DK170992B1 - Immobiliserede enzymer samt fremstilling og anvendelse heraf - Google Patents
Immobiliserede enzymer samt fremstilling og anvendelse heraf Download PDFInfo
- Publication number
- DK170992B1 DK170992B1 DK483487A DK483487A DK170992B1 DK 170992 B1 DK170992 B1 DK 170992B1 DK 483487 A DK483487 A DK 483487A DK 483487 A DK483487 A DK 483487A DK 170992 B1 DK170992 B1 DK 170992B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- enzyme
- preparation
- immobilized
- substituted phenyl
- cells
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 41
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 title claims description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 68
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 68
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 33
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 22
- 108091022884 dihydropyrimidinase Proteins 0.000 claims description 20
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 18
- WJRBRSLFGCUECM-UHFFFAOYSA-N hydantoin Chemical compound O=C1CNC(=O)N1 WJRBRSLFGCUECM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 229940091173 hydantoin Drugs 0.000 claims description 17
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 102100036238 Dihydropyrimidinase Human genes 0.000 claims description 12
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 10
- -1 (-) (4-hydroxyphenyl) Chemical group 0.000 claims description 9
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 7
- 241000193764 Brevibacillus brevis Species 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 4
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 3
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims description 2
- 241000721603 Mycoplana Species 0.000 claims 1
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 claims 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 58
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 21
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- UMTNMIARZPDSDI-UHFFFAOYSA-N 5-(4-hydroxyphenyl)imidazolidine-2,4-dione Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1C(=O)NC(=O)N1 UMTNMIARZPDSDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 6
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 6
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 5
- VMAQYKGITHDWKL-UHFFFAOYSA-N 5-methylimidazolidine-2,4-dione Chemical compound CC1NC(=O)NC1=O VMAQYKGITHDWKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 4
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 3
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007650 D alpha amino acids Chemical class 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000648 calcium alginate Substances 0.000 description 2
- 235000010410 calcium alginate Nutrition 0.000 description 2
- 229960002681 calcium alginate Drugs 0.000 description 2
- OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L calcium;(2s,3s,4s,5s,6r)-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxy-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxylato-4,5,6-trihydroxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Ca+2].O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H](C([O-])=O)[C@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O2)C([O-])=O)O)[C@H](C(O)=O)O1 OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000001469 hydantoins Chemical class 0.000 description 2
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 2
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 2
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 description 2
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 2
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 2
- 239000008262 pumice Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 239000007195 tryptone soya broth Substances 0.000 description 2
- 125000004191 (C1-C6) alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- YIWGJFPJRAEKMK-UHFFFAOYSA-N 1-(2H-benzotriazol-5-yl)-3-methyl-8-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carbonyl]-1,3,8-triazaspiro[4.5]decane-2,4-dione Chemical compound CN1C(=O)N(c2ccc3n[nH]nc3c2)C2(CCN(CC2)C(=O)c2cnc(NCc3cccc(OC(F)(F)F)c3)nc2)C1=O YIWGJFPJRAEKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WWSABODBEODTEA-UHFFFAOYSA-N 5-(3,4-dihydroxyphenyl)imidazolidine-2,4-dione Chemical compound C1=C(O)C(O)=CC=C1C1C(=O)NC(=O)N1 WWSABODBEODTEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NXQJDVBMMRCKQG-UHFFFAOYSA-N 5-phenylimidazolidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)NC1C1=CC=CC=C1 NXQJDVBMMRCKQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-SSDOTTSWSA-N D-alpha-phenylglycine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N Dialdehyde 11678 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1[C@H](C[C@H](/C(=C/O)C(=O)OC)[C@@H](C=C)C=O)NCC2 ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLNTWVDSQRNWFU-UHFFFAOYSA-N OOOOOOO Chemical compound OOOOOOO JLNTWVDSQRNWFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002845 Poly(methacrylic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N amoxicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960003022 amoxicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- SLGWESQGEUXWJQ-UHFFFAOYSA-N formaldehyde;phenol Chemical compound O=C.OC1=CC=CC=C1 SLGWESQGEUXWJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010525 oxidative degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N p-Hydroxyampicillin Natural products O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)C(N)C1=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229920001568 phenolic resin Polymers 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000012609 strong anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 1
- 239000012610 weak anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
- C12P41/009—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures by reactions involving hydantoins or carbamoylamino compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
- C12N11/091—Phenol resins; Amino resins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
DK 170992 B1
Den foreliggende opfindelse angår et immobiliseret præparat til brug i fremstillingen af D(-)a-aminosyrer via en enzymatisk rute og angår især et præparat til brug i en fremgangsmåde til fremstilling af D(-)(substitueret phenyl)glyciner, 5 såsom D(-)(p-hydroxyphenyl)glycin, som anvendes som udgangsmateriale til fremstilling af antibiotikalt amoxycillin.
Det er kendt, for eksempel fra GB 1452591 og 1506067, at der findes mange enzymer, som er i stand til at omdanne 5-(substitueret phenyl)hydantoiner til D-a-aminosyrer. De mest 10 hensigtsmæssige enzymer fremstilles af bakterielle organismer, og GB 1534426 og 1564982 omhandler hydantoinase-producerende organismer, som kan hydrolysere 5-(substitueret phenyl)hydantoiner til D(-)N-carbamoyl-(substitueret phenyl)-glyciner. Derudover omhandler GB 1587116 en enzymatisk frem-15 gangsmåde til fremstilling af D-α-aminosyre ud fra 5-(substitueret phenyl)hydantoin.
Indenfor teknikkens stade er det velkendt, at immobiliseringen af en enzymproducerende celle eller af enzymet medfører en renere enzymbehandlingsvæske, og at dette er fordelagtigt 20 for efterfølgende ekstraktionsprocesser. GB 1564982 redegør for, at celler eller behandlede celler af hydantoinase-producerende organismer kan immobiliseres ved hjælp af almindelige metoder. I praksis er de immobiliserede systemer, der er fremstillet på denne måde, imidlertid ikke tilstrækkeligt 25 stabile til at give en kommerciel holdbar fremgangsmåde. Et kommercielt holdbart system skal kunne genbruges i et tilstrækkeligt antal enzymbehandlinger for at kunne dække omkostningerne ved dets fremstilling. Dette vil typisk være ca. 15 gange.
30 Det har overraskende vist sig, at tilstedeværelsen af en divalent metalion i sådant et immobiliseret enzymsystem giver stabilitet til præparatet, så det kan genanvendes.
I overensstemmelse hermed angår den foreliggende opfindelse et immobiliseret enzympræparat til brug i fremstillingen af DK 170992 B1 2 en D(-)(eventuelt substitueret phenyl)glycin eller et N-carbamoyl derivat deraf ud fra 5-(eventuelt substitueret phenyl) hydantoin, hvilket enzympræparat omfatter celler eller behandlede celler af en organisme, som producerer et hydan-5 toinaseenzym, der er i stand til at hydrolysere 5-(eventuelt substitueret phenyl)hydantoin, hvilke celler eller behandlede celler er immobiliseret i eller på en hensigtsmæssig bærer, eller et enzym, som stammer fra organismen, og som er adsor-beret på en positivt ladet polymerbærer eller kovalent bundet 10 til en funktionaliseret polymerbærer, sammen med en effektiv mængde af en stabiliserende divalent metalion valgt fra gruppen bestående af Mn++, Co++ og Ni++.
Den effektive mængde stabiliserende divalent metalion som beskrevet heri afhænger af den anvendte ion og kan variere 15 fra en spormængde, dvs. det som forbliver bundet til enzympræparatet, efter at et overskud af tilsat divalent metalion er blevet fjernet, til et niveau på, for eksempel, 2 mM, når enzympræparatet er suspenderet i et vandigt medium.
En særligt foretrukken divalent metalion er Mn++.
20 Ved udtrykket D(-)(eventuelt substitueret phenyl)glycin forstås i nærværende beskrivelse og krav D(-)phenylglycin og D(-)(mono-,di-eller tri-substitueret phenyl)glyciner. Hensigtsmæssige substituenter omfatter hydroxy, C(1.6)alkyl, Cji.gjalkoxy og halogen. Foretrukne D(-)(substitueret phe-25 nyl)glyciner er D(-)(p-hydroxyphenyl)glycin og D(-)(3,4-dihy-droxyphenyl)glycin.
Udtrykket 5-(eventuelt substitueret phenyl)hydantoin betegner i nærværende beskrivelse og krav 5-phenylhydantoin eller 5-(substitueret phenyl)hydantoin, hvori phenyl er substitueret 30 med op til tre grupper omfattende hydroxy, C(1.6)alkyl, C(1-6)alkoxy og halogen. Typiske eksempler er 5-(4-hydroxy-phenyl)hydantoin og 5-(3,4-dihydroxyphenyl)hydantoin.
DK 170992 B1 3
Udtrykket "immobiliseret enzympræparat" omfatter i nærværende beskrivelse og krav immobiliserede præparater af hele celler, sprængte celler eller cellefrit enzym. Enzymet kan være råt, delvist oprenset, eller oprenset. Fortrinsvis er det immobi-5 liserede enzympræparat et immobiliseret cellefrit enzympræparat .
Det foretrækkes, at organismen, fra hvilken hydantoinaseenzy-met vindes, er en mikroorganisme såsom en Bacillusstamme, Pseudomonasstamme, etc., der er kendt fra GB 1564982, 1587116 10 og 1534426, eller en anden hensigtsmæssig organisme såsom en Mycoplana-art.
Hensigtsmæssige bærere til immobilisering af celler eller behandlede celler er de, der traditionelt anvendes i den kendte teknik, såsom polymermatricer omfattende polyacryl-15 amid, polyurethan eller calciumalginat eller porøse organiske eller uorganiske materialer såsom pimpsten, aluminiumoxid og metalfolier.
Hensigtsmæssige positivt ladede polymerbærere til immobilisering af cellefri enzymer omfatter anionbytterharpikser og 20 polymerbærere såsom DEAE cellulose. Hensigtsmæssige funktio-naliserede polymerbærere omfatter substitueret polymethacryl-syrepolymer, der er funktionaliseret med aldehyd, og materialer såsom aluminiumoxid med høj massefylde, der er belagt med et polyethylenimin/glutaraldehydkompleks.
25 Hensigtsmæssige anionbytterharpikser omfatter stærke eller svage anionbytterharpikser, dog foretrækkes de sidste. Foretrukne anionbytterharpikser omfatter phenol- formaldehyd-anionbytterharpikserne Duolite A568 eller Duolite DS 17183 (fra Rohm og Haas Company), som er funktionaliseret med 30 sekundære aminer, polystyrenharpikser, som er funktionaliseret med tertiære aminer såsom Amberlite IRA 935, og Amberlite IRA 945 (fra Rohm og Haas Company) og Purolit A100. Andre hensigtsmæssige harpikser omfatter Amberlite IRA 901, som er polystyren funktionaliseret med kvaternære ammoniumioner, og DK 170992 B1 4
Lewatit OC 1037 (fra Bayer AG), som er polystyren funktiona-liseret med primære aminer. Polystyrenharpikser med funktionelle grupper af di-ethanoltypen, såsom Diaion EX-05 (fra Mitsubishi Chemical Industries), kan også anvendes.
5 Stabiliteten kan yderligere forbedres ved at krydsbinde præparatet in situ. for eksempel med en vandopløselig dialdehyd. Et foretrukket krydsbindingsmiddel er glutaraldehyd. I tilfælde af immobiliserede cellefri enzymer kan krydsbindingsmidlet med fordel anvendes i et niveau på under ca. 1%, 10 fortrinsvis på ca. 0,2%.
I et yderligere aspekt angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fremstilling af en D(-)(eventuelt substitueret phenyl)glycin eller et N-carbamoyl derivat deraf ved hydrolyse af 5-(eventuelt substitueret phenyl)hydantoin ved 15 hjælp af et hensigtsmæssigt hydantoinaseenzym under udelukkelse af luft, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at enzymet er givet i form af et immobiliseret enzympræparat indeholdende celler eller behandlede celler af en organisme, der fremstiller enzymet, hvilke celler eller behandlede 20 celler er immobiliseret i eller på en hensigtsmæssig bærer, eller et enzym, som stammer fra organismen, og som er adsor-beret på en positivt ladet polymerbærer eller kovalent bundet til en funktionaliseret polymerbærer, sammen med en effektiv mængde af en stabiliserende divalent metalion valgt fra 25 gruppen bestående af Mn++, Co++ og Ni++.
Det er væsentligt, at luft udelukkes under hydrolyseprocessen, og derefter mens det immobiliserede cellepræparat genvindes og genbruges. Det har vist sig, at indtrængning af luft fører til enzyminhibering, sandsynligvis pga oxidative 30 nedbrydelsesprodukter fra hydantoinen. Reaktionen udføres fortrinsvis i en atmosfære af nitrogen eller andre inerte gasser. Det foretrækkes, at nitrogen eller inert gas også bobles gennem reaktionsblandingen.
DK 170992 B1 5 I en foretrukken fremgangsmåde ifølge opfindelsen tilsættes yderligere mængder stabiliserende divalent metalion, fx i et niveau på 0,2-2 mM, fortrinsvis i et niveau på 0,5-1,0 mM, til reaktionsblandingen. Dette har til formål at minimere en-5 zymaktivitetsreduktionen under reaktionen.
Hydrolysereaktionen udføres fortrinsvis ved en pH på mindst pH 8, og især i området 8,5 til 9,5. En pH på ca. 9,0 foretrækkes. Dette kontrolleres under reaktiosforløbet, for eksempel ved tilsætning af alkali eller ved anvendelse af en 10 passende buffer. Reaktionen udføres normalt ved en temperatur i området fra 30 til 60°C, fortrinsvis 40 til 50°C i en periode på fra 6 til 48 timer, typisk 12 til 24 timer.
Det er hensigtmæssigt, at det immobiliserede enzympræparat bringes i kontakt med en vandig opslæmning af ca. 5 til 25% 15 (vægt/volumen) af den 5-(eventuelt substitueret phenyl)hydan-toin, fortrinsvis 10 til 20% (vægt/volumen), især ca. 15% (vægt/volumen), sammen med 0,2 til 2, fortrinsvis ca. 0,5, mM, divalent metalion. Hydrolysereaktionen kan udføres i en omrørt tankreaktor eller i en søjlereaktor under udelukkelse 20 af luft.
Visse immobiliserede enzympræparater ifølge opfindelsen er i stand til at hydrolysere 5-(eventuelt substitueret phenyl)-hydantoin direkte til D(-)(eventuelt substitueret phenyl)-glycin. Sådanne enzympræparater kan typisk afledes fra mikro-25 organismer beskrevet i GB 1587116, især de, der tilhører slægten Pseudomonas.
Sædvanligvis vil de immobiliserede enzympræparater ifølge den foreliggende opfindelse imidlertid hydrolysere 5-(eventuelt substitueret phenyl)hydantoin til et mellemprodukt D(-)N-30 carbamoyl(eventuelt substitueret phenyl)glycin, som derefter kan hydrolyseres, hvis det ønskes, ved hjælp af kemiske eller enzymatiske metoder, til opnåelse af den tilsvarende D(-)-(eventuelt substitueret phenyl)glycin.
DK 170992 B1 6 Når det er ønskeligt at hydrolysere mellemproduktet D(-)N-carbamoyl(eventuelt substitueret phenyl)glycin ved hjælp af en kemisk metode, kan reaktionen praktisk udføres med salpetersyre som beskrevet af T. Ohashi et al. i Aoric. Biol.
5 Chem.. 1981, 4£(4), 831-838.
Hensigtsmæssige enzymatiske metoder til hydrolyse af D(-)N-carbamoyl (eventuelt substitueret phenyl)glyciner til D(-)-(eventuelt substitueret phenyl)glyciner omfatter carbamoyla-ser, som beskrevet, for eksempel, i GB 2022581.
10 De immobiliserede enzympræparater ifølge den foreliggende opfindelse kan lagres fugtige inden brug, fortrinsvis ved lave temperaturer såsom ca. 4°C og kan genbruges. Immobili -serede enzympræparater ifølge opfindelsen er med succes blevet anvendt mere end femten gange, og visse foretrukne 15 immobiliserede cellefri enzympræparater er blevet genbrugt fyrre gange eller mere.
I et yderligere aspekt angår den foreliggende opfindelse en fremgangmåde til fremstilling af et immobiliseret enzympræparat til brug i fremstillingen af en D(-)(eventuelt substi-20 tueret phenyl)glycin eller et N-carbamoyl derivat deraf, hvilken fremgangsmåde omfatter, at behandlede eller ubehandlede celler af en organisme, som producer en hydantoinase, der er i stand til at hydrolysere en 5-(eventuelt substitueret phenyl)hydantoin immobiliseres i eller på en hensigts-25 mæssig bærer, eller at et enzym, der stammer fra cellerne, bringes i kontakt med positivt ladet eller funktionaliseret polymerbærer i nærværelse af en effektiv mængde stabiliserende divalent metalion valgt fra gruppen bestående af Mn++,
Co++ og Ni++.
30 Metoder til immobilisering af de behandlede eller ubehandlede celler i eller på en hensigtsmæssig bærer i nærværelse af en effektiv mængde stabiliserende divalent metalion er analoge med de metoder, der normalt anvendes i den kendte teknik. Således kan de behandlede celler indlejres i hensigtsmæssige DK 170992 B1 7 bærere såsom polymermatricer omfattende polyacrylamid og polyurethan eller calciumalginat, eller de kan bindes kemisk til hensigtsmæssige bærere såsom porøse organiske eller uorganiske materialer omfattende pimpsten, alumini-umoxid og 5 metalfolier.
I et yderligere aspekt angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fremstilling af et immobiliseret cellefri enzympræparat til brug i fremstillingen af en D(-)(eventuelt substitueret phenyl)glycin eller et N-carbamoyl derivat 10 deraf, hvilken fremgangsmåde omfatter, at et hydantoinase-enzym, der er i stand til at hydrolysere en 5-(eventuelt substitueret phenyl)hydantoin, fremstilles, at en opløsning af enzymet bringes i kontakt med en positivt ladet eller funktionaliseret polymerbærer i nærværelse af en effektiv 15 mængde af en stabiliserende divalent metalion valgt fra gruppen bestående af Mn++, Co++ og Ni++, hvorved et immobili-seret enzympræparat fremstilles, og at det immobiliserede enzympræparat skilles fra en vandig suspension af dette.
Hydantoinaseenzymet fremstilles fortrinsvis ved gæring af en 20 passende mikroorganisme i et hensigtsmæssigt gæringsmedium. Hensigtsmæssige mikroorganismer og dyrkningsmedier er de, der er velkendte af fagmanden, og eksempler herpå gives i GB 1564982, 1534426 og 1587116.
En foretrukken mikroorganisme er Bacillus brevis IFO 12333, 25 som kan dyrkes i det dyrkningsmedium, der er beskrevet i GB 1587116 eller i tilsvarende medier. Sådanne medier kan med fordel omfatte en enzyminducer såsom hydantoin eller DL-5-methyl-hydantoin og divalent metalioner omfattende Mn++,
Mg++, Co++ og Fe++, som er angivet at stimulere hydantoinase-30 produktion. I en foretrukken fremgangsmåde dyrkes Bacillus brevis i et næringspodningsmedium i en passende periode såsom 44 timer og dyrkes derefter i et gæringsmedium indeholdende det inducerende middel og hensigtsmæssige divalente metalioner ved ca. 25°C, idet en pH på 7 til 8 opretholdes i den 35 tidlige vækstfase. Gæringen er afsluttet efter ca. 44 timer.
DK 170992 B1 8
Cellerne høstes derefter, for eksempel ved centrifugering, og ødelægges derefter ved sonikering eller ved andre for fagmanden kendte teknikker for at frigive hydantoinasen. For delvis at oprense enzymet foretrækkes det at fælde nukleinsyrerne, 5 for eksempel ved tilsætningen af manganosulfat til en koncentration på 20mM. For at fælde de thermolabile proteiner opvarmes enzymet til en temperatur i området 50 til 65°C, fortrinsvis 55 til 60°C, i ca. 30 minutter efterfulgt af afkøling til 4°C. Enzymopløsningen kan derefter centrifugeres 10 for at fjerne celledebris og udfældet nukleinsyre og proteiner. Det foretrækkes, at enzymopløsningen ikke dialyseres før adsorptionen for at bevare den divalente metalion. I dette tilfælde er det ikke nødvendigt at tilføre yderligere divalent metalion til fremstilling af det immobiliserede 15 enzympræparat.
Til fremstilling af det immobiliserede cellefri enzympræparat blandes den delvist oprensede enzymopløsning med polymer-bæreren i nærværelse af hensigtsmæssige divalente metalioner. Enzymladningen skal optimiseres for hver type polymerbærer og 20 er typisk 3 til 7 enheder pr. gram bærer. Blandingen rystes ved ca. 25°C, indtil adsorption har fundet sted, for eksempel ca. 24 timer.
Polymerbæreren forberedes fortrinsvis til adsorption ved at blive vasket i saltopløsning og indstillet til ca. pH 8 til 25 9.
For at krydsbinde det immobiliserede cellefri enzympræparat er det ønskeligt at filtrere præparatet fra adsorptionopløsningen og at behandle den med en opløsning af krydsbindings-midlet ved en pH i området 8 til 9. Det krydsbundne præparat 30 kan derefter vaskes med destilleret vand og yderligere buffer, fortrinsvis indeholdende en hensigtsmæssig divalent metalion, inden fugtig opbevaring i forseglede beholdere, fortrinsvis ved lave temperatur såsom ca. 4°C.
Nogle eksempler er beskrevet i det følgende: DK 170992 B1 EKSEMPEL 1 9
Hydantoinaseenzym blev fremstillet ved bakterielle gæringer på følgende måde. 9 1 gæringsmedium indeholdende følgende komponenter blev fremstillet og indstillet til pH 7,0.
5 Gærekstrakt 200 g KH2P04 10 g K2HP04 10 g (NH4)2S04 50 g
MgS04 5 g 10 FeS04 0,1 g
MnS04 0,1 g
CaCl2 0,8 g
Antiskum 15 g
Mediet blev anbragt i en 12 liters fermentor og autoklaveret 15 i 60 minutter ved 121°C. Opløsninger af 20% (vægt/volumen) glucose og 2% DL 5-methylhydantoin blev steriliseret separat, og 500 ml af hver blev under sterile forhold sat til fermentoren.
Fermentoren blev podet med 300 ml af en podningskultur af 20 Bacillus brevis IFO 12333, der var dyrket på Tryptone Soya Broth i 44 timer ved 25°C. Gæringen blev holdt på 25°C og beluftet med 6 1/min. pH blev kontrolleret og holdt på 7,0 i 24 timer med HC1. Ammoniumhydroxid blev derefter anvendt til at hæve pH til 7,5. Efter 28 timer blev pH hævet til 8,0 og 25 fik derefter lov til at stige frit.
Gæringen fik lov til at fortsætte i 46 timer, hvorefter cellerne blev høstet ved centrifugering. Cellepellet blev resuspenderet i 1,25 1 0,2 M Tris/HCl buffer, pH 8,5. Cellerne blev derefter sonikeret for at frigive hydantoinasen til 30 opløsningen.
Delvis oprensning af enzymet blev udført som følger: nukleinsyrer blev udfældet ved tilsætningen af 20 mM MnS04, enzym- DK 170992 B1 10 opløsningen blev varmebehandlet ved 58°C i 30 minutter og derefter afkølet til 4°C. Efter opbevaring ved 4°C i 18 timer blev præparatet centrifugeret for at fjerne celledebris og udfældede nukleinsyre og proteiner. Præparatet blev analyse-5 ret for at bestemme hydantoinaseaktivitet. En suspension af 1% DL-5-(4-hydroxyphenyl)hydantoin i 0,2 M Tris/HCl buffer, pH 8,5 blev rystet ved 42°C, til mætning indtraf. En aliquot af enzympræparatet blev derefter tilsat, og dannelsen af D(-)N-carbamoyl(4-hydroxyphenyl)glycin blev fulgt ved HPLC.
10 En enhed hydantoinase er defineret som den mængde enzym, der kan omdanne 1 mM DL-5-(4-hydroxyphenyl)hydantoin til D(-)N-carbamoyl-(4-hydroxyphenyl)glycin på 1 time.
EKSEMPEL 2
Prøver af anionbytterharpiks, der var tilvejebragt fra kom-15 mercielle kilder, blev vasket i 1 time i 1 M NaCl og derefter ækvilibreret natten over i 0,2 M Tris HC1 buffer, pH 8,5. De ækvilibrerede harpikser blev isoleret ved filtrering og lagret, indtil de skulle bruges. Det delvist oprensede enzym, der var fremstillet som beskrevet i eksempel 1, blev anvendt 20 i immobiliseringsproceduren. Enzymet fik, ved at blande 10 ml enzymopløsning pr. gram (fugtig vægt) harpiks (3,5 -7,0 enheder/gram harpiks), lov til at adsorbere til harpikserne i 24 timer ved 25°C. Enzymharpikskomplekserne blev frafiltreret og behandlet med 1% glutaraldehyd ved pH 8,5. Efter 1 time 25 blev harpiksprøverne igen filtreret fra og vasket tre gange med destilleret vand. Til slut blev enzymharpikserne vasket med 0,2 M Tris/HCl buffer, pH 8,5 og lagret fugtige i forseglede beholdere ved 4°C.
Hvert enzymharpikskompleks, der var fremstillet på denne 30 måde, blev analyseret for at bestemme dets specifikke aktivitet som beskrevet i eksempel 1. Tabel 1 viser de specifikke aktiviteter, der blev opnået for en række kommercielle ion-bytterharpikser, der var behandlet på denne måde.
DK 170992 B1 11
M 4-J
<U y Φ m t| *i tr· 'tj T1 *-< <s σ> φ m ^ •h 712¾ veinxfæovOfnn
Dj MT;? *·«·»·*- v s s
U 8,5-¾ CSCN^^tNO^fO
m w rr <u JC --------- u 0)
4J
4J
>1 J3 J-t c- C L 0) \ 9 >! B "S in in in η έ1
"d N'n£inmN»HfHvOt},o ro C
C CC C».»-fc«-vv«.».CL O
10 wftaJvOvOtrtininro^f^o e jj ·η O <D <0
£ __________U H Q
&1 (Λ δ Ή id · ft rH J-j IT) Ih ft Φ οι S x δ -η τί & & „,-g t{ « cg4 ^ fe § δ M & « « g ^ · H o ft M $ ft 2j jj 1-1 g Q > 0) ro
rH 3 rH ft Ό I-D
<U -H Q Φ μ ft C _ C C (0 'Q O * Φ ° .5 .5 a a % I S I £2 . 8 •S ^ llIIIIISuSSi} U 3 OOOOOOO·^ ft tn in Φ L· <n ch m cn m ft Q .k ft * 5 1 1 Sr a ϊ O ----------S w u “ yt α )η 3 ή
Φ >, IC
g 3® S .¾
O rH C
rH 4H 0) -H <T3 O
♦H r—I Ih XI
•J -U *0 *0 UVh'JHU
« £ , £ j? ro .2 ft -h 5 *2 El λ £ < G ΌΌ P < 3 in E-ι D. H h O T3 ft 0 x 1 1 ·* s1 g ·§ ^ g poSSSSSS 8 <U -»3 s ? I Π U ^ 5 €
i. £ I-Hc—I4J4J+J.P4JZJ (U H <D
» S 88RS.S.S,RS.fSTJ 2 " δ ®5J_tftftftftft φ q >h ft u S isSsssJs 5^1 *» · ® ----------ΪΈ * *8 8
3 x ° ® · α S
> Φ Φ H
2 a, ft . u a: ft id d !n m η -η <c 3 u <u > ·* æ oj & qj r- m w et ro rH Æ<<m φ · φ ro Φ φ
r'QQOKKtsom ft X w Η G
ni rHvSonHMrHQ fc Airatno) 1 s h g p e s 1 ; k |$ -<H in WWÉ-<HHHfc·* O -C ro Φ Hft υ & ddslillsj 2« iiJ cu φ m 33522SHi-3 ih ίο 4J tn o -u d. x CaB4<i22jQ ΟΉΐη-Η-Ηα)
w Ξ y s S -2 H
o, ft Vj o φ
2 rHtNro'fl-mvor'QD
DK 170992 B1 12 EKSEMPEL 3 440 ml delvist oprenset enzymopløsning (aktivitet = 0,59 enheder/ml) som fremstillet i eksempel 1 blev sat til 40 g Duolite A568 harpiks. Blandingen blev rystet forsigtigt ved 5 25°C i 24 timer for at lade hydantoinasen adsorbere til bæreren. Enzymharpikskomplekset blev derefter udskilt ved filtrering og vasket tre gange med destilleret vand og til slut med 0,2 M Tris/HCl buffer, pH 8,5. Enzymharpiksen blev lagret fugtig i en forseglet beholder ved 4°C. Det immobili-10 serede enzym blev analyseret som beskrevet i eksempel 1, og dets specifikke aktivitet blev fundet at være 3,9 enheder/g.
200 g DL-5-(4-hydroxyphenyl)hydantoin og 0,23 g MnS04 blev sat til 1,8 1 destilleret vand i en beholder udstyret med en kappe. Nitrogengas blev boblet gennem blandingen. Suspensio-15 nen blev rystet, temperaturen holdt på 40°C og pH indstillet til 8,7 med ammoniumhydroxid. Da systemet var ækvilibreret, blev 150 enheder (38,5 g enzymharpikskompleks) hydantoinase tilsat. Reaktionen fik lov til at fortsætte i 24 timer, og pH blev holdt på 8,7 med ammoniumhydroxid under hele processen.
20 Efter 24 timer blev udbyttet af D(-)N-carbamoyl-(4-hydroxy-phenyl)glycin bestemt ved HPLC til at være 97%. Det ved denne proces dannede produkt blev isoleret ved almindelige metoder og fundet at være af høj optisk renhed.
Enzymharpiksen, der blev anvendt i denne proces, blev gen-25 brugt 50 gange ved at dekantere D(-)N-carbamoyl(4-hydroxyphe-nyl)glycinopløsningen i slutningen af reaktionen, idet man sørgede for, at enzymet forblev i en nitrogenatmosfære, og erstatte den med en frisk forudækvilibreret substratsuspension. Under disse enzymharpiksgenbrug gav omdannelsen til 30 D(-)N-carbamoyl(4-hydroxyphenyl)glycin udbytter på 95% eller mere.
EKSEMPEL 4 DK 170992 B1 13
Hydantoinaseenzymet blev også immobiliseret på UOP IPS - 100, en aluminiumoxidbaseret bærer, der er imprægneret med et høj molekylvægts polethylenimin-glutaraldehydkompleks. UOP IPS -5 100 er et kommercielt produkt fra UOP Inc, Des Plaines, Illi nois. 250 ml delvist oprenset enzymopløsning fremstillet som beskrevet i eksempel 1 (aktivitet = 0,23 enheder/ml) blev sat til 7,5 g UOP-bærer. Blandingen blev rystet forsigtigt ved 25°C i 18 timer. Det således dannede enzym-bærerkompleks blev 10 udskilt ved filtrering og blev derefter vasket med destilleret vand efterfulgt af 0,2M Tris/HCl buffer, pH 8,5. Det im-mobiliserede enzym blev analyseret under anvendelse af den i eksempel 1 beskrevne standardmetode og blev fundet at have en specifik aktivitet på 4,68 enheder/g. Det ikke-opløselig-15 gjorte enzym blev lagret fugtig i en forseglet beholder ved 4°C.
EKSEMPEL 5 800 liter hydantoinase-indeholdende celler af Bacillus brevis IFO 12333 blev dyrket under anvendelse af mediet beskrevet i 20 eksempel 1. Induceren, 5-methyl hydantoin, blev steriliseret i mediet, og metalionerne blev opløst i deioniseret vand og sat til mediet lige inden sterilisering. Glucose blev tilsat som en steril 40% (vægt/volumen) opløsning til opnåelse af en slutkoncentration på 1% (vægt/volumen). Mediet blev podet med 25 celler, der var dyrket i 36 timer ved 25°C i 12 rystede kolber, der hver indeholdt 400 ml Tryptone Soya Broth. Gæringen foregik ved 25°C under et tryk på 1,0 bar og en luftstrøm på 0,3 beholdervolumen/minut. pH blev holdt under 7,0 i de første 36 timer, hvorefter pH efter 36 timer og indtil høsten 30 efter 48 timer blev hævet til 7,5. Det endelige celleudbytte var 6,0% med en specifik aktivitet på 1,8 enheder/g.
Cellerne blev høstet under anvendelse af en afvandende centrifuge af typen Westphalia ("Westphalia desludging centrifuge"), og pH af den resulterende celleopslæmning (100 1) blev DK 170992 B1 14 hævet til pH 8,5 med ammoniakopløsning inden homogenisering i en APV Manton-Gaulin (K6) maskine. Homogenatet blev derefter fortyndet til 270 1 med blødgjort vand efterfulgt af tilsætning af MnS04,4H20 til 20 mM, idet pH blev holdt på 8,5-8,6 5 med ammoniakopløsning. Dette blev efterfulgt af varmebehandling ved 60°C i 1 time. Det flokkulerede homogenat blev derefter afkølet til 30°C og klaret ved passage gennem en afvandende centrifuge.
8,2 kg anionbytterharpiks Duolite A568, som var blevet vasket 10 med 1 M NaCl og indstillet til pH 8,5 med NH4OH i løbet af 1 time, blev sat til 130 liter klaret enzymopløsning med en aktivitet på 189 enheder/liter. Adsorption af enzymet til harpiksen fik lov til at foregå i løbet af 20 timer med omrystning, pH blev holdt på 8,5 med NH4OH. Harpiksen blev 15 derefter isoleret ved filtrering og sat til 100 liter 0,2% (vægt/volumen) glutaraldehydopløsning ved pH 8,5. Krydsbindingsprocessen foregik i løbet af 1 time med omrystning. Enzymharpiksen blev derefter isoleret ved filtrering og vasket med 0,05 M Tris/HCl buffer pH 8,5, der indeholdt 1 mM 20 MnS04, i løbet af 30 minutter. Der blev isoleret 8,6 kg enzymharpiks med en specifik aktivitet på 1,7 enheder/g.
EKSEMPEL 6 6,65 kg enzymharpiks med en aktivitet på 1,1 enheder/g, der var fremstillet ifølge metoden beskrevet i eksempel 5, blev 25 anvendt til at hydrolisere 9,75 kg DL-5-(4-hydroxyphenyl)-hydantoin i 65 liter blødgjort vand indeholdende 11 g MnS04. Hydrolysereaktionen blev udført i løbet af 23 timer ved 40°C og pH 9,3-9,5, og N2 blev boblet gennem blandingen for at udelukke ilt. Ved slutningen af reaktionen blev der målt et 30 udbytte af D(-)N-carbamoyl(4-hydroxyphenyl)glycin på 96,4%.
EKSEMPEL 7
Enzymharpiksen i eksempel 6 blev anvendt til at udføre 12 hydrolyser af 10% DL-5-(4-hydroxyphenyl)hydantoin med et
Claims (11)
1. Immobiliseret enzympræparat til brug i fremstillingen af et D(-)(eventuelt substitueret phenyl)glycin eller et N-25 carbamoylderivat deraf ud fra 5-(eventuelt substitueret phenyl)hydantoin, kendetegnet ved, at enzympræparatet omfatter celler eller behandlede celler af en organisme, som producerer et hydantoinaseenzym, der er i stand til at hydrolysere 5-(even-30 tuelt substitueret phenyl)hydantoin, hvilke celler eller behandlede celler er immobiliseret i eller på en hensigtsmæssig bærer, eller et enzym, som stammer fra organismen, og som DK 170992 B1 er adsorberet på en positivt ladet polymerbærer, eller kovalent bundet til en funktionaliseret polymerbærer, sammen med en effektiv mængde af en stabiliserende divalent metalion valgt fra gruppen bestående af Mn++, Co++ og Ni++.
2. Præparat ifølge krav l, kendetegnet ved, at det immobiliserede enzym er cellefrit.
3. Præparat ifølge krav l eller 2, kendetegnet ved, at enzymet er opnået fra en Bacil-10 lusstamme, Pseudomonasstamme eller Mycoplanastamme.
4. Præparat ifølge krav 3, kendetegnet ved, at enzymet er opnået fra Bacillus brevis IFO 12333.
5. Præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 4, 15 kendetegnet ved, at den divalente metalion er Mn++.
6. Præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 5, kendetegnet ved, at enzymet er bundet til bærereren ved krydsbinding.
7. Fremgangsmåde til fremstilling af en D(-)(eventuelt sub-20 stitueret phenyl)glycin eller et N-carbamoyl derivat deraf ved hydrolyse af 5-(eventuelt substitueret phenyl)hydantoin ved hjælp af et hensigtsmæssigt hydantoinaseenzym under udelukkelse af luft, kendetegnet ved, at enzymet er givet i form af et 25 immobiliseret enzympræparat indeholdende celler eller behandlede celler af en organisme, der fremstiller enzymet, hvilke celler eller behandlede celler er immobiliseret i eller på en hensigtsmæssig bærer, eller et enzym, som stammer fra organismen, og som er adsorberet på en positivt ladet polymer-30 bærer eller kovalent bundet til en funktionaliseret polymerbærer, sammen med en effektiv mængde af en stabiliserende DK 170992 B1 divalent metalion valgt fra gruppen bestående af Mn++, Co++ og Ni++.
8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det immobiliserede enzympræ-5 parat er et enzympræparat ifølge et hvilket som helst af kravene 2 til 6.
9. Fremgangsmåde ifølge krav 7 eller krav 8 til fremstilling af D(-)(4-hydroxyphenyl)glycin eller D(-)N-carbamoyl(4-hy-droxyphenyl)glycin.
10. Fremgangsmåde til fremstilling af et immobiliseret enzym præparat til brug i fremstillingen af et D(-)(eventuelt substitueret phenyl)glycin eller et N-carbamoyl derivat deraf, kendetegnet ved, at behandlede eller ubehandlede celler af en organisme, som producerer en hydantoinase, der 15 er i stand til at hydrolysere en 5-(eventuelt substitueret phenyl)hydantoin immobiliseres i eller på en hensigtsmæssig bærer, eller at et enzym, der stammer fra cellerne, bringes i kontakt med en positivt ladet eller funktionaliseret polymerbærer i nærværelse af en effektiv mængde af en stabiliserende 20 divalent metalion valgt fra gruppen bestående af Mn++, Co++ og Ni++.
11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at det immobiliserede enzympræparat er cellefrit, hvilken fremgangsmåde yderligere omfatter, 25 at det immobiliserede enzympræparat skilles fra en vandig suspension af dette.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB868622389A GB8622389D0 (en) | 1986-09-17 | 1986-09-17 | Preparation |
| GB8622389 | 1986-09-17 | ||
| GB8623306 | 1986-09-27 | ||
| GB868623306A GB8623306D0 (en) | 1986-09-27 | 1986-09-27 | Preparation |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK483487D0 DK483487D0 (da) | 1987-09-15 |
| DK483487A DK483487A (da) | 1988-03-18 |
| DK170992B1 true DK170992B1 (da) | 1996-04-15 |
Family
ID=26291302
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK483487A DK170992B1 (da) | 1986-09-17 | 1987-09-15 | Immobiliserede enzymer samt fremstilling og anvendelse heraf |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0261836B1 (da) |
| JP (1) | JPH0779696B2 (da) |
| AU (1) | AU603827B2 (da) |
| CA (1) | CA1298800C (da) |
| DE (1) | DE3786511T2 (da) |
| DK (1) | DK170992B1 (da) |
| ES (1) | ES2058121T3 (da) |
| HK (1) | HK1003230A1 (da) |
| IE (1) | IE60591B1 (da) |
| NZ (1) | NZ221808A (da) |
| PT (1) | PT85718B (da) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5565344A (en) * | 1990-12-07 | 1996-10-15 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Process for production of D-α-amino acids |
| ES2042409B1 (es) * | 1992-04-10 | 1994-06-01 | Control & Gestion Instr | Procedimiento para la preparacion de d-aminoacidos o derivados de d-aminoacidos. |
| JP3996183B2 (ja) * | 1994-06-24 | 2007-10-24 | 株式会社カネカ | 複合固定化酵素調製物を用いたｄ−アミノ酸の製造方法 |
| EP1616945B1 (en) * | 1994-12-28 | 2007-11-21 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Process for producing D-N-carbamoyl-alpha-amino acids |
| US6461858B1 (en) * | 1998-01-26 | 2002-10-08 | Pharm-Eco Laboratories, Inc. | Enzyme activated supports for enantiomeric separations |
| DE10130169A1 (de) * | 2001-06-22 | 2003-01-09 | Degussa | Aktivierte rec-D-Hydantoinasen |
| WO2011003702A1 (en) * | 2009-07-09 | 2011-01-13 | Dsm Ip Assets B.V. | Stabilized enzyme compositions |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH596313A5 (da) * | 1975-05-30 | 1978-03-15 | Battelle Memorial Institute | |
| IT1039757B (it) * | 1975-07-10 | 1979-12-10 | Snam Progetti | Complessi enzimatici atti a trasformare idantoine raceme in am minoacidi otticamente attivi e loro applicazione |
| US4094741A (en) * | 1976-02-04 | 1978-06-13 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Process for preparing D-(-)-N-carbamoyl-2-(phenyl or substituted phenyl)glycines |
| US4211840A (en) * | 1977-06-08 | 1980-07-08 | Ajinomoto Company, Incorporated | Method for producing D-α-amino acid |
| GB2122621B (en) * | 1982-06-25 | 1985-09-25 | Uop Inc | Enhanced immobilization of glucose isomerase |
-
1987
- 1987-09-09 EP EP87307979A patent/EP0261836B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-09-09 DE DE87307979T patent/DE3786511T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-09-09 ES ES87307979T patent/ES2058121T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-09-15 AU AU78432/87A patent/AU603827B2/en not_active Expired
- 1987-09-15 NZ NZ221808A patent/NZ221808A/xx unknown
- 1987-09-15 IE IE249787A patent/IE60591B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-09-15 CA CA000546904A patent/CA1298800C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-09-15 DK DK483487A patent/DK170992B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-09-15 PT PT85718A patent/PT85718B/pt unknown
- 1987-09-16 JP JP62231965A patent/JPH0779696B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-03-19 HK HK98102340A patent/HK1003230A1/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63185382A (ja) | 1988-07-30 |
| PT85718A (en) | 1987-10-01 |
| EP0261836B1 (en) | 1993-07-14 |
| JPH0779696B2 (ja) | 1995-08-30 |
| IE872497L (en) | 1988-03-17 |
| AU7843287A (en) | 1988-03-24 |
| PT85718B (pt) | 1990-08-31 |
| AU603827B2 (en) | 1990-11-29 |
| NZ221808A (en) | 1989-02-24 |
| DE3786511T2 (de) | 1994-01-13 |
| ES2058121T3 (es) | 1994-11-01 |
| EP0261836A1 (en) | 1988-03-30 |
| DK483487A (da) | 1988-03-18 |
| DK483487D0 (da) | 1987-09-15 |
| IE60591B1 (en) | 1994-07-27 |
| CA1298800C (en) | 1992-04-14 |
| DE3786511D1 (de) | 1993-08-19 |
| HK1003230A1 (en) | 1998-10-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5283182A (en) | Preparation of immobilized hydantoinase stabilized with divalent metal ions | |
| SU1512488A3 (ru) | Способ получени амида | |
| WO1986007386A1 (en) | Process for preparing optically active, organic compounds | |
| HU226148B1 (en) | Method for preparing 2-hydroxy 4-methylthio butyric acid using a nitrilase | |
| JPH04504362A (ja) | 酵素による７―アミノセフアロスポラン酸の製造 | |
| DK170992B1 (da) | Immobiliserede enzymer samt fremstilling og anvendelse heraf | |
| US4668625A (en) | Process for preparing peptides | |
| US4758518A (en) | D-2-haloalkanoic acid halidohydrolase | |
| JP3409353B2 (ja) | アミド化合物の製造方法および使用される微生物 | |
| CN1035320A (zh) | 酰基氨基酸外消旋酶，其生产方法及应用 | |
| US6630338B2 (en) | Removing deacetylase contaminant from cephalosporin C acylase using cationic surfactant | |
| HK1003230B (en) | Immobilised enzyme preparation and its use | |
| AU639494B2 (en) | A process for preparing peroxycarboxylic acids using an enzyme catalyst | |
| EP0383403A1 (en) | Process for preparation of organic chemicals | |
| JPWO1996000296A1 (ja) | 複合固定化酵素調製物を用いたｄ−アミノ酸の製造方法 | |
| CN1129957A (zh) | 用复合固相酶制品生产d-氨基酸的方法 | |
| US4492757A (en) | Process for preparing L-threonine | |
| EP0775748B1 (en) | Preparation of D-alpha-amino acids, using bacteria transformed with the carbamoylase-hydantoinase operon | |
| CN101253271A (zh) | 光学活性α-羟基羧酸的制造方法 | |
| Chibata et al. | Applications of immobilized enzymes and immobilized microbial cells for L-amino acid production | |
| EP1057894A2 (en) | Esterase genes and uses of the same | |
| US5723321A (en) | Process for preparing D-lysine | |
| JP3392865B2 (ja) | 固定化酵素調製物およびＤ―α―アミノ酸の製造法 | |
| JPH10286087A (ja) | 固定化生体触媒 | |
| EP0352846B1 (en) | Process for the preparation of biocatalysts with previously absent stereoselective enzyme activity |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PUP | Patent expired |