JPS5832896A - 複合プラスミド及びそれを含有する微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明に、複合プラスミド及びそれ全含有する仔牛プロ
レンニン生産性宿主微生物に関する。

更に詳しくは、本発明に、修生第四四より分泌され京チ
ーズの製造に不可欠な凝乳酵素レンニン（キモシン）の
前駆体である仔牛プロレンニン（プロキモシン）の　Ｚ
）＃、４（相補的ＤＮＡ）を含有して成る複合プラスミ
ド及び該複合プラスミド金持った仔牛プロレンニン生産
性宿主微生物に関する。

修生第四胃粘膜より分泌されるレンニンは、アミノ酸残
基数３２３個の酸性プロテアーゼの一種であり、その前
駆体であるプロレンニンは、アミノ酸残基数３６５個の
レンニン前駆体蛋白質であって、酸性条件下で、自己触
媒的に凝乳酵素レンニンに転化する分子量約３７，００
０の酵素蛋白質である。

宿主微生物のベクター・プラスミドに有用物質生産情報
金持ったｃＤＮＡｆ組み込んだ複合プラスミドを持つ宿
主微生物を用いて、該微生物に上記有用物質を生産させ
る遺伝子組み換え技術金利川した技術分野に、近年、急
速に進歩し、たとえば生長ホルモンやインターフェロン
などの有用物賞金、大腸菌を宿主微生物として利用して
生産する技術が開発されつつある。

不発明者等は、チーズ製造に不可欠な凝乳酵素レンニン
の前駆体蛋白であるプロレンニンの構造遺伝子の全鎖長
のクローン化を月相して研健全続けてきた。そして、そ
の研究経過について、日本農芸化学会昭和５５年大会講
演要旨集、４０８頁（昭和５５年３月５日発行）　；　
Ｐｒｏｃｅｅｄｉ、ｎｇｓ　ｏｆｔｈｅ　　Ｉｖ　ｔｈ
　　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｆｅｒｍｅｎｔａ
ｔｉｏｎＳｙｍｐｏｓｉｕｍ　、　１７９　ｋ、Ｆ−２
１・５　（Ｌ）、１９８０年；日本夷芸化学会昭第１］
５６年大会講演要旨果、２５９頁及び５６９頁（昭和５
６年３月１０日発行）などに経過報告を行ってきた。

しかしながら、ハイブリッド・アレステッド・トランス
レーション法［ｈ１／ｂｒｉｄ　−ａｒｒｅｓｔｅｄｔ
ｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　ｌで確認されたプ
ロレンニン構造遺伝子の実質的に全鎖長を持つクローン
、すなわち、修生プロレンニン生産能が確実に期待でき
るクローンの形成には到達できなかった。上記経過報文
チック０−７１ｒｌ、ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（＋
）の菌株が取得きれたが、それらが含有するのけ約０．
２Ｍｄ程胚０部分的鎖長のプロレンニン構造遺伝子を持
つプロレンニンｃＤＮＡの部分片であって、グロレンニ
ン、ＤＮＡｆ含有するものではなかった。

更に研究全通めた結果、今回、本発明者等は、後に実施
列において詳しく述べるように、ハイブリッド・アレス
テッド・トランスレーション法で確認されたプロレンニ
ン構造遺伝子の実質的に全鎖長盆含有する複合プラスミ
ドを持った修生プロレンニン生産性クローンの形成に成
功した。

本発明者等は、後に詳しく述べる手法を利用して、修生
グロレンニンの　ＤＮＡｆ含有して成る複合プラスミド
の合成に成功し、この複台プラスミド牙待った宿主微生
物全取得した。この新規複合プラスミドゲ待った新規な
宿主微生物は、微工研（Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ。

Ａｇｅｎｃｙ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　５ｃｉｅ
ｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈ−ｎｏｌｏｇｙ　、　Ｊａｐ
ａｎ　）が寄託を受理しないＰ２レベルニ属する微生物
例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＣ６００ｒ、
ｉｇ−ｍｋ−（、ＴＡＣＲｌ　）であッテ、本発明者等
の鴇する東亨大学農学部展芸化学科鍔酵学研究室に保存
されている。

修生プロレンニンは、生後約数週間以内の修生の第四病
より分泌される酵素蛋白質であって、チーズ製造に必須
であるが、近年その生産は需要に応じきれず、微生物レ
ンネットによる代用も行われており、不発明者等によっ
て遺伝子組み換え技術全利用した修生プロレンニン生産
性宿主微生物　５− の提供に成功したことの工業酌量ａは極めて太きい。

従って、本発明の目的は、修生プロレンニンの、ＤＮＡ
ｋ含有して成る複台プラスミド、史には、該複合プラス
ミドを持った宿主微生物全提供するにある。

本発明の上記目的及び更に多くの他の目的ならびに利点
は、以下の記載から一層明らかとなるであろう。

本発明の複合プラスミド及びそれ全含有する宿主微生物
音形成する一態様によれば、生後数週間以内の修生の第
４胃粘膜層からプロレンニンｍＲＮＡ（メツセンジャー
ＲＮＡ）全抽出し、逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒ
ａｎｓｃｒｉｐｔαｓｇ）を用いる手法全利用して、該
ｍＲＮＡ２鋳型として、その相補的一本鋒Ｄ　Ｎ　４２
合成したのち、アルカリ処理して鋳型ｍＲＮＡｆ除去し
、斯くて得られたー　６− 不鎖ＤＮＡｆ用いて、例えはＤＮＡポリメラーセＩや逆
転写酵素音用いる手法金利中して相補的二本鎖、ＤＮＡ
ｆ台成踵　ヌークレアーゼＳ１（ｒｂｕｃｌｅａｓｅ　
Ｓ　１　）　ｆ用いる手法を利用して、形成された相補
的二本鎖、ＤＮＡのヘアピン（１＃造部分のみをｆ択的
に除去して、完全なプロレンニン特異的二本鎖ｃＤＮＡ
を合成したのち、ターミナル・デオキシヌークレオチジ
ル・トランスフェラーゼ（ＴｄＴ　；　ｔｅｒｍｉｎａ
ｌ　ｄｅｏｘｙｎｒｂｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆ
ｅｒαｓｅ　）　ｑ用いる手法全利用して、得られたプ
ロレンニン特異的二本鎖ＣＤＮＡの両３′末端て、たと
えばポリｄＧ（デオキシグアニン）ホモポリマーを付加
する。

一方、適当なベクタープラスミドたとえば大嚇（＠（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ベクターｐＢＲ３２
２に、Ｓα１１制限酵素を作用させる手法金利用して得
ることのできる線状、ｐＢＲ３２２ＤＮＡＹＣ１ＤＮＡ
ポリメラーゼｌ　（ＤＮ　Ａ　ｐｏｌｙｍｉｒａｓｅ　
ｌ　）を用いる手法を適用して、その両３′末端一本鎖
部分を修旬したのち、ＴｄＴｆ用いる手法金利用して該
修ｆ夏された両３′末端に、たとえばポリｄＣ（デオキ
シシチジル）ホモポリマー全付加する。

と このようにして得ると６できる３′末端にポリｄＣホモ
ポリマーを付加した線状、ＢＨ３２２ＤＮＡと、前述の
ようにして得ることのできる３′末端にポリｄＧホモポ
リマーを付加したグロレンニン特異的二本鎖、ＤＮＡｆ
ｒ混合、アニーリング（ａｎｎｅａｌ　１ｎｃｔ　）　
して、修生プロレンニンの、ＤＮＡを含有して成る複合
プラスミドを形成することができる。

次いで、大腸菌全カルシウム処理し、上述のようにして
得られた複合プラスミドと混合して形質転換株を形成す
る。ベクタープラスミドの薬剤耐性全利用する手法によ
って　ＢＲ３ｚ２のＳａｔ　　１ｐ　　　　　　　　　
　□ 部位上に伺等かの挿入ＤＮＡケ有するクローンヶ選択し
、この選択された株の中から、プロレンニン、ＤＮＡｆ
持つクローンケ選択するためにコロニー・ハイブリダイ
セーション（ｃｏｌｏｎｙ　ｈｙｂｒｉ−ｄｉｚａｔｉ
ｏｎ　）　ｆ行う。この手法によるプロレンニンｃＤＮ
Ａｋ持つクローンの選択は、先に取得したグロレンニン
特異的　ＲＮＡを放射線標識した　ＲＮｍ？７１゜ Ａたとえば１”　ｌ　−ｒｎＲＮ　Ａや８２Ｐ−ｍＲＮ
Ａ’ｆプローブ（ｐｒｏｖｅ　）　トしたコロニー・ノ
１イフ゛リダイゼーションにより行うことができる。

このようにして得られる修生ブロレンニノのｃＤＮＡ’
ｆｚ含有して成る機会プラスミド金持つと考えられる宿
主微生物候補株は？・イブリッド・アレステッド・トラ
ンスレーション法によす、挿入されたプロレンニン構造
遺伝子の存在全確認する。

後に、実施１ダ１に於て示すとおり、本発明によって、
　９− ハイフリット・アレステッド・トランスレーション法で
確認されたプロレンニン構造遺伝子の実質的に全鎖長金
持つクローンが提供された。更に、Ａ／Ｉａｔａｍ−Ｇ
ｉｌｂｅｒｔ法によってプロレンニンのＮ末端アミノ酸
配列に対応する塩基配列の脊圧が確認された。

本発明の複合グラ哀ミド及びそれを含有する宿主微生物
の取得の一態様について説明したが、宿主微生物、該複
合グラスミドの合成、ベクター・プラスミドなどには種
々の変更態様を採用することができる。宿主微生物の他
の例としては、５ａｃｃｈ、ａｒｏｍｙｃｅａ　ｃｇｒ
ｅｖｉｓｉａｅの如き酵母、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ　（枯草菌）の如きグラム陽性細菌、Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　Ｗ４ａｍの如きダラム陰性細菌など
全例示することができる。たとえば、制限エンドヌクレ
アーゼ−リガーゼ法を利用して複合プラスミドを合成す
る手法も利用可能である１゜−Ｉ　Ｏ− 父、ベクター・プラスミドの他の例としては、大腸＠全
宿主微生物とする場合には、例えば、　ＩＶＩ　Ｂ　９
　ｙｔ：の他の公知ベクター・プラスミド、酵は閑を宿
主微生物とする場合には、例えば２μＤＮＡ又は酵母染
色体由来の各種の公知ベクター・プラスミド、枯草菌を
宿主微生物とする場合には、例えは、ｐＵＢｌｌｏの如
き公知ベクタープラスミド、Ｐ　ｓ　ｅｒｂｄｏ　ｍ　
ｏｒｔａ　ｓ　＠細菌を宿主微生物とする場合には各種
の薬剤耐性プラスミドなど全例示することができる。

以下、不発明の複合プラスミド及びそれ全含有する宿主
微生物の形成の一例について、更に詳しく具体１＋ＩＩ
金示す。

■、プロレンニンｍＲＡ／　Ａ　（メツセンジャーＲＮ
Ａ）の分離 生後数ａ間以内の修生の第４冑粘膜層から、プロレンニ
ン、７．ＲＮＡｆ抽出採取する。抽出は、自由らの方法
（Ａｇｒ、　Ｂｉａｌ、　Ｃｈｅｍ、、　　４４．１３
７３〜１３８１．１９８０）の改良法で行うことができ
る。例えば、修生第４胃粘膜層ケ採取し、低温で粉末化
したのち、フェノール法灯ｔＬｌ；Ｉベントナイトの存
在下でフェノール法を利用して全ＲＮＡ’＜抽出する。

得られた畠分子ＲＮＡ含有水性抽出相を沈殿剤処理たと
えばリチウムクロライドで処理し、形成される高分子Ｒ
ＮＡ含有含有沈殿物取採取ことができる。

例えば上述のようにして得ることのできる高分子ＲＮＡ
宮有宮殿沈殿物溶ｇ、？形成し、たとえはポリ（Ｕ）セ
フ７ｏ−ｘ（ｐｏｌｙＵ−８ｅｐんａｒｏｓｅ　）やオ
リゴ（ｄＴ）セファロースなどの如き吸着剤全利用した
アフイニテイ・クロリトグラフィーによって、プロレン
ニン、ｒｒＬＲＮＡ含有成分を分離採取することができ
る。上記高分子ＲＮａ含有沈殿物水溶液を、上記例示の
如き吸着剤カラム中を流下させると、プロレンニンｍＲ
ＮＡ２含むｒｒＬＲＮＡ分画が選択的に吸着され、リボ
ゾームＲＮＡその他の夾雑成分が流出除去される。ホル
ムアミド水浴液で俗離ζぜることによりグロレンニン、
ｒｎＲＮＡ含有ホルムアミド水浴液が得られる。この操
作は複数回くりかえして行うのが好ましい。

上述のようにして得ることのできるプロレンニンｍＲＮ
Ａ含有分画金、それ自体公知の手法に従って蔗糖密度勾
配遠心分画法全利用して分子量分画し、１５８全中心と
する分子量？持つ分画（グロレンニン、、ＲＮＡ分画）
を採取できる。プロレンニンｍＲＮＡ分画は試験管内蛋
白質合成系によって確認することができる。この分画操
作も、所望により複数回くりかえして行うことができる
。

■、プロレンニンｃＤＮＡの調製。

上述のようにして得ることのできるプロシンニンｍＲＮ
Ａ２崗型として、逆転写酵素を用いる手法全適用し、該
−ＲＮＡの相補的−不備ＤＮＡを−１３− 合成したのち、アルカリ処理して鋳型ｍＲＮＡ２除去し
、−不備のプロレンニン、ＤＮＡｋＰＪることができる
。

例えば、該プロレンニンｒｒＬＲＮＡに、４種のデオキ
ヌクレオチド三リン酸（ｄＸＴＰ’ｓ　）の存在下、オ
リゴ（ｄＴ）ｆブライマーとして、逆転写酵素を作用さ
せることにより、核プロレンニンｍＲＮＡ２鋳型として
、その相補的一本領ＤＮＡ全合成することができる。合
成された該相補的−′水銀ＤＮＡ２アルカリ存在下、約
７０℃程度に加温する処理により該鋳型ｍＲＮＡを分解
的に除去し、−不備のプロレンニンｃＤＮＡ２形成する
ことができる。

上述のようにして得られた一本鎖のプロレンニンｃＤＮ
ＡＫＤＮＡポリメラーゼＩや逆転写酵素紫、ｄＸＴＰ’
ｓの存在下で作用させることにより、相補的二本鎖ｃＤ
ＮＡｆ合成できる。合成された−　１４− 相補的二本鎖、ＤＮＡＦｉヘヤビン構造部分構造部分全
イア、該溝漬部分全選択的に切除する酵素ネクレアーゼ
ＳＩを作用させることにより該ヘアピン淘ｒｉｊ部分を
１’、ｓ’ｇ去して、先金なグロレンニン特異的二不頻
Ｊ）ＮＡｋ合成することができる。

ＩＩ＋　、　　プロレンニンｃＤＮＡとベクタープラス
ミドの連結。

上述のようＶＣして合成をれる兇全〃グロレンニン特ソ
４訃二本’ＪＪｌ　、　Ｄ　Ｎ　ＡＯ両３′末ｑＩＡと
、適当な宿主のベクター・プラスミドを所望の部位で切
１１フ１することによって導かれる線状ＤＮＡの両３′
末端に、夫々相補性ケ有するデオキシヌクレオチジルホ
モボリマー’ｋ（寸）川する。

１＋すえは、該プロレンニン二本１ｆ４ｃＤＮＡの両３
′末端ＶＣ１ｄ　Ｇ　ＴＰ　（デオキシグアノシントリ
ホスエート）の存在下、７’　ｄ　Ｔ　２作用させるこ
とにより、該３′末端にポリｄＧホモポリマー會付７Ｊ
ｔｌすることができる。一方、適当なベクター・プラス
ミド、たとえばＥ、　　、Ｏｌｉのベクター・プラスミ
ド、ＢＨ３２２ＶＣ１制限酵累Ｓａｌ　ｌヌクレアーゼ
を作用させることにより、線状アＢＲ３２２ＤＮＡｆ形
成する。この線状ＤＮＡの両３′末端一本鎖部分に、４
種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＸＴＰｈ）の存
在下、ＤＮ／ＵポリメポリゼＩを作用σせることにより
、該両３′末端一本鎖部分全修復した後、デオキシシト
シントリホスフェ−）（ｄｃＴＰ）の存在下、ＴｄＴを
作用させることにより、該修復部末端にポリｄＣホモポ
リマーを付加することができる。

本発明の修生プロレンニンの、ＤＮＡｋ含有して成る複
合プラスミドは、例えば上述のようにして得ることので
きる３′末端にポリｄＧホモポリマーの付加されたプロ
レンニン特異性二本鎖ｃＤＮＡと例えば上述のようにし
て得ることのできる修復された３′末端にポリｄＣホモ
ポリマーの付刃口された線状ｐＢＲ３２２ＤＮＡとを混
会し、アニーリングすることにより、ポリｄＣホモホリ
マ一部とこれ？相補性のあるポリｄＧホモポリマ一部の
部分で結合させて、プロレンニン構造ｉ跣伝子の実質的
に全鎖長全含有する複合グラスミドを合成することがで
きる。

■、宿主微生物の形質転換と修生プロレンニンのｃＤＮ
Ａｆ含有して成る複合グラスミドを持つクローンの選択
。

宿主微生物たとえば大腸％（Ｅ、ｃｏリ　Ｃ６Ｃ６００
ｒ−３ｆカルシウム処理した後、前述のようにして得ら
れた修生のプロレンニンのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｋ　含有し
て成る複合プラスミドと混合して、該複合プラスミドを
大腸菌内に取り込１せて、形質転換株音形成する。この
ようにして形成された形質転換株の中から、プロレンニ
ン、ＤＮＡｑ含有して成る−　１７− 複合プラスミド含有するクローンを選択する。

例えば、上に例示したｐＺ？　７ｉ！　ａ　２２の炙り
１部位にプロレンニン、ＤＮＡを挿入した場合には、こ
の選択は、アンピシリン耐性で且つテトラサイクリン感
受性である修生のプロレンニンの、ＤＮＡを含有して成
る複合プラスミド金持つと期待される形質転換株と、ア
ンピシリン耐性でほつテトラサイクリン耐性である池の
形質転換株とを、アンピシリン及びテトラサイクリンに
対する薬剤耐性の差異全利用して１ず予備的に行うこと
ができる。

このようにして予備的に選択された修生のプロレンニン
の、ＤＮＡｋ含有して成る複合プラスミドを持つと期待
される形質転換株から、真に該複合プラスミドを持つ形
質転換株全選択分離するたメニ、コロニー・ハイブリダ
イゼーション及びハイブリッド・アレステッド寺トラン
スレーション去全行う。コロニー・ハイブリダイゼーシ
ョンは、−１８− 先に述べた手法で得ることのできるプロレンニン特異的
ｍＲＮＡ全放射線標識したｒｎ、ＲＮＡたとえは＋２１
１１−　ｒｒＬＲＮ　Ａやｓｔ　ｐ　−ｍＩＩ　＃　Ａ
　ｋプローブとした、それ自体公知の手法により行うこ
とができる。このコロニー・ハイブリダイゼーションで
得られた、ハイブリダイゼーション（＋）の株について
、史にそれ自体公知のハイブリッド・アレステッド・ト
ランスレーション法により、挿入されたプロレンニン構
造遺伝子の存在を確認する。

以下、実施例により本発明α合プラスミドの合成、それ
を含有する宿主微生物の形成の−［ｆｌについて、更に
詳しく述べる。

実施例 ［１）　　７’ロレンニンメツセンジヤーＲＮＡ（ｍＲ
ＮＡ）の抽出精製 生後２週Ｆ用の修生第四冑（２頓分）の粘膜層約１４０
ｒｉ剥離し、０．０２５Ｍ　ＢＤＴＡ％ｏ、ｉＡ／Ｎａ
Ｃ１，１％５ＤＳｆ含む冷却し＊０．１Ａ／ｌ−リス−
塩酸緩衝Ｍ（ｐ＃９．ｏ）で洗浄し、アセトン−ドライ
アイス中で脱水、凍結し、梃にボモヂナイザーで粉末化
した。得られた粉末はベントナイト０．７１を含む上記
緩衝液１ｔに懸濁し、フェノール、クロロフォルム、イ
ソアミルアＡ／　＝７−　ｋ混合溶媒（５０：５０：１
）５００ｉ／１７１１えて攪拌した後遠心して上層水相
全とり出した。同様の操作を更に６回くり返した優に最
後に得られた水相に終ａ匿２ＭとなるようにＬｉＣ１全
加え、４℃で一夜放置後遠心【よって沈殿を集め、これ
１　ｏ、　ｉ　ｘＳ８　Ｃ（１５０ｍＭ（ＤＮａＣｌ　
及ヒｉ　５　ｍＭツク−ｒ−ン醪三ナトリウム塩）６０
ｍに溶解した。同様の操作金哄１’？ｌＴ１回くり返し
た後、得られた溶液に２倍楡のエタノールを加えて高分
子ＲＮＡｆ沈殿させる操作全３回くり返した。最後に得
られた沈殿を水ニ溶解し、４倍ｉｌのｏ、ＯＩＭＥＤＴ
Ａ％０．７３／ＮａＣ１，２５％フォルムアミド紫含む
トリス塩酸０．２％ＳＤＳ、９０チフォルムアミド０．
０１Ｍりん酸カリを含む浴液（ｐ　Ｈ７，５３によって
カラムに吸収されたｍＲＮＡ５溶出させた。溶串液は蒸
溜水に対し透析後、エタノール？加えてｍＲＮＡケ含む
ＲＮＡを沈殿させた。沈殿はｍ解後５−２０％蔗糖密度
勾配中で５０．０００　Ｘ　ｆ、１３時間遠心した麦、
プロレンニンＷＬＲＮ　Ａ　ｆ有し約１５９ｆ中心とす
る分子量を有するＲＮＡ　として１２０μｍ？含む分画
を得た。この分画はウサギ網状赤血球リゼー）ｆ用いる
試験管内蛋白合成系による検定で、はん訳生成物の７０
％以上に達するプロレンニン全生成する活性？有するこ
とが確認された。

２ｌ− （２）　　プロレンニンｃＤＮＡの調製（１１で得たプ
ロレンニンγｎＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃｌ）ＨＡを
合成する−にめＫ、ｔｎ　ＲＮ　Ａ　３０　ｉ４　。

ＡＭ　Ｖ逆転Ｆｉ−酵素１４０単位、オリゴ（ｄ　Ｔ　
）　ｎ−ｔｓｌ、６μｇ１四種のデオキシヌクレオチド
三りん酸各０．５ｍＭ、アクチノマイシ：ｙＤ　４０　
Ａｉ　、ＮａＣ１６０ｍＭ　Ｓ　ＭｇＣ１ｔ　　６　ｔ
ｒｔＭ％　ＤＴ　Ｔ　　２　ｍＭ、　　　）　　リスｌ
Ｉ盆酸塙５　ｏｍｎ’（ｐＨ８，３）を４００μｎ中に
含む反応液を４２℃１時間インキュベートした。

反応生成物をフェノール抽出、エタノール沈澱によって
分離した後０．３　ＮＡ’　ａ　ＯＨに溶解し・６８°
Ｃ１５分加熱するととによって鋳型ｍ　ＲＮ　Ａを分解
し、次いでセファデックスＧ−ｓθゲル濾過により一本
鎖ｃＤＮＡ２４０ｔＬｌｌを取得した。

得られ°た一本鎖ｃＤＮＡを＠型として二本鎖ＤＮＡを
合成するために、上記−重鎖ｃ、ＤＮＡ２００ｎｌｌ、
ＤＮＡポリメラーゼ（フラグメントＡ）１８単位、−２
２− 四種のデオキシヌクレオチド三りん酸各１ｍＭ１ＭｇＣ
１，４竜Ｍ１　β−メルカプトエタノール０，５ｎＬＡ
４、トリス塩酸塩（ｐｆｉ　７．５　）　３０ｍＭを２
４０μノ中に含む反応液を２５°Ｃ４時曲インキュベー
トした。反応生成物をフェノール抽出、エタノール沈叡
によって分離した後、酢酸す）　ＩＪウム３゜ｍＭ、Ｎ
ａＣｌ３０ｍＭ％ＺｎＳＯ４１ｍＡＩ（ｐＥ４６）を含
む２００μｌの反応液中でヌクレアーゼ８１８０単位と
４０℃、９０分処理することによりヘアピン構造を分解
除去した。これを５−３０％蔗糖密度勾配中で９５．０
０（ｌｃｇ、１２時間遠心して平均０．７メガダルトン
の分子−′を有するヘアピン構造のないプロレンニン二
本鎖ｃＤＮＡ１００ｓ＃を取得した。

（３）　　プロレンニンｃＤＮＡとベクタープラスミド
の連結 （２）で倚られたプｏ　ｖン＝ンｃ　１．）ＩＶＡ　０
．０５　ｐｍｏｌｅをターミナルデオキシヌクレオチラ
ルトランスフェラーゼ８０単位、ｄ　Ｇ　’ｌ’　Ｐ　
ｏ、　０６μ領ｏ１ｓ　。

ＭｇＣｌ、　５　ｍＭ’、　ｆｉＥＰＥｓ−ＮａＯｆｉ
　ｌ　ＯｍＭ　（ｐ　ｆ１７．１）を含む１２０μノの
反応液（Ａ）中で３７℃、６分インキュベートし、ｃ　
Ｄ　Ｎ　Ａの３′末端に（ｄＧ）ホモポリマーを付加し
た。一方、ベクタープラスミドｐＢＲ３２２をＳａｌ　
　Ｉエンドヌクレアーゼで切断して得た線状ＤＮＡを四
種のデオキシヌクレオチド三シん酸存在下ＤＮＡポリメ
ラーゼ（フラグメントＡ）とインキュベートしてその末
端−重鎖部分を修復して得られた０、５ｐｍｏ　Ｌ　ｇ
のＤＮＡをターミナルデオキシヌクレオデジルトランス
フェラーゼ２４単位ｄｃＴＰ０．０４μｍｏｌｅ、　　
ＣｏＣ１，１ｍＭ、　カコジル酸カリウム塩１００ｍＡ
グ、トリス塩酸塩３０　ｔｎＭ　（ｐＨ”１．６　）を
含む１２０μノの反応液（Ｂ）中で２５℃１０分インキ
ユベートシ、その３′末端に（ｄｃ）ホモポリマーを付
加した。反応液Ａｌ２Ｏμノと反応’ｌｊ’ｊＢ２４μ
ｌとをそれぞれＩｎ　Ｄ　ｉ’　Ａ添加によｐノ又応イ
埜市後０℃で７１ら合し、フェノール抽出およびエタノ
ール沈澱によって反応生成物を分ｔ７！ｔ’、する。

これを１ｍＭ　　Ｉ！；Ｄｉ’Ａ、１００ｍ、Ｍ’　　
ＮａＣＬを含む１００兜Ｍトリス塩酸塩（ｐＨ７，６）
に０．３μ／／　／　ｒｄの割で溶ｆ＃’（＝　Ｌで６
８℃２時間加温後３０分間に５℃の降温速度で箆温まで
冷却して（ｄＧ）ホモポリマーを付加しプこプロレンニ
ンｃＤＮ’Ａと（ｄＣ）ホモポリマー金伺加したｐＢＲ
３２２ＤＮＡとをアニーリングにより連結させた。

（４）連結ＤＮＡによる大腸菌の形質転換とプロレンニ
ンｃ　Ｉ）　Ｎ’　Ａ　ｆ：菊するクローンの収得に３
）でａｈた卑結ＤＮＡを用いて大腸珈を形質転換するに
はカルシウム処」！■による常法を用いた。β。

ＣＯＩ　％　（、’　６００　？’７ｃ　ｔｎ’７．を
形質転換処理後、アンピシリン３０μ９　／　Ｍｅを含
むＬ−グロス寒天平板２５− 培地上で形質転換株８０４株を選択し、次いでテトラサ
イクリン１０μｇ７ｍｔを含む同培地上でアンピシリン
１１１１性、テトラサイクリン感受性を示す株奢選択し
た。有られた総計６２２株をアンピシリン３０μｇ／−
を含有するＬ−グロス寒天上にＩｔ−ｒ、　Ｄつけたミ
リポアフィルタ−上に格子状に植苗してコロニーを形成
させ、次いでこのフィルターを洗浄、プロテアーゼ処理
、９５％エタノールおよびクロロフォルム処理した後真
空中８０℃２時間加熱して各・沫のＤｊ’ＪＡをフィル
ター上に焼料けだ。同時に作成した相同な三枚のフィル
ターの中一枚は（１）で得られたプロレンニン脩：ＲＮ
Ａを１２１１　Ｉで標識したものをグローブとし、一枚
は過剰のγＲＮＡで処理した俊同じ””　Ｉ　−ｔｎ　
ＲＮ　Ａをプローブとし、更に一枚は”ｌｌＩ　−ｆＲ
Ｎ　Ａをプローブとして常法によるコロニーノ・イブリ
ダイゼーションを行った。得られたハイブリダイゼーシ
ョンの−２６− 結果を上記の相同な三枚ごとに比較することにより、ｒ
　Ｄ　Ｎ　Ａを含むクローンを除外し、プロレンニンｃ
ＤＮＡを有すると考えられるクローン３０株を取得した
。更にこうして得られた３０株から、セシウムクロライ
ド−エチジウムブロマイド平衡密度遠心でプラスミドＤ
ＮＡを取得し、その各々ヲ（１１で−ｍられたプロレン
ニンｆｒＬＲＮ　Ａとハイブリダイズさせた後、ウサギ
網状赤血球リゼートを用いる試験管内蛋白合成系で検定
することによシ、プロレンニン合成を阻止するかどうか
を調べた。

このハイブリッド・アレステッド・トランスレーション
法により明らかにプロレンニンｃＤＮＡを貧有すると確
定されたクローン１０株が取得された。

（５）　クローン化されたプロレンニンｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ
の特性 （４）で僧られたプロレンニンｃＤＮ’Ａを含むと確−
２７一 定すしたクローンの中の一つ１ｏ２−Ｂ株が含むｐＴＡ
ｃＲ１プラスミドＤ　Ｈ’　Ａを抽出し、菱ａｌｌエン
ドヌクレアーゼで処理した後アガロースゲル電気泳動に
かけた結果、プロレンニンａＤＮ’Ａの全長にほぼ匹敵
する挿入ＤＮＡフラグメントが検出された。この挿入Ｄ
ＮＡフラグメントの塩基配列をＭ　ａ　ｚ　ａ情−Ｇｉ
ｌｂｓｒｔ法によって決定した結果下に示すように、明
らかにプロレンニンのＮ末端アミノ酸配列に対応する塩
基配列の存在が証明された。

Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　ＩＩｓ　　Ｔｈｒ　　Ａｒｇ　　
ｆｉｇ　　Ｐｒｏ　　ＬｅｕＴｙｒ　　Ｌｙｓ　　ＧＬ
） 特許出願人　　別　府　　輝　彦 手続補正書 昭和５６年１０月２８１ 特許庁長官　島　１）春　や　　　殿 ■、事件の表示 １１ｔｆ第１１５６年介６′Ｉ−奴ＩＩ第１３１６３１
号２、発明の名称 複合プラスミド及びそれを含・げする働生物３補ｉ［を
する名 事件との関係　　特許出願人 住　所　東京■Ｓ杉並区堀）内１−５−２１名　　称　
　別　府　輝　彦 （氏　名） ４代　理　人〒１０７ 明Ｉ）ｌｌｌ’！の“晃明の詐紳１な説明”の栴Ｊ７、
　Ｍ正の内容 （１）明細婁第２８頁１３〜１４行に、［ 」 とある後に、行を改めて、以下のとおり加入する。

「上記の方法で得られたプロレンニンｃｌ）ＮＡを含む
と確定されたクローンより得られたプラスミドＤＮＡに
ついて、Ｍａｘａ、ｍ−Ｇ１１ｂｅｒｔ法により塩基配
列を決定した結果は、その中の一つｐＴＡｃＲ１０２Ｂ
６は、プＯｖン＝ンｃＤＮＡ全長１ｏ９５塙基の中、プ
ロレンニンＮ末端に対応する１番より８９０番壕での塩
基を、ｐＴＡｃＲ１０３Ｃ２は、７７１番よりプロレン
ニンＣ末端に対応する１０９５番までの塩基を含有して
いた。プロレンニンｃＤＮＡ全長を含有するプラスミド
ｐＣＲ１ｏｏ１を次のように造成した。

　１　− ル１」ち、ｐ７’ＡｃＲ１０２Ｂ　６および’ｐｉ’Ａ
ｃＲ１０３Ｃ２をｒｓａｌｔで処理することによって得
られた名挿入ＤＮＡ断片を、ｅｘｎｎｕａｌｅａｓｅ　
Ｉｌｌ　で消化して両３′末端から約１５０塩基を切り
縮め、次いで、ｐ７’ＡＣＲＩＯ２Ｂ６由来の断片はＡ
　７１　？Ｌ　１で、９ＴＡＣＲ１０３Ｃ２由米の断片
はＢａｍＨｌで、夫々、切噸１した仮、両省を混合アニ
ーリングした（ａ）。これとは別に、ｐ’ｌ’Ａｃｋｌ
Ｏ２Ｂ６プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ　＋Ａｐｎｌ　
で処ｓして倚らノ′シる小ＤＡＡＶｈｔ片（ｂ）、及び
ｐＴＡｃＲ１０３Ｃ２プラスミドＤＩν゛Ａをｂｃｏ７
ビＩ　＋　Ｂａｍ１ｉ　Ｉで処理して得ら扛る犬１）Ｈ
Ａ断片（Ｃ）をそれぞれ調製し、（α）（ｂ）（Ｃ）の
三者を混合アニーリング後、ＤＮＡ−リガーゼ（ｌｉｇ
αｓｅ）　　で連結した。かくして得られたｐｃＲｌｏ
ｏｌはプロレンニン全アミノ酸配列に苅応する児全なｃ
ＤＮＡを含有し、その停止コドンを含む塩基配列は下に
示す通りであった。

　２− ４０ ５０ Ｃ’ｌ’ＣＧＣＣＴＣＡ　　ＧＡＧ　　’Ｉ’ＡＣｉ’
ｃＧ　　ＡＴＡ　　ＣＣＣＧＴＧ　　Ｔ’ｌ’Ｔ　　Ｇ
Ａ（７、、−、ＡＩ−（１−−ρｌ　　　ｍ、−１”１
　　　　ｔ１＋−−−−３０ ５０ ７０ 〕　ＡＡＣＡＴＧ　　ＡＴＧ　　ＡＡＣＡＧＧ　　ＣＡ
ＣＣ’ｌ’Ｇ　　ＧＴＧ３０ ２７０ １０ ３０ ５０ ６５ ２０ ００ ２０ ３４〇 　４− かくして得られたプラスミドｐｃＲ１００１が含有する
完全なプロレンニンｃＤＮＡを、大腸菌ラクトースオペ
ロンのｌａｃプロモーター領域よシβ−ガラクトシダー
ゼ摺造遺伝子中同酵素のＮ末端より７番目のアミノ酸ロ
イシンに対応するコドン１でを台上′する９ＢＲ３２２
由来のプラスミドに藺、み増りフレームを合せて連結す
ることにより１．ＣＲ２ｏｏ１１造成し、Ｅ、　ｃｏｌ
ｉ　Ｃ６００ｒｊ、ｒｎ、−１，に形質転換によって移
入した。？−ニーｉられた菌株Ｆ、ｃｏｌｉＣＲ１をア
ンピシリン３０μｆ／ｍｅ、テトラサイクリン１０　／
ｉｆ／ｌｎｌ及びＩＰＴＧ　　１ｒｎ、Ｍを含有する肉
汁培地中で３７Ｃ振鉛培養し、増殖が４′５犬に達した
時に集菌し、音波処理によって菌体を破壊し無細胞抽出
液を得た。本抽出液について１２６Ｉでラベルした抗プ
ロレンニン仇体を用いるラジオイムノアッセイ法により
プロレンニン蛋白の開示を行つｆｃ結果、宿主１細胞当
り約ｉ、　ｏ　ｏ　ｏ分子に相当す　５− るプロレンニン砥白か生成していることが本す出された
。」 　６− 手続補正書 昭和５７年５月７日 特許片長゛冒　　島　１）益　樹　　　殿ｌ、事件の表
示 哨ｉ：１１５６年刊許願第１３１６３１号２、発明の名
称 機台プラスミド及びそ７Ｌを甘Ｍする嶺生吻３補止をす
る者 事件との関係　　特許出願人 住　所　来ｙ、郁杉並１区堀ノ内１−５−２１名　　称
　　刀ＩＪ　　％寸　綽　Ｊ彦（氏　名） ４代　理　人〒１０７ １肘１１責の１光ψｊの＃ｉ４ａなＭ−門１の■７、補
正の内容 別鉱のとおシ 「　ｉ’Ａｃ　　ＡＡＡ　　ＧＧＣ−３’Ｔｙｒ　　Ｌ
ｙｓ　　Ｇｌｙ　　　　　Ｊとある後に、昭和５６年１
０月２８日付差出しの手続補正１で補正されて、「上記
の方法で倚られたプロレンニンｃＤＮ’Ａを・・・・・
プロレンニン蛋白が生成していることが検出された。」
とある各・、以下のとおり訂正する。

「上記の方法で侍られたフ０ロレンニンｃｌ）ＩＶＡを
含むと確定されたクローンより得られたグラスミドＬ）
ＮＡについて、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ　（Ｂによ
シ塩基配列を決足した結果幻５、その中の一つｐｌ’Ａ
ｃＲ１０２Ｂ６は、プロレンニンｃ　ＤＮＡ全長１０９
５纒基の中、）０ロレンニンＮ末端に対応する１　％＝
よシ８９０笹捷での堰基會、ｐＴＡｌ；Ｒ１０３Ｃ２は
、７７１査よシプロレンニンＣ末端に対応する１０９５
番までの塩基を台上し７ていた。プロレン　１− ニンｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ全長を含有するプラスミドｐＣＲ１
００１を次のように造成した。

即ち、ｐＴＡｃＥｌ　０２Ｂ６およびｐＴＡＣＲ１０３
Ｃ２を５ａｉｌで処理することによって得られた各挿入
ＤＮＡ断片を、ｅｘｏｎｕｃＬｇａｓｇ　ｍで消化して
両３′末端から約１５０塩基を切り縮め。

次イテ、ｐｌ’ＡｃＲ１０２Ｂ６由米（Ｄ断片はＫｐｎ
ｌで、　　ｐｌ’ＡｃＲ１０３Ｃ２由来の断片はム幻！
Ｈ１で、夫々、切断した後、両者を混合アニーリングし
た（α）。これとは別に、ｐｌ’ＡｃＲ１０２Ｂ６プラ
スミド１）ＨＡをＥｃｏｌ’ｔ１＋Ｋｐｎｌで処理して
得られる小ＩＪＮｓｌＡ断片Ｃｂ）、及びｐＴＡＵＲｌ
　０３Ｃ２ｆラスミドＤＮＡを見臼＋ｆｆｌ＋ｆｌ鯵ψ
Ｉで処理して得られる大ＤＮＡ断片（ｅ）をそれぞれ調
製し、（α）（ｂ）（６）の三者を混合アニーリング後
、ＤＮＡ−リガーゼ（ｊｉｇαｇｇ）で連結した。かく
し１侍られたｐＣＲｌｏＱｌはプロレンニン全アミノ敗
配列に　２一 対応する完全なｃＤＮ’Ａを含有し、その停止コドンを
含む塩基配列は下に示す通りであった。

ｐＴＡｃＲ１０２Ｂ６とｐＴＡＣＲ１０３Ｃ２の連結は
、プロレンニンｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ塩基配列中篇２４９−２
５４のＡｐｎＩ部位置前からＡ１０１３−１０１８のＢ
ａ７ｎＨ１部位置後までを含有するプラスミドｐ　’Ｉ
’　Ａ　ＣＲ５を接続部分として用いることによっても
次のように造成することができる。

即ち、ｐＴＡｃＲｘ　ｏ　２ＢｔｙのＢｉｎｔｉｒｉｉ
＋Ｋｐｎ＋分解によって得られる挿入ＤＮＡ断片（ｄ）
、ｐ’ｌ’ＡｃＲ５のＫｐｎＩ＋ＢａｍＥ１部分分解に
よって得られる十鎖側７６０塩基を有する挿入ＤＮＡ断
片（ｅ）、およびｐｉ’ＡｃＲ１０３Ｃ２のＢａｍＨＩ
＋１ｊｉｎｄＮ分解で祠られる挿入ＤＮＡ＠片ωの谷々
を調製し、相互に相補的末端を有する三者を連結して（
ｄ）　−（１）　−（イ）の構成を刹する粉状１））Ｊ
Ａとした後、史に７“４’−Ｊ）ＮＡリガーゼ処理する
ことによって堤状ＤＮＡｐＣＲ１００１とする。

　３− １　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　２０１ ６０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　８００ １２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１４００ ８０ ０ ４０ ０ ００ ００ ００ ｊυ ６０ ”Ｃ０ ２６０２８０ １０ ４− ６０ ＣＴＧ　　ｌ’ｃＴ　　Ａ１’ＣＣＡＣｉ’Ａｃ　　Ｇ
ＧＧ　　ＡＣＡ　　ＧＧＣＡＧＣＡＬａｗ　　Ｓ＃ｒ　
　ｌ１ｇ　　Ｈｉｓ　　１°ｙｒ　　Ｇｌｙ　　ｌ’ｈ
ｒ　　Ｇｌｙ　　Ｓｇｒ　　Ｍ２０ ４００　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　４２０番 ＡＣＴ　　Ｇｉ’ＣＩ’ＣＣＡＡＣＡＴＴ　　Ｃ１’Ｃ
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧ　　Ｃ１’ｈｒ　　Ｖａｔ　　Ｓｓ
ｒ　　Ａｓｎ　　ＩＬｔｔ　　ＶａＬ　　Ａｓｐ　　Ｉ
ｌｇ　　Ｇｉｎ　　Ｇ４０ ４６０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　４８０■ ＧＧＧ　　　ＧＡＣＧＴＣり’ＴＣＡＣＣＴＡ’ｌ’　
　　ＧＣＣＧＡＡ　　ＴＴＣにＧＬｙ　　Ａｓｐ　　Ｖ
ａｌ　　Ｐｈｍ　　ｉ’ｈｖ　　Ｉ’ｉｌｒ　　′ＡＩ
、ａ　　Ｇｌｕ　　ｅｈｔｚ　　Ａｌａ０ ５２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　５４０ＣＴＣＧＣＣＴＣＡ　　ＧＡＧ　　
ＴＡＣＴＣＧ　　Ａｆｆ’Ａ　　ＣＣＣＧＴＧ　　７’
Ｌｇｕ　　Ａｌａ　　Ｓｍｒ　　Ｇｌｒｂ　　Ｔｙｒ　
　Ｓｇｒ　　ｌｌｓ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｔ　　Ｆ８０ ８０ 奢 ＧＣＣＣＡＡ　　ＧＡＣＣ１’Ｇ　　ＴＴＣ’ｌ’ｃＧ
　　ＧＴＴ　　ｉ’Ａｃ　　ＡＴＧ　　ａＡｌａ　　Ｇ
ｉｎ　　Ａｓｐ　　Ｌｇｒｂ　　Ｐｈａ　　Ｓｕｒ　　
Ｖａｌ　　Ｔｙｒ　　Ｍｇｔ　　Ａ４０ Ｃ；ＴＧ　　ＧＧＧ　　ＧＣＣＡ７’Ｃ（ｒＡｃ　　（
Ｘ；Ｇ　　ｌ’ｃｃ　　ＴＡＣＴＡＣＡＬｅ）ｂ　　Ｇ
Ｌｙ　　Ａｌａ　　ｌ１ｔｒ　　Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　
Ｓｅｒ　ｌ’ｙｒ　　Ｔｙｔｒ　　：／’１０ ８０ ’ｌ’Ｇ　　ＣＡＵ　　ＧＧＣＡｌ’ＣＣ１’Ｇ　　Ｇ
ＧＣＴＡＴ　ＧＡＣＡＣＣＧＴＣ１！ｔ　　Ｃ１１ｎ　
　ｕｌｙ　　ｌｉｅ　　Ｌａｕ　　Ｇｌｙ　　ｉ’ｈｒ
　　Ａｓｐ　　Ｔｈｒ　　Ｖａｔ３０ ４０ ＡＧ　　ＡＣＡ　　Ｇｉ’Ａ　　ＧＧＣＣＩ’Ｇ　　Ａ
ＧＣＡＣＣＣＡＧ　　ＧＡＧ　　ＣＣＣ１ｎ　　ｉ’ｈ
ｒ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｙ　　ＬｇｌＬ　Ｓｅｒ　　ｉ’
ｈｒ　　ＧＬｎ　　Ｇｌｒｔ、Ｐｒ。

５０ ００ ＡＣＧＧＧ　　　ＡＴＣＵＴＧ　　　ＧＧＧ　　　ＡＴ
Ｇ　　　ＧＣＣツ”ＡＣＣＣＣｉ’ｃＧｓｐ　　ＧＬｙ
　　Ｉｌｑ　　Ｃ７１ｎ　　Ｇｊｙ　ｋｉｔ　　ＡＬｔ
ｋ　　Ｔｆｌｒ　　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ７０ ６０ １’Ｔ　　ＧＡＣＡＡＣＡＴＧ　　ＡＴＧ　　ＡＡＣＡ
ＧＧ　　ＣＡＣＣＴＧ　　ＧＴＧｈｇ　　Ａｓｐ　　Ａ
ｓｎ　Ｍｅｔ　　Ｍｇｔ　　Ａｓｎ　　Ａｒｇ　ｈｉｓ
　　ＬＩＩｙ　　Ｖａｔ９０ ６００　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　６２０Ａに　　ＡＧＧ　　ＡＡＴ　　
ＧＧＣＣＡＧ　　ＧＡＧ　　ＡＧｃ　　ＡＴＧ　　Ｃ１
’ＣＡＣＧｓｐ　　Ａｒｇ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｙ　　Ｇ
ｉｎ　　ＧＬｕ　　Ｓｅｒ　Ｍｇｔ　　Ｌｅｕ　　ｌ’
ｈｒ０ ６６０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　６８０にＡ　　ＧＧＧ　　ｉ’ｃｃ　
　Ｃ１’Ｇ　　にＡＣＴＧＧ　　Ｃ１’ＣＣＣＣｕｉ’
Ｇ　　ＡＣＡｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ｓｇｒ　　Ｌｇｕ　ｆ
ｌｉｓ　　７°ｒｐ　　Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ　
　Ｔｈｒ２２〇 　５　− ００ ７６０ ８００　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
８２０７０ ８６０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　８８０９０ ９２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
９４０１０ ９８０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１０００ｉａ。

？２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７
４０４０ ８０ ４０ ００ ００ ６０ ２０ ０２０ ３４〇 　６− ０４０ ５０ ０９５ ＧＣＣＡＡＡ　　ＡＣＣＡｉ”Ｃｉ’ＧＡＡｌａ　　Ｌ
ｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ｊｉｇ　　　＊６５ １０６０　　　　、　　　　　　　　　　　　　　　　
１０８０７− かくして得られたプラスミドｐｃｆｃ１００１が含有す
る元金なプロレンニンｃＤＮＡを、大腸菌ラクトースオ
ペロンの土すプロモーター穎域に読み取りフレームを合
せて連結することにより、ｐｃＲ２００ｌを造成し、Ｅ
、　　ｃｏｌｉ　　Ｃ６００ｒ７．ｍτ形質転換によっ
て移入した。

上記ｐｃ＃２００１の造成は次の埋りに行った。

（１）大腸菌ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター
、す？ソーム結合部位およびβ−ガラクトシダーゼの八
木の一部を含有するｐＢＲ３２２田来のプラスミドｐＨ
Ｈ２ＯをＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ処理して軸状ＤＮＡとし、次
いでＤＮＡポリポリーゼＩによって末端−不備ＤＮＡｔ
ｈ１分を二本鎖とした後、Ｌυψ１部位を含むデカヌク
レオチドをリンカ−として両端にＴ４−ＤＩＶＡＩ）ガ
ーゼを用いて連結し、更になｈＩ＋ｓすＩ処理する。ｔ
２ｉｐＴＡｃＲ１０２Ｂ　６ｉたはｐｃＲｌｏｏｌを−
Ｈ！十膿１１５のＢａｍｆｉ　Ｉ　部位よりＡ２５３の
ＩＣｐｎ　１部位までの挿入ＤＮＡ断片を得る。（３１
７ｒＣＲ１００１をＫｐｎ１＋５ａｌｌ処理してプロレ
ンニンＣＤＮＡ塩基配列中扁２５４のＫｐｎ　　を部位
よシ禾端Ｓα１１部位までの挿入ＤＮＡ断片を得る。上
記（１）　ｔ２１　（３１で初られた谷１）ＮＡを連結
後、更に’Ｉ’４−ＤＮＡリガーゼ処理することによっ
て環状ＤＮＡ　ｐＣＲ２００１を得ることができる。

得られた菌株Ｅ、ｃｏｌｉ　ＣＲ１をアンピシリンａｏ
μ、！７／ｍ’、テトラサイクリア　１０　μｌ　／　
ｒｔｒｌ及びＩ　Ｐ　１’Ｇ　１ｍＭを含有する肉汁培
地中で３７℃振盪培養し、増殖が峡太に達した時に集画
し、音波処理によって菌体を破壊し無細胞抽出液を得た
。

本抽出液に一ついて１２１１７ｊでラベルした抗プロレ
ンニン抗体を用いるラジオイムノアッセイ法によりプロ
レンニン蛋白の測定を行った結果、宿主１細胞当り約１
．　ｏ　ｏ　ｏ分子に相当するプロレンニン蛋白が生成
していることが検出された。

生成物の分子量がプロレンニンと同程度であることは、
同梱出液を抗プロレンニン抗体をセファロース４Ｂ上に
固定化した同相抗体カラムを通過書せ、吸着された蛋白
を溶出後５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル′１気泳動に
よって恢定することによって確認された。」 −１０− 手続補正書 昭和５７年　８月１７日 特許庁長官　若　杉　オＯ夫　　殿 １、事件の表示 ロ６和５６年特許願第１３１６’３１号２、発明の名称 複合プラスミド及びそれを含有する微生物３、補正をす
る者 事件との関係　　特許出願人 住　所　　東京都杉差区堀ノ内１−５−２１名称別府輝
彦 （氏　名） ４、代　理　人〒１０７ 住　　所　　　東京都港区赤坂１丁目９番１５号６補＋
Ｈの１１象 明：ｌｌｌ蕎のａ発明の詳７１．ｌｌＩな涜１明”の欄
７、補正の内容 沖釦代のとおり （１）　　明細書第２８頁１３〜１４行に、１’ｙｒ　
　　Ｌｙｓ　　　Ｇｌｙ　　　Ｊとある後に、昭和５７
年５月７日付差出しの手絖補正書により補正されて、 「上記の方法で得られた・・・・・・・・・・・・確認
さｔ′した。」とあるケ以下のとおり訂正する。

「上記の方法で得ら才したプロレンニンｃ　ＤＮＡｆ含
むと確定されたクローンより得られたグラスミドＤＮＡ
に−１１）ｌ／１テ、Ｍａｘａｍ　−Ｇ　１ｌｂｅｒｔ
法により塩基配列全決定した結果は、その中の一つｐ　
Ｔ　Ａ、　ＣＲ１０２Ｂ６Ｕ、プロレンニンｃＤＮＡ全
長１０９５塩基の中、プロレンニンＮ末端に対応する１
番より８９０番１での塩基を、ｐＴＡｃＲ１０３Ｃ２は
、７７１番よりプロレンニンＣ末嘴腎対応する１０９５
番までの塩基を含有していた。ｆロレンニンｃ　Ｄ　Ｎ
　Ａ全長を含有するプラスミドルＣＲ１００１フ次のよ
うに造成した。

即ち、ｐｉ’Ａｃｋ１０２Ｂ６およびｐＴＡＣＲ１０３
Ｃ２をΣａｌＩで処理することによって得られた各挿入
ＤＮＡ断片を、ｇｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　■で消化して
圃３′床堝から約１５０塙基を切り縮め、次いで、ｐＴ
ＡｃＲｌ　０２Ｂ６由米の鵬゛片は勺」■で、ｐＴＡｃ
Ｒ１０３ｃ２由米の断片はβ旦μ２ｈＩで、夫々、切断
した故、両省を混合アニーリングした（、ＩＩ）。これ
とは別に、ｐＴＡｃＲ１０２Ｂ６プラスミドＤＮＡｆ：
ｇｃｏＲＩ＋に’ｐｎＩで処理して得られる小ＤＮＡ断
片（ｂ）、及びｐＴＡｃノで１０３Ｃ２プラスミドＩＪ
ＮＡを１！；　ｃ　ｏ　Ｒｌ　＋ｐ　ａ　ｍＨＩで処理
して侍られる犬ＤＮＡ断片（Ｃ）をそれぞれ調装し、（
α）（ｂ）（Ｃ）の三者を混合アニーリング後、ＤＮＡ
−リガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）で連結した。かくして侍ら
れたｐｃＡ’１ｏｏ１ｕプロレンニン全アミノは配列に
対応する完全なｃＤＮ’Ａを含有し、その停止コドンを
含む塩基配列は下に示す辿りであった。

ｐ　’Ｉ’　Ａ、　ＣＲ１０２Ｂ　６とｐｉ’Ａ、ｃ’
Ｒ１０３Ｃ２の連給ば、プロレンニンＣρＮＡ１温桶配
夕１］中屋２４９−２５４のＫｐｎ１部位匝１１］から
尻１０１３−１０１８のＢａｍＨ’１部位血俊までを宮
廟するプラスミドｐ　ｌ”　Ａ　ＣＲ５’ｚ接続ＭＳ分
として用いることによっても次のように遺取することが
できる。

ｂ＋Ｊち、ｐＴＡｃＲｌ　０２Ｂ６の隻ｙが■十り偲１
分解によって得られる挿入ＩＪＡｌ’　Ａ断片（ｄ）、
ｐ’ｌ’Ａｃｌ１５（１）ＫｐｎＩ＋Ｈａ７ｎＨＩ部分
分解によって得られる＋鎖側７６０ｉｆｉ基を南するう
早入ｊＪＮ’Ａ断片（１）、およびｐ’ｌ’ＡｃＲ１０
３Ｃ２のＢａｍｈ　Ｉ＋ｌ−ｉ　１ｎｄＶＡ分解で伯ら
れる押入ｕ　ｔＶＡμｊ１片０）の各々を泗攻し、相互
に相釉的末端會有する三者を連給して（ｄ）　−（ｇ）
　−０）の悟取を令する線状ＤＮＡとした彼、史に７“
４−ｕＮＡリガーゼ処理することによって塊状ＤＮＡｐ
ｃＡＩ’１ＯＯ１とする。

　３− １　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　２０４　υ １８０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　２０００ ２４０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　２６００ ００ ００ ００ ６０ ｔ１ ２０ １　υ ８０ ０ ３２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　３４０１０ ６０ Ｃ１’Ｇ　　ｉ’ｃＴ　　Ａ１’ＣＣＡＣｉ’Ａｃ　　
ＧＧＧ　　ＡＣＡ　　ＧＧＣＡＧＣＡＴＧＬｒｅｕ　　
Ｓｅｒ　　ｌ’ｌｅ　　Ｈｉｓ　　ｌ’ｙｒ　　Ｇｌｙ
　　ｌ’ｈｒ　　（ｉｌｙ　　Ｓｅｒ　　Ｍｅｔ２０ ４００　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　４２０ＡＣＴ　　Ｃ１’Ｃ１’ＣＣＡＡＣＡ
ＴＴ　　（，７’Ｇ　　ＧＡＣＡｌ’ｃ　　ＣＡＧ　　
ＣＡＧＴｈｒ　　Ｖａｔ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｎ　　Ｉｌ
ｅ　　Ｖａｔ　　Ａｓｐ　　Ｉｌｇ　　Ｃ１−１ｎ　　
ｃｒｌｎ４０ ４６０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　４８０ＧＧＧ　　ＧＡＣＧｉ’Ｃｉ’Ｔ
ｃ　　ＡＣＣＴＡｉ’　　ＧＣＣＧＡＡ　　７’１’（
、’　　にＡＣＧｌｙ　　Ａｓｐ　　Ｖａｌ　　Ｐｈｅ
　　ｉｏｈｖ　　１’ｙｒ　　＃ｉｔｔ　　ｕｌｕ　　
２ｈｅ、Ａｓｐ６０ ５２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　５４０（、ＴＣＧＣＣＴＣＡ　　ＧＡ
Ｇ　　ＴＡＣＴＣＧ　　Ａ’ｌ’Ａ　　ＣＣＣＵ’ｌ’
Ｇ　ｉ’ｉ’ＴＬｇｕ　　Ａｌａ　　δ’、ｅｒ　　Ｇ
１１ｔ　Ｔｙｒ　　Ｓｅｒ　　ｌｉｅ　　Ｐｒｏ　　Ｖ
ａｌ　　Ｐｈｅ８０ ５８０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　６（ＧＣＣＣＡＡ　　Ｃ，ＡＣＣ１’
Ｇ　　ｉ’Ｔｃ　　ｉｏＣＧ　　にｉ’Ｔ　　ｉ”ＡＣ
ＡＴＧ　　ｖＡｃＡｌａ　　Ｇｉｎ　　Ａｓｐ　　Ｌｇ
ｕ　　Ｐｈｅ　　Ｓｇｒ　　Ｖａｌ　　ｉ’ｙｒ　　Ｍ
ｅｔ　　Ａｓｐ００ ４０ ＣＴＧ　　ＧＧＧ　　ＧＣＣ７ＩＴｃ　　ＧＡＣ“　Ｃ
ＣＧ　　ｉ”ｃｃ　　ｉ”Ａｃ　　ｉ’Ａｃ　　ＡＣＡ
ＬｅｌＬ　（ｒｌｙ　　Ａｌａ　　Ｉｔｅ　　Ａｓｐ　
　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　’ｌ’ｙｒ　　ｌ’ｙｒ　　Ｔ
ｈｒ１０ ４− ８０ ＣＡＧ　　ＧＧＣＡｉ’ＣＣ１°Ｇ　　ＧＧＣＴＡｉ’
　　ＧＡＣＡＣＣＧＴＣＧｉｎ　　Ｇｌｙ　　ｌｉｅ　
　Ｌｅｕ　Ｃ；ｌｙ　　７’ｈｒ　　Ａｓｐ　　Ｔｈｒ
　　Ｖａ１３０ ４０ ＡＣＡ　　Ｇｉ’Ａ　　Ｃ；ＧＯＣ１’Ｇ　　ＡＧＣＡ
ＣＣＧＡＧ　　（、ＡＧ　　ＣＣＣ１’ｈｒ　　Ｖａｌ
　　Ｇｌｙ　　Ｌｅａ　　Ｓｅｒ　　ｌ’ｈｒ　　Ｇｌ
ｎ　　Ｇｌｒｔ　　Ｐｒ。

５０ ００ ＧＧＧ　　ＡＴＣＣ１’Ｇ　　ＧＧＧ　　ＡＴＧ　　Ｇ
ＣＣｉ’Ａｃ　　ＣＣＣｉ’ｃＧＧ１１／　Ｉｆ　　Ｌ
ｌｌｕ　　Ｇｌ；ｙ　　Ｍ’ｂｔ　　ＡＬｄｒ　　Ｉ’
１１ｖ　　Ｐｒｏ　　Ｓｇｒ７０ ６０ ＧＡＣＡＡＣＡ’ｌ’Ｇ　　Ａｉ’Ｇ　　ＡＡＣＡＧＧ
　　ＣＡＣＣＴＧ　　ＧＴＧＡｓｐ　　Ａｓｎ　Ｍｅｔ
　　Ｍｅｔ　　Ａｓｎ　　Ａｒｇ　　ｈｉｓ　　Ｌｅｙ
　　Ｖａ１９０ １０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　６２０ＡＧＧ　　ＡＡＴ　　ＧＧ
Ｃ（、”ＡＧ　　ＧＡＧ　ＡＧｃ　　ＡＴＧ　　Ｃ１’
ＣＡＣＧＡｒｇ　　Ａ、ｓｎ　　Ｇｌｙ’Ｇｌｎ　　Ｇ
ｌｕ　　Ｓｅｒ　Ｍｇｔ　　Ｌｅｕ　　ｌ’ｈｒ６６０
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　６８０ＧＧＧ　　ｉ’ＣＣＣ１’Ｇ　　（、
，４（、”１“ＧＧ　　ＧＴＣ；　　ＣＣＣＧ’ｌ’Ｇ
　　ＡＣＡＧｌｙ　　Ｓｅｒ　　ｂｅｕ　ｈｉｓ　　ｌ
’ｒｐ　　Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ　　ｉ’ｈｒ２
０ ５− ００ ７６０ ８００　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　８２０７０ ８６０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　８８０９０ ９２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　９４０１０ ９８０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１０００３０ ？２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　７４０４０ ８０ ４０ ８０ ００ ００ ６０ ＧＣＣ’１°ＡＴ　ＡＣＣＡＧＣにＡＡ　　（ｉＡｃ　
　ＣＡＧ　　ＧＧＣ７１１ａ　　Ｔｙｒ　　Ｔｈｒ　　
δｇｒ　　ｔｆｌｎ　　Ａｓｐ　　Ｇｉｎ　　Ｇｌｙ２
０ ０２０ １’ＣＣＣＡＧ　　ＡＡＡ　　ｉ’（、Ｇ　　Ａｉ’Ｃ
Ｃ１”Ｇ　　ＧＧＧ　　Ｃ，ＡｉＳｇｒ　　にｉｎ　　
Ｌ？／ｓ　”ｌｏｒｐ　　ｌ’ｌｅ　　ｂｅｕ　　Ｃｒ
１ｙ　　Ａｓｐ４０ ０４０ ５０ ０９５ ＧＣＣＡＡＡ　　ＡＣＣＡ１’Ｃｉ“ＧＡＡｌａ　　Ｌ
ｙｓ　　ｌ’ｈｒ　　Ｉｌｅ　　　＊６５ ６− １０６０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　ｌＯ８〇　７− かくして得られたプラスミドｐｃＡ１００１が含有する
完全なプロレンニンｃ７７ＮＡを、大＝＝ラタトースオ
被ロンの↓リプロモーター乍取に読み取りフレームを合
せて連給することにより、ｐｃＲ２００１をｍｈｔし、
Ｅ″、ｃｏｌｉＣ６°０ｒ７ｃｍτ形負転換によって移
入した。

上記ｐｃ：ｔｃ２００１の造成は次の堪りに行った。

（１）大腸菌ラクトースオペロンの匡プロモーター、リ
ボゾーム陀合郁位およびβ−がラクトシダーゼのＮ木の
一部を含有するｐＢＡ’３２２田釆のプラスミドｐＨｈ
２０をＥ　ｃ　ｏ九Ｉ処理して粉状ＤＮＡとし、次いで
ｕＮＡポリポリーゼ■によって木端−不備ＤＮＡ部分を
二本鎖とした後、ＬヱｈＩ部位を含むデカヌクレオチド
をリンカ−として両端にｉ”　４−１）ＩＶＡ　ＩＪガ
ーゼケ用やて連結し、更に町ワｈ１＋殖すＩ処理する。

（２）ｐ’ｌ’ＡｃＩｔ　１０２Ｂ６＝７たはｐｃ＊１
００１を−ｈ■＋リユｌ　処ｍしてプロレンニンｃＤＮ
Ａ塊基配列中届１５のＢａｍｈ１節位よりＡ、　２５３
　（Ｄ９偲　１部位捷での挿入１）ＮＡ断片を得る。＋
３）ｐ（、’Ｒ１００Ｉを１（、ｐｎＩ＋５ａｌＩ処理
してプロレンニンｃＤＮＡｊ」基配列中煮２５４のＫｐ
ｎ　　１部位より末端５ａ１１部位までの挿入ＤＮＡ１
ｆＩＴ片を得る。上記＋１）　ｔ２＋　＋３１で得られ
た各ｕＮＡを連結後、更にｉ”　４−　ＤＮ’Ａリガー
ゼ処理することによって塊状ＤＮＡ　ｐＣＲ２００１を
得ることができる。

得られた菌株Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ１ｔ１をアンピシリン３
０μ９７ｍ１．−　　及 びＩ　Ｐｌ”Ｇ　１　ｑＭを含有する肉汁培地中で３７
°Ｃ振盪培養し、増殖が最大に達した時に集菌し、音波
処理によって菌体を破壊し無細胞抽出数を侍だ。

本抽出液について１２町１でラベルした抗プロレンニン
抗体を用いるラジオイムノアッセイ法によりプロレンニ
ン蛋白の１ｌ１１１足を行った結果、宿主１軸胞当シ約
１．　ＯＯ０分子に相当するプロレンニン蛋白が生成し
ていることが検出された。

生成物ｌの分子量がプロレンニンと同程度であることは
、同創出液を抗プロレンニン抗体をセファロース４Ｂ上
に一定化した１司相抗体カラムを通過させ、吸着された
蛋白を溶出後５ＤＳ−ポリアクリルアミドケゞル亀気泳
動によって検定することによって確認された。」 −１０−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　仔牛プロレンニンの、　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｋ＠有して
   成る複合プラスミド。 ｚ　該プラスミドのベクター・プラスミドが、ＢＲ３２
   ２である特許請求の範囲第１項記載の複合プラスミド。 ３、仔牛７　ｏ　レンニンのｃＤＮＡｙｚ含有して成る
   複合プラスミドを持った宿主微生物。 ｃｏｌｉ）である特許請求の範囲第３項記載の微生物。