DK171906B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af proteiner til anvendelse i den farmaceutiske industri og/eller veterinærindustrien ved udvinding fra mælk - Google Patents

Description

DK 171906 B1

Denne opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af proteiner til anvendelse i den farmaceutiske industri og/eller veterinærindustrien ved udvinding fra mælk.

5 Behandlingen af skummetmælk består i almindelighed i først at extrahere caseinet ved syre- eller enzymatisk koagulering, derpå at extrahere mælkeserumproteiner ved termisk koagulering, ultrafiltrering eller ionbytning og til sidst at udskille lactosen, som kan hydrolyseres.

10 Men denne behandling frembyder visse ubekvemme egenskaber. Det fraseparerede casein foreligger i form af et præcipitat, der er delvis nedbrudt, og som kan indeholde andre, medrevne proteiner; de andre proteiner, som er ex-traheret ved termisk koagulering, mister en del af deres 15 biologiske egenskaber, og det samme er tilfældet ved ul-tracentrifugering, idet længden af bearbejdningstiden i almindelighed nødvendiggør en pasteurisering af mælkese-rumet; med hensyn til udskillelse ved ionbytning er det vanskeligt at udføre denne proces industrielt, eftersom 20 de kendte ionbyttere baseret på cellulose eller dextran har dårlige mekaniske egenskaber.

Ionbyttere til fraseparering af proteiner fra serum, som ikke frembyder disse ulemper, er beskrevet i de franske patentansøgninger nr. 7 526 530 af 28. august 1975 og nr.

25 7 622 985 af 28. juli 1076. Caseinet er dog også her i form af præcipitat, delvis nedbrudt og det kan indeholde medrevne proteiner.

Den foreliggende opfindelse angiver en hidtil ukendt fremgangsmåde til fraktionering af mælk, hvorved disse 30 ulemper undgås og det gøres muligt industrielt at fremstille rene proteiner i uomdannet tilstand og i besiddelse af alle deres biologiske egenskaber.

DK 171906 B1 2

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen af den i krav l's indledning beskrevne art er særegen ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

Ved proteiner, der ikke er casein, eller proteiner fra 5 mælkeserum forstår man lactalbuminer, serumalbumin, lac-toglobuliner og immunoglobuliner.

Anionbytterharpikserne er dannet på bærestoffer: aluminiumoxider eller siliciumoxider, som er beklædt med en mængde mindre end 20 mg/m i form af en tværbunden poly-10 merfilm indeholdende eller medførende reaktionsdygtige grupper af typen tertiære aminer eller kvaternære ammoniumsalte med de almene formler:

Θ, , Q

-CH2-N-CH2- eller -CH2-N - (R)^ X

R

15 hvori R, som kan være ens eller forskellig, betyder en alkylgruppe eller hydroxyalkylgruppe med 1-4 carbonato-mer, og X betyder en uorganisk eller organisk anion som f.eks. chlorid, sulfat, nitrat, phosphat, citrat. De er i 20 besiddelse af en ionbytningskapacitet mindre end 2 mækv./g.

Siliciumoxidet og bærestofferne for anionbytterharpikserne har en kornstørrelse på mellem 4 p og 5 mm, en speci-fik overflade i størrelsesordenen fra 5 til 150 m /g, et 25 porevolumen på fra 0,4 til 2 ml/g og en porediameter, der er mindre end størrelsen af caseinet og større end størrelsen af de øvrige proteiner, og som er på mellem 25 og 250 nm.

De tværbundne polymere, som beklæder bærestoffets over-30 flade, består af i sig selv velkendte produkter, som er DK 171906 B1 3 dannet ud fra monomere såsom epoxyforbindelser, der tværbindes med polyaminer som katalysatorer; formaldehyd, som tværbindes ved polykondensation med urinstof, melamin, polyaminer eller phenoler; vinylmonomererne: vinylpyri- 5 din, styren og afledte forbindelser som tværbindes med polyvalente monomere såsom diacrylater eller dimethacry-later af mono- eller polyalkylenglycoler, divinylbenzen, vinyltrialkoxysilan, vinyltrihalogensilan, bis-methylen-acrylamid i nærvær af en starterforbindelse eller ultra-10 violette stråler.

Beklædningen af det uorganiske bærestof med tværbundet polymer opnås ved imprægnering af bærestoffet med en opløsning af den eller de monomere og eventuelt af starterforbindelsen i et opløsningsmiddel, som derpå afdampes, 15 hvorpå de monomere tværbindes ved kendte fremgangsmåder.

Som opløsningsmiddel anvender man ethvert påløsningsmid-delprodukt brugbart for de monomere og starterforbindelsen, hvis kogepunkt fortrinsvis er så lavt som muligt for at gavne dets endelige fordampning. Det drejer sig f.eks.

20 om methylenchlorid, ethylether, benzen, acetone, ethyl-acetat.

I det tilfælde, hvor den på overfladen af bærestoffet tværbundne polymere ikke i sin kæde besidder reaktionsdygtige grupper, er det nødvendigt at modificere den.

25 Dette er særligt tilfældet med tværbundne polymere baseret på styren og styrenderivater, med formaldehydpolymere med urinstof, melamin, polyaminer, phenoler.

Denne modifikation består, når det drejer sig om styren eller phenolformaldehydpolymere, i at fæstne til den po-30 lymere chlormethylgruppe, som man derpå omsætter med en sekundær eller tertiær amin, idet omsætningen sker efter en hvilken som helst kendt fremgangsmåde.

DK 171906 B1 4

Til at fæstne chlormethylgrupperne på den polymere er det fordelagtigt, når det drejer sig om styrenpolymere, at dispergere det med polymer beklædte uorganiske bærestof i chlormethyletheren i varmen i nærvær af en Lewis-syre.

5 Når det omvendt drejer sig om en phenolformaldehydhar-piks, kan man f.eks. dispergere det med polymer beklædte uorganiske bærestof i epichlorhydrin og lade det reagere i varm tilstand.

Denne modifikation består, når det drejer sig om polymere 10 af formaldehyd med polyaminer, urinstof, melamin, i at omdanne de i kæden tilstedeværende primære aminer til tertiære aminer eller salte af kvaternære ammoniumforbindelser ved enhver klassisk teknik f.eks. ved omsætning med et alkylsulfat eller et alkylhalogenat.

15 Kontakten imellem skummetmælken og den eller de anvendte anionbytterharpikser og siliciumoxidet sker uden modifikation af mælkens pH ved temperaturer på mellem 0 og 50 °C fortrinsvis mellem 0 og 15 °C.

Mængden eller mængderne af anionbytterharpikser er i 20 størrelsesordenen fra 5 til 15 g pr. g samlet protein, der skal extraheres, og mængden af siliciumoxid er i størrelsesordenen fra 2 til 7 g pr. g samlet protein, der skal extraheres.

De proteiner, der tilbageholdes af den eller de anvendte 25 anionbytterharpikser, består af β-lactoglobulinerne, a-lactalbuminer, serumalbumin og en lille del immunoglobu-liner. Siliciumoxidet fastholder størstedelen af immu-noglobulinerne.

Adskillelsen af proteiner fra den eller de anvendte har-30 pikser samt fra siliciumoxidet sker ved eluering med enten en opløsning med forhøjet ionstyrke eller med en opløsning med surt pH for anionbytterharpiksernes vedkom- DK 171906 B1 5 mende, basisk for siliciumoxidet. Opløsningen med surt pH er en opløsning af uorganisk eller organisk syre som f.eks. saltsyre, eddikesyre, salpetersyre, svovlsyre, mælkesyre, og opløsningen med basisk pH er en opløsning 5 af alkalihydroxid såsom ammoniak, natriumhydroxid eller kaliumhydroxid.

For at opnå en mere selektiv adskillelse er det muligt at behandle mælken efter hinanden med flere anionbytterhar-pikser, som ligner hinanden, eller som er forskellige, 10 før eller efter behandling med siliciumoxid. I tilfælde af to anionbytterharpikser vil eluatopløsningen fra den første harpiks være meget rig på β-lactoglobuliner, medens eluatopløsningen fra den anden harpiks indeholder oc-lactalbuminerne og serumalbumin og meget små mængder af 15 β-lactoglobuliner og af immunoglobuliner.

Extraktionen af proteiner fra skummetmælk kan udføres med identiske resultater ved diskontinuert, semikontinuert fremgangsmåde i kolonner, eller kontinuert under anvendelse af en serie af kolonner. Den kontinuerte udførelse 20 er særlig egnet til industriel udførelse, idet harpikserne tillader en let påfyldning af kolonnerne, en stor gennemstrømningshastighed og en let eluering.

De dannede proteinopløsninger indeholder ikke mere end spor af lactose og af mineralsalte. De kan anvendes som 25 de er, eller proteinerne kan separeres ved enhver kendt teknik og især ved forstøvningstørring.

Efter extraktion af den eller de anvendte anionbytterharpikser og af siliciumoxidet indeholder den tilbageværende opløsning, som består af casein, af lactose og af mine-30 ralsalte, ikke flere proteiner. Caseinet extraheres ved udelukkelseschromatografi eller særligt ved ultrafiltrering efter enhver kendt fremgangsmåde tillempet dette DK 171906 B1 6 specielle tilfælde. Extraktionen kan udføres diskontinuert eller kontinuert.

Man opnår således en opløsning af nativt casein i vand, hvis koncentration er afhængig af den anvendte ekstrak-5 tionsfremgangsmåde, samt en opløsning af lactose og mineralsalte .

Opløsningen af nativt, ikke-koaguleret casein indeholder kun spor af lactose og kan anvendes, som den er, eller caseinet kan separeres fra opløsningen, især ved forstøv-10 ningstørring.

Ifølge en variant af fremgangsmåden ifølge opfindelsen fraskilles lactosen og mineralsaltene fra skummetmælken, hvorpå proteinerne, der ikke er casein, extraheres ved, at mælken bringes i kontakt med mindst én anionbytterhar-15 piks og derpå med siliciumoxid, eller med siliciumoxid og derpå med mindst én anionbytterharpiks, fiksering af proteinerne efterfulgt af eluering; hvorved caseinet forbliver i opløsning.

Separationen af lactose og af mineralsalte fra skummet-20 mælken opnås ved extraktion, ved udelukkelseschromatogra-fi eller ved ultrafiltrering.

Extraktionen af proteinerne med anionbytterharpiksen eller -harpikserne og siliciumoxidet gennemføres som beskrevet nedenfor. Efter extraktion af proteinerne, der 25 ikke er casein, opnår man en opløsning af uomdannet casein, der ikke er koaguleret.

Ifølge en anden variant kan fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes på mælkeserum, dvs. på skummetmælk, hvorfra caseinet er blevet fjernet. I dette tilfælde bringes 30 mælkeserumet i kontakt med mindst én anionbytterharpiks og derpå med siliciumoxid, eller med siliciumoxid og der- DK 171906 B1 7 på mindst én anionbytterharpiks, fiksering af proteinerne og eluering.

Adskillelsen af mælkeserumproteinerne ved anvendelse af anionbytterharpikser og af kationbytterharpikser er be-5 skrevet i fransk tilægspatentansøgning nr. 7 622 985 af 28. juli 1976. Anvendelsen af siliciumoxid i stedet for en kationbytterharpiks muliggør dog en meget lettere eluering og fører til mere koncentrerede proteinopløsninger.

Som følge heraf er den mængde vand, der skal fjernes ved 10 tørring af proteinerne, mindre, hvoraf følger en kortere behandling, som er mindre skadelig for proteinerne.

Derudover er siliciumoxid et mere enkelt produkt end kationbytterharpikserne.

Extraktionen af mælkeserumproteinerne med en eller flere 15 anionbytterharpikser og med siliciumoxid udføres som beskrevet for mælk, men kontakten mellem mælkeserum og en eller flere anionbytterharpikser og med siliciumoxid foretages ved et pH større end 4 og fortrinsvis mellem 5,5 og 7,5, og ved temperaturer på mellem 0 og 50 °C og 20 fortrinsvis mellem 0 og 30 °C.

Efter extraktion af proteinerne med en eller flere anionbytterharpikser og med siliciumoxid indeholder den tilbageværende opløsning lactose og mineralsalte, men ikke flere proteiner.

25 Uanset oprindelsen kan lactosen i opløsningen hydrolyseres kemisk eller enzymatisk ved enhver kendt fremgangsmåde til dannelse af en opløsning af glucose og galactose.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres i mejeriindustrien til fremstilling af proteiner, herunder casein, 30 som er særligt egnet til anvendelse i den farmaceutiske industri og i veterinærindustrien.

DK 171906 B1 8 I det efterfølgende anføres til belysning eksempler på udførelsesformer for opfindelsen.

EKSEMPEL 1 I en kolonne 1 med 2,5 cm diameter anbringes 20 g anion-5 bytterharpiks bestående af siliciumoxid med kornstørrelse på 100-200 pm, en specifik overflade på 24 m2/g, en mid-delporediameter på 140 nm og et porevolumen på 1 ml/g, som er beklædt med 3,3 mg/m2 af en styren-vinyltriethoxy-silan-copolymer med følgende reaktionsdygtige grupper: 10 ch3 —/> - CH2 - - CH3 Cl CH3

Denne harpiks frembyder følgende kendetegn: - carbonindhold 4,8% 15 - chlorindhold 2 % - nitrogenindhold 0,9% - ionbytterkapacitet 0,6 mækv./g.

I en kolonne 2 med 2,5 cm diameter anbringes 10 g silici-umoxidkorn med en kornstørrelse på 100-200 pm, en speci-20 fik overflade på 25 m2/g, en porediameter på 140 nm og et porevolumen på 1,1 ml/g.

Efter at de to kolonner er blevet anbragt i serie vaskes harpiksen og siliciumoxidet ved at føre 500 ml vand igennem dem.

25 250 ml skummetmælk, som indeholder 7 g casein, 1,6 g an dre proteiner og 12 g lactose, perkoleres først igennem kolonne 1, derpå igennem kolonne 2 med en hastighed på 100 ml/time.

DK 171906 B1 9

Harpiksen og siliciumoxidet i de to kolonner vaskes ved at sende 200 ml vand igennem dem.

Ved at sende en opløsning af 0,01 N saltsyre igennem kolonne 1 elueres de bundne proteiner. Der opnås 33 ml op-5 løsning indeholdende 1,3 g proteiner. Disse proteiner er a-lactalbuminer, β-lactoglobuliner, serumalbumin og en ringe andel af immunoglobuliner.

Ved at sende en opløsning af 1 N ammoniumcarbonat igennem kolonne 2 elueres de bundne proteiner: der opnås 12 ml 10 opløsning indeholdende 0,3 g immunoglobuliner.

De to proteinopløsninger indeholder mindre end 1 vægt-% fedtbestanddele og lactose. Den elektroforetiske bevægelighed af proteinerne er identisk med den, som de havde i mælken. De er derfor ikke blevet denatureret.

15 De fra kolonne 2 kommende opløsninger (mælk + vaskevand), som ikke indeholder andre proteiner end casein, ultrafil-treres. Den tilbageholdte fase indeholder ca. 7 g uomdan-net casein ved en koncentration på 20 vægt-%.

Ultrafiltratet indeholder næsten den samlede mængde lac-20 tose ved en koncentration tæt ved 42 g/1 samt mineralsaltene.

EKSEMPEL 2

Eksempel 1 gentages, idet dog behandlingen af skummetmælken med anionbytterharpiks og siliciumoxid udføres ved 50 25 “C.

De opnåede resultater er identiske med de i eksempel 1 opnåede.

DK 171906 B1 EKSEMPEL 3 10

Man gentager eksempel 1, idet man anbringer før kolonne 1 en kolonne A med 1 can diameter indeholdende 3 g af den samme anionbytterharpiks, som findes i kolonne 1. Ved 5 eluering af kolonne A med en 0,01 N opløsning af saltsyre opnår man 15 ml af en opløsning indeholdende 0,3 g proteiner, som næsten udelukkende består af β-lactoglobuliner.

Eluering af kolonne 1 med en opløsning af 0,01 N saltsyre fører til 33 ml af en opløsning indeholdende 1 g protei-10 ner, som for størstedelen består af a-lactalbuminer og af serumalbumin samt en meget lille del af β-lactoglobuliner og immunoglobuliner.

Eluering af kolonne 2 fører til samme resultater, som er anført for eksempel 1.

15 EKSEMPEL 4 I en kolonne 1 med 2,5 cm diameter anbringes 10 g silici-umoxidkorn med en kornstørrelse på 100-200 pm, en specifik overflade på 25 m2/g, en porestørrelse på 140 nm og et porevolumen på 1,1 ml/g.

20 I en kolonne 2 med 2,5 cm diameter anbringes 15 g af en anionbytterharpiks, som består af siliciumoxid med en kornstørrelse på fra 100 til 200 pm, en specifik overflade på 24 m2/g, en middelporediameter på 140 nm og et porevolumen på 140 nm og et porevolumen på 1 ml/g, som er 25 beklædt med 6 mg/m2 af en styren-vinyl triethoxysilan-copolymer, som har følgende reaktionsdygtige grupper: ^/C2H5 -yj-c'· - \ c2h5 DK 171906 B1 11 og som har følgende karakteristika: - carbonindhold 7,5% - nirogenindhold 1,5% - ionbytterkapacitet 1,07 mækv./g.

5 Efter at de to kolonner er blevet anbragt i serie vaskes siliciumoxidet og harpiksen ved at man fører 500 ml vand igennem dem. 250 ml skummetmælk, som indeholder 7 g casein, 1,6 g andre proteiner og 12 g lactose, perkoleres med en hastighed på 100 ml/time først igennem kolonne 1, der-10 efter igennem kolonne 2.

Siliciumoxidet og harpiksen i de to kolonner vaskes derpå ved at man hælder 200 ml vand igennem dem.

Ved at hælde en opløsning af 0,01 N ammoniak igennem kolonne 1 elueres de bundne proteiner. Man opnår 12 ml op-15 løsning indeholdende 0,4 g immunoglobuliner, dvs. størstedelen.

Ved at føre en opløsning af 0,01 N saltsyreopløsning igennem kolonne 2 elueres de bundne proteiner: a-lactal-buminer, β-lactoglobuliner, serumalbumin og spor af immu-20 noglobuliner. Der opnås 23 ml opløsning indeholdende 1,2 af disse proteiner.

De to proteinopløsninger indeholder mindre end 1 vægt-% lactose. Den elektroforetiske bevægelse af proteinerne er identisk med den, som de havde i mælk. De er således ikke 25 blevet denatureret.

Den fra kolonne 2 kommende opløsning ca. 260 ml, som ikke indeholder andre proteiner end casein, perkoleres gennem kolonne 3 til adskillelse af caseinet ved udelukkel-seschromatografi. Denne kolonne med 3 cm diameter inde-30 holder 450 g siliciumoxid med en kornstørrelse på fra 100 til 200 pm, en specifik overflade på 400 m2/g, en middel- DK 171906 B1 12 porediameter på 8 nm og et porevolumen på 1 ml/g, og den elueres med vand.

Der opnås 330 ml af en opløsning indeholdende omtrent den samlede mængde uomdannnet casein, og en opløsning inde-5 holdende lactosen og mineralsaltene.

EKSEMPEL 5 I en kolonne 1 med 2,5 diameter anbringes 15 g af den samme anionbytterharpiks, som blev anbragt i kolonne 2 i eksempel 4.

10 I kolonne 2 med 2,5 cm diameter anbringes 10 g silicium-oxidkorn med en kornstørrelse på 100-200 pm, en specifik overflade på 50 m2/g, en porediameter på 80 nm og et porevolumen på 1,1 ml/g.

Efter at de to kolonner er anbragt i serie, vaskes har-15 piksen og siliciumoxidet ved at føre 500 ml vand igennem dem.

300 ml mælkeserum med pH 6,5, som indeholder 1,5 g proteiner og 11 g lactose, perkoleres ved stuetemperatur først igennem kolonne 1 og derpå igennem kolonne 2 med en has-20 tighed på 400 ml/time.

Harpiksen og siliciumoxidet i de to kolonner vaskes ved at føre 200 ml vand igennem dem.

Ved at føre en 0,01 N opløsning af saltsyre igennem kolonne 1 elueres de bundne proteiner. Der opnås 33 ml op-25 løsning indeholdende 1,25 g proteiner. Disse proteiner er a-lactalbuminer, β-lactoglobuliner, serumalbumin og en lille andel immunoglobuliner.

Ved at føre en 0,01 N opløsning af ammoniak igennem kolonne 2 elueres de bundne proteiner. Der opnås 10 ml op DK 171906 B1 13 løsning indeholdende 0,25 g proteiner, som næsten udelukkende består af immunoglobuliner.

De to proteinopløsninger indeholder mindre end 1 vægt-% fedtstof og lactose. Proteinernes elektroforetiske bevæ-5 gelse er identisk med den, som de havde i mælkeserumet.

De er således ikke blevet denatureret.

EKSEMPEL 6

Eksempel 5 gentages, idet dog behandlingen af serum med anionbytterharpiks og siliciumoxid foretages ved 50 °C.

10 De opnåede resultater er identiske med de i eksempel 5 opnåede.

EKSEMPEL.-7

Man gentager eksempel 5, idet man dog før kolonne 1 anbringer en kolonne A med 1 cm diameter, som indeholder 3 15 g af den samme anionbytterharpiks, som er placeret i kolonne 1. Ved eluering af kolonne A med en 0,01 N opløsning af saltsyre opnår man 15 ml af en opløsning indeholdende 0,3 g proteiner, som næsten udelukkende består af β-lactoglobuliner.

20 Eluering af kolonne 1 med en 0,01 N opløsning af saltsyre fører til 33 ml af en opløsning indeholdende 0,95 g proteiner, som for størstedelen består af a-lactalbuminer og af serumalbumin samt en meget lille andel af β-lactoglobuliner og immunoglobuliner.

25 Eluering af kolonne 2 fører til de samme resultater, som opnået i eksempel 5.

EKSEMPEL 8 DK 171906 B1 14 I en kolonne 1 med 2,5 cm diameter anbringes 10 g silici-umoxidkorn, der har en kornstørrelse på 100-200 μιη, en specifik overflade på 25 m2/g, en porediameter på 140 run 5 og et porevolumen på 1,1 ml/g.

I en kolonne 2 med 2,5 cm diameter anbringes 20 g af den samme anionbytterharpiks, som er anvendt i kolonne 1 i eksempel 1.

Efter at de to kolonner er anbragt i serie vaskes silici-10 umoxidet og harpiksen ved at føre 500 ml vand igennem dem.

300 ml mælkeserum med pH 6,5, som indeholder 1,5 g proteiner og 11 g lactose, perkoleres ved stuetemperatur med en hastighed på 600 ml/time først igennem kolonne 1 og 15 derpå igennem kolonne 2.

Siliciumoxidet og harpiksen i de to kolonner vaskes derpå ved at man fører 200 ml vand igennem.

Ved at føre en 0,01 N opløsning af ammoniak igennem kolonne 1 elueres de bundne proteiner. Der opnås 12 ml op-20 løsning, som indeholder 0,4 g immunoglobuliner, dvs. størstedelen.

Ved at føre en n/10 opløsning af svovlsyre igennem kolonne 2 elueres de bundne proteiner: α-lactalbuminer, β- lactolglobuliner, serumalbumin og spor af immunoglobulin; 25 der opnås 20 ml opløsning indeholdende 1,1 g af disse proteiner.

De to proteinopløsninger indeholder mindre end 1 vægt-% lactose. Proteinernes elektroforetiske bevægelse er identisk med den, som de havde i mælkeserumet. De er således 30 ikke blevet denatureret.

EKSEMPEL 9 DK 171906 B1 15 I en kolonne 1 med 2,5 cm diameter anbringes 20 g af den samme anionbytterharpiks, som er anbragt i kolonne 1 i eksempel 1.

5 I en kolonne 2 med 2,5 cm diameter anbringes 10 g silici-umoxidkorn, der har en kornstørrelse på 100-200 pm, en specifik overflade på 25 m2/g, en porediamter på 140 nm og et porevolumen på 1,1 ml/g.

Efter at de to kolonner er anbragt i serie vaskes harpik-10 sen og siliciumoxidet ved at man fører 500 ml vand igennem dem.

500 ml mælkeserum justeret til pH 7,5 ved tilsætning af 0,1 N natriumhydroxid, og som er filtreret til fjernelse af uopløselige bestanddele, og som indeholder 2,5 g pro-15 teiner og 18 g lactose, perkoleres ved stuetemperatur først igennem kolonne 1 og derpå igennem kolonne 2 med en hastighed på 300 ml/time.

Harpiksen og siliciumoxidet i de to kolonner vaskes ved at man fører 100 ml vand igennem dem.

20 Ved at føre en 0,01 N opløsning af saltsyre igennem kolonne 1 elueres de bundne proteiner. Der opnås 35 ml opløsning indeholdende 2,05 g proteiner. Disse proteiner er a-lactalbuminer, β-lactoglobuliner, serumalbumin, og en lille andel inununoglobuliner.

25 Ved at føre en molær opløsning af ammoniumcarbonat igennem kolonne 2 elueres de bundne proteiner: der opnås 12 ml opløsning indeholdende 0,45 g proteiner, som næsten udelukkende består af inununoglobuliner.

Til sammenligning gentager man dette eksempel, idet man i 30 stedet for de 10 g siliciumoxid i kolonne 2 anvender 10 DK 171906 B1 16 gaf kationbytterharpiks, som består af et siliciumoxid, der har en kornstørrelse på 100-200 pm, en specifik overflade på 25 m2/g, en middelporediameter på 140 run og et porevolumen på 1,1 ml/g, og er beklædt med 7,2 mg/m2 af 5 en acrylsyre-diethylenglycoldimethacrylat-copolymer, som bærer funktionelle COOH-grupper.

Denne harpiks udviser følgende karakteristika: - carbonindhold 10,55% - ionbytterkapacitet 1,05 mækv./g.

10 Ved eluering af den første kolonne opnår man samme resultater som i eksempel 5.

Ved eluering af den anden kolonne opnår man 17 ml af en opløsning, som indeholder 0,45 g proteiner, der næsten udelukkende består af immunoglobuliner.

15 Man konstaterer, at anvendelsen af siliciumoxid, der er et meget mere enkelt materiale end kationbytterharpiks, muliggør dannelse af en mere koncentreret opløsning af immunoglobulinerne: - med ionbytterharpiks: 2,65 g/100 ml 20 - med siliciumoxid: 3,75 g/100 ml, dvs. 41,5% mere protein

Claims (6)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af proteiner til anvendelse i den farmaceutiske industri og/eller veterinærindustrien ved udvinding fra mælk, kendetegnet 5 ved, at man først extraherer de proteiner, der ikke er casein, idet man i vilkårlig rækkefølge bringer skummetmælk i berøring med mindst én anionbytterharpiks og med siliciumoxid med en kornstørrelse på 4 pm - 5 mm, en specifik overflade på 5-15 m1/g, et porevolumen på 0,4-2 10 ml/g og en porediameter på 25-250 run, fixerer proteinerne og eluerer disse og derpå fraseparerer det i den flydende fase tilbageblevne casein fra de uorganiske salte og lac-tosen, hvorved anionbytterharpiksen udviser en ionbytningskapacitet på mindre end 2 mækv./g og består af alu-15 miniumoxid eller siliciumoxid med en kornstørrelse på 4 pm-5 mm, en specifik overflade på 5-150 m1/g, et porevolumen på 0,4-2 ml/g og en porediameter på 25-250 run, og er beklædt med mindre end 20 mg/m1 af en film af et tværbundet polymerisat, som er bærer af funktionelle tertiære 20 aminogrupper eller kvaternære ammoniumsaltgrupper med de almene formler: -CH2-N-CH2- eller -OL.-N -(R), X^> R ^ hvori R, som kan være ens eller forskellige, betegner en 25 Ci-C« alkylgruppe eller hydroxyalkylgruppe, og X er en organisk eller uorganisk anion. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man bringer skummetmælken i kontakt med anionbytterharpiksen og siliciumoxidet ved en temperatur på 0- 30 50 “C. DK 171906 Bl

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at man pr. g protein, der skal ex tr aher es, anvender 5-15 g anionbytterharpiks og 2-7 g siliciumoxid.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 5 1-3, kendetegnet ved, at man eluerer de af ionbytterharpikserne og siliciumoxidet fastholdte proteiner enten med en opløsning med høj ionstyrke eller med en opløsning med sur pH-værdi, når det drejer sig om anionbytterharpiks, eller med en opløsning med basisk pH-10 værdi, når det drejer sig om siliciumoxid.

5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved, at man efter extraktio-nen af proteiner, som ikke er casein, extraherer uomdan-net casein ved hjælp af udelukkelseschromatografi eller 15 ultrafiltrering.

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved, at man gennemfører ex-traktionen af proteiner, der ikke er casein, fra skummetmælk, der ved ultrafiltrering eller udelukkelseschromato- 20 grafi er befriet for lactose såvel som uorganiske salte.

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved, at man gennemfører ex-traktionen af proteiner, der ikke er casein, fra mælkeserum med en pH-værdi større end 4.