭＪ位にＢｐａＩと３つの制限酵素（４５イＷ
がちり、夫々に異種遺伝子の挿入が口Ｊ能である国ＪＪ
１図参照）。
２、ｂｐ）内には、・ＡＴＣ開始コドンから下流１２５
ｂｐの位１６に九−位、２２１３ｐ位にＢｃ１位１．５
’９７１ＭＪ位にＢｐａＩと３つの制限酵素（４５イＷ
がちり、夫々に異種遺伝子の挿入が口Ｊ能である国ＪＪ
１図参照）。
ｐＫＳ３しＪｌ、ｐＨＷＩのｊｉａｅＮ位に、ｐＭＣ１
３９６のＢａｎｂＢ１位とＳａｌ １位力ぷはさまれた
アンビンリン耐性遺伝子部分（３，７Ａｂ）が組み込ま
れた発見１プラスミドである。まず、ｐＭｃ１３９６を
８０ｍ、Ｉｉ Ｉ、Ｓａ ｌ Ｉで完全消化し、切１所
片の一本鎖部分にＤＩＶＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ
ｆ片）を作用させる。この信４作により両端が平滑であ
る断片（ａ）（３７Ｋｂ）が倫られる。一方、ｐｊｉｌ
ｌｌをＨａｅＩＩｌで部分消化し、Ｅｒ遺伝子内のＨａ
ｅ Ｉｌ１位ノ・大切断シタ。コｔ７）ＤＩＶＡＩＪ
ｉ片（ｂ）（：１．４Ｋｂ）とＩ） Ｎ Ａ恒で片くα
）をＴ、ＤＮＡリガーゼでン８＋：宜宕する。
３９６のＢａｎｂＢ１位とＳａｌ １位力ぷはさまれた
アンビンリン耐性遺伝子部分（３，７Ａｂ）が組み込ま
れた発見１プラスミドである。まず、ｐＭｃ１３９６を
８０ｍ、Ｉｉ Ｉ、Ｓａ ｌ Ｉで完全消化し、切１所
片の一本鎖部分にＤＩＶＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ
ｆ片）を作用させる。この信４作により両端が平滑であ
る断片（ａ）（３７Ｋｂ）が倫られる。一方、ｐｊｉｌ
ｌｌをＨａｅＩＩｌで部分消化し、Ｅｒ遺伝子内のＨａ
ｅ Ｉｌ１位ノ・大切断シタ。コｔ７）ＤＩＶＡＩＪ
ｉ片（ｂ）（：１．４Ｋｂ）とＩ） Ｎ Ａ恒で片くα
）をＴ、ＤＮＡリガーゼでン８＋：宜宕する。
このプラスミドを形デ支転夜により大１＋ｉ４ Ｌａｄ
Ｅ、ＣＯＩ ＺＭ Ｃ１０６４ｒｋ−ｍｋ−ｓ、、、
ｒＣ’Ｍ、Ｊ、Ｃａ５ａｄａｂａｎａｔ、 ａｌ、Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 １４３．９７１（１９８０
１〕に導入する。アンピシリン、クロラムフェニコール
で形質転換法を選ダクシ、これｔ太；、。
Ｅ、ＣＯＩ ＺＭ Ｃ１０６４ｒｋ−ｍｋ−ｓ、、、
ｒＣ’Ｍ、Ｊ、Ｃａ５ａｄａｂａｎａｔ、 ａｌ、Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 １４３．９７１（１９８０
１〕に導入する。アンピシリン、クロラムフェニコール
で形質転換法を選ダクシ、これｔ太；、。
訓製した後、制限酵素により切断するとｐＫｓ３が確認
される。第２図にｐ ＭＣｌ ３９ ’６とｐ Ｂ Ｆ
＋からｐＫＳ３を槁成する倶様を示す。ｐＫＳ３のＨ
ａｅＩ１１位１ｉｆｔ近の塩基配列は次のとおりである
。
される。第２図にｐ ＭＣｌ ３９ ’６とｐ Ｂ Ｆ
＋からｐＫＳ３を槁成する倶様を示す。ｐＫＳ３のＨ
ａｅＩ１１位１ｉｆｔ近の塩基配列は次のとおりである
。
ＥｃｏＲＩ Ｓｍａ ＋ Ｂａ、ｍＨＩｐ、Ｋｓ３が、
枯草菌宿主内で異種遺伝子をＥτプロモーターのｊｂＬ
ｌ １ｉ１４Ｉ下にＸＡ現できることは次のようにして
確かめられる。ｐＫｓを５ｔｎａｌ、５ａｌｔテ！；１
ＪＶＪ丁し、Ｃ’ ｒ （クロラムフェニコール＊Ｉ住
）＝分をとり出す。β−ガラクトシダーゼ構造遺伝子ｆ
ｐＡｉ’ｃ １４０３ （Ａ ｒ’、 Ｌａｃ、’ ２
Ｙ、９．．９Ｋｂ）（Ｍ、 Ｊ 、 Ｃａ５ａｄａｂ
ａｎ ら、Ｊ 、 Ｈａｃｔｅｒｉｏｌ、ｌ ４ ３．
９７１ （１９８０）から、Ｓｍａｌと５ａｉｌで切断
することによｐ切り出ア。両者２Ｔ、ＤＮＡリガーセｉ
ＣＪ、： ツテ連Ｍし、宿主Ｂ、ｓｕｂｔｉｌｉｓｌｉ
Ｍ１２５にノー貝転良する。形質転換体をクロラムフェ
ニコール、エリスロマインン、λσα１（５−７’ロモ
ー４−クロロ−３−インドリル−ベーターＤ−ガシクト
ヴイド、Ｓｉｇｍａ社）を含むＬ−Ｂ培地上で選択する
と、ｎ色を示すコロニーが謬められ、β−ガラクトシダ
−ＩＬ゛が生ｊ或していることが明らかである。従って
、ｐＫＳ３は枯草菌宿主内でβ−ガラクトシダーゼを・
ホ甲、する。
枯草菌宿主内で異種遺伝子をＥτプロモーターのｊｂＬ
ｌ １ｉ１４Ｉ下にＸＡ現できることは次のようにして
確かめられる。ｐＫｓを５ｔｎａｌ、５ａｌｔテ！；１
ＪＶＪ丁し、Ｃ’ ｒ （クロラムフェニコール＊Ｉ住
）＝分をとり出す。β−ガラクトシダーゼ構造遺伝子ｆ
ｐＡｉ’ｃ １４０３ （Ａ ｒ’、 Ｌａｃ、’ ２
Ｙ、９．．９Ｋｂ）（Ｍ、 Ｊ 、 Ｃａ５ａｄａｂ
ａｎ ら、Ｊ 、 Ｈａｃｔｅｒｉｏｌ、ｌ ４ ３．
９７１ （１９８０）から、Ｓｍａｌと５ａｉｌで切断
することによｐ切り出ア。両者２Ｔ、ＤＮＡリガーセｉ
ＣＪ、： ツテ連Ｍし、宿主Ｂ、ｓｕｂｔｉｌｉｓｌｉ
Ｍ１２５にノー貝転良する。形質転換体をクロラムフェ
ニコール、エリスロマインン、λσα１（５−７’ロモ
ー４−クロロ−３−インドリル−ベーターＤ−ガシクト
ヴイド、Ｓｉｇｍａ社）を含むＬ−Ｂ培地上で選択する
と、ｎ色を示すコロニーが謬められ、β−ガラクトシダ
−ＩＬ゛が生ｊ或していることが明らかである。従って
、ｐＫＳ３は枯草菌宿主内でβ−ガラクトシダーゼを・
ホ甲、する。
同様にして、２９Ｋｊ社白遺伝子のＢａＩ２位へβ−ガ
ラクトシダーゼ構造遺伝子（ｐＭｏ １４０３）を挿入
することが可能である。史に、前述と全く同様の手法で
、このプラスミドが枯ギー′Ｉｄ主細胞中、β−ガラク
トシダーゼを発りｌターるかどうか、判定できる。２９
に蛋白遺伝子のＨｐａ ｌ伯を第１」用した発現シラス
ミドも、同様に、造Ｉ或しβ−ガラクトシダーゼの発現
能を調べられる。これらの結果から、β−がラクトシダ
ーゼの発現効率の商いものを選択１−１望ましい異種遺
伝子の発現ベクターとして利用できる。
ラクトシダーゼ構造遺伝子（ｐＭｏ １４０３）を挿入
することが可能である。史に、前述と全く同様の手法で
、このプラスミドが枯ギー′Ｉｄ主細胞中、β−ガラク
トシダーゼを発りｌターるかどうか、判定できる。２９
に蛋白遺伝子のＨｐａ ｌ伯を第１」用した発現シラス
ミドも、同様に、造Ｉ或しβ−ガラクトシダーゼの発現
能を調べられる。これらの結果から、β−がラクトシダ
ーゼの発現効率の商いものを選択１−１望ましい異種遺
伝子の発現ベクターとして利用できる。
ｐ、ＫＳ３のみならず、ｐＨＷ＋から得られる他の発現
ベクター＜Ｂｃｌ １位、ｌ１ｐａ １位挿入）すべて
β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現するが、そのＡ３３
６４にはいずれもｐＫｓ３に比して極めて低い。
ベクター＜Ｂｃｌ １位、ｌ１ｐａ １位挿入）すべて
β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現するが、そのＡ３３
６４にはいずれもｐＫｓ３に比して極めて低い。
グラスミドｐ ＣＲ７１） ２
ｐ Ｃ’ ／？ ７ ｆ） ｌはプ１コキモシン遺伝子
の全長を有するから、これｆ Ｈｉ ｎ ｄ Ｕｌ、Ｓ
ａｌ Ｉで切断し、プロキー敷ンンｃ 、Ｄ ＩＶ Ａ
７５とり出すことができるが、切り出しｆ＜、 ｔ＋
）’を片にはｐｏｌｙ ｄＧ （ｐｏｌｙ ｄＣ）配列
が付シーチしている。ｐｏすｄＧ配列は枯草菌の形質部
」実効率を低める為、プロキモシンｃ ／） Ｎ Ａを
枯草菌７３す２ベクターに接続する除にこれを取り除く
、１！＞ｙｔ、２がＱ ６゜−とこで、７ｉＣＲ７０１
を１ｉｉｎｆ＋で５．１全消化し、ヌクレアーゼＳ＋′
ｆ：作用させ、一本鎖ｆ１１〜分ｋ ｌ）、ｉ；去する
。この断片（２５５０ｂ ｐ）に５ａｌｌリンカ−（Ｇ
ＧＴＣＧＡＣＣ） を連結し、更に、’； ｔｘ ｌ
Ｉでｍ化する、これを断片（Ｃ）とする。
の全長を有するから、これｆ Ｈｉ ｎ ｄ Ｕｌ、Ｓ
ａｌ Ｉで切断し、プロキー敷ンンｃ 、Ｄ ＩＶ Ａ
７５とり出すことができるが、切り出しｆ＜、 ｔ＋
）’を片にはｐｏｌｙ ｄＧ （ｐｏｌｙ ｄＣ）配列
が付シーチしている。ｐｏすｄＧ配列は枯草菌の形質部
」実効率を低める為、プロキモシンｃ ／） Ｎ Ａを
枯草菌７３す２ベクターに接続する除にこれを取り除く
、１！＞ｙｔ、２がＱ ６゜−とこで、７ｉＣＲ７０１
を１ｉｉｎｆ＋で５．１全消化し、ヌクレアーゼＳ＋′
ｆ：作用させ、一本鎖ｆ１１〜分ｋ ｌ）、ｉ；去する
。この断片（２５５０ｂ ｐ）に５ａｌｌリンカ−（Ｇ
ＧＴＣＧＡＣＣ） を連結し、更に、’； ｔｘ ｌ
Ｉでｍ化する、これを断片（Ｃ）とする。
−力、ｐＢ Ｒ３２２をＳαＬＩにより完全消化し、Ｃ
ａ１ｆ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅにより
フォスファターゼ反応ｔ−行なう。こうして得られた断
片（カとｉ：記断片（ｃ）をＴ４１）ＮＡ リガーゼで
連結する。このプラスミドを形質転換により大腸菌Ｅ。
ａ１ｆ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅにより
フォスファターゼ反応ｔ−行なう。こうして得られた断
片（カとｉ：記断片（ｃ）をＴ４１）ＮＡ リガーゼで
連結する。このプラスミドを形質転換により大腸菌Ｅ。
佇ＭＣ１０６４ｒｋｆｆｌｋｓｆ、Ｌｒ に導入する。
アンピシリン、テトラサイクリンで形質転換株？選択し
、これを小量調製した後、制限酵素によって切断すると
１３ＣＲＴ（Ｊ２ （５，５Ｋｂ）が確認される。第３
図にｐＣＲ７０１１！：ｐＢＲ３２２からｐｃＲｒ Ｑ
２を構成する模様を示す。ｐｃＲ７０２はｐｃＲｒ
０１（７）、５ ａ ｌ Ｉ −Ｅｉｎｆ １部分が除
去されている。このグラスミドｐｃＲＴ。
、これを小量調製した後、制限酵素によって切断すると
１３ＣＲＴ（Ｊ２ （５，５Ｋｂ）が確認される。第３
図にｐＣＲ７０１１！：ｐＢＲ３２２からｐｃＲｒ Ｑ
２を構成する模様を示す。ｐｃＲ７０２はｐｃＲｒ
０１（７）、５ ａ ｌ Ｉ −Ｅｉｎｆ １部分が除
去されている。このグラスミドｐｃＲＴ。
２を保持する形質転換株は実際プロキモシンを生産する
。
。
ｐＫｓＲＩＯＬ
プラスミドｐＫｓＲ１０１ではＥ、ｒｎτプロモーター
かグロキモシンｃＤＮＡ全長にリープイン゛グフレーム
を合せて接続されている。ｐ Ｋ Ｓ Ｒｌ Ｏ！は次
のように組立てられる。まず、ｐＫｓ３をＢａｍ１ｉ
Ｉ、５ａｌＩで二重消化し、４．３ Ｋ ｂの６７ｎ
７部分を含むＤＩＶＡ断片（ｇ）を分離する。この断片
にはＥｍｒプロモーターと２９に蛋白遺伝子ノ一部が言
１れる。次に、ｐ ＣＲ７０，２ｆ ＩＪａｍｌｉ’
Ｉ。
かグロキモシンｃＤＮＡ全長にリープイン゛グフレーム
を合せて接続されている。ｐ Ｋ Ｓ Ｒｌ Ｏ！は次
のように組立てられる。まず、ｐＫｓ３をＢａｍ１ｉ
Ｉ、５ａｌＩで二重消化し、４．３ Ｋ ｂの６７ｎ
７部分を含むＤＩＶＡ断片（ｇ）を分離する。この断片
にはＥｍｒプロモーターと２９に蛋白遺伝子ノ一部が言
１れる。次に、ｐ ＣＲ７０，２ｆ ＩＪａｍｌｉ’
Ｉ。
ＥｃｏＲｌで完全消化して、生成する４６Ｓｂｐの断片
（イ）を単品する。更に、ｐｃＲＴＯ２をＥｃｑＲｌと
５ａ１１で二重消化し、’１２９ｂｐの１）ＩＶＡｚＨ
片（ｇ） ｗ １μ喘する。これら両ｋｊｔ片（イ）と
（ωは共にプロキモシンｃＤＮＡ″ｃあり、両者を合せ
るとプロキモシンのほぼ全艮となる。上記のＤＮＡ断片
（ｅ）、（イ）、（ｇ）を１“４ リガーゼで連結する
。この連＃ｊＤ ＮＡｆ形質転ｍＫよりＢ、 ５ｕｂｔ
ｉｌｉａ ＲＭ １２５へ導入する。形繊転換株の内、
クロラムフェニコール耐性株を逍択し、制限酵素切断に
よって確認するとｐ Ａ Ｓ Ｒ１０１が保持されてい
る。第４図にｐｃＲ７０２と７ｙＫＳ３から７ｙＫＳＲ
１０１を構成する模様を示す。
（イ）を単品する。更に、ｐｃＲＴＯ２をＥｃｑＲｌと
５ａ１１で二重消化し、’１２９ｂｐの１）ＩＶＡｚＨ
片（ｇ） ｗ １μ喘する。これら両ｋｊｔ片（イ）と
（ωは共にプロキモシンｃＤＮＡ″ｃあり、両者を合せ
るとプロキモシンのほぼ全艮となる。上記のＤＮＡ断片
（ｅ）、（イ）、（ｇ）を１“４ リガーゼで連結する
。この連＃ｊＤ ＮＡｆ形質転ｍＫよりＢ、 ５ｕｂｔ
ｉｌｉａ ＲＭ １２５へ導入する。形繊転換株の内、
クロラムフェニコール耐性株を逍択し、制限酵素切断に
よって確認するとｐ Ａ Ｓ Ｒ１０１が保持されてい
る。第４図にｐｃＲ７０２と７ｙＫＳ３から７ｙＫＳＲ
１０１を構成する模様を示す。
プロキモシン５番目のコドン（ＣＣＴ）附近のＤＩＶＡ
配列はＩｉａｘａｍ−Ｇｔｌｂｇｒｔ法により解析する
と次の通９である。
配列はＩｉａｘａｍ−Ｇｔｌｂｇｒｔ法により解析する
と次の通９である。
プロキモシン
枯草菌中でのプロキモシンの発現
プラスミドｐＫｓＲＩＯＬｆ保持する形質転換枯４菌細
胞をＬ−Ｂ培地で前培養の段、Ｃ’Ｈ−培地で本培養す
る。本培養中にエリスロマイシンを添加し、遺伝子の発
現を誘導する。培養物を集画処理し、ＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気な勤にかける。移動蛋白をニトロセル
ローズフィルターに転与し、酵素免疫プロティングアッ
セイ（Ｅｎｚｙｔｎｅ Ｉｍｔｎｎｏ Ｂｌｏｔｔｉｎ
ｇ Ａｓｔｔａｙ）で分析すると、プロキモシン蛋白が
検出される。生成蛋白’Ｂ４は標品プロキモシン葡検量
して測定すると一細胞当り約７５００〜１５０００分子
に相当すると推測される。生成蛋白はプロキモシンと２
９に蛋白の融合４Ｊｉ白であり、分子節は約４万５千と
測定される。従って、発現グラスミドｐＫｓＲｘＯ１を
１呆イコ″する枯４１ Ｈ，５ｕｂｔｉｌｉｓ ＲＭ
１２５＜ｐＫｓＲｌｏ ｔ）はＥ−ｒｒロモ−ｐ−の制
御−丁、プロキモシン遺伝子を発現し、プロモーター領
域内、開始コドンより下流、プロキモシン遺伝子間に介
在する２９に蛋白遺伝子がコードする２ｑＫ＞白とプロ
キモシン融合瓜白ｔｌ−顔生する。
胞をＬ−Ｂ培地で前培養の段、Ｃ’Ｈ−培地で本培養す
る。本培養中にエリスロマイシンを添加し、遺伝子の発
現を誘導する。培養物を集画処理し、ＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気な勤にかける。移動蛋白をニトロセル
ローズフィルターに転与し、酵素免疫プロティングアッ
セイ（Ｅｎｚｙｔｎｅ Ｉｍｔｎｎｏ Ｂｌｏｔｔｉｎ
ｇ Ａｓｔｔａｙ）で分析すると、プロキモシン蛋白が
検出される。生成蛋白’Ｂ４は標品プロキモシン葡検量
して測定すると一細胞当り約７５００〜１５０００分子
に相当すると推測される。生成蛋白はプロキモシンと２
９に蛋白の融合４Ｊｉ白であり、分子節は約４万５千と
測定される。従って、発現グラスミドｐＫｓＲｘＯ１を
１呆イコ″する枯４１ Ｈ，５ｕｂｔｉｌｉｓ ＲＭ
１２５＜ｐＫｓＲｌｏ ｔ）はＥ−ｒｒロモ−ｐ−の制
御−丁、プロキモシン遺伝子を発現し、プロモーター領
域内、開始コドンより下流、プロキモシン遺伝子間に介
在する２９に蛋白遺伝子がコードする２ｑＫ＞白とプロ
キモシン融合瓜白ｔｌ−顔生する。
本発明のガ法によって調製された、新規カブラスミドを
保有する大腸繭、ちるいは枯草菌は工粟技術院倣生物工
業技術研究所にブタペスト条約に従って寄此されており
、各菌株に与えられた受託番号によｐ％定される。
保有する大腸繭、ちるいは枯草菌は工粟技術院倣生物工
業技術研究所にブタペスト条約に従って寄此されており
、各菌株に与えられた受託番号によｐ％定される。
本発明は以下の裏施例によりさらに詳しく６己述される
が、球々な裳史又は修正が発明の技術範囲内で許される
ことを理解すべきである。
が、球々な裳史又は修正が発明の技術範囲内で許される
ことを理解すべきである。
実施例
本笑施例中、用いられる棟々の緩衝液は次のｉｌ主成を
南し〜特に記載がなけ扛ば浴液はすべてＴＥＡ緩衝液を
使用した。
南し〜特に記載がなけ扛ば浴液はすべてＴＥＡ緩衝液を
使用した。
ＴＥ緩衝液 ＴＥＮ緩衝液
１ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＢＣ’ｌ ２ ０ｔｎＭ Ｔｒ
ｉｓ−１１Ｃ’１（ｐＨ８，０） （ＬＨ７，５） １ｍＭＥｌ）ＴＡ５０ｒｎＡイＩＶａＣ１１想Ｍ ＥＤ
１’Ａ （ｘｉｏｌ ＮｌＬｃｌａａｓｇ （Ｘｌｏ）ｌ）ＮＡ
ボリメＳ１緩衝液 ラーゼ緩衝液 ０．３Ｍ ＩＶａ−Ａｃ、ｇｔａｔｅ ０．３Ｍ Ｔｒ
ｉｍ−１１ｃＩ（ｐＨ４，６） ＣｐＭ７．５） ０．５Ｍ ＮａＣ１４０ｍＭ ＭｇＣ１゜１１ＣＩ ｐ
Ｈ７，６（ｐＨ７，５） ６６ｍＭ ＭｇＣ１ｔ １００ｍＭ ＭｇＣ１゜１０ｍ
Ｍ １）ＴＴ ５０ｍＭ ＤＴＴｌｒｎＭ Ｓｐｔｔｒ
ｍｉｄｉｎｇ ｘｍＭ Ｅｌ）ＴＡ アガロース″屯気泳動用緩衝液 ４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１１Ｃ１（ｐＨ７，５）５ ｍＭ
Ｃ１１３Ｃ’（ＪＯＮ ａ ｌ ７ＩＬＭ ＥＤＴＡ 形員転俣及び発現実収に用いる栄養培地は次の組成を有
する。
ｉｓ−１１Ｃ’１（ｐＨ８，０） （ＬＨ７，５） １ｍＭＥｌ）ＴＡ５０ｒｎＡイＩＶａＣ１１想Ｍ ＥＤ
１’Ａ （ｘｉｏｌ ＮｌＬｃｌａａｓｇ （Ｘｌｏ）ｌ）ＮＡ
ボリメＳ１緩衝液 ラーゼ緩衝液 ０．３Ｍ ＩＶａ−Ａｃ、ｇｔａｔｅ ０．３Ｍ Ｔｒ
ｉｍ−１１ｃＩ（ｐＨ４，６） ＣｐＭ７．５） ０．５Ｍ ＮａＣ１４０ｍＭ ＭｇＣ１゜１１ＣＩ ｐ
Ｈ７，６（ｐＨ７，５） ６６ｍＭ ＭｇＣ１ｔ １００ｍＭ ＭｇＣ１゜１０ｍ
Ｍ １）ＴＴ ５０ｍＭ ＤＴＴｌｒｎＭ Ｓｐｔｔｒ
ｍｉｄｉｎｇ ｘｍＭ Ｅｌ）ＴＡ アガロース″屯気泳動用緩衝液 ４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１１Ｃ１（ｐＨ７，５）５ ｍＭ
Ｃ１１３Ｃ’（ＪＯＮ ａ ｌ ７ＩＬＭ ＥＤＴＡ 形員転俣及び発現実収に用いる栄養培地は次の組成を有
する。
Ｌ−Ｂｒｏｔｈ １ｔ＜ｐＨ７，２〜？、４）Ｈａｃｔ
ｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ １０２ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ５ ｆ’グルコース １
ｙ ＡαＣ１！Ｍ ＣＭ Ｂｒｏｔｈ ｌｔ （ｐＨ７，０）Ｋ２ＥＰ０４
１４ ？ Ｋｌｉ、ＰＯ４６Ｓ’ ＩＶａ、−ｃｉｔｒａｔｅ １ ？ （ｆｉｉｌｌ、 ）ｔ Ｓ Ｃｊ、 ２ ｔＪ）ｉｆｃ
ｏ Ｃａ５ｅｉｎ Ｏ，５ｔＥｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ Ｊｉｇ、ＳＵ、−１１１２００，２９ グルコース ５ｖ 侠求アミノ酸 アデニン １００ｍｇ ロイシフ ５０〜 宿主の形質転瑛は、大腸菌の場合Ｎ ｏｒｇａｒｄの方
法（Ｍ、Ｖ、ＮｏｒｇａｒｄらＧｅｎｅ、 ３．２７９
（ｉ９７８））に従い、枯草菌の場合５ｐｉｚｉｚｅ
ｎの方法（／、５ｐｉｚｉｚｅｎら、Ｊ、Ｅａｃｔｅｒ
ｉｏ１１８１ ＊７４１ （１９６２））に従った。
ｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ １０２ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ５ ｆ’グルコース １
ｙ ＡαＣ１！Ｍ ＣＭ Ｂｒｏｔｈ ｌｔ （ｐＨ７，０）Ｋ２ＥＰ０４
１４ ？ Ｋｌｉ、ＰＯ４６Ｓ’ ＩＶａ、−ｃｉｔｒａｔｅ １ ？ （ｆｉｉｌｌ、 ）ｔ Ｓ Ｃｊ、 ２ ｔＪ）ｉｆｃ
ｏ Ｃａ５ｅｉｎ Ｏ，５ｔＥｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ Ｊｉｇ、ＳＵ、−１１１２００，２９ グルコース ５ｖ 侠求アミノ酸 アデニン １００ｍｇ ロイシフ ５０〜 宿主の形質転瑛は、大腸菌の場合Ｎ ｏｒｇａｒｄの方
法（Ｍ、Ｖ、ＮｏｒｇａｒｄらＧｅｎｅ、 ３．２７９
（ｉ９７８））に従い、枯草菌の場合５ｐｉｚｉｚｅ
ｎの方法（／、５ｐｉｚｉｚｅｎら、Ｊ、Ｅａｃｔｅｒ
ｉｏ１１８１ ＊７４１ （１９６２））に従った。
犬）ｉ力閑の形式転換法
Ｌ−Ｂ培地（１０ｄＪ中、大腸菌を密度１〜２×ｌθ６
細胞／ ｍｅ、までＪ臂殖させ、聚昭して１０ｒｎｌＰ
ＣＰ １で洸汐する。再開集菌し、５ｍ１ＰＣＰＴＩ
に眉２１蜀後、２０分間静置する。柔菌後０．５ ｍｌ
Ｐ Ｃｐｍに１６ン蜀しｃｏｍｐｅｔｅｎｔ （ｆ）
ＩＶ Ａ取り込み能をゼする）ｌｙ＋ｌｌＩ胞ヲ得る。
細胞／ ｍｅ、までＪ臂殖させ、聚昭して１０ｒｎｌＰ
ＣＰ １で洸汐する。再開集菌し、５ｍ１ＰＣＰＴＩ
に眉２１蜀後、２０分間静置する。柔菌後０．５ ｍｌ
Ｐ Ｃｐｍに１６ン蜀しｃｏｍｐｅｔｅｎｔ （ｆ）
ＩＶ Ａ取り込み能をゼする）ｌｙ＋ｌｌＩ胞ヲ得る。
ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞０．２ ｍｌにＤＮＡを加え、
０℃で３０分〜６０分間静置する。
０℃で３０分〜６０分間静置する。
仄に、１．８ｄのＬ−Ｂｉ＠地を加え３７℃で１．５時
１目」振面する。この培養物を薬剤入り （例えば、ア
ンピシリン）プレートにｏ、 ｉ ｙ接種し、架剤耐性
株を採取する。
１目」振面する。この培養物を薬剤入り （例えば、ア
ンピシリン）プレートにｏ、 ｉ ｙ接種し、架剤耐性
株を採取する。
枯草菌の形質転換法
枯草菌をＬ−Ｂ培地中、前培養し、培養物ｌＯｍｅから
Ａｊｌ１２ゴにｌＯチ接種し、３７℃で４時間伽面培養
する。これをＭＷにｘｏ％按種し、３７”Ｇで１．５晩
間培養する。かくして得られたｃｏｍ−ｐｅｔｏｎｔ細
胞を凍結保存すル（／Ｊ、Ｄｕｂｎａｕら）。
Ａｊｌ１２ゴにｌＯチ接種し、３７℃で４時間伽面培養
する。これをＭＷにｘｏ％按種し、３７”Ｇで１．５晩
間培養する。かくして得られたｃｏｍ−ｐｅｔｏｎｔ細
胞を凍結保存すル（／Ｊ、Ｄｕｂｎａｕら）。
Ｖｉｒｏｌ、、４ 、 ｓ ｏ Ｄ ９ ｅ ９１ ン
。この詠結保存ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細施０．３ ｍｌに
Ｅ Ｇ ＴＡをｉ＋ａ度１ｍＭとなるように添加し、３
７℃で５分間プレインギュペートした陵、ＤＩＶＡ溶故
５０μｔを加える。これを３７℃で４５分間保畠する。
。この詠結保存ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細施０．３ ｍｌに
Ｅ Ｇ ＴＡをｉ＋ａ度１ｍＭとなるように添加し、３
７℃で５分間プレインギュペートした陵、ＤＩＶＡ溶故
５０μｔを加える。これを３７℃で４５分間保畠する。
これに１〜２倍餐のＬ−Ｂ培地を加え、３７℃で６０分
間〜９０分１０１発現させる。この培養、勿勿栄剤入り
プレートに０．１ ｍε埃捕し、架剤耐性株を採取する
。
間〜９０分１０１発現させる。この培養、勿勿栄剤入り
プレートに０．１ ｍε埃捕し、架剤耐性株を採取する
。
実施例１
プラスミドｐＫＳ ３の組み立て
ｉ） ｐＨｌＶＩのＨαｅＮによる部分消化プラスミド
ｐｌＮＶ１ （Ｃｍ”、Ｅｍｒ３．４Ａ ｂ ）ＴＥ溶
液２０μ４（５０μｍ ／ ｍｅ ）、ＲαｅＩｌｌ（
５単位、１μｌＪ）、１ｔａｅｍ緩衝液３ｘＡＸＨ，０
６μｌからなる最終容量４０μノの反応液を３７℃で２
分間保温（インキュベート）シて、ｐｔｉｙ■をＩＩ
ａ ｅ ｍで部分消化した。反応葡フェノール処理によ
り停止させ、生成りＮＡ （ｂ ）をエタノール沈殿さ
せた。沈殿を６μｌの水に溶解し、この溶解液を■）の
リゲーションに使用した。
ｐｌＮＶ１ （Ｃｍ”、Ｅｍｒ３．４Ａ ｂ ）ＴＥ溶
液２０μ４（５０μｍ ／ ｍｅ ）、ＲαｅＩｌｌ（
５単位、１μｌＪ）、１ｔａｅｍ緩衝液３ｘＡＸＨ，０
６μｌからなる最終容量４０μノの反応液を３７℃で２
分間保温（インキュベート）シて、ｐｔｉｙ■をＩＩ
ａ ｅ ｍで部分消化した。反応葡フェノール処理によ
り停止させ、生成りＮＡ （ｂ ）をエタノール沈殿さ
せた。沈殿を６μｌの水に溶解し、この溶解液を■）の
リゲーションに使用した。
ｊｉ） ｐＭｃ１３９６のＢａｍＥ ｌＸ５ａｌ ＋に
よる完全消化 大腸菌プラスミド’ＩＭＣ１３９６（Ａｐｒ。
よる完全消化 大腸菌プラスミド’ＩＭＣ１３９６（Ａｐｒ。
ｌａｃ’ ｚ−ｙ 、９．９Ｋｂ ）ＴＥ溶液２０μＩ
ｊ（ｓ２ｔｔｌｌ／ｍｅ）、Ｂａｍ１ｌ Ｉ （３０単
位、ａｐｌ）、ＢαｑｎｌｌＩ緩衝液３μｌからなる反
応液を３７°Ｃで６０分間保温した。生成りＮＡをエタ
ノール沈殿させ、沈殿を２４μ１Ｈ２０に溶解した。こ
れに５ｔｘＬ ｌ （３０単位、３μ７り及びＳ ａ
Ｘ’ｌ緩衝液３μｌを加えて３０μｌとし３７℃で６０
分間保温、続いて６５℃で１０分間保温した。生成りＮ
Ａ （α）をエタノール沈殿させた。
ｊ（ｓ２ｔｔｌｌ／ｍｅ）、Ｂａｍ１ｌ Ｉ （３０単
位、ａｐｌ）、ＢαｑｎｌｌＩ緩衝液３μｌからなる反
応液を３７°Ｃで６０分間保温した。生成りＮＡをエタ
ノール沈殿させ、沈殿を２４μ１Ｈ２０に溶解した。こ
れに５ｔｘＬ ｌ （３０単位、３μ７り及びＳ ａ
Ｘ’ｌ緩衝液３μｌを加えて３０μｌとし３７℃で６０
分間保温、続いて６５℃で１０分間保温した。生成りＮ
Ａ （α）をエタノール沈殿させた。
１ｉｉ） Ｊ）ＨＡ断片（α）の一本鎖末端の修復ＤＮ
Ａ断片（α）を２９μ１Ｈ２０に溶解し、２０ｍＭｄＮ
ＴＰ（各２−５ｔｔｌ計１０μｌ）、ポリメラーゼ緩衝
液５μｌ、ＤＮＡポリメラーシー（ｂｒｅｎｏｗの断片
）（ｉ、ｓμ、ｔμｌ）を加え総量４５μｌの反応液と
し、これを３０℃１０分間保温した。反応をフェノール
処理により停止し、午成りＮＡ（３，’１Ｋｂ）をエタ
ノール沈殿させた。
Ａ断片（α）を２９μ１Ｈ２０に溶解し、２０ｍＭｄＮ
ＴＰ（各２−５ｔｔｌ計１０μｌ）、ポリメラーゼ緩衝
液５μｌ、ＤＮＡポリメラーシー（ｂｒｅｎｏｗの断片
）（ｉ、ｓμ、ｔμｌ）を加え総量４５μｌの反応液と
し、これを３０℃１０分間保温した。反応をフェノール
処理により停止し、午成りＮＡ（３，’１Ｋｂ）をエタ
ノール沈殿させた。
沈殿を６μｌＢ、０に溶解し、この溶解液を次の工程に
使用した。
使用した。
■） ＤＮＡ断片（ｂ）とＤＮＡ断片（ａ）の連結
両生成りＮＡの溶液各６μｌｚ Ｔ＜’）ガーゼ（１，
８単位、２μＢ）、３ｍＭＡＴＰ （４μｌ）、リガー
ゼ緩衝液２μ４からなる総量１６μｌの反応液を１１℃
で一夜保温した。連結されたＤＮＡをエタノール沈殿さ
せた。
８単位、２μＢ）、３ｍＭＡＴＰ （４μｌ）、リガー
ゼ緩衝液２μ４からなる総量１６μｌの反応液を１１℃
で一夜保温した。連結されたＤＮＡをエタノール沈殿さ
せた。
■） 形質転換
常法に従って調製した宿支しμＤノＣ１０６４ｒｌ ｔ
ｎ、ｒ−ａｍ” （７） ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞に■
）で得られたＤＮＡを形質転換で取シ込ませた。形質転
換株の中、アンピシリン、クロラムフエニゴール耐性株
を採取した。この形質転換薬剤耐性株からプラスミドを
抽出し、制限酵素切断によってｐＫＳ ３を保持してい
ることを確認した。この菌株ｐ：、ｃｏｌｉＭＣ１０６
４ｒｋ−ｍｋ＋ｓｍｒ（ｐＫｓ３ ）は微工研に受託番
号１７ＥＲＭ ＨＰ−５０３号として寄託された。
ｎ、ｒ−ａｍ” （７） ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞に■
）で得られたＤＮＡを形質転換で取シ込ませた。形質転
換株の中、アンピシリン、クロラムフエニゴール耐性株
を採取した。この形質転換薬剤耐性株からプラスミドを
抽出し、制限酵素切断によってｐＫＳ ３を保持してい
ることを確認した。この菌株ｐ：、ｃｏｌｉＭＣ１０６
４ｒｋ−ｍｋ＋ｓｍｒ（ｐＫｓ３ ）は微工研に受託番
号１７ＥＲＭ ＨＰ−５０３号として寄託された。
実施例２
プラスミドｐｃＲ７’０２の組み立て
ｉ） ｐｃＲ７ｏ１の１ｆｉｎｆｌによる消化グラスミ
ドｐ（？Ｒ７０１６５μ１（１５０μｇ／−）、Ｈｉｎ
ｆ ｌ （３５単位、７ｐｌ）、ｌ１ｉｎｆ緩衝液１０
μ１１水１８μｌからなる総量１００μｌの反応液を３
７℃で１．５時間保温して、ｐＣＲ７０１をｌ１ｉｒｔ
ｆＩで完全消化し／こ。生成りＮＡをエタノールで沈殿
させた。沈殿を２６３７μｌの水に溶解し、次の工程で
使用した。
ドｐ（？Ｒ７０１６５μ１（１５０μｇ／−）、Ｈｉｎ
ｆ ｌ （３５単位、７ｐｌ）、ｌ１ｉｎｆ緩衝液１０
μ１１水１８μｌからなる総量１００μｌの反応液を３
７℃で１．５時間保温して、ｐＣＲ７０１をｌ１ｉｒｔ
ｆＩで完全消化し／こ。生成りＮＡをエタノールで沈殿
させた。沈殿を２６３７μｌの水に溶解し、次の工程で
使用した。
ｉｊ ） Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓ 、処理生成りＮＡ溶
液２６３．７ ｐ ｌ 、 ＮｕｃＬｅａｓｅ Ｓ 。
液２６３．７ ｐ ｌ 、 ＮｕｃＬｅａｓｅ Ｓ 。
（６３０単位、ｅ、 ａ ｔｔ ｌ ）、Ｎｗｃｌｅａ
ｓｅ Ｓ 、緩衝液３０μｌからなる総量３００μｌの
反応液を４０℃で３０分間保温した。反応をフェノール
処理によシ停止した。フェノールをエーテル抽出により
除去し、生成りＮＡをエタノールで沈殿させた。これを
アガロースゲル（０８Ｌ％）電気泳動にかけ、最も大き
いＩ）ＮＡ断片（２５５０ｂｐ）を回収した。
ｓｅ Ｓ 、緩衝液３０μｌからなる総量３００μｌの
反応液を４０℃で３０分間保温した。反応をフェノール
処理によシ停止した。フェノールをエーテル抽出により
除去し、生成りＮＡをエタノールで沈殿させた。これを
アガロースゲル（０８Ｌ％）電気泳動にかけ、最も大き
いＩ）ＮＡ断片（２５５０ｂｐ）を回収した。
１ｉｉ） Ｉ）ＮＡ断片に５ａｌｌリンカ−を連結工程
ＩＩ）で回収したＤＮＡ断片（８μｌ Ｈ２Ｏ）。
ＩＩ）で回収したＤＮＡ断片（８μｌ Ｈ２Ｏ）。
にｌＩ２０４μｌとリガーゼ緩衝液１μｌを加えた混合
液Ａを調製した。次に、５ａｌＩｙ）ンカー（ＧＧＴＣ
ＧＡＣＣ）ａμｌ（１μＩ／μｌ）、リン酸カリウム緩
衝液３μｌ、３ｍＭＡＴＰ３μ１１Ｂ２０１９μｌ、Ｔ
、ＤＮＡキナーゼ（６単位、２μｌ）から成る反応液を
３７℃に１時間保温し、５ａｌＩリンカ−をｋｉｎａｔ
ｉｏｆＬした（この反応液を混合液Ｂという）。混合液
Ｂに混合液Ａを加えた後、３ｒｎ、ＭＡＴｐ５１ＬＩＪ
とＴ４ リガーゼ３μｌを加え、全反応液を１１℃で一
夜保温し、続いて６５℃で１０分間保温した。
液Ａを調製した。次に、５ａｌＩｙ）ンカー（ＧＧＴＣ
ＧＡＣＣ）ａμｌ（１μＩ／μｌ）、リン酸カリウム緩
衝液３μｌ、３ｍＭＡＴＰ３μ１１Ｂ２０１９μｌ、Ｔ
、ＤＮＡキナーゼ（６単位、２μｌ）から成る反応液を
３７℃に１時間保温し、５ａｌＩリンカ−をｋｉｎａｔ
ｉｏｆＬした（この反応液を混合液Ｂという）。混合液
Ｂに混合液Ａを加えた後、３ｒｎ、ＭＡＴｐ５１ＬＩＪ
とＴ４ リガーゼ３μｌを加え、全反応液を１１℃で一
夜保温し、続いて６５℃で１０分間保温した。
Ｆ／） ＳαＩＩによる消化
工程１１１）の反応混合液に５ａ７１（２００単位、１
０μｌ）、ｌｉ、Ｏ１１７μ１ｌＳＳａｌ Ｉｉ衝液液
２０μｌ添加し、３７℃で２時間保温した。更に、念の
為５ａｌｌ（２００単位、２０μｌ）、５ａｌＩ紘衝液
２０ Ｉｌｌ、 Ｈ，０１６０ｐｌを加え３７℃で２時
間保温し、Ｓａｌ Ｉによる完全消化を行なった。生成
Ｊ） Ｎ Ａをエタノール沈ｉｌｌせた。
０μｌ）、ｌｉ、Ｏ１１７μ１ｌＳＳａｌ Ｉｉ衝液液
２０μｌ添加し、３７℃で２時間保温した。更に、念の
為５ａｌｌ（２００単位、２０μｌ）、５ａｌＩ紘衝液
２０ Ｉｌｌ、 Ｈ，０１６０ｐｌを加え３７℃で２時
間保温し、Ｓａｌ Ｉによる完全消化を行なった。生成
Ｊ） Ｎ Ａをエタノール沈ｉｌｌせた。
これをアガロースゲル（０，８％ ）電気泳動にかけ過
剰なリンカ−を取り除いた。
剰なリンカ−を取り除いた。
Ｖ） ｐＢＲ３２２のＳａｌ Ｉ消化とアルカリ／オス
フエターゼ処理 ｐ Ｂ Ｒ３２２２０μ１（２５９μＩ／渭ｌ）、５ａ
ｌＩ（Ｔｏ年単位７μＩｌ）、Ｓ（Ｌ Ｉ Ｉ 収（ｋ
液７μｍ、ｌＩ２０３６μｌから成る総量７０μｌの反
応液を３７℃で１時間保温することにより ｐ １３
Ｒ３２２をＳａｔ Ｉで消化した。生成１）ＮＡをエタ
ノールで沈殿し、沈殿を７８μＡＢ、０に溶解した。コ
ノＤ Ｎ、Ａ溶液にＪＪＰ緩衝液（ｘｌＯＨ１００？？
ＩＭ ＭｇＣｌ、を０．５ＭＴデｉ８−塩酸中に含みｐ
Ｈが８５である）９μ４とＣａ１ｆ １ｎｔｅｓｔｉｎ
ｅ ａｌｋａ−１ｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ （
６単位、３ｔｔｌｌ）を加えり溶液を３７℃で１時間保
温した。フェノール処理によシ反応を失活させた。
フエターゼ処理 ｐ Ｂ Ｒ３２２２０μ１（２５９μＩ／渭ｌ）、５ａ
ｌＩ（Ｔｏ年単位７μＩｌ）、Ｓ（Ｌ Ｉ Ｉ 収（ｋ
液７μｍ、ｌＩ２０３６μｌから成る総量７０μｌの反
応液を３７℃で１時間保温することにより ｐ １３
Ｒ３２２をＳａｔ Ｉで消化した。生成１）ＮＡをエタ
ノールで沈殿し、沈殿を７８μＡＢ、０に溶解した。コ
ノＤ Ｎ、Ａ溶液にＪＪＰ緩衝液（ｘｌＯＨ１００？？
ＩＭ ＭｇＣｌ、を０．５ＭＴデｉ８−塩酸中に含みｐ
Ｈが８５である）９μ４とＣａ１ｆ １ｎｔｅｓｔｉｎ
ｅ ａｌｋａ−１ｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ （
６単位、３ｔｔｌｌ）を加えり溶液を３７℃で１時間保
温した。フェノール処理によシ反応を失活させた。
■） 再連結
Ｆ／ ） （ｒ）牛成りＮ Ａ （ｃ ） （エタノー
ル沈殿させた）を４０μ１ｌ１２０に溶解し、内２０μ
ｌを使用した。■）の生成りＮＡ（ｄ）（エタノール沈
殿させた）を２０μｌ１ｌｉ、Ｏに溶解し、内５μｌを
使用した。両ＤＮＡ溶液に３毒ＭＡＴＰＴμ１１Ｔ４
リガーゼ（０，９単位、１μｌ）、リガーゼ緩衝液を加
え、２１℃で２時間保温し、両ＤＮＡを連結した。連結
されたＤＮ、ｆ、をエタノール沈殿させた。生成したＤ
ＮＡプラスミド中、共に同じｐＢＲ３２２に由来する重
複する部分が自然脱落（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ） Ｌ、た
。
ル沈殿させた）を４０μ１ｌ１２０に溶解し、内２０μ
ｌを使用した。■）の生成りＮＡ（ｄ）（エタノール沈
殿させた）を２０μｌ１ｌｉ、Ｏに溶解し、内５μｌを
使用した。両ＤＮＡ溶液に３毒ＭＡＴＰＴμ１１Ｔ４
リガーゼ（０，９単位、１μｌ）、リガーゼ緩衝液を加
え、２１℃で２時間保温し、両ＤＮＡを連結した。連結
されたＤＮ、ｆ、をエタノール沈殿させた。生成したＤ
ＮＡプラスミド中、共に同じｐＢＲ３２２に由来する重
複する部分が自然脱落（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ） Ｌ、た
。
■） 形質転換
常法に従って調製した宿主Ｅ、ｃｏｌｉＭＣ１０６４７
ｋ−ｍ ｊ ａｍｒ（７） ＣＯｍｐｅ Ｌｅｎｔ細胞
に■）で得られたＤＮＡを形質転換により取り込ませた
。約５００コロニーの形質転換株の中、アンピシリン、
テトラサイクリン削性約７０株を選択した。この薬剤耐
性形質転換株からプラスミドを抽出し、制限酵素切断に
よってｐｃＲ’１０２を保持していることを確認した。
ｋ−ｍ ｊ ａｍｒ（７） ＣＯｍｐｅ Ｌｅｎｔ細胞
に■）で得られたＤＮＡを形質転換により取り込ませた
。約５００コロニーの形質転換株の中、アンピシリン、
テトラサイクリン削性約７０株を選択した。この薬剤耐
性形質転換株からプラスミドを抽出し、制限酵素切断に
よってｐｃＲ’１０２を保持していることを確認した。
この菌株Ｅ、ｃｏｌｉＭＣ１０６４ｒｋ−ｍｙ”−ｓｍ
ｒ（ｐ ＣＲ７０２）は微工研に受託番号ＦＥＲＭＩ３
Ｆ−５０１号として寄託された。
ｒ（ｐ ＣＲ７０２）は微工研に受託番号ＦＥＲＭＩ３
Ｆ−５０１号として寄託された。
笑施例３
プラスミド ＫＳＲｌｏｌの組み立て
１）ＩＫＳ３のＢａｍ１ｉｌ、Ｓａｌ Ｉによる完全消
化ｐＫＳ３３ｏｔｔｉｌ （ｓｏμｇ／ｍｅ）、５ａｌ
ｌ（５０単位、５μｌ）、５ａｌＩｆｉ衝液５ｔＬ１１
””１５μｌから成る総量２０μノの反応液を３７℃で
１時間保温し、ｐＫＳ３を５ａｌｌで完全消化した。生
成りＮＡをエタノール沈殿し、沈殿を４０μ１ｌ１２０
に溶解する。この溶液に対しテＢａｔｎＪ１１ （５０
単位、５ｔｔｌ）、ｌ）ａｍｌｌｌ緩衝液５μｌを加え
た溶液を３７℃で１時間保温した。生成りＮＡｆエタノ
ールで沈殿させた。これをアガロースゲル電気泳動にか
け、大きな断片（ｇＮ４．３．７（ｉｔ）を単離した。
化ｐＫＳ３３ｏｔｔｉｌ （ｓｏμｇ／ｍｅ）、５ａｌ
ｌ（５０単位、５μｌ）、５ａｌＩｆｉ衝液５ｔＬ１１
””１５μｌから成る総量２０μノの反応液を３７℃で
１時間保温し、ｐＫＳ３を５ａｌｌで完全消化した。生
成りＮＡをエタノール沈殿し、沈殿を４０μ１ｌ１２０
に溶解する。この溶液に対しテＢａｔｎＪ１１ （５０
単位、５ｔｔｌ）、ｌ）ａｍｌｌｌ緩衝液５μｌを加え
た溶液を３７℃で１時間保温した。生成りＮＡｆエタノ
ールで沈殿させた。これをアガロースゲル電気泳動にか
け、大きな断片（ｇＮ４．３．７（ｉｔ）を単離した。
ｉｉ ） ｐ Ｃｉ？ ７０２のＢａｍ１ｉｌ、Ｅｃｏ
Ｒｌによる二重消化 ｐｃＲ’１０２ ２０ｐｌ （１５０／ｊ＃／ｍｇ）、
ＥｃｏＲＩ （７５単位、１５μｌ）、Ｅ ｃ ｏ Ｒ
Ｉ緩衝液５μｍ１．Ｂ２０２０μｌからなる総量５０μ
ｌの反応液を３７℃で１時間保温することによりｐｃＲ
’７０２をＥｃｏＲＩで切断した。生成りＮＡをエタノ
ールで沈殿させ、沈殿を４０μ１Ｅ２９に溶解した。こ
の溶液にＢａｍ、７７■（ｓ。
Ｒｌによる二重消化 ｐｃＲ’１０２ ２０ｐｌ （１５０／ｊ＃／ｍｇ）、
ＥｃｏＲＩ （７５単位、１５μｌ）、Ｅ ｃ ｏ Ｒ
Ｉ緩衝液５μｍ１．Ｂ２０２０μｌからなる総量５０μ
ｌの反応液を３７℃で１時間保温することによりｐｃＲ
’７０２をＥｃｏＲＩで切断した。生成りＮＡをエタノ
ールで沈殿させ、沈殿を４０μ１Ｅ２９に溶解した。こ
の溶液にＢａｍ、７７■（ｓ。
単位、５μｌ）、１３αｒｎ、 ／／緩衝液５μｌを加
え容量５０μノの反応液とし、３７°Ｃで１時間保温し
た。切断されたＤＮＡをエタノールで沈殿させ、これを
アガロースゲル電気泳動にかけ、最小の断片（、／”）
（４６ｓｂ７＋）を単離した。
え容量５０μノの反応液とし、３７°Ｃで１時間保温し
た。切断されたＤＮＡをエタノールで沈殿させ、これを
アガロースゲル電気泳動にかけ、最小の断片（、／”）
（４６ｓｂ７＋）を単離した。
ｉｉ） ｐｃＲ７０２１）Ｅｃｏノ＜＋、ｓａｌ ｌに
ょする二重消化 ｐ Ｃ’ Ｒ７０２：３０μ１Ｖ（１３０μＩ／ゴ）、
Ｓａｌ■（５０単位、５μｌ）、５ａｉｌ緩衝液５ μ
ｚ、 １１！０１０ Ｉｌｌから々る総量５０ｔｔｌの
反応液を３７℃で１時間保温し、ｐｃＲ’ｉｏ、２をＳ
αｉｔで消化した。生成りＮＡをエタノール沈殿し、沈
殿を４０μｌＨ２Ｏに溶解した。この溶解液にＥｃｏＲ
ｌ（７５単位、５ｔｔｌ）、Ｅｃｏ ・ＲＩ緩衝液（５
μ７りを加え容量５０μｌの反応液とし、３７℃で１時
間保温した。切断されたＤＨＡをエタノール沈殿させ、
これをアガロースゲル電気泳動にかけ、最小の断片（ｇ
）（７２９ｂｐ）４６４６ｂｐ）、断片（！７）（７２
８６ｂ７））を１８μＡ ｌｉ ２０に溶解した。この
ＤＮＡ溶解液に、Ｔ、リガーセ（２７単位、３ｔｔｌ）
、３ｍＭＡＴＰ（６μｌ）、リガーセ緩衝液３μｌを加
え容量３０μｌの反応液とし、１１℃で一夜保温した。
ょする二重消化 ｐ Ｃ’ Ｒ７０２：３０μ１Ｖ（１３０μＩ／ゴ）、
Ｓａｌ■（５０単位、５μｌ）、５ａｉｌ緩衝液５ μ
ｚ、 １１！０１０ Ｉｌｌから々る総量５０ｔｔｌの
反応液を３７℃で１時間保温し、ｐｃＲ’ｉｏ、２をＳ
αｉｔで消化した。生成りＮＡをエタノール沈殿し、沈
殿を４０μｌＨ２Ｏに溶解した。この溶解液にＥｃｏＲ
ｌ（７５単位、５ｔｔｌ）、Ｅｃｏ ・ＲＩ緩衝液（５
μ７りを加え容量５０μｌの反応液とし、３７℃で１時
間保温した。切断されたＤＨＡをエタノール沈殿させ、
これをアガロースゲル電気泳動にかけ、最小の断片（ｇ
）（７２９ｂｐ）４６４６ｂｐ）、断片（！７）（７２
８６ｂ７））を１８μＡ ｌｉ ２０に溶解した。この
ＤＮＡ溶解液に、Ｔ、リガーセ（２７単位、３ｔｔｌ）
、３ｍＭＡＴＰ（６μｌ）、リガーセ緩衝液３μｌを加
え容量３０μｌの反応液とし、１１℃で一夜保温した。
連結されたＤＮＡをエタン・−ル沈殿させた。
■） 形質転換
枯草菌宿主Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ ＲＭ １２５ （ａ
ｒｇ。
ｒｇ。
ｌ ｅｑｔ、 ｒ−、ｍ−）を使用して、常法に従い、
前記の連結されたＤＮＡを宿主のｃｏｔｎ、ｐｅｔｅｎ
ｔ細胞に形質転換によシ導入した。形質転換株の内、ク
ロラムフェニコール耐性株２株を選択した。この薬剤耐
性株からプラスミドを抽出し、制限酵素切断によって確
認したところ、ｐＫＳＲｌｏｌを保持していた。コノ菌
株Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ ＲＭ １２５ （ａｒＱ＋１
ｅｒｂ、ｒ 、 、 ｒｎ−； ｐＫｓＲ１０１）は微
工研に受託番号ＦＥＲＮ ＢＰ−５０４号として寄託さ
れた。
前記の連結されたＤＮＡを宿主のｃｏｔｎ、ｐｅｔｅｎ
ｔ細胞に形質転換によシ導入した。形質転換株の内、ク
ロラムフェニコール耐性株２株を選択した。この薬剤耐
性株からプラスミドを抽出し、制限酵素切断によって確
認したところ、ｐＫＳＲｌｏｌを保持していた。コノ菌
株Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ ＲＭ １２５ （ａｒＱ＋１
ｅｒｂ、ｒ 、 、 ｒｎ−； ｐＫｓＲ１０１）は微
工研に受託番号ＦＥＲＮ ＢＰ−５０４号として寄託さ
れた。
実施例４
枯草菌中に於けるプロキモシンの発現
実施例３で得られたｐＫｓＲｌｏｌを保持する枯草菌Ｂ
、５ｕｂｔｉｌｉｓ ＲＭ ｌ ２５をＬ−Ｂ培地（１
゜μｉ ／ ｍｌのクロラムフエニコールヲ含有）中、
３７℃で一晩振盪培養した。この前培養物０，２ｄをＩ
Ｏ−の〇Ｈ−培地中に接種して、３７℃で振盪培養した
。細胞密度が約３Ｘ１０７細胞／−に遅した時点で、エ
リスロマイシン（最終濃度０．０５μｍ１７ｍ１）を添
加し、更に培養を１時間続けた。
、５ｕｂｔｉｌｉｓ ＲＭ ｌ ２５をＬ−Ｂ培地（１
゜μｉ ／ ｍｌのクロラムフエニコールヲ含有）中、
３７℃で一晩振盪培養した。この前培養物０，２ｄをＩ
Ｏ−の〇Ｈ−培地中に接種して、３７℃で振盪培養した
。細胞密度が約３Ｘ１０７細胞／−に遅した時点で、エ
リスロマイシン（最終濃度０．０５μｍ１７ｍ１）を添
加し、更に培養を１時間続けた。
培養物１ ｍｌをとり、集菌後、冷ＰＢＳ（２０ｍＭリ
ン酸緩衝液、１５０ｒｎＭＮａＣｌ、ｐＨ７，０で洗浄
した。再度集菌して、リゾチームをｉ ｍｙ ／ ｔａ
ｐ。
ン酸緩衝液、１５０ｒｎＭＮａＣｌ、ｐＨ７，０で洗浄
した。再度集菌して、リゾチームをｉ ｍｙ ／ ｔａ
ｐ。
含有するライジングバッファー（３０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ、５ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭＮａＣｌ、２ｔｎＭｐ
ＭｓＦＳ ｐＨ８，ｏ ）’１ｔｔｌを加え、３７°０
１０分間保温し、更に×４サンプルバッファー（０，０
６２５ＪｆＴｒｉｓ−ＨＣＩ、２％ＳＤＳ。
ＣＩ、５ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭＮａＣｌ、２ｔｎＭｐ
ＭｓＦＳ ｐＨ８，ｏ ）’１ｔｔｌを加え、３７°０
１０分間保温し、更に×４サンプルバッファー（０，０
６２５ＪｆＴｒｉｓ−ＨＣＩ、２％ＳＤＳ。
１０％グリセロール、５％ベーターメルカプトエタノー
ル、ｐ １１６．８ ） ７ ｔｉ ｌを加え、１００
℃に１０分間加熱した。これに１〜２μｌのピロニンＧ
溶液（１０ｍ９／ｍｌＥ ｔ Ｏｌｉ ）を加えたもの
をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０％）に
かけた。移動した蛋白をＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴｃ Ｅｒ
Ｌを用いた電気プロティング法（Ｂ。
ル、ｐ １１６．８ ） ７ ｔｉ ｌを加え、１００
℃に１０分間加熱した。これに１〜２μｌのピロニンＧ
溶液（１０ｍ９／ｍｌＥ ｔ Ｏｌｉ ）を加えたもの
をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０％）に
かけた。移動した蛋白をＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴｃ Ｅｒ
Ｌを用いた電気プロティング法（Ｂ。
Ｂｏｗｅｎらｆｉｈｂｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｇｓ、
、 ８ 、１ （１９８０）によジニトロセルローズフ
ィルター上に転写した。このニトロセルローズフィルタ
ーヲ８１０−１？ＡＩ） ＢＬＯＴ （ＧＡＲ−１１Ｒ
Ｐ）ＡＳＳＡＹ ＫＩＴ （Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｒａ
ｂｂｉｔ ＩｇＧ１１ｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏ
ｚｉｄａｓｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ） （１３″ＬＯＲ
ＡＤ社より購入）を用いて発色させ、蛋白質のアッセイ
を行なった（詳しくはｔｉ Ｌ Ｏ／？ Ａｎ社マニュ
アルを参照）。本分析（酵素免疫プロティングアッセイ
）によれば、形質転換株１３．５ｑｔｌ）−−り土ｉｓ
Ｒ＃１２５ （ｐｆｆＳＲｌｏｌ）がプロキモシン融合
蛋白を産生じていることが認められた。又、蛋白発現量
を測定するために、標品プロキモシンの濃度を変化させ
て、産生蛋白の帯の強度と比較したところ、蛋白帯の強
度はプロキモシン量５０ｎｌｌと１１００ｎの間にある
と観測された。１細胞あたりのプロキモシン融合蛋白の
生産螢は約７、５００〜１５，０００分子と計算された
。生成蛋白の分子量は分子量マーカーを用いて推測する
と約４ｓ、０００でプロキモシンと２９に蛋白の融り蛋
白としての計算値と一致した。
、 ８ 、１ （１９８０）によジニトロセルローズフ
ィルター上に転写した。このニトロセルローズフィルタ
ーヲ８１０−１？ＡＩ） ＢＬＯＴ （ＧＡＲ−１１Ｒ
Ｐ）ＡＳＳＡＹ ＫＩＴ （Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｒａ
ｂｂｉｔ ＩｇＧ１１ｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏ
ｚｉｄａｓｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ） （１３″ＬＯＲ
ＡＤ社より購入）を用いて発色させ、蛋白質のアッセイ
を行なった（詳しくはｔｉ Ｌ Ｏ／？ Ａｎ社マニュ
アルを参照）。本分析（酵素免疫プロティングアッセイ
）によれば、形質転換株１３．５ｑｔｌ）−−り土ｉｓ
Ｒ＃１２５ （ｐｆｆＳＲｌｏｌ）がプロキモシン融合
蛋白を産生じていることが認められた。又、蛋白発現量
を測定するために、標品プロキモシンの濃度を変化させ
て、産生蛋白の帯の強度と比較したところ、蛋白帯の強
度はプロキモシン量５０ｎｌｌと１１００ｎの間にある
と観測された。１細胞あたりのプロキモシン融合蛋白の
生産螢は約７、５００〜１５，０００分子と計算された
。生成蛋白の分子量は分子量マーカーを用いて推測する
と約４ｓ、０００でプロキモシンと２９に蛋白の融り蛋
白としての計算値と一致した。
第１図は２９に蛋白の制限酵素地図である。
第２図はプラスミドｐ １１ Ｆ Ｉとｐ＆Ｃ１３９６
からｐＫＳ３を構成する模式図である。図中にｐｉ１１
’ｃ’ １３９６の５ｍａｌＩ位、ｐＪＩＷＩのＩｌａ
ｇｌ１１位付近の塩基配列も示しである。 第３図はプラスミドｐ ＣＲ７０，１とｐＢＲ３２２か
らｐ ＣＲ７０２を構成する模式図である。 第４図はプラスミドｐｃＲ７０２とｐＫ５３からｐ、Ｋ
ｓＩ？ＬＯＬを構成する模式図である。 外１名 華１図
からｐＫＳ３を構成する模式図である。図中にｐｉ１１
’ｃ’ １３９６の５ｍａｌＩ位、ｐＪＩＷＩのＩｌａ
ｇｌ１１位付近の塩基配列も示しである。 第３図はプラスミドｐ ＣＲ７０，１とｐＢＲ３２２か
らｐ ＣＲ７０２を構成する模式図である。 第４図はプラスミドｐｃＲ７０２とｐＫ５３からｐ、Ｋ
ｓＩ？ＬＯＬを構成する模式図である。 外１名 華１図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 次の工程より成るプロキモシンの生産方法ａ、）
プロキモシン遺伝子を、ブロモ−ターを含む枯Ｉ４Ｌ菌
ベクター糸にリーディングフレームを会ゼて抑大し発現
グラスミドを形成させること、 ｂ）形成された発現プラスミドを形質転換により枯４．
菌宿主に導入し形′ＪＬ転挨株を倚ること、 Ｃ）侍られた形質転換株から薬剤耐性株を選択すること
、 ｄ）該薬剤耐性株を栄養培地で培養すること、及び ｅ）僧られた培養物からプロキモシンを回収すること。 ２、ｆｉｆロモーターンう（、Ｅつｒｆロモーターであ
る＋）−計、請求の範囲第１項記Ｊ成の方法。 ３、該発現グラスミドがｐＡ＝ＳＲ１０１である付π［
１消求の範囲第１項記載の方法。 ’、 ’ａ宿王がＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ ＲＭ ｌ ２
５ （ａｒｇ。 １ｅｒｂ 、 ｒ−、７７１−） である特許請求の範
囲第１項ないしる６３項のいずれかに記載の方法。 ５、該プロキモシン遺伝子がｐ ＣＲ、，７０２Ｌ ’
）早Ｆ俳でれるものでらる喘許請求の範囲第４項記載の
方法。 ６、Ｅ□ｒプロモーターとプロキモシンｃＤｆｉ／Ａを
含崩し、該ブロモ−ターの制御ｌ１Ｉｌ下でグロキモシ
ンｌ百王細１１ｍ内で発現できる発現シラスミド。 ７゜該プロキモシンｃ Ｉ） Ａ’ Ａが５番目のコド
ン（Ｃ’ＣＴ）から配列の末尾（３６５番目）筐でのｃ
ＤＮＡ配列である特許請求の範囲第６項記鴫の発現プラ
スミド。 ＆ 該宿主細胞が枯草菌細胞である特許請求の範囲第６
項又は第７項記載の発現プラスミド。 ９、該枯草菌細胞がＢ、５ｕｂｔｉｌｉｓ ＲＭｌ２５
（ａｒｇ、Ｉｇｕ、ｒ−、ｒｎ−）である特許請求の１
ｌｉａ囲第８項第８の発現シラスミド。 １０、次の工程より成るｐＫｓ３プラスミドの構成方法 ａ）プラスミドｐｌｉＷＩを１０ｇｍで部分消化して平
滑末端を刹°するＩ）ＮＡ断片（１）を得ること、 ｂ）グラスミドｐＭｃ ｌ ３９６をＢａｒｎｌｉｌ及
びＳａｔ Ｉで消化すること、 ｃ） ｂ）で得られたＤＩＶＡの一本鎖部分をＩ）ＩＶ
Ａポリメラーゼにより修復しＤＮＡ断片（２）を得るこ
と、 ｄ）上記ＤＮＡ断片（１）及び（２）を１４ リガーゼ
で連結すること。 １１、次の工程より成るｐ ＣＲ７０２シラスミドの構
成方法 α）プラスミドｐ ｃ Ｒ７０１４７ＪＮｎｆ ｒテＭ
化し生じた一本鎖ＤＩＶＡをヌクレアーゼＳ１で切り４
ＩシＩＪ）ＮＡ断片（３）ｒ得ること、ｂ）ＤＩＶＡ断
片（３）に５ａｌｔリンカ−をっけ、それを５ａｌｌで
消化してＤＪＶＡ断片（４）を作ること、 Ｃ）一方、グラスミドｐＢＲ３２２’６Ｓａｌ Ｉで消
化して、ＤＩＶＡ断片（５）を作ること、ｄ）上４ＱＩ
）、ＮＡ断片（４Ｌ！：（５）ｒＴ＋ ＋）ｔｔ−セー
ｃ７結すること。 １２ 次の工程より成るｐＫｓＲ１０１プラスミドの構
成方法 α）プラスミドｐＫＳ３をＢａｍＨとＳａｌ Ｉで二重
消化し、ＤＩＶＡｑｊ片（６）ヲ得ること、ｂ） プラ
スミＹｐＣＲ’ＩＯ２ＢａｍＥＩをＥｃｏＲＩ で完全
消化して、ＤＩＶＡ断片（７）を作ること、 ｃ）ｐｃＲ７０２をＥｃｏＲＩと５ａｉｌで完全消化し
て、ＤＩＶＡ断片（８）を作ること、ｄ）上記１）ＮＡ
断片（６）、（７）及び（８）をＲ４リガーゼで連結す
ること。 ｌ＆ 微工研に受託番号ＦＥＲＮ ＢＰ−ｓｏａ号とし
て寄ルしされた大腸菌に見い出されるプラスミ ドｐＫ
ｓ３ 。 １４、倣工研に蛍託査号ＦＥＲＭ ＢＰ−５０１号とし
て寄託された大腸菌に見い出されるプラスミ ド ｐｃ
’Ｒ’１０２ 。 １５、微工研に受託番号ＦＥＲＮ ＨＰ−５０４号とし
て寄託された枯草菌に見い出されるプラスミ ドｐＫ
Ｓ Ｒ１０１。 １６、微工研に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５０３号とし
て寄託された大腸菌Ｅ、 ｃｏｌｉ ＭＣ１０６４ｒ
＆ ’−ｒｎｋ” ８ ｆｎ” （ｐ Ｋ Ｓ３ ）。 １７、微工研に受託番号ＦＥＲＮ ＢＰ−５ｏｘ号とし
て寄託された大腸菌Ｅ、 ｃＯｌｉ ＭＣ１０６４ｒｋ
ｍｋ ｓ、、、（ｐＣＲ７０２）。 ｌ＆ 微工研に受託番号ＦＥＲＮ ＢＰ−５ｏ４号とし
て寄託された枯草菌Ｂ、ｓｊｔ、ｂｔｉｔｉｓ ＲＭｌ
２．５ｒ−ｍ−、ａｒｇ、ｌａｗ （ｐＫｓＲｌ ０
１）。
Priority Applications (12)
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|---|---|---|---|
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Patent Citations (3)
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