DK169996B1 - Fremgangsmåde til effektiv indføring af DNA i en industriel Bacillus-stammevært, fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid i en sådan vært, plasmid, genetisk manipuleret industriel Bacillus-mikroorganisme og anvendelse af en sådan mikroorganisme - Google Patents

Description

DK 169996 B1 i

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til effektivt i en industriel Bacillus-stammevært at indføre DNA, som er i stand til stabil opretholdelse og ekspression af et protein eller polypeptid af interesse i nævnte industri-5 elle vært, idet nævnte industrielle Bacillus-stammevært er prototroph, resistent mod genetisk udveksling og phaginfektion eller transformation og secernerer DNAser og har et produktionsniveau på mindst 0,5 vægt/vol-% secerneret protein under industrielle fermenteringsbetin-10 gelser.

Der er en væsentlig interesse i at anvende industrielle encellede mikroorganismestammer som værtsorganismer ved rekombinant-DNA til fremstilling af poly-peptider i høje udbytter. Mange industrielt vigtige en-15 zymer, såsom amylolytiske og proteolytiske enzymer, produceres af mikroorganismer af slægten Bacillus, f.eks.

B. subtilis, B. amyloliguefaciens, B. licheniformis, B. stearothermophilus, og B. coaqulans. I fermentere anvendes der stammer, som er i høj grad robuste og stabile.

20 Endvidere er stammerne resistente mod phag-infektion og desuden mod genetisk udveksling, dvs. indføring af DNA ved konventionelle transformationsprocedurer. De konventionelle industrielle stammer er desuden prototrophe for at undgå tilsætning af dyre aminosyrer til næringsmedi-25 et. Andre egenskaber af industrielle stammer er deres høje produktivitet indtil slutningen af fermenteringen, der kan være så lang som en uge, stabil cellekoncentration efter udtømning af næringsblandingen og høj produktivitet, sædvanligvis mindst ca. 0,5 vægt/vol-% secerne-30 ret protein. Desuden finder man ofte hos bacilli, at der er en væsentlig sekretion af DNAser, således at der sker en væsentlig nedbrydning af alt DNA i mediet.

Som følge af de industrielle stammers resistens overfor genetisk modifikation og deres prototrophe ka-35 rakter, der gør dem vanskelige at sulte, viser de resistens mod transformation. Det ville derfor være af stor DK 169996 B1 2 værdi at tilvejebringe en effektiv fremgangsmåde til indføring af DNA i industrielle stammer,hvor DNA'et ville opretholdes stabilt i den industrielle stamme, hvor A.

der ikke ville være noget tab eller ikke noget væsent-5 ligt tab i den industrielle stammes levedygtighed og aktivitet, og hvor der kunne opnås høje udbytter af endogene og exogene polypeptid- eller proteinprodukter.

Endvidere er selektion af celler vanskelig, når modifikationen eller transformationen af værtscellerne 10 indebærer forøgelse af kopiantallet af et endogent gen eller tidligere indført gen, når genet ikke er involveret i overlevelsesselektion. Det er derfor i høj grad ønskeligt at have en effektiv fremgangsmåde, ved hvilken man kan påvise og udvælge med hensyn til tilstedeværel-15 sen af yderligere gener (forøget kopiantal).

Genetiske manipulationer af B. subtilis er blevet rapporteret af Yoneda et al., Biochem. Biophys. Res.

Commun. (1973) 50: 765-770; Yoneda og Maruo, J. Bacte-riol. (1975) 124: 48-54; Sekiguchi et al., J. Bacteriol.

20 (1975) 121: 688-694; Hitotsuyanagi et al., Agric. Biol.

Chem. (1979) £3: 2342-2349; Yoneda, Appl. Env. Micro biol, (1980) 39.: 274-276. Vellykket anvendelse af rekom-binant-DNA-teknologi med hensyn til produktionsforbedringer for visse, effektivt transformerbare laboratorie-25 stammer af B. subtilis er blevet rapporteret, f.eks. med hensyn til a-amylaser, β-lactamaser, dihydrofolat-reduk-tase, interferon og insulin (Palva, Gene (1982) 1^: 81-87; Shinomiya et al., Agric. Biol. Chem. (1981) 45: 1733-1735; Gray og Chang, J. Bacteriol. (1981) 145: 422-30 428; Williams et al., Gene (1981) 16.: 199-206; Palva,

Gene (1983) 22: 229-235). vanskelighederne ved genetisk manipulering af jordbundsisolater af Bacillus licheni-formis er raporteret af Thorne og Stull, J. Bacteriol.

(1966) 91: 1012-1014. Se også britisk patentansøgning GB 35 2091268, europæisk patentansøgning 0 034 470, europæisk patentansøgning 0 032 238 og europæisk patentansøgning 0077 109, da den angår pUR1523.

DK 169996 B1 3

Der er nu tilvejebragt nye fremgangsmåder og produkter, som implicerer genetisk modificerede industrielle Bacillus-stammer. Ekstrachromosomalt DNA indeholdende et gen af interesse, der er i stand til ekspression i en 5 industriel stammevært, indføres i en passende bakterievært, hensigtsmæssigt en laboratoriestammevært beslægtet med den industrielle stamme, og den modificerede bakterievært kombineres med en industriel stamme under sammensmeltningsbetingelser. Celler af den industrielle 10 stamme, der indeholder genet eller generne af interesse, udvælges ved hjælp af en markør, der er tilknyttet genet af interesse.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man i nærværelse af et fusogen kombinerer første 15 let transformerbare, forligelige værtsceller indeholdende nævnte DNA som et ekstrachromosomalt element, der er i stand til opretholdelse i nævnte første vært, og nævnte industrielle Bacillusstammeværtsceller under betingelser, der muliggør selektion af nævnte industrielle 20 Bacillus-værtsceller, hvorhos nævnte første værtsceller og nævnte industrielle Bacillus-stammeværtsceller er til stede som protoplaster, hvorved nævnte DNA overføres til nævnte industrielle Bacillus-stammeværtsceller, og udvælger industrielle Bacillus-stammeværtsceller, der in-25 deholder nævnte DNA.

ved denne fremgangsmåde opnår man industrielle Bacillus-stammeværtsceller med et overraskende højt produktionsniveau med hensyn til proteiner af interesse ud fra en industriel Baci-llus-stamme, der allerede har et 30 højt produktionsniveau. Dette er overraskende på baggrund af den kendte teknik, hvorunder man ganske vist har frembragt Bacillus-stammer med forøget ekspression, men der har herved for det første været tale om labora-toriestammer, og for det andet har der været tale om 35 stammer, der i forvejen enten ikke producerede det ønskede enzym eller kun gjorde dette i ringe grad. Den relevante kendte teknik gennemgås nærmere i det følgende.

DK 169996 B1 4

Chemical Abstracts 96:214136e rapporterer, at visse Bacillus-stammer ikke på let måde transformeres. Forfatterne har held med hensyn til at indføre pUBllO ved anvendelse af en modificeret procedure med hensyn 5 til protoplast-transformation. Modifikationerne vedrører omhyggelig anvendelse af lysozym. Denne publikation an- 11 viser eller antyder helt klart ikke den ved den foreliggende opfindelse anvendte procedure, da der ikke er tale om anvendelse af industrielle stammer, og da der heller 10 ikke er nogen som helst angivelse af, at der anvendtes en anden, let transformerbar stamme som middel til overføring af DNA'et til en industriel stamme.

Biological Abstracts 7_3:38805 beskriver anvendelsen af polyethylenglycol til inducering af protoplast-15 fusion af aerobe bacilli som middel til overføring af plasmid-DNA til ikke-kompetente stammer af Bacilli. Ved den beskrevne fremgangsmåde anvendes laboratoriestammer af Bacilli, ikke industrielle stammer som ved den foreliggende opfindelse.

20 Biological Abstracts 7_3:53368 beskriver på lig nende måde, at protoplast-fusion anvendtes på laborato-riestammer af B. subtilis i nærværelse af polyethylenglycol for at opnå overføringen af plasmid-DNA.

Agric. Biol. Chem 47:159-161 (1983) beskæftiger 25 sig ikke med industrielle stammer, men derimod transformation af laboratoriestammer, hvor amylase-genet klones i pUBllO og vises at blive eksprimeret i en amy-bag-grund.

Ifølge J. Bacteriol. 154:831-836 (1983) indførtes 30 en protease i en vild-type stamme af B. stearothermophi-lus. Værtsstammerne opnås ved mutagenese under anvendelse af Imanaki's procedure, uden nogen som helst angivelse af, at man benytter det ifølge den foreliggende op- * findelse anvendte protoplast-system.

35 GB-A-2091268 beskriver generelt transformation af

Bacillus, anvender pUBllO som overføringsvektoren, an- DK 169996 B1 5 vender en Bacillus-laboratoriestamme med en amy-baggrund og følger en procedure, der er forskellig fra proceduren ved den foreliggende opfindelse ved transformering af laboratoriestammen.

5 Ingen af de ovennævnte publikationer beskriver en fremgangsmåde til transformation af industrielle Bacil-lus-værtsceller. Der er faktisk kun beskrevet laborato-riestammer. I de ovennævnte publikationer gør man sig ikke klart, hvilke specielle vanskeligheder man støder 10 på ved transformation af industrielle stammer. Selv om det ganske rigtigt i almindelighed gælder, at forøget ekspression opnås med en stamme, der enten ikke producerer et ønsket enzym eller kun gør dette i ringe grad, er situationen en ganske anden, når der anvendes en indu-15 striel stamme, som allerede producerer mere end 5 g/1 af enzym eller andet protein. Ved indføjelse af yderligere genkopier i en sådan stamme kunne man forvente instabilitet, f.eks. fremkaldt af rekombination. Dette var overraskende ikke tilfældet. Som følge af tydelig chromoso-20 mal integration (se nedenstående tabel I på side 23 ) blev produktionsniveauet betydeligt forøget. Dette står i modsætning til den kendte teknik, hvor man kun indføjer et nyt gen, der koder for et bestemt enzym, i en stamme, som ikke allerede producerede dette enzym. I 25 sidstnævnte tilfælde kan der opnås forholdsvis høje produktionsniveauer, idet man starter fra nul og anvender en let transformerbar stamme. I tilfælde af en overproducerende stamme kan enzymproduktionsniveauet ikke begrænses af genkopiantallet eller på grund af tran-30 skription af genet, der koder for enzymet, men på grund af andre faktorer såsom proteinsyntese af selektionskapacitet. Det er således overraskende, at produktionen hos en overproducerende stamme kan forøges yderligere, og at en stamme med yderligere genkopier giver en stabil 35 produktion ved chromosomal integration. Ingen af de ovennævnte publikationer beskriver, hvorledes man kan DK 169996 B1 6 indføre exogent materiale i en industriel stammeværts-celle.

Vedrørende den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendte protoplast-fusion bemærkes, at den er en 8 5 del af et større koncept, som blev udviklet til på stabil måde at transformere en industriel Bacillus-stamme „ med både homologe og heterologe gener. Uden et omfattende forsøgsarbejde kunne det ikke forventes erkendt, at dette koncept, ud af mange koncepter, kunne føre til så 10 overraskende høje produktionsniveauer af proteiner.

Der kan benyttes forskellige hensigtsmæssige udførelsesformer for fremgangsmåden ifølge opfindelsen som angivet i krav 2-15 og 19.

En speciel udførelsesform til fremstilling af en 15 industriel Bacillus-stamme med forøget evne til at producere et ønsket protein eller polypeptid er ejendommelig ved, at de let transformerbare, forligelige værtsceller indeholdende nævnte DNA som et ekstrachromosomalt element er fremstillet ved 20 (a) fragmentering af DNA indeholdende et gen, der koder for det ønskede protein eller polypeptid, (b) ligering af en vektor til nævnte fragmenterede DNA, (c) transformering af første værtsceller med nævnte 25 ligerede vektor, og (d) udvælgelse af de transformerede celler med hensyn til tilstedeværelsen og eventuelt ekspressionen af det ønskede gen og eventuelt inaktivering af protoplaster af de nævnte transformerede første 30 værtsceller.

En anden speciel udførelsesform til effektivt i en industriel Bacillus-stammevært at indføre DNA, der er i stand til stabil opretholdelse og ekspression af et polypeptid af interesse i den industrielle Bacillus- * 35 stammevært, idet nævnte industrielle Bacillus-stammevært er prototroph, resistent mod genetisk udveksling og DK 169996 B1 7 phaginfektion eller transformation og secernerer DNAser og har et produktionsniveau på mindst 0,5 vægt/vol-% secerneret protein under industrielle fermenteringsbetingelser, er ejendommelig ved, at man i nærværelse af et 5 fusogen kombinerer første dræbte Bacillus-værtsceller, der er let transformerbare og forligelige og indeholder nævnte DNA i en plasmidkonstruktion med et replikations-system, der kan fungere i Bacillus, og nævnte industrielle Bacillus-stammeværtsceller, hvor nævnte celler er 10 til stede som protoplaster, og hvorved nævnte DNA overføres til de industrielle Bacillus-stammeværtsceller, og udvælger industrielle Bacillus-stammeværtsceller, der indeholder nævnte DNA.

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til frem-15 stilling af et polypeptid af interesse i en industriel Bacillus-stammevært, idet nævnte industrielle Bacillus-stammevært er prototroph, resistent mod genetisk udveksling og phaginfektion eller transformation og secernerer DNAser og har et produktionsniveau på mindst 0,5 20 vægt/vol-% secerneret protein under industrielle fermenteringsbetingelser, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man dyrker industrielle Bacillus-stamme-værtsceller fremstillet ifølge et vilkårligt af kravene 1-15 i et egnet næringsmedium og isolerer det af nævnte 25 DNA-eksprimerede polypeptid. Hensigtsmæssige udførelsesformer herfor er angivet i krav 17 og 18.

Opfindelsen angår desuden et plasmid som angivet i krav 20, og en genetisk manipuleret industriel Bacil-lus-mikroorganisme som angivet i krav 21 og 22, samt an-30 vendelse af en sådan genetisk manipuleret industriel Bacillus-mikroorganisme til produktion af et protein eller polypeptid.

På tegningen, der tjener til yderligere belysning af opfindelsen, viser 35 fig. 1 et skematisk billede af plasmidet pGB33, fig. 2 et skematisk billede af plasmidet pGB34, DK 169996 B1 8 fig. 3 et skematisk billede af plasmidet pLC28, fig. 4 et skematisk billede af plasmidet pLC83, fig. 5 et skematisk billede af plasmidet pLC87, fig. 6 et skematisk billede af plasmidet pBG35, 5 fig. 7 et skematisk billede af plasmidet pLP33, fig. 8 et skematisk billede af plasmidet pLP87 og * fig. 9 et SDS-polyacrylamidgel-elektroforetogram af produkter secerneret af forskellige industrielle Bacillus-stammer i forhold til proteinmolekylvægtmarkører.

10 I det følgende beskrives specielle udførelsesfor mer nærmere.

Der er tilvejebragt fremgangsmåder til genetisk manipulation af industrielle Bacillus-stammer til anvendelse ved fermentering til fremstilling af polypeptid-15 produkter i godt udbytte. De opnåede modificerede industrielle stammer bevarer de ønskede egenskaber hos industrielle stammer, samtidig med at de giver forøgede udbytter af ekspressionsprodukter af endogene (samme art) eller exogene (anden art) gener.

20 Fremgangsmåden indebærer indføring af ekstrachro- mosomalt DNA i en bakterievært, der er i stand til re-plikation af DNA'et og er let modtagelig for indføring af det ekstrachromosomale DNA. Den modificerede bakterieværtscelle, der indeholder det ekstrachromosomale 25 element, kombineres derefter med den industrielle Bacil-lus-stamme under sammensmeltningsbetingelser, hvor Ba-cillus-modtagecellerne derefter kan udvælges med hensyn til tilstedeværelsen af det eller de gener af interesse, der hidrører fra det ekstrachromosomale element.

30 Den foreliggende opfindelses praktiske udførelse kan opdeles i følgende dele: (1) fremstilling af plas-midkonstruktionen, omfattende det eller de gener, for hvilke forøget ekspression i Bacillus-værten er ønsket, (2) kloning af plasmidkonstruktionen i en forligelig 35 vært, der kan anvendes til sammensmeltning med den industrielle Bacillus-stamme, (3) sammensmeltning af den DK 169996 B1 9 plasmidkonstruktionen indeholdende vært med den industrielle Bacillus-stamme, herunder udvælgelse af en sådan industriel stamme, og (4) dyrkning af nævnte stamme i et passende næringsmedium til fremstilling af ekspres-5 sionsproduktet af genet eller generne af interesse.

Genet eller generne af interesse kan være et vilkårligt prokaryotisk eller eukaryotisk gen. Disse gener kan omfatte bakterielle gener, encelle-mikroorganisme-gener, mammale gener eller lignende. Strukturgenerne 10 kan fremstilles på flere forskellige måder, herunder syntese, isolering fra genomt DNA, fremstilling ud fra cDNA, eller kombinationer heraf. De forskellige metoder til manipulering af generne er velkendte og indbefatter restriktionsdigestion, resektion, ligering, in-vitro-15 mutagenese, primer-reparation, anvendelse af lihkere og adaptere, og lignende. DNA-Sekvenser opnået fra en værtsorganisme kan således manipuleres på flere forskellige måder, afhængigt af de krav DNA-konstruktionen stiller. Se Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold 20 Spring Habor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982.

Når genet opnås ud fra en værtsorganisme, der har transkriptionsmæssige og translationsmæssige start- og stopreguleringssignaler, som genkendes af den industrielle Bacillus-stamme,er det sædvanligvis hensigtsmæssigt 25 at bevare 5' og 3'-flankeringsregionerne i strukturgenet til tilvejebringelse af en cistron, der er i stand til ekspression i den industrielle Bacillus-vært, Den transkriptionsmæssige startregion kan sørge for konstitutiv eller inducibel ekspression, således at værtsorganismen 30 i passende situationer kan dyrkes til høj densitet, før der opnås høje ekspressionsniveauer for strukturgenerne af interesse.

Når strukturgenet er fra en kilde, hvis regulato-riske signaler ikke genkendes af Bacillus, vil det være 35 nødvendigt at opnå reguleringsregioner, der genkendes af Bacillus, og indføje strukturgenerne mellem start- og DK 169996 B1 10 stopreguleringssignalerne. I nogle tilfælde kan de exo-gene strukturgen med dets egen eller egne stopkodoner indføres i læseramme bagved N-ende-kodonerne i et endogent Bacillus-strukturgen med dets naturlige regulato- 5 riske signaler. Det opnåede produkt kan derefter have nogle, f.eks. 0-30, yderligere N-terminale aminosyrer. Alternativt kan der fremstilles operoner, hvor en enkelt promotor sørger for transkriptionsmæssig initiering af et meddeler-RNA, der koder for et flertal af polypepti-10 der.

I visse tilfælde kan det være ønskeligt, at ekspressionsproduktet secerneres. Når ekspressionsproduktet secerneres naturligt, og leader-signalet og bearbejdningssignalet eller -signalerne genkendes af Bacillus-15 værten, vil dette ikke give vanskeligheder. Når produktet imidlertid ikke secerneres normalt, eller Bacillus ikke genkender sekretionssignalerne og/eller bearbejdningssignalet eller -signalerne, dvs. at signalerne ikke fungerer i tilfredsstillende grad i Bacillus, kan det 20 være nødvendigt at isolere eller syntetisere DNA-sekven-ser, der koder for sekretionssignalerne og bearbejdningssignalet eller -signalerne for et Bacillus-polypep-tid, og knytte dem til 5'-enden i strukturgenet i den rette læseramme.

25 Strukturgenerne kan eksprimere mange forskelllige polypeptider eller proteiner, såsom enzymer, hormoner, lymfokiner, overfladeproteiner, blodproteiner, strukturproteiner, immunoglobuliner eller lignende, fra pattedyr, encellede mikroorganismer, f.eks. bakterier, fungi, 30 såsom gærsvampe eller trådformede fungi, alger, protozoer osv., planter eller andre DNA-kilder. Af særlig interesse er enzymer, specielt hydrolaser og mere specielt proteaser og saccharidaser. Som eksempler på sådanne enzymer kan der nævnes endopeptidaser, exopepti-35 daser, serin- og non-serin-proteaser, a- og β-amylaser (især termostabil a-amylase) og lignende.

DK 169996 B1 11

Der findes en lang række vektorer, der kan anvendes såvel til den forligelige værtsorganisme som Bacil-lus-stammen, hvor replikationssystemerne kan være de samme eller forskellige for den forligelige værtsorga-5 nisme og Bacillus-stammen♦ (Med vektor menes et replika-tionssystem eller replikationssystemer, der er forligelige med en eller flere værtsorganismer, sædvanligvis en markør til udvælgelse i værtsorganismen og mindst ét bekvemt, sædvanligvis unikt, restriktionssted). Sædvanlig-10 vis vil det være hensigtsmæssigt som den forligelige værtsorganisme at have en ikke-industriel eller labora-torie-Bacillus-stamme, men dette er dog ikke nødvendigt, og i nogle tilfælde kan andre organismer anvendes, såsom E. coli. Vektoren vil omfatte et eller flere replika-15 tionsystemer, således at den i det mindste kan klones i den forligelige værtsorganisme. Replikationssystemet kan sørge for enten højt eller lavt kopiantal, fortrinsvis et kopiantal på mindst ca. 10 og almindeligvis ikke mere end ca. 100.

20 Afhængigt af om man ønsker integration af struk turgenerne i den industrielle Bacillus-stamme eller opretholdelse af et ekstrachromosomalt element, kan man inkorporere eller undlade at inkorporere et replika-tionssystem for Bacillus. Alternativt kan man til inte-25 grering sørge for strækninger af homologi i vektoreller plasmidkonstruktionen med Bacillus-genomet til forøgelse af sandsynligheden for rekombination.

Foruden replikationssystemet vil der være mindst én markør, og der kan være mere end én markør, men sæd-30 vanligvis ikke mere end ca. tre markører. Med markør menes et strukturgen, der er i stand til ekspression i en værtsorganisme, og som sørger for overlevelsesselektion.

Med "overlevelsesselektion" menes bibringelse af proto-trophi til en auxotroph værtsorganisme, eller biocid 35 eller viral resistens. Til prototrophi kan der anvendes forskellige gener, såsom leu, ura, trp eller lignende.

DK 169996 B1 12

Med hensyn til biocidresistens kan dette indbefatte resistens mod antibiotika, f.eks. neo, cam, tet, tun, kan eller lignende. Andre markører inkorporerer resistens mod tungmetaller, immunitet og lignende. De forskellige 5 DNA-sekvenser kan afledes fra forskellige kilder og sammenføjes til tilvejebringelse af en vektor, der omfatter et eller flere bekvemme, fortrinsvis unikke, restriktionssteder til muliggørelse af indføjelse eller substitution af strukturgenerne på sådanne steder eller i ste-10 det for tabte fragmenter til tilvejebringelse af plas-midkonstruktionen.

Når først plasmidkonstruktionen er blevet fremstillet, kan den nu klones i en passende forligelig værtsorganisme, der betegnes som den forligelige værts-15 organisme eller kloningsværtsorganismen. Der kan anvendes enhver værtsorganisme, som er bekvem, er let transformerbar og muliggør replikation af plasmidkonstruktionen og overføring til den industrielle Bacillus-stamme gennem sammensmeltning. Til rådighed står en lang række 20 laboratoriestammer, der har en høj transformationseffektivitet og sædvanligvis er auxotrophe og/eller følsomme overfor antibiotika. Anvendelsen af en Bacillus-vært til kloning af plasmidkonstruktionen har mange fordele, idet den muliggør anvendelse af et enkelt replikationssystem 25 samt den samme markør til overlevelsesselektion i både den forligelige værtsorganisme og den industrielle stamme. For størstedelen vil plasmidkonstruktionen således blive klonet i en passende Bacillus-vært. Bacillus-vær-ten behøver ikke at være den samme Bacillus-stamme som 30 den industrielle vært og vil primært vælges ud fra bekvemmel ighedshensyn. Plasmidkonstruktionen kan indføres i den forligelige vært i overensstemmelse med konventionelle metoder, såsom transformation, anvendelse af cal-cium-precipiteret DNA, konjugation eller andre hensigts-35 mæssige metoder. Den forligelige vært kan derefter dyrkes i et passende næringsmedium, under selektive betin- DK 169996 B1 13 gelser til udvælgelse af en vært, der indeholder plas-midkonstruktionen. Til auxotrophe værtsorganismer er næringsmediet mangelfuldt med hensyn til det krævede næringsstof, medens der til biocidresistens anvendes en 5 cytotoxisk mængde af bioxidet eller biociderne, f.eks. et antibiotikum eller antibiotika, i næringsmediet. Efter dyrkning af den forligelige værtsorganisme til en tilstrækkelig densitet behandles den forligelige værtsorganisme derefter til forberedelse af cellerne til sam-10 mensmeltning.

Cellerne dræbes bekvemt med et cytotoxisk middel før eller uder protopiastdannelsen. Der kan benyttes forskellige midler, herunder antibiotika, men iodacet-amid har vist sig at være bekvemt og effektivt og for-15 styrrer ikke den efterfølgende sammensmeltning. Proto-plaster fremstilles ud fra cellerne på konventionel måde, f.eks. ved lysozym- eller zymolyasebehandling, og protoplasterne suspenderes omhyggeligt i et passende medium med den rette osmolalitet til opretholdelse af in-20 tegriteten af protoplastet.

Den industrielle Bacillus-acceptorstamme behandles også til dannelse af protoplaster på lignende måde som den forligelige værtsstamme, men der anvendes levedygtige celler til fremstilling af protoplaster. Der kan 25 anvendes forskellige Bacillus-stammer, som har de for en industriel Bacillus-stamme ønskede egenskaber, såsom B. subtilis, licheniformis, amyloliquefaciens, stearother-mophilus og coaqulans, fortrinsvis licheniformis og subtilis. De industrielle Bacillus-stammer vælges fra orga-30 nismer, der kan isoleres fra jordbunden eller kan fås fra deponeringsinstitutioner eller andre kilder eller kan opnås ved modificering af sådanne Bacillus-stammer.

De industrielle Bacillus-stammer er karakteristiske ved at være resistente mod genetisk udveksling, såsom phag-35 infektion eller transformation. Stammerne er stabile og kan være i stand til eller ude af stand til sporedannel- DK 169996 B1 14 se. De er prototrophe og giver høje udbytter af endogene proteinprodukter, såsom enzymerne a-amylase og forskellige proteaser. De har også vist sig at secernere DNA-ser, hvilket resulterer i nedbrydning af DNA i mediet 5 og giver beskyttelse mod genetisk udveksling.

Protoplastet fra den døde forligelige værtsorga- ♦ nisme og protoplastet fra den levedygtige industrielle Bacillus-vært kombineres i nærværelse af et passende fu-sogen. Selv om der kan anvendes ethvert fusogen, der gi-10 ver en ønsket effektivitet, har polyethylenglycol for det meste vist sig at give høj sammensmeltningseffektivitet under meget bekvemme omstændigheder. Forholdet mellem det døde protoplast og Bacillus-acceptorstammen vil fortrinsvis være mindst 1:1, og der kan anvendes 15 overskud af det døde protoplast. Efter kort tid erstattes fusogenblandingen med et passende næringsmedium, og celler gendannes i et selektivt medium, hensigtsmæssigt ved påføring på en agarplade. Klonerne kan derefter screenes på passende måde til påvisning af ekspressionen 20 af de yderligere strukturgener. Der kan anvendes forskellige metoder, navnlig hvor der er involveret enzymer, for hvilke der findes almindeligt anerkendte påvisningsmetoder. Når der ikke er involveret enzymer eller der ikke står et påvisningssystem til rådighed, kan der 25 alternativt anvendes antistoffer, DNA- eller RNA-hydri-disering eller bioassays til screening af klonerne til bestemmelse af tilstedeværelsen af piasmidkonstruktionen og ekspression af strukturgenet eller -generne af interesse.

30 Den industrielle Bacillus-vært, der indeholder plasmidkonstruktionen eller chromosomalt integrerede plasmidkonstruktioner eller fragmenter heraf,dyrkes derefter i et næringsmedium under konventionelle fermenteringsbetingelser. Fermenteringen kan fortsættes, indtil 35 næringsblandingen er udtømt. Hvor produktet blevet secerneret, kan produktet isoleres fra næringsblandingen DK 169996 B1 15 ved konventionelle metoder, f.eks. ekstraktion, chroma-tografi, elektroforese eller lignende. Hvor produktet tilbageholdes i cytoplasmaet, kan cellerne udvindes ved centrifugering, filtrering osv. og lyseres ved hjælp af 5 mekanisk forskydningspåvirkning, detergent, lysozym eller ved andre metoder, og produktet kan isoleres som beskrevet ovenfor. Ved anvendelse af den omhandlede fremgangsmåde kan der opnås i høj grad forøgede udbytter af endogene polypeptider, sædvanligvis mindst ca. 150% af 10 udbyttet af modercellen, mere sædvanligt mindst 175%, og fortrinsvis mindst ca. 200% af udbyttet af modercellen.

Opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler. De i eksemplerne omtalte depone-15 ringer er i overensstemmelse med Budapesttraktaten.

Eksempel 1

Isolering af chromosomalt DNA.

Chromosomalt DNA fra B. licheniformis industriel 20 stamme T5, deponeret ved Centraal Bureau voor Schimmel-cultures, Oosterstraat 1, Baarn, Holland (i det følgende betegnet CBS) den 6. juli 1983 under nr. 470.83, isole-redes fra 3L kulturer, der dyrkedes natten over ved 37°C under luftning. Cellerne centrifugeredes ud ved 10.000 25 o/m i 10 minutter i en Sorvall GSA rotor, suspenderedes i 10 ml saccharose-tris-puffer indeholdende 25 vægt/ vol-% saccharose og 50 mM tris-HCl pH 8,0, og lyseredes ved tilsætning af 0,5 ml lysozym-opløsning (20 mg/ml) og inkuberedes i 15 minutter ved 37°C. Efter tilsætning af 30 2 ml EDTA (0,5 M) og inkubering i 5 minutter ved 0°C tilsattes der 1 ml 20% (vægt/vol) natriumdodecylsulfat (SDS). Suspensionen ekstraheredes derefter med en 1:1 phenol-chloroform-blanding. Supernatanten fraskiltes og forsynedes forsigtigt med et overliggende lag af 2 rum-35 fang ren ethanol, hvorefter DNA'et isoleredes ved hjælp af en glasstav. Efter opløsning i destilleret vand in- DK 169996 B1 16 deholdende 10 pg/ml ribonuclease ekstraheredes DNA-suspensionen med 1:1 phenol-chloroform, precipiteredes med 2 rumfang ethanol og resuspenderedes i TE-puffer (dvs.

10 mM tris-HCl, pH 8,0, indeholdende 1 mM EDTA).

5

Eksempel 2 4

Isolering af plasmid-DNA.

B. subtilis stamme 1G 20, indeholdende plasmide pUBHO (jfr. europæisk patentbeskrivelse 0 021 468), 10 dyrkedes natten over i IL penassay broth medium, hvortil der var sat 5 μΐ/ml neomycin. Efter centrifugering i 15 minutter ved 5000 o/m i en Sorvall model GSA rotor og resuspendering i 15 ml saccharose-tris-puffer lyseredes cellerne og behandledes med EDTA og SDS som beskrevet i 15 eksempel l. Efter tilsætning af NaCl til en slutkoncen-tration på 1 M opbevaredes supernatanten natten over ved 4°C og centrifugeredes derefter i 45 minutter ved 12500 o/m i en Sorvall type SS 34 rotor. De øverste 70% (vol/ vol) af supernatanten behandledes med 20 yg/ml DNAse-20 frit RNAse (i 0,5 timer ved 37°C) og ekstraheredes med phenol-chloroform-blanding (1:1) efterfulgt af ekstraktion med chloroform alene.

DNA'et precipiteredes fra den ekstraherede supernatant ved tilsætning af 0,2 rumfang 5 M Nacl og 0,25 25 rumfang af 40% (vægt/vol) polyethylenglycol 6000, efterfulgt af inkubering i 16 timer ved 4°C. Efter precipite-ring og centrifugering (30 minutter ved 12500 o/m, Sorvall type SS 34 rotor) resuspenderedes DNA'et i 2 til 3 ml TE-puffer (som i eksempel 1), og dispersionen ind-30 stilledes på pH 12,0 med 4 M NaOH. pH-Værdien indstilledes derefter på 8,5, og suspensionen ekstraheredes med phenol. Efter precipitation af ekstrakten med ethanol ' resuspenderedes plasmid-DNA'et i et lille volumen TE-puffer .

35 Plasmid pUR1523 (jfr. europæisk beskrivelse A- 77109) DNA fra E. coli isoleredes efter den metode, der DK 169996 B1 17 er beskrevet af Birnboim og Doly, Nucl.Acids Res. (1979) 7: 1513-1523.

Eksempel 3 5 a) Kontruktion af de a-amylase-holdige rekombinant-plasmider pGB33 og pGB34 (fig. 1 og 2).

5 yg chromosomalt DNA, isoleret fra Bacillus-produktionsstammen T5 (som beskrevet i eksempel 1) og 1 yg pUBHO, isoleret fra B. subtilis 1G 20 (som beskrevet 10 i eksempel 2), underkastedes digestion med Ecori. Efter termisk denaturering af restriktionsenzymet i 7,5 minutter ved 65°C precipiteredes DNA'et med ethanol og resus-penderedes i 20 yl af en ligaseblanding indeholdende 20 mM tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol 15 (DTT), 0,2 mg/ml okseserumalbumin, 0,5 mM ATP og 1 enhed af T4-ligase (Boehringer-Mannheim). Blandingen ligeredes natten over 4°C. Den ligerede blanding overførtes til B. subtilis som beskrevet i nedenstående eksempel 4. Plas-mid-DNA isoleredes (under anvendelse af den i eksempel 2 20 beskrevne metode) fra udvalgte rekombinant-mikroorganis-mer og analyseredes med restriktionsendonucleaser. Plasmid pGB3 3 var en rekombinant af pUBHO og et chromosomalt EcoRI-fragment på ca. 3 kbp, indeholdende a-amyla-se-cistronet. Ved digestion af pGB33 med restriktionsen-25 donucleaserne Hindlll og BamHI, efterfulgt af S1 exonu-clease-resektion og ligering med T4 opnåedes pGB34 (fig.

2), der stadig rummer a-amylase-cistronet, men mangler et DNA-segment indeholdende mange ubekvemme restriktionssteder. Plasmiderne pGB33 i B. subtilis 1-85 30 (= trp") og pGB34 i B. subtilis 1S-53 (Bacillus Genetic Stock Center, Ohio, U.S.A.) deponeredes ved CBS den 6. juli 1983 som henholdsvis nr. 466.83 og 467.83.

DK 169996 B1 18 b) Konstruktion af de chymosin-holdige rekombinant-plas-mider pLC28, pLC83 og pLC87 (fig. 3, 4 og 5).

0,5 yg pGB34 DNA og 0,5 yg pUR1523, et E. coli plasmid, der rummer genet for oksechymosin, underkaste- ? 5 des digestion med Pstl. Efter termisk denaturering og ligering som beskrevet i eksempel 3 a) anvendtes blandingen til transformation. Plasmid-DNA isoleredes fra udvalgte transformanter (under anvendelse af den i nedenstående eksempel 4 beskrevne selektionsprocedure) 10 analyseredes med restriktionsendonucleaser. Det udvalgte plasmid, kaldet pLC28, var en rekombinant af det chymo-sin-gen-holdige Pstl-fragment fra pUR1523, indføjet på det unikke Pstl-sted i pGB34 (fig. 3). Ved overskæring af pLC28 med restriktionsendonucleasen Clal, efterfulgt 15 af resektion med exonucleasen Bal31 og ligering med T4-ligase, opnåedes der pLC83 (fig. 4), der indeholder genet for chymosin, men ikke længere indeholder et DNAse gment med mange ubekvemme restriktionerssteder. Plas-miderne pLC28 og pLC83, begge i B. subtilis 1S-53, depo-20 neredes ved CBS den 6. juli 1983 som henholdsvis nr.

469.83 og 468.83.

Til anbringelse af chymosin-genet i fase bagved de transkriptionsmæssige og translationsmæssige ct-amyla-se-startreguleringssekvenser underkastedes pLC83 dige-25 stion med Pstl, resektion med nuclease Sj og ligering med T4-ligase. Det opnåede plasmid kaldtes pLC87 og vistes at have den korrekte placering og orientering ved sekvensanalyse. Se fig. 5.

30) Konstruktion af de protease-holdige rekombinant-plas-mider pLP33 og pLP87 (fig. 7 og 8).

100 yg chromosomalt DNA fra den protease-produce-rende stamme B. subtilis 168 (Bacillus Generic Stock Center, Columbus, Ohio) underkastedes delvis digestion 35 med restriktionsenzymet Clal. Efter phenolekstraktion adskiltes DNA-fragmenterne på en 1% agarosegel. Ved DK 169996 B1 19 hjælp af elektroeluering elueredes der flere DNA-frektioner fra gelen og ligeredes med Clal-lineariseret pGB35 (et rekombinant-plasmid indeholdende Bacillus-vek-toren pGL112, W.M. de Vos, Thesis University of Gronin-5 gen 1983, og a-amylase-genet fra pGB33 (se fig. 6). Ligeringsprodukterne overførtes til kompetente B. subtilis RUB331 celler på den i eksempel 4 beskrevne måde. De opnåede chloramphenicol-resistente transformanter analyseredes for forøget proteaseaktivitet (prot+) og formind-10 sket a-amylase-produktionsevne (amy-) (se eksempel 4) på 0,4% casein-amylose-plader. Plasmid-DNA isoleredes fra prot+amy_ transformanter, og restriktionsstederne blev kortlagt. pLP33 viser sig at indeholde et 3,3 kbp Clal-fragment (fig. 7), som omfatter et strukturgen, der ko-15 der for en serin-protease. pLP87 (fig. 8) har en chromo-somal-Clal-indføjelse på 1,8 kbp indeholdende den genetiske information for en ikke-serin-protease.

Eksempel 4 20 Transformation af Bacillus-stammer♦ B. subtilis 1-85 (trp-amy~) transformeredes ved inkubering af 1 ml cellesuspension og 1 yg ligeret DNA i 0,5 timer ved 37°C under forsigtig rystning (Anagnosto-poulos og Spizizen, J. Bacteriol. (1961) ÉU: 741-746).

25 Transformanter udvalgtes for antibiotikumresistens på minimum-medium-agarplader, til hvilke der var sat 0,02% (vægt/vol) casaminosyrer (Difco) og 10 yg/ml af et antibiotikum. Disse transformanter analyseredes derefter for tilstedeværelsen af det ønskede strukturgen.

30 I tilfælde af a-amylase udførtes dette ved at se efter ringe efter at have dækket pladerne med en opløsning indeholdende 0,6% (vægt/vol) Kl og 0,3% (vægt/vol) I2; ved positiv hybridisering til en 32P-mærket DNA-son-de syntetiseret in vitro i overensstemmelse med den N-35 terminale aminosyresekvens i det biologisk aktive enzym; ved immunoprecipitering med antistof mod enzymet og ved sammenlignende isoelektrofokusering.

DK 169996 B1 20 I tilfælde af chymosin udførtes der positiv udvælgelse gennem hybridisering med 32P-mærket pUR1523 DNA og ved immunoprecipitering med anti-chymosin-antistof-fer.

5 Til identificering af genet for en Bacillus-pro- tease afprøvedes transformanterne for deres evne til at danne ringe på casein-minimal-medium-agarplader. Forskellen mellem serin- og ikke-serin-protease bestemtes ved den metode, der er angivet af Scheiner og Quigley 10 (Anal. Biochemistry (1982) 122: 58-69).

De udvalgte transformanter anvendtes som donorstammer til cellesammensmeltningsforsøg.

Eksempel 5 15 Cellesammensmeltning og regenerering.

Den transformerede B. subtilis stamme (B. subtilis stamme 1-85 indeholdende pGB33, B. subtilis stamme 1S-53 indeholdende pLC87 eller B. subtilis stamme RUB331 indeholdende pLP33) dyrkedes natten over i 50 ml NBSG-X 20 medium (Thorne og Stull, J. Bacteriol. (1966) 91:1012-1020 (tabel II, side 1014)) med et relevant antibiotikum deri ved 37°C. Kulturerne fortyndedes i forholdet 1:1 med frisk NBSG-X medium og dyrkedes i endnu 1-1,5 timer i nærværelse af 10 mM iodacetamid. Efter centrifugering 25 i 10 minutter ved 5000 o/m i en Sorvall type GSA rotor og resuspendering i 10 ml SMM puffer indeholdende 1,5 M saccharose, 0,06 M MgCl2 og 0,06 M maleat blev cellerne protoplastet ved inkubering af cellerne i 2 timer ved 37°C i nærværelse af 2 mg/ml lysozym. Protoplasterne 30 centrifugeredes ud (10 minutter x 5000 o/m), resuspende-redes i 5 ml SMML puffer (L-broth hvori der var opløst 1,5 M saccharose, 0,06 M MgCl2 og 0,006 M maleat), blandedes og repelleteredes. Efter at være blevet resuspen-deret blandedes protoplasterne med protoplasterne fra 35 acceptorstammen T5, levende celler blev protoplastet som beskrevet ovenfor, og inkuberedes i 2 minutter i nærvæ- DK 169996 B1 21 relse af ca. 30% (vægt/vol) polyethylenglycol 6000. Efter 1:3-fortynding med SMML medium og centrifugering re-suspenderedes pelleten i et lille rumfang af SMML medium. Derefter anbragtes delmængder på 100 μΐ på regenere-5 ringsagarplader indeholdende 0,7% (vægt/vol) K2HP04, 0,3% (vægt/vol) KH2P04, 0,125% (vægt/vol) (NH4)2S04, 0,035% (vægt/vol) MgS04.7H20, 1,5% (vægt/vol) agar, 3,7% (vægt/vol) KC1, 0,1% (vægt/vol) glucose, 0,01% (vægt/ vol) okseserumalbumin suppleret med 0,1% (vægt/vol) spo-10 reopløsning indeholdende 0,2% (vægt/vol) MnS04, 0,2% (vægt/vol) ZnS04, 0,2% (vægt/vol) CoCl2, 0,5% (vægt/vol) FeS04, 6% (vægt/vol) NaCl og 0,5% (vægt/vol) CaCl2. Desuden indeholdt disse plader det relevante antibiotikum, i tilfælde af pGB33, pLP33 og pLC87 100-160 vg/ml neo-15 mycin. Efter inkubering ved 37 °C i mindst 72 timer underkastedes pladerne replika-pladeoverføring til hjerte-infusion-agarplader, der også indeholdt et andet antibiotikum, mod hvilket acceptorstammen er resistent, men overfor hvilket donorstammen er sentisiv. Fusanter be-20 tegnet som type A analyseredes efter de metoder, der er beskrevet i eksempel 4. I tilfælde af a-amylase blev proceduren gentaget som følger. Type A fusanter sammen-smeltedes med B. subtilis protoplaster indeholdende pGB36 (et rekombinant-plasmid af pTL12, indeholdende ge-25 net, der koder for resistens mod trimethoprim (Tanaka og Kawano, Gene (1980) 10: 131-136) og EcoRI-restriktions-fragmentet fra pGB33, der indeholder genet, som koder for B. licheniformis α-amylase), hvorved der opnåedes fusanter betegnet som type B. Både type A og type B fu-30 santer karakteriseredes ved genomisk analyse uder anvendelse af 32P-mærket plasmid pGB33 og ved sammenlignende SDS gel-elektroforese. Til sidst udvalgtes de opnåede fusanter for den fermentative produktion af de forskellige enzymer.

DK 169996 B1 22

Eksempel 6

Fermentativ produktion af α-amylase, protease og chymo-sin ved hjælp af genetisk manipulerede Bacillus-produk-5 tionsstammer.

Den genetisk manipulerede produktionsstamme af B. licheniformis T5, opnået ved sammensmeltning med B. subtilis stammen 1-85, indeholdende pGB33 (som beskrevet i eksempel 5), dyrkedes i 7 dage i en industriel nærings-10 væskeblanding under sådanne fermenteringsbetingelser, at produktionen af secerneret protein er mindst 0,5 vægt/ vol-%, idet α-amylase er hovedbestanddelen. Denne manipulerede stammes produktion sammenlignedes med produktionen fra moderstammen B. licheniformis T5. Som efter-15 vist ved hjælp af et SDS polyacrylamidgel-elektroforeto-gram af produkter secerneret af produktionsstammen B. licheniformis T5 (se fig. 9, bane 3) og produkter secerneret af den genetisk manipulerede stamme B. licheniformis T5, indeholdende pGB33 (se fig. 9, bane 2), forøge-20 des produktionen af α-amylase i betydelig grad ved indføring af plasmidet pGB33.

Der opnåedes sammenlignelige resultater med plasmidet pLP33, hvilken indføring forbedrede produktionen af protease, og med plasmid pLC87, hvilken indføring re-25 suiterede i en B. licheniformis T5 stamme, der er i stand til at producere chymosin.

Tabel I viser de sammenfattede resultater af en kvantificering af forbedringerne med de respektive genetisk manipulerede mikroorganismer.

i 5 DK 169996 B1 23

Tabel I

Organisme plasmid α-amylase-prod.

B. licheniformis T5 - 100% * B. licheniformis T5 pG3 33 180% ** B. lich. T5 type A pGB 36 230% *** 10 (PGB 33)

Organisme plasmid proteaseproduktion B. licheniformis T5 - 100% 15 B. licheniformis T5 pLP 33 145%

Organisme plasmid chymosin-produktion B. licheniformis T5 20 B. licheniformis T5 pLC 87 + * 1 a-amylase-gen; 2.5 ** 2 a-amylase gener; *** 3 α-amylase gener;

Den omhandlede fremgangsmåde har vist sig i høj grad vellykket med Bacillus. Imidlertid finder mange an-30 dre encellede mikroorganismer end Bacillus anvendelse ved industriel fermentering og har egenskaber som i industrielle Bacillus-stammer, hvilket gør dem modstandsdygtige mod effektiv transformation. Den omhandlede fremgangsmåde kan derfor finde anvendelse til industri-35 elle stammer af andre prokaryotiske og eukaryotiske organismer, såsom andre bakterier, fungi, f.eks. gærsvampe DK 169996 B1 24 og trådformede fungi, protozoer, alger osv. Arter af slægter som Aspergillus, Candida, Escherichia, Kluyvero-myces, Penicillium, Pseudomonas, Saccharomyces og Strep-tomyces er af særlig interessse.

5 Af særlig interesse i disse organismer og til dels som angivet for Bacillus er den industrielle produktion af endogene polypeptider, såsom a-amylaser, amy-loglycosidaser, catalaser, cellulaser, chymosiner, β-ga-lactosidaser, glucose-isomeraser, hemicellulaser, inver-10 taser, lactaser, lipaser, pectinaser, pectin-esteraser, penicillin-amidaser, penicillinaser, proteaser, exo- og endopeptidaser, pullulanaser og xylanaser. Også af interesse er exogene proteiner, såsom mammaliale blodproteiner, f.eks. faktor VIII, både C og R, serumalbumin, 15 vævsplasminogenaktivator, andre blodfaktorer, f.eks. V, VI, VII, IX, X, XI og XII, lymfokiner, interferoner, f.eks. α-, β- og γ-mammalia-enzymer, celleoverfladereceptorer, immunoglobuliner osv.

Det fremgår klart af de ovennævnte resultater, at 20 der er tilvejebragt en enkel og effektiv procedure til indføring af homologe eller heterologe gener i industrielle Bacillus-stammer under bibeholdelse af de ønskede egenskaber af stammerne og tilvejebringelse af cellernes forøgede funktion med hensyn til forøget produktion af 25 et ønsket ekspressionsprodukt endogent i Bacillus-værten eller produktionen af et nyt ekspressionsprodukt af interesse. Der opnås høj overføringseffektivitet, og hvor der foreligger væsentlig homologi mellem plasmidkon-struktionen og chromosomet i den industrielle Bacillus-30 stamme, kan der opnås enkel og multipel kopiintegration af strukturgenerne. Den omhandlede fremgangsmåde forøger i høj grad mulighederne for at ændre for tiden eksisterende industrielle Bacillus-stammer til opnåelse af effektiv fermentativ produktion af mange forskellige poly-35 peptider og proteiner af interesse.

Claims (23)

1. Fremgangsmåde til effektivt i en industriel Bacillus-stammevært at indføre DNA, som er i stand til 5 stabil opretholdelse og ekspression af et protein eller polypeptid af interesse i nævnte industrielle vært, idet nævnte industrielle Bacillus-stammevært er prototroph, resistent mod genetisk udveksling og phaginfektion eller transformation og secernerer DNAser og har et produk-10 tionsniveau på mindst 0,5 vægt/vol-% secerneret protein under industrielle fermenteringsbetingelser, kendetegnet ved, at man i nærværelse af et fusogen kombinerer første let transformerbare, forligelige værtsceller indeholdende nævnte DNA som et ekstrachromosomalt 15 element, der er i stand til opretholdelse i nævnte første vært, og nævnte industrielle Bacillus-stammeværts-celler under betingelser, der muliggør selektion af nævnte industrielle Bacillus-stammeværtsceller, hvorhos nævnte første værtsceller og nævnte industrielle Bacil-20 lus-stammeværtsceller er til stede som protoplaster, hvorved nævnte DNA overføres til nævnte industrielle Bacillus-stammeværtsceller, og udvælger industrielle Bacillus-stammeværtsceller, der indeholder nævnte DNA.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg-25 n e t ved, at den industrielle Bacillus-stamme er en Bacillus licheniformis.

3. Fremgangsmåde ifølge krav l eller 2, kendetegnet ved, at polypeptidet er et endogent enzym fra nævnte Bacillus-stamme.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendeteg net ved, at det endogene enzym er en a-amylase, fortrinsvis en termostabil α-amylase, eller en protease.

5. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1-4, kendetegnet ved, at den industrielle 35 Bacillus-stammevært er resistent mod genetisk modifikation fra et plasmid, en phag eller et kosmid. DK 169996 B1

6. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1-5, til fremstilling af en industriel Bacillus-stamme med forøget evne til at producere et ønsket protein eller polypeptid, kendetegnet ved, at de let 5 transformerbare, forligelige værtsceller indeholdende nævnte DNA som et ekstrachromosomalt element er frem- * stillet ved (a) fragmentering af DNA indeholdende et gen, der koder for det ønskede protein eller polypeptid, 10 (b) ligering af en vektor til nævnte fragmenterede DNA, (c) transformering af første værtsceller med nævnte ligerede vektor, og (d) udvælgelse af de transformerede celler med hensyn 15 til tilstedeværelsen og eventuelt ekspressionen af det ønskede gen og eventuelt inaktivering af protoplaster af de nævnte transformerede første værtsceller.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendeteg-20 n e t ved, at DNA'et, der indeholder et gen, som koder for det ønskede protein eller polypeptid, fragmenteres ved hjælp af et eller flere restriktionsenzymer.

8. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1-7, kendetegnet ved, at nævnte første værts- 25 celler dræbes før eller under protoplastdannelse.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til effektivt i en industriel Bacillus-stammevært at indføre DNA, der er i stand til stabil opretholdelse og ekspression af et po-lypeptid af interesse i den industrielle Bacillus-stam- 30 mevært, idet nævnte industrielle Bacillus-stammevært er prototroph, resistent mod genetisk udveksling og phagin-fektion eller transformation og secernerer DNAser og har - et produktionsniveau på mindst 0,5 vægt/vol-% secerneret protein under industrielle fermenteringsbetingelser, 35kendetegnet ved, at man i nærværelse af et fusogen kombinerer første dræbte BaciJlus-værtsceller, DK 169996 B1 der er let transformerbare og forligelige og indeholder nævnte DNA i en plasmidkonstruktion med et replikations-system, der kan fungere i Bacillus, og nævnte industrielle Bacillus-stammeværtsceller, hvor nævnte celler er 5 til stede som protoplaster, og hvorved nævnte DNA overføres til de industrielle Bacillus-stammeværtsceller, og udvælger industrielle Bacillus-stammeværtsceller, der indeholder nævnte DNA.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kende-lOtegnet ved, at den industrielle Bacillus-stamme- vært er en Bacillus licheniformis.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 9 eller 10, kendetegnet ved, at polypeptidet af interesse er et endogent Bacillus-enzym.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kende tegnet ved, at polypeptidet af interesse er et for Bacillus exogent enzym.

13. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 9-12, kendetegnet ved, at nævnte DNA bliver 20 integreret i chromosomet i den industrielle Bacillus-stammevært.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at enzymet er en a-amylase, fortrinsvis en termostabil α-amylase, eller en protease.

15 CBS under nr. 467.83, pLC28, deponeret ved CBS under nr. 469.83, pLC83, deponeret ved CBS under nr. 468.83, og pLC87, der kan opnås ud fra plasmid pLC83 ved Pstl-di-gestion, resektion med nuclease S-l og ligering med T4-ligase.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kende tegnet ved, at enzymet er chymosin eller en af dets precursorformer.

16. Fremgangsmåde til fremstillig af et polypep-tid af interesse i en industriel Bacillus-stammevært, 30 idet nævnte industrielle Bacillus-stammevært er proto-troph, resistent mod genetisk udveksling og phaginfek-tion eller transformation og secernerer DNAser og har et produktionsniveau på mindst 0,5 vægt/vol-% secerneret protein under industrielle fermenteringsbetingelser, 35 kendetegnet ved, at man dyrker industrielle Bacillus-stammeværtsceller fremstillet ifølge et vilkår- DK 169996 B1 ligt af kravene 1-15 i et egnet næringsmedium og isolerer det af nævnte DNA eksprimerede polypeptid.

17. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, at polypeptidet secerneres af de indu- 5 strielle Bacillus-værtsstammeceller og isoleres ved fraskillelse fra næringsmediet. ,

18. Fremgangsmåde ifølge krav 17, kendetegnet ved, at det secernerede polypeptid er en a-amylase, fortrinsvis en termostabil a-amylase, eller en 10 protease.

19. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det ligerede produkt fra trin (b) er et plasmid valgt fra gruppen bestående af pGB33, deponeret ved CBS under nr. 466.83, pGB34, deponeret ved

20. Plasmid, kendetegnet ved, at det er valgt fra gruppen bestående af plasmid pGB33 som indeholdt i B^ subtilis 1-85 med deponeringsnummeret CBS 466.83, plasmid pGB34 som indeholdt i B^ subtilis 15-53 25 med deponeringsnummeret CBS 467.83, plasmid pLC83 som indeholdt i B^ subtilis 15-53 med deponeringsnummeret CBS 468.83, plasmid pLC28 som indeholdt i B_^ subtilis 15-53 med deponeringsnummeret CBS 469.83, og 30 plasmid pLC87, der kan opnås ud fra plasmid pLC83 ved Pstl-digestion, resektion med nuclease S-^ og ligering med T4-ligase.

21. Genetisk manipuleret industriel mikroorganisme af slægten Bacillus, kendetegnet ved, at 35 den er prototroph, resistent mod genetisk udveksling og phaginfektion eller transformation og secernerer DNAser DK 169996 B1 og har et produktionsniveau på mindst 0,5 vægt/vol-% secerneret protein under industrielle fermenteringsbetingelser, og at den omfatter indføjet DNA i form af en plasmidkonstruktion eller en chromosomalt integreret 5 plasmidkonstruktion eller fragmenter heraf, hvilken konstruktion indeholder et gen, der koder for et ønsket protein eller polypeptid, og en selektionsmarkør, hvorved den genetisk manipulerede mikroorganisme har forøget evne til at producere det ønskede protein eller poly-10 peptid sammenlignet med den industrielle modermikroorganisme, og at den er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 19.

22. Genetisk manipuleret industriel Bacillus-mikroorganisme ifølge krav 21, kendetegnet 15 ved, at den producerer a-amylase, og at den indeholder mindst to stabile gener, der koder for a-amylase.

23. Anvendelse af en genetisk manipuleret industriel Bacillus-mikroorganisme som defineret i krav 21 eller 22, til produktion af et protein eller polypeptid.