DK172013B1

DK172013B1 - DNA, vektor indeholdende dette DNA, vært transformeret med vektoren,polypeptid indeholdt i DNA'et og salt deraf, aggregat indeholdende polypeptidet samt pharmaceutisk sammensætning indeholdende polypeptidet eller aggregatet.

Info

Publication number: DK172013B1
Application number: DK100985A
Authority: DK
Inventors: Masaaki Yamada; Yasuji Furutani; Mitsue Notake; Juniti Yamagishi
Original assignee: Dainippon Pharmaceutical Co
Priority date: 1984-03-06
Filing date: 1985-03-05
Publication date: 1997-09-15
Also published as: DE19975063I2; DK100985D0; HUT37957A; ES540939A0; AU3944885A; DK100985A; FR99C0037I2; ES550939A0; PH22108A; AU584608B2; ES8703490A1; HU202921B; FR99C0037I1; ES8802159A1; EP0155549B1; NL990034I1; CA1341240C; DE19975063I1; KR850006874A; EP0155549A2

Description

DK 172013 B1

Den foreliggende opfindelse angår et DNA, der er ejendommeligt ved det i krav l's kendetegnende del angivne, og opfindelsen angår specielt et DNA som defineret i de uselvstændige krav 2-10.

5 Opfindelsen angår også en vektor, der er ejendommelig ved, at den har et DNA ifølge et hvilket som helst af kravene 1-8 eller 9-10 indsat, idet vektoren fortrinsvis er en ekspressionsvektor .

Endvidere angår opfindelsen en vært, der er ejendomme-10 lig ved, at den er transformeret med en vektor ifølge opfindelsen, og opfindelsen angår desuden et polypeptid som defineret i krav 14 og i de uselvstændige krav 15-21. Opfindelsen angår endelig også et pharmaceutisk acceptabelt salt som defineret i krav 22, et aggregat som defineret i krav 23 15 samt en pharmaceutisk sammensætning som defineret i krav 24, hvilken sammensætning kan anvendes som anti-tumormidde1.

Carswell et al. har fundet, at sera af mus inficeret med bacillus Calmette-Guérin (BCG) og derpå behandlet med endotoxin indeholder et stof, som nekroti-20 serer transplanteret Meth-A-sarcom, og har kaldt det tumornekrosefaktor (herefter omtalt som TNF) [Proc. Nat.

Acad. Sci. USA J72, 3666 (1975)].

TNF anses for at være et fysiologisk aktivt stof, der frigøres fra makrofager og er kendt ved at 25 være karakteriseret ved, at (i) når det indgives til dyr med en bestemt slags tumor (f.eks. Meth-A-sarcom), fremkalder det nekrose i tumoren og helbreder dyrene, (ii) det har en cytotoksisk virkning in vitro på en bestemt slags tu-30 morceller (såsom muse-L-celler), men har næsten ingen skadelig virkning på normale celler, og (iii) dets aktivitet er ikke dyreartsspecifik.

35 0 DK 172013 B1 2 På grund af disse karakteristika har der været et stærkt Ønske om at udvikle TNF som en ny type antitu-mormiddel.

TNF eller et TNF-lignende stof er blevet an-5 ført i nedenstående litteraturhenvisninger eller offentliggjort i følgende patentskrifter:

Green et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 73, 381 (1976).

Matthews et al., Br. J. Cancer, 42, 416 (1980) .

-,0 Ruff et al., J. Immunol., 125, 1671 (1980).

Månnel et al.. Infect. Immunity, 28, 204 (1980) .

Haranaka et al., Japan. J. Exp. Med. 51, 191 (1981) .

EP patentskrift nr. 90892.

15 EP patentskrift nr. 86475.

JP patentskrift nr. 21621/1983.

De fremgangsmåder, der er omhandlet i disse dokumenter, er karakteristiske ved, at de omfatter rensning af TNF fra kropsvæsker (f.eks. blod) eller væv fra kani-20 ner, mus, hamstere eller marsvin som råmaterialer. Produkterne er imidlertid ikke så klart definerede, og det er tydeligt, at der findes forskellige begrænsninger for disse fremgangsmåder med hensyn til levering af råmaterialer og slutprodukternes renhed.

25 Til klinisk anvendelse som et potent antitumor middel, er TNF, der stammer fra mennesker, ønskeligt ud fra sin immunogenicitet. De ovenfor beskrevne fremgangsmåder kan imidlertid ikke anvendes til produktion af human TNF.

30 Følgende er hidtil blevet rapporteret vedrø rende et antitumorcytotoksin, der stammer fra mennesker: cytotoksiner produceres ud fra humane perifere monocyter og humane myelocytiske monocytiske leukæmiceller (Matthews, Immunology £4, 135 (1981)] ud fra adhærente cel-35 ler i humane perifere blodceller [Reed et al., J. Immunol.

115, 395 (1975)] og ud fra humane B-cellelinier [William- 0 3 DK 172013 B1 sonet al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 8Ό, 5397 (1983)].

Disse stoffer har cytotoksisk aktivitet, men er heller ikke tydeligt definerede.

Den foreliggende opfindelse er baseret på for-5 skellige undersøgelser, hvor der er anvendt rekombinant DNA-teknologi. Disse undersøgelser har ført til en heldig kloning af cDNA, der koder for humant TNF-polypeptid.

Under disse undersøgelser har det også vist sig, at den humane TNF-cDNA koder for precursorpolypeptidet. Endvi-10 dere er det lykkedes at producere humant TNF-polypeptid i en vært transformeret med en ekspressionsvektor, hvori det klonede human-TNF cDNA er indsat, og at rense det humane TNF-polypeptid til homogenitet.

For at forenkle beskrivelsen anvendes følgende 15 forkortelser i beskrivelse og krav: A: adenin C: cytosin G: guanin T: thymin 20 Ala: alanin

Arg: arginin

Asn: asparagin

Asp: asparaginsyre

Cys: cystein 25 Gin: glutamin

Glu: glutaminsyre

Gly: glycin

His: histidin

Ile: isoleucin 30 Leu: leucin

Lys: lysin

Met: methionin

Phe: phenylalanin

Pro: prolin 35 Ser: serin

Thr: threonin 0 DK 172013 B1 4

Trp: tryptophan

Tyr: tyrosin

Val: valin DNA: desoxyribonucleinsyre

5 cDNA: komplementært DNA

sscDNA: enkeItstrenget cDNA

dscDNA: dobbeltstrenget cDNA

RNA: ribonucleinsyre

mRNA: meddeler RNA

10 poly(A)mRNA: poly(A)-holdigt mRNA

dATP: desoxyadenosintriphosphat dCTP: desoxycytidintriphosphat dGTP: desoxyguanosintriphosphat dTTP: desoxythymidintriphosphat 15 oligo(dC): oligodesoxycytidylsyre oligo(dG): oligodesoxyguanylsyre oligo(dT): oligodesoxythymidylsyre poly(A): polyadenylsyre poly(U) polyuridylsyre 20 poly(dC): polydesoxycytidylsyre poly(dG): polydesoxyguanylsyre ATP: adenosintriphosphat EDTA: ethylendiamintetraeddikesyre kb: kilobaser 25 kbp: kilobasepar bp: basepar

Meth-A-sarcom: methylcholanthren-fremkaldt sarcom TNF: tumornekrosefaktor

30 rHu-TNF: rekombinant human-TNF

I den foreliggende beskrivelse er den basesekvens, der vises ved en enkelt streng, basesekvensen i en retningsstreng, og den venstre ende er en 5'-endestilling og den højre ende en 3'-endestilling. I aminosyresekven-35 Sen er den venstre ende en N-endestilling og den højre ende en C-endestilling.

0 5 DK 172013 B1

Nedenfor følger en detaljeret beskrivelse af den foreliggende opfindelse sammen med en redegørelse for baggrunden, der førte til den foreliggende opfindelse .

5 [IJ-I]_|DNA, der koder for kanin-TNF og kanin-TNF'et

Den foreliggende opfindelse er baseret på forskellige undersøgelser under en vis hensyntagen til anvendelsen af rekombinant DNA-teknologi, og' det er derpå lykkedes at klone cDNA , der koder for kanin-TNF, og at finde 10 ud af, hvad kanin-TNF'en er. Mere specifikt dyrkes kaninmakrofager in vitro sammen med passende induktorer, og det konstateres, at der produceres kanin-TNF, som frigøres i dyrkningsmediet. Så finder man frem til de dyrkningsbetingelser, som får kanin-TNF mRNA til at blive pro-15 duceret og akkumuleret i høje koncentrationer i makrofagerne. Endvidere er det lykkedes at klone cDNA'er, der koder for kanin-TNF, og bestemme disses basesekvens, og tillige har det vist sig at kanin-TNF'en dannes som en precursor. Yderligere er det lykkedes at producere kanin-TNF'en 20 i en vært, der er transformeret med en ekspressionsvek-tor, hvori det klonede cDNA er indsat.

Enkeltheder vedrørende ovennævnte cDNA, der indkoder kanin-TNF'en og kanin-TNF'en er beskrevet f. eks. i EP patentansøgning nr. 84114325.8. Hovedpunkterne 25 heri beskrives kort nedenfor.

Et typisk DNA, der indkoder modent kanin-TNF, er repræsenteret ved basesekvensen 30 35 0 DK 172013 B1 6

(5')-TCA GCT TCT CGG GCC CTG AGT GAC AAG COT CTA GCC CAC GTA GTA GCA AAC CCG CAA

GTG GAG GGC CAG CTC CAG TGG CTG AGC CAG

CGT GCG AAC GCC CTG CTG GCC AAC GGC ATG

5 AAG CTC ACG GAC AAC CAG CTG GTG GTG CCG

GCC GAC GGG CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG

GTT CTC TTC AGC GGT CAA GGC TGC CGC TCC

TAC GTG CTC CTC ACT CAC ACT GTC AGC CGC

TTC GCC GTC TCC TAC CCG AAC AAG GTC AAC

10 CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAC

CGG GAG ACC CCC GAG GAG GCT GAG CCC ATG

GCC TGG TAC GAG CCC ATC TAC CTG GGC GGC

GTC TTC CAG TTG GAG AAG GGT GAC CGG CTC

AGC ACC GAG GTC AAC CAG CCT GAG TAC CTG

15 GAC CTT GCC GAG TCC GGG CAG GTC TAC TTT

GGG ATC ATT GCC CTG-(3')

Formel 1-1 20 DtfA'et med en basesekvens med ovenstående for mel 1-1 koder for et polypeptid med formlen

Ser Ala Ser Arg Ala Leu Ser Asp Lys Pro

Leu Ala His Val Val Ala Asn Pro Gin Val

Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Ser Gin Arg 25 Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Met Lys

Leu Thr Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ala

Asp Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Val

Leu Phe Ser Gly Gin Gly Cys Arg Ser Tyr

Val Leu Leu Thr His Thr Val Ser Arg Phe 30 Ala Val Ser Tyr Pro Asn Lys Val Asn Leu

Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys His Arg

Glu Thr Pro Glu Glu Ala Glu Pro Met Ala

Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val

Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser

Thr Glu Val Asn Gin Pro Glu Tyr Leu Asp

JO

Leu Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

Formel, 1^2 0 7 DK 172013 B1

Et DNA, der koder for en kanin-TNF, koder for en precursor for kanin-TNF'en., og et typisk DNA, der koder for kanin-TNF-precursoren, er gengivet ved formlen

5 (5')-AGC ACT GAG AGT ATG ATC CGG GAC GTC

GAG CTG GCG GAG GGG CCG CTC CCC AAG AAG GCA GGG GGG CCC CAG GGC TCC AAG CGC TGC CTC TGC CTC AGC CTC TTC TCT TTC CTG CTC GTG GCT GGA GCC ACC ACG CTC TTC TGC CTG 10 CTG CAC TTC AGG GTG ATC GGC CCT CAG GAG

GAA GAG CAG TCC CCA AAC AAC CTC CAT CTA GTC AAC CCT GTG GCC CAG ATG GTC ACC CTC AGA TCA GCT TCT CGG GCC CTG AGT GAC AAG CCT CTA GCC CAC GTA GTA GCA AAC CCG CAA 15 GTG GAG GGC CAG CTC CAG TGG CTG AGC CAG

CGT GCG AAC GCC CTG CTG GCC AAC GGC ATG AAG CTC ACG GAC AAC CAG CTG GTG GTG CCG GCC GAC GGG CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTT CTC TTC AGC GGT CAA GGC TGC CGC TCC 20 TAC GTG CTC CTC ACT CAC ACT GTC AGC CGC

TTC GCC GTC TCC TAC CCG AAC AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAC CGG GAG ACC CCC GAG GAG GCT GAG CCC ATG GCC TGG TAC GAG CCC ATC TAC CTG GGC GGC 25 GTC TTC CAG TTG GAG AAG GGT GAC CGG CTC

AGC ACC GAG GTC AAC CAG CCT GAG TAC CTG GAC CTT GCC GAG TCC GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTG-(3') 30 Formel 2-1 eller et DNA, der fremkommer ved at tilføje ARG til 5'--ende stillingen.

DNA1 et med basesekvensen i formel 2-1 koder for 35 et polypeptid med formlen 0 DK 172013 B1 8

Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu

Leu Ala Glu Gly Pro Leu Pro Lys Lys Ala

Gly Gly Pro Gin Gly Ser Lys Arg Cys Leu

Cys Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Leu Val 5 Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe Cys Leu Leu

His Phe Arg Val Ile Gly Pro Gin Glu Glu

Glu Gin Ser Pro Asn Asn Leu His Leu Val

Asn Pro Val Ala Gin Met Val Thr Leu Arg

Ser Ala Ser Arg Ala Leu Ser Asp Lys Pro 10 Leu Ala His Val Val Ala Asn Pro Gin Val

Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Ser Gin Arg

Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Met Lys

Leu Thr Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ala

Asp Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Val 15 Leu Phe Ser Gly Gin Gly Cys Arg Ser Tyr

Val Leu Leu Thr His Thr Val Ser Arg Phe

Ala Val Ser Tyr Pro Asn Lys Val Asn Leu

Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys His Arg

Glu Thr Pro Glu Glu Ala Glu Pro Met Ala 20 Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val

Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser

Thr Glu Val Asn Gin Pro Glu Tyr Leu Asp

Leu Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly

Ile Ile Ala Leu ..... [2-2] 25

Formel 2-2

Et polypeptid med aminosyresekvensen med formlen 1-2, som er den modne kanin-TNF, er ikke artsspeci-30 fik og er anvendeligt som antitumormiddel, fordi det har selektiv cyctotoksisk virkning på tumorceller og reducerer tumorer hos tumorbærende dyr.

Formel 3 viser basesekvensen for ét eksempel på cDNA, hvor kanin-TNF'en er indkodet. Basesekvensen 35 med formlen 2-1 svarer til basesekvensen fra 37.-738. base i formel 3. Imidlertid er de første 15 baser en DK 172013 B1 9 u o _ o o o o o o -o o cm-oo oo-υ u *· -Ej 2 o-oo «·υο -p o £ so 2 E-· <H OO «Η ου Μ 2 H m 2 E-t f» OO nr Ej 2 tj

oo o o h < oo ου 2 e< oo S

oo oo/ oo oo eh 2 OP ρυ o O «ίΤΓΓΤΓ e* 2 oo h < tj oo 2eh m £2 oo 2E· oo o o s

OO OO 4) OO OO OO OO OO tH

Eh < oo <β Eh 2 <h Eh 2 P O Ej 2 ^ 2 H E· 2 S OO 2 Eh OO eh 2 oo oo o oo o oo o op o oo o oo o oo O -E-· 2 »H -O O r^-op n-«£ H <Λ-0 0 sn-<t« *h-2Eh

in 2 E-< -i o O r-i<h m 2 E· μ O O n OO nr O O

E-J 2 oo OO 2Eh M otr oo oo OO 2 E· op OO * OO Eh 2 2 Eh 2 E· O O 2 H o o > o o o o 2 Eh oo oo oo oo < E;i2 op op

2 Eh OO OO OO O O 2 En 2 H

o o O O O O EH 2 EH 2 O O O O

Eh 2 O O 2 Eh O O §h 2 O O O O

OO o oo o OO O 2 H o oo o oo o op O -2 Eh O-OO so-ου N-OO oo-o O ^»-OO ®-2Eh

ir O O r-H O O -H E· 2 Μ O O ΓΗ 2 Eh ro OO 'i* O O

OO OO OO 2 eh OO 2 Eh Eh 2

M 2 Eh OO OO OO Eh 2 OO OO

^ M OO 2 Eh OO 2 Eh 2 Eh po O O

00 0> Eh 2 OO Eh 2 2 En O O Eh 2 2 Eh «» < Eh OO OO OO 2 Eh OO 2Eh t) a\UU OO OO OO OO 2 Eh oo -*© o 2 Eh Eh 2 2 Eh Eh 2 2Ih Ej 2 ε OO 2 Eh O OO O OO o OO O OO O 2 E·

% 0-00 o-OO ΙΛ-ΟΟ r-1-OO r»-00 ro-o O os-OO

P ro O O os ·< Eh h E<< cm 2 Eh N UO ro O O roOO

fe 2 Eh 2 Eh OO OO 2 Eh OO OO

OO OO OO EH < pp op op 2 eh OO eh 2 OO Eh 2 2 Eh OO OO EH 2 OO OO 2 Eh 2 Eh

2 Eh OO Eh 2 OO p O 2 Eh OO

OO Eh 2 OO OO Eh2 OO OO

OO OO Eh 2 OO 2 Eh OO OO

Em 2 OO O OO O po O OO O 2 Ej o po o-OO 0-00 <*-Em 2 o-Eh< so - 2 Eh cn - Eh 2 oo-Eh 2

<M Eh 2 00 OO Ή Eh 2 CH < Eh cm OO r*t OO ro OO

OO OO OO PO OO 2 Eh po OO OO Eh 2 Η 2 OO Eh 2 Em 2

OO OO OO OO OO OO OO

oo oo oo oo po OO OO

OO 2 eh OO OO Eh 2 2 Eh Op

OO OO 2 Eh 2 Eh OO OO OO

OO OO PO OO Eh 2 OO Op OO OO o Eh 2 o Eh 2 O OO O OO o 2 Eh o-OO o-OO ro -O O os-H 2 m-OO H-OO f" -2 Eh rH oo r- po *-H OO rH O O CM O P ro 2 Eh ro oo

OO Eh 2 PO 2 Eh 2Eh Eh 2 OO

OO OP Eh 2 OO 2 Em OO OO

OO OO Op pO OO Η 2 Eh 2

OO 2 Eh Eh 2 Eh 2 Eh 2 OO OO

OO OO OO OO oo op OO

OO OO OO PO 2 Eh OO OO

OO Eh 2 OO Ih 2 Eh 2 2 Eh 2 Eh

OO OO E· 2 OO OO 2 Eh OO

DK 172013 B1 10

O O O O O O

oo-u u *·-υο ο-υο w*ou <m -υ o «ο-υο ^ »o m η < no υο no ου < H r* ου υ ο ου υο υο ε· < <t* υο ου ου υρ υρ υο ου < η < εη <£< η < υο ft< ου ου ου υο υρ υρ εη< **< ρυ υρ ρυ < £ υο ρυ < εη <ε· Ου 2 £ ρυ ρυ υρ υρ ο < η ο ου ο ου ο ου ο ου ο υρ ι»·2ε· Μ-υ ρ on-<eh m -«c ε< Η·ου η*-υο «ο υο m υρ m ου no 2 Εη r- ου ι- Εη < εη < υ ο ο υ/ ου υρ υ ρ ρυ < t· < ρν μ < ρ υο εη < ου εη< ου <β ου ε· < υο υο υο υο > ρυ ρυ υρ ου υο _υο < ρ < < ρ υρ < η η 3 —σο εη2 ου υο υο υο υο ου υο υο " ο εη «ς ο ε· < ο υο ο < εη ο υο ο η < to νο-εη 3 Ν·ου οο-< Εη ^>·υο ο-ρυ ιο-υο 1) υρ m υο ιη ου no υο r~ ft < r* υο tj Εη < υο < &Η Εη <5 ΕΗ 2 Εη < ο υο ου ου εη 2 υο υο t2 εη < υο ου υο υο < εη C- |η 2 ΕΗ < ου Ε* < < Εη υο ου Η 2 υο ρυ ου υο μ ου υο υρ υο ρυ < ε· < εη ου < εη ου ft < υ ο . ο υο ο υο ο υο ο ου ο υο ο υρ m m-υο r-ι -υ ο -υ ο m -υ ο σ'-υ ο ·η-<Ε· s Η*υο m ου ·ηου no ου \ο <f. r-ρυ S Ε· 2 2 Εη Ε· 2 Ου Εη 2 Η 2 ο υρ υο υο ρυ ρυ υρ 2 2 ft ΕΗ 2 υρ εη 2 2 Εη 2 Ε» εη < ου υο υο ρυ ου υο εη < υο υρ £ 2 ου εη 2 υρ ου 2 £ υο ου ρυ 2 ΕΗ <ΕΗ 2 ΕΗ εη 2 UP ΡΡ 2 Εη ο υρ ο υρ ο ου ο υο ο ου ο < εη ο υο -Εη 2 ο-2 £ Ν0-2Εη Μ -Εη 2 00 - < Εη ^-UU Ο - Εη 2 η* υο ιη υο in 2 Εη no 2 Εη no υο Εη 2 αο υο υρ εη < υο υο υρ ρυ υο <ft υρ εη 2 υο <ft ft < υρ εη < <f < εη υο 2 ε· υο ου ρυ υρ υρ ρυ υρ υρ υο

Εη 2 Εη 2 υο 2 Εη Εη 2 υο PU

υρ υο ρυ ρυ ρυ ρυ ρυ ου υο εη 2 υρ ρυ £2 ρυ Ο ου Ο Εη 2 Ο υο Ο 2 Ε* Ο 2 E· ο Εη 2 Ο Εη < η-ρυ <Λ-υ Ο ιη -Εη 2 Η -Εη 2 r--ο υ ro -2 Ε· σι-υρ η» υο ό ου m υ ρ ό ρυ ό υρ r~ υρ η- εη 2 <Εη Εί< ΕΗ< ρυ υρ εη< υρ ου ου υο ft < <f* 2Εη 2 εη υο υρ υο υρ υρ ου υρ υρ 2 Εη Εη 2 ΡΡ ΡΡ ΡΡ Εη 2 ρυ εη < υρ ρυ 2 ε» ρυ υρ ρυ υρ υρ ρυ υρ εη < υρ υ ρ υρ < S εη< ε»< εη< υρ υο ΕΗ 2 2 Εη 2 Ε· UP Εη 2 υο DK 172013 B1 11 o oligo(dG)-hale tilføjet til indsætning af cDNA'et i en vektor.

[ -2] DNA'erne ifølge opfindelsen er DNA'er med eller indeholdende en basesekvens svarende til et human-5 tumornekrosefaktor-(human TNF)-polypeptid eller dets væsentlige del(e), eller dets allele mutantpolypeptid eller en basesekvens, der fremkommer ud fra modificering af denne basesekvens, eller mere specifikt DNA'er med eller indeholdende en basesekvens svarende til en aminosy-10 resekvens med formlen

(Y) -(X) -(B) -A I

p n m eller en basesekvens med et terminerlngscodon i 3'-en-15 destillingen i basesekvensen, hvor A er et polypeptid med formlen

Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val

Val Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu

Gin Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu 20

Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn

Gin Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr

Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu Phe Lys Gly

Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu

Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser 25

Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ia

Ile Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro

Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu

Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu

Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile 30

Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu

Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala

Leu 35 hvor en eller flere aminosyrer kan udelades eller erstattes med anden(re) aminosyre(r), DK 172013 B1 0 12 B er et peptid med formlen

Ser-Ser-Ser-Arg Ib 5 hvor 1-3 aminosyrer kan være udeladt eller erstattet med andre aminosyre(r), X er et polypeptid, Y er Met, og m, n og p er 1 eller 0; og hvor polypeptidet A har j. det væsentlige samme aktivitet som human tumornekrosefaktor.

Et foretrukket eksempel på polypeptidet repræsenteret af X i formlen I er et polypeptid med formlen

Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu

Leu Ala Glu Glu Ala Leu Pro Lys Lys Thr 15

Gly Gly Pro Gin Gly Ser Arg Arg Cys Leu

Phe Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val

Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe Cys Leu Leu Ic

His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gin Arg Glu

Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser 20

Pro Leu Ala Gin Ala Val Arg

Specifikke eksempler på basesekvenserne, der svarer til de aminosyresekvenser, der er repræsenteret ved ovenstående formler la, Ib og ic, er sådanne med 25 hhv. følgende formler Ila, Ilb og IIC: 30 35 0 DK 172013 B1 13

(5‘)-ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA _ GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC

5 CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC IIa TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTG-{3') (5')-TCA-TCT-TCT-CGA-(3') IIb 20

(5·)-AGC ACT GAA AGC ATG ATC CGG GAC GTG GAG CTG GCC GAG GAG GCG CTC CCC AAG AAG ACA GGG GGG CCC CAG GGC TCC AGG CGG TGC TTG TTC CTC AGC CTC TTC TCC TTC CTG

Ile

ATC GTG GCA GGC GCC ACC ACG CTC TTC TGC

25 CTG CTG CAC TTT GGA GTG ATC GGC CCC CAG AGG GAA GAG TTC CCC AGG GAC CTC TCT CTA ATC AGC CCT CTG GCC CAG GCA GTC AGA-(3') 30 Det skal bemærkes, at DNA'erne ifølge den fo religgende opfindelse omfatter følgende DNA'er.

(1) DNA'er, der koder for et human-TNF-polypeptid eller dets vigtigste del(e).

(2) DNA'er, der er en allel mutant af et DNA, 35 der koder for et human-TNF-polypeptid eller dets vigtigste del(e).

0 DK 172013 B1 14 (3) DNA'er, der fremkommer ved modifikation af DNA'er, der koder foret humant TNF-polypeptid eller dets allele mutantpolypeptid.

(4) DNA'er, der fremkommer ved kemisk eller enzy-5 matisk modifikation af DNA'er, der koder for et humant TNF-polypeptid eller dets allele mutantpolypeptid.

(5) Delvis eller helt kemisk syntetiserede DNA'er svarende til DNA'er, der koder for et humant TNF-polypeptid eller dets vigtigste del(e).

10 (6) DNA'er, der koder for et polypeptid, hvis ak tivitet i det væsentlige er ækvivalent med et humant TNF-polypeptids eller dets vigtigste del(e)s.

(7) Eventuelle degenerations-DNA'er, der koder for et humant TNF-polypeptid eller dets vigtigste del(e).

15 (8) DNA'er, der koder for et humant TNF-polypeptid, hvori 1 eller flere codoner er udeladt eller erstattet med andre codon(er).

(9) DNA'er, der koder for et humant TNF-polypeptid eller dets vigtiste del(e) og med et initieringscodon 20 og/eller termineringscodon og/eller promotor efterfulgt af en Shine-Dalgarno-sekve;ns længere oppe i initierings-codonet.

(10) DNA'er, der indeholder en basesekvens, der afviger fra basesekvensen, der koder for kanin-TNF, men 25 er stærkt homolog med en eller flere dele af basesekvensen, der koder for kanin-TNF.

Foretrukne DNA'er ifølge opfindelsen er: (1) DNA med en basesekvens svarende til en amino-syresekvens med formlen I, hvor A har formlen la, B har 30 formlen Ib, X er formlen Ic, m og n er 1, og Y og p er som i formlen I.

(2) DNA med en basesekvens svarende til en amino-syresekvens med formlen I, hvor A har formlen la, B har formlen Ib, m er 1, n er 0, og Y og p er som i formlen I, 35 og 0 DK 172013 B1 15 (3) DNA med en basesekvens svarende til en amino-syresekvens med formlen I, hvor A har formlen Iz, m og n er 0, og Y og p er som i formlen I.

Et særligt foretrukket DNA har en basesekvens 5 svarende til en aminosyresekvens med formlen I, hvor A har formlen la, B formlen Ib, m er 1 eller 0, og n og p er 0.

Basesekvensen svarende til en amonosyresekvens med formlen I, hvor A har formlen la, B formlen Ib, S formlen Ic, og m, n og 10 p hver er 1, er vist ved sekvensen af baserne 1-699 i formel 4, hvor baserne er numre reret. Basesekvensen svarende til aminosyresekvensen med formlen la ses ved sekvensen af baserne 247-699 i formel 4, og det samlede antal aminosyrer svarende til denne basesekvens er 151.

I formel 4 viser de øverste rækker basesekven-15 sen og de nederste rækker den tilsvarende aminosyresekvens.

Eksempler på polypeptidet med formlen la, hvor en eller flere aminosyrer er udeladt eller erstattet, omfatter: (4) et polypeptid med formlen la, hvor Thr i den 20 første stilling frå N-endestillingen er udeladt, (5) et polypeptid med formlen la, hvor aminosyresekvensen fra Thr i den første stilling til Pro i den 6. stilling fra N-endestillingen er udeladt, (6) et polypeptid med formlen la, hvor aminosyre-25 sekvensen fra Thr i 1.-stillingen til His i 9. stilling fra N-endestillingen er udeladt, (7) et polypeptid med formlen la, hvor aminosyresekvensen fra Thr i 1.-stillingen til Ala i 12. stillingen fra N-endestillingen er udeladt, og 30 (8) et polypeptid med formlen la, hvor Thr og His i 66. og 67. stilling fra N-endestillingen er erstattet med His, Thr eller Tyr.

Ifølge opfindelsen er i det mindste (9) en basesekvens fra den 577. til den 708. base 35 i de øverste rækker i formel 5, og især (10) en basesekvens fra 658. til 708. base i de øverste rækker i formel 5

Formel 4 DK 172013 B1 16

GACCCACGG

-30 -20 -10 -1

CTCCACCCTCTCTCCCCTGGAAAGGACACC

1 10 20 30

ATGAGCACTGAAAGCATGATCCGGGACGTG

MetSerThrGluSerMetlleArgAspVal 40 50 60

GAGCTGGCCGAGGAGGCGCTCCCCAAGAAG

GluLeuAlaGluGluAlaLeuProLysLys 70 80 90

ACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGC

ThrGlyGlyProGlnGlySerArgArgCys 100 110 120

TTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATC

LeuPheLeuSerLeuPheSerPheLeuIle 130 140 150

GTGGCAGGCGCCACCACGCTCTTCTGCCTG

ValAlaGlyAlaThrThrLeuPheCysLeu 160 170 180

CTGCACTTTGGAGTGATCGGCCCCCAGAGG

LeuHisPheGlyVallleGlyProGlnArg 190 200 210

GAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCTAATC

GluGluPheProArgAspLeuSerLeuIle 220 230 ^ 240 AGCCCTCTGGCCCAGGCAGTCAGA PCATCT SerProLeuAlaGlnAlaValArg»erSer 250 260 270

TCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCC

SerArgThrProSerAspLysProValAla 280 290 300

CATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGG

HisValValAlaAsnProGlnAlaGluGly 310 320 330

CAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAAT

GlnLeuGlnTrpLeuAsnArgArgAlaAsn 340 350 360

GCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGA

AlaLeuLeuAlaAsnGlyValGluLeuArg ... fortsættes

Formel 4 (forts.) DK 172013 B1 17 370 380 390 GATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGC AspAsnGlnLeuValValProSerGluGly 400 410 420

CTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTC

LeuTryLeuIleTyrSerGlnValLeuPhe 430 440 450

AAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTG

LysGlyGlnGlyCysProSerThrHisVal 460 470 480

CTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCC

LeuLeuThrHisThrlleSerArglleAla 490 500 510

GTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTC

ValSerTyrGlnThrLysValAsnLeuLeu 520 530 540

TCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAG

SerAlalleLysSerProCysGlnArgGlu 550 560 570

ACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGG

ThrProGluGlyAlaGluAlaLysProTrp 580 590 600

TATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTC

TyrGluProIleTyrLeuGlyGlyValPhe 610 620 630

CAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCT

GlnLeuGluLysGlyAspArgLeuSerAla 640 650 660 GAGATCAATCGGCCCG ACTATCTCGACTTT GIuIIeAsnArgProAspTyrLeuAspPhe 670 680 690

GCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATC

AlaGluSerGlyGlnValTyrPheGlylle 700 710 720 ATTGCCCTG TGAGGAGGACGAACATCCAAC IleAlaLey 730 740

CTTCCCAAACGCCTCCCCTGC

DK 172013 B1 18

Formel 5 —-— 30

ATGAGCACTGA|AKqqATGATCCGGGACGT|G

ATGAGCACTGAfcMlkTGATCCGGGACGllC

60

GAGCTGGCCGAG^ØGlCGCTCCCCAAGAAG

GAGCTGGCGGAGGHddCGCTCCCCAAGAAG

90

A)CAGGGGGGCCCCAGGGCTCCA|G|GCG|mGC

GCAGGGGGGCCCCAGGGCTCCA|A|GCG|crrGC

120

TfefflTCCTCAGCCTCTTCTdqpTCCTqApc

CmCfcfcCTCAGCCTCTTCT(TnrTCCTG|C|rC

150

GTGGCjÆaCECCACCACGCTCTTCTGCCTG

GTGGCmGqA|GCCACCACGCTCTTCTGCCTG

180

CTGCACTl*rG|^TGATCGGCCC|C|CA0AGjG

CTGCACT11CA|G|GjGTGATCGGCCCmCAGlGA|G

210

GAAGAGl---fflljCCCjCjfcGGftCCTCffCfCCTA

GAAGAGjCAGwdcCqAiftlACAKcCTCjCApCTA

240

AffcaGjCCC^CffGGCCCAq------GØAGffC

GtTCWkcCljGfrGGCCCAGIATGGTCAicjCQTC

270

AGATCAfKTTCTCGjAAECQqGAGTGACAAG

AGATCAbCTTCTCGjGGCCqnGAGTGACAAG

300

CC^lPAGCCC^ljG^IlGTAGCAAACCdTpAA

CCqOTAGCCCAqSajAlGTAGCAAACCClGlCAA

330

aCT|3AGGGlGJCAGCTCCAGTGGCTG/iApa»C

(^GpAGGGjqCAGCTCCAGTGGCTGflGbctAG

. .. fortsættes Øverste rækker:basesekvens, der koder for human-TNF-precursor.

Nederste rækker:basesekvens, der koder for kanin-TNF- precursor.

Formal 5 (forts.) 2gg DK 172013 B1 19

CaGjGQCj^ltCCCTICCTGGCCA^TjGGQGffQ

cqTfcqqMcbcccijGCTGGCCA^cbGqAtrGf 390

GjAGC^GjSGAjG^TAACCAGCTGGTGGTGCdA

^GCTiqACGlGACAACCAGCTGGTGGTGCdG

420

TflAESGjGaqCTGTACCTCATCTACTCCCAG

G|qqG^qG|CTGTACCTCATCTACTCCCAG

450

GldCTCTTCAlAGi^CAAGGCTGCqCpTCC

G^jCTCTTC/^QGGjlfcAAGGCTGCCpICTCC

480

ACCdAhteTGCTCCTCACiqCACACjCAjTCAGC ---Tl^TGCTCCTCAqqCACACrrGrrCAGC

510

CG9AfrCGCCGTCTCCTACC(A£3CCAAGGTC

CGQrbCGCCGTCTCCTACQCpAACAAGGTC

540

AACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGC

570

CAlGAjGGGAGACCCCl^GAGGGGGCTGAGjGpC

CA|CqGGGAGACCCqqGAGGAGGCTGAqC)CC

600

^^CTGGT^T)SAGCCCATCTA|rjCTGGqA

^ijqGjCCTGGTACfeAGCCCATCTAldCTGGqC

630

jGGHGTCTTCCAGOTGGAGAAGGGTGACCGJA

|GG)q3TCTTCCAGPTrGGAGAAGGGTGACCG)G

660 pCA^jqr|sAaApCASi|aa CTCAGdft|CjC|3A(3GffCAA|c|c|AGCCfflGAjGtrA|c 690

!MAteTGCCGAGTqi1GGGCAGGTCTAC

ZTlGfeAClqrTGCCGAGTdqGGGCAGGTCTAC

***

TTTGGGATCATTGCCCTGTGA

Regioner omgivet af et rektangel er en homolog region "---" viser udeladelse af et codon.

"***" viser et termineringscodon.

O

DK 172013 B1 20 vigtige basesekvenser i DNA, der koder for et dolv-peptid med biologisk aktivitet.

[1-3]_Fremgangsmåder til fremstilling af DNA'erne ifølge opfindelsen 5 Ifølge den foreliggende opfindelse kan DNA'et der koder for et humant TNF-polypeptd eller en vigtig del deraf fremstilles ved at dyrke humån-makrofager sam-med induktor(er), fraskille en fraktion, der indeholder hu-man-TNF mRNA fra de inducerede celler, fremstille en 10 cDNA-serie ud fra fraktionen og klone human-TNF-cDNA'et ved en differentieret hybridiseringsmetode ved hjælp af en passende sonde, f.eks. et kanin-TNF cDNA-fragment,eller ved en differentieret hybridiseringsmetode efterfulgt af mRNA-hybridiserings-translationsanalyse.

15 Med andre ord kan det fremstilles via følgen de trin: A. Dyrkning af human-makrofager med induktor(er).

B. FraskiUelse af en fraktion, der indeholder hu-man-TNA mRNA fra de inducerede celler.

20 C. Fremstilling af sscDNA ud fra mRNA1et ved hjælp af omvendt transcriptase og derefter omdannelse til dscDNA.

D. Indsætning af dscDNA1 et i en vektor.

E. Indføring af den rekombinante vektor i en vært 25 for at transformere den og konstruere en cDNA- (koloni)-serie, og F. Kloning af cDNA, der koder for humant TNF-poly-peptid eller dets vigtige del fra serien.

Eventuelt kan modifikation (trin G) af DNA'et, 30 der er fremstillet ovenfor, give andre DNA'er ifølge opfindelsen, som har eller indeholder en basesekvens svarende til den aminosyresekvens, der har formlen I.

Herefter vil fremgangsmåderne til fremstilling af DNA'et ifølge opfindelsen blive beskrevet mere detal-35 jeret. Det skal imidlertid bemærkes, at operationerne og betingelserne under de enkelte trin af fremgangsmå- 0 21 DK 172013 B1 derne, der vil blive beskrevet nedenfor, er kendt, og fremgangsmåderne er ikke begrænset til disse særlige metoder.

(1) Fremstilling af human-TNF mRNA 5 Human-TNF mRNA kan fås fra human-makrofager, f.eks. ved følgende metode.

Human-makrofager fås f.eks. fra human alveole ved hjælp af den af Sone et al. beskrevne metode i J. Immunol. 129, 1313 (1982), ud fra blod ved hjælp af den 10 af Matthews beskrevne metode i Br. J. Cancer 48^, 405 (1983), ud fra placenta ved hjælp af den af Wilson et al. beskrevne metode i J. Immunological Methods 56_, 305 (1983) eller ud fra andet væv.

De opnåede makrofager udsås i en skål med en 15 celletæthed på ca. 2 x 10^ til 1 x 10^ celler pr. cm^ og fordyrkes ved 35-38°C, fortrinsvis ca. 37°C, i en fuldt fugtet atmosfære indeholdende 5% carbondioxid i ca. 30 minutter til 2 timer.

Derpå tilsættes endotoxin, der fås ud fra en 20 gram-negativ bakterie, fortrinsvis lipopolysaccharid afledt ud fra Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa eller Salmonella typhii, som induktor, og der tilsættes cycloheximid som proteinsynteseinhibitor. Dyrkningen fortsættes i yderligere 3-8 timer for at akkumulere hu-25 man-TNF mRNA i makrofagerne.Fordyrkningen kan udelades.

Mængden af endotoxin ligger i reglen på ca. 0,1-1000 mikrogram/ml, fortrinsvis på ca. 1-100 mikrogram/ml.

På dette tidspunkt kan der desuden som induktor tilsættes en phorbolester såsom phorbol-12-myristat-13-acetat, 30 phorbol-12,13-didecanoat eller phorbol-12,13-dibenzoat, i en mængde på ca. 1-2000 ng/ml. Mængden af proteinsynteseinhibitor varierer afhængigt af dennes type.

Når det således drejer sig om cycloheximid, er mængden 0,1-50 mikrogram/ml. Der kan anvendes forskellige dyrk-35 ningsmedier, der er egnet til dyrkning af pattedyrecel-ler som dyrkningsmedium. Eksempler herpå omfatter RPMI- 0 22 DK 172013 B1 -1640, Eagle's MEM-medium, og Dulbeco1 s modificerede MEM-medium (med henblik på sammensætningerne af ovennævnte medier henvises til f.eks. "Cell Cultivation Manual" udg. af Y. Sohmura, Kodansha (1982), og J. Paul "Cell 5 and Tissue Culture", E. & S. Livingstone Ltd. (1970). Fortrinsvis sættes et dyreserum (såsom kalvefoster-serura eller kalveserum) til dyrkningsmediet i en mængde på ca. 1-20%.

Efter dyrkningen ekstraheres alt RNA fra celler-10 ne ved hjælp af en gængs metode, f.eks. den af Chirgwin et al. beskrevne i Biochemistry 18, 5294 (1979), og derpå fraksilles ved hjælp af affinitetskolonnechromatogra-fi på oligo(dT)-cellulose eller poly(U)"Sepharose" eller ved hjælp af en portionsmetode en fraktion, der indehol-15 der poly(A)mRNA. En med human-TNF mRNA beriget mRNA-frak-tion kan fås ved at underkaste poly(A)mRNA-fraktionen syre-urinstof-agarosegel-elektrophorese eller saccharo-se-densitetsgradientcentrifugering.

For at få bekræftet, at den fremkomne mRNA-frak-20 tion er den ønskede, der indeholder mRNA, der koder for humantTNF-polypeptid, translateres mRNA'et til et protein, og dettes biologiske aktivitet undersøges. Dette kan f.eks. ske ved at injicere mRNA'et i oocyter af Xe-nopus laevis eller sætte det til et passende protein-25 syntetiserende system, såsom et reticulocyt-lysat eller hvedekim-cellefri-proteinsyntetiserende system, og ved at få bekræftet, at det translaterede protein har cyto-toksisk aktivitet på muse-L-celler in vitro.

(2) Kloning af human-TNF cDNA 30 Poly(A)mRNA'et eller den berigede mRNA-frak-

tion, der fås i trin (1) ovenfor, anvendes som skabelon , og der anvendes en oligo(dT) som primer (igangsætter) for at syntetisere sscDNA ved hjælp af omvendt transcriptase (f.eks. det,der afledes ud fra fugle-mye-35 loblastose-virus (AMV) i nærvær af dATP, dGTP, dCTP og dTTP. Derpå anvendes sscDNA som skabelon, og dscDNA

0 23 DK 172013 B1 syntetiseres ved hjælp af omvendt transcriptase eller E. coli-DNA-polymerase I (stort fragment).

Det fremkomne dscDNA indsættes f.eks. i re-striktions-endonuclase Pst-I-spaltningsstedet i plasmid 5 pBR322 ved hjælp af en gængs metode, f.eks. poly(dG)--poly(dC)-homopolymerekstensionsmetoden [T.S. Nelson, "Methods in Enzymology". 68, 41 (1979)], Academic Press Inc., New York]. De herved opnåede rekombinante plas-mider indsættes i en vært såsom E. coli X 1776 i over-10 ensstemmelse med Cohen et al.'s metode [Proc. Nat. Acad.

Sci. USA 69, 2110 (1972)] for at transformere den, og ved at udvælge tetracyclin-resistente kolonier, fremstilles en cDNA-(koloni)-samling.

cDNA-samlingen underkastes kolonihybridiserir.g 15 [D. Hanahan et al., Gene 10, 63 (1980)] ved at anvende 32 et med P-mærket kanin-TNF cDNA-fragment, der fås som anført i referenceeksempel 1, som sonde, og de ønskede kloner, der rummer rekombinante plasmider indeholdende indsat cDNA, der koder for humant TNF—polypeptid, screenes.

20 Hvis der ikke kan fås en sådan egnet TNF cDNA- -sonde som anført ovenfor, screenes de ønskede kloner ved hjælp af kolonihybridisering ved hjælp af induktionsplus- og^minus-sonder, og ved hybridiseringstranslations- analyse som nedenfor.

3 2 25 Et med P-mærket dDNA syntetiseres ved hjælp af poly(A)mRNA-fraktionen eller den berigede mRNA-frak- tion, der indeholder humant TNF-mRNA'et, der fås i trin (1), som skabelon og anvendes som induktionsplus-sonde.

Separat anvendes en mRNA-fraktion, der fås på samme måde 30 som ovenfor med undtagelse af, at der anvendes ikke-in- ducerede makrofager som udgangsmateriale, som skabelon, 32 32 og der syntetiseres P-mærket cDNA. Det med P mærkede cDNA anvendes som induktions-minus-sonde. Ud fra den o-Vennævnte cDNA-samling udvælges plasmidkloner, der er 35 stærkt hybridiserede med induktions-plus-sonden, men ikke hybridiseret med induktions-minus-sonden.

0 24 DK 172013 B1

Nedenstående metode udføres for at få bekræftet, at de opnåede kloner rummer indsat cDNA, der koder for humant TNF-polypeptid. Plasmid-DNA'erne isoleres fra de ovennævnte kloner, omdannes til enkeltstrenget DNA 5 ved varme- eller alkalibehandling og fikseres på nitrocellulosefiltre. mRNA-fraktionen, der indeholder human--TNF mRNA, tilsættes til filtrene for at hybridisere med det fikserede DNA. Derpå elueres det hybridiserede mRNA og udvindes. Det udvundne mRNA injiceres i oocyter af 10 Xenopus laevis for at bestemme, om det udvundne mRNA koder for humant TNF-polypeptid.

De ovennævnte metoder giver transformanter, der rummer rekombinant plasmid med et DNA-fragment indeholdende en basesekvens, der er komplementær med human-TNF-15 mRNA'et.

Når de opnåede klonede cDNA'er ikke indeholder hele kodningsregionen for humant TNF-polypeptid, udvælges cDNA'er med en større størrelse ved at screene cDNA-sam-lingen, idet der som sonde anvendes de klonede TNF cDNA-20 -fragmenter fra transformanterne, der er udvalgt som angivet ovenfor.

Det klonede c DNA, der koder for et polypeptid indeholdende aminosyresekvensen for humant TNF-polypeptid, kan bestemmes endeligt ved at analyse basesekvenserne i 25 nogle af de herved fremkomne klonede cDNA-fragmenter ifølge f.eks. Maxam-Gilbert-metoden [Proc. Nat. Acad. Sci.

USA 74, 560 (1977)], idet der søges efter en basesekvens, der har homologi med basesekvensen i kanin-TNF cDNA og udvælges cDNA'er indeholdende en basesekvens svarende 30 til hele kodningsregionen i humant TNF-polypeptid.

Homologi mellem basesekvensen, der koder for kanin-TNE^ og den, der koder for humant TNF-polypeptid, og homologi mellem de udledede aminosyresekvenser i kanin--TNF- og humant TNF-polypeptid er vist i hhv. formel 5 og 35 formel 6.

DK 172013 B1 25

Formel 6 - 10 4et Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val 4et Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val 20

Glu Leu Ala Glul Glu Ala Leu Pro Lys Lys

Glu Leu Ala Glul Gly Pro Leu Pro Lys Lys 30

Thr |Gly Gly Pro Gin Gly Serj Arg [Arg Cys

Ala bly Gly Pro Gin Gly Serj Lys |Arg Cys 40

Leul Phe Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leul Ile

Leuj Cys Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leul leu 50

Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe Cys Leu

Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe Cys Leu 60

Leu His Phel Gly |Val Ile Gly Pro Glnl Arg

Ile Ser |Pro| Leu (Ala Giri------Ala Val

Val Asn [Prc| Val [Ala Glr| Met Val Thr Leu 90

Arg Serj Ser [Ser Arg] Thr Pro ISer Asp Lys

Arg Ser Ala |Ser Arg Ala Leu Ser Asp Lys 100

Proj Val [Ala His Val Val Ala Asn Pro Gin

Prol Leu |Ala His Val Val Ala Asn Pro Gin 110

Ala [Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu| Asn Arg

Val iGlu Gly Gin Leu Gin Trp Leul Ser Gin 120

Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Glyl Val

Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Glyl Met ... fortsættes

De øverste rækker: Human-TNF-precursor

De nederste rækker: Kanin-TNF-precursor DK 172013 B1 26 rormei b (forts.) 130

Glu Leul Arg Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Lys Leu| Thr Asp Asn Gin Leu Val Val Pro 140

Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Ala Asp bly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin 150

Val Leu Phel Lys ply Gin Gly Cys Pro Ser Val Leu Phel Ser bly Gin Gly Cysl Arg |ser 160

Thr His É/al Leu Leu Thr His Thrj Ile jser —- Tyr yal Leu Leu Thr His Thrl Val |Ser 170

Arg Ile |Ala Val Ser Tyrl Gin Thr Lys Val Argj Phe |Ala Val Ser Tyri Pro Asn [Lys Val 180

Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys 190

Gin |Arg Glu Thr Pro Glul Gly Ala Gluj Ala His Arg Glu Thr Pro Glul Glu Ala Gluj Pro 200

Lys Pro ITrp Tyr Glu Pro ile Tyr Leu Gly

Met Ala fTrp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly 210

Gly Val Phe <*ln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Gly Val Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg 220

Leu Serj Ala plul Ile lAsni Arg IProl Asp Tyr

Leu Se ri Thr blul Val Asn| Gin [Pro Glu |Tyr 230

Leu Aspl Phe |Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr

Leu As pi Leu lAla Glu Ser Gly Gin Val Tyr

Phe Gly Ile Ile Ala Leu Phe Gly Ile Ile Ala Leu

Regioner omgivet af et rektangel er homologe regioner "---" viser udeladelse af en aminosyre 0 27 DK 172013 B1

Ved at dømme ud fra disse homologier og de bestemt N-endestillede og C-endestillede aminosyresekven-ser i kaninplasma-TNF (jf. referenceeksempel 3 nedenfor), viser det sig, at human-TNF cDNA koder for sit precursor-5 polypeptid på 233 aminosyrerester, og et modent human-TNF--polypeptid er et polypeptid svarende til de 155 amino-syrerester fra carboxyendestillingen af precursoren.

Det modne humant TNF-polypeptid er kodet i den basesekvens, der svarer til en aminosyresekvens med form-10 len I, hvor A er formlen la, B er formlen IB, m er 1, og n og p er 0.

Human-TNF-precursorpolypeptidet er kodet i basesekvensen, der svarer til en aminosyresekvens med formlen I, hvor A har formlen la, B har formlen Ib, X har 15 formlen Ic, og m, n og p er 1, og Y er Met.

<[ Høje homologier i basesekvenserne cg de udledte aminosyresekvenser som ovenfor kan vise, at human-og kanin-TNF'er er phylogenetisk afledt ud fra det samme gen og antyder, at en betydelig(e) del(e) af de fælles re— 20 gioner er en sekvens, der er nødvendig for at udtrykke deres biologiske aktiviteter. Imidlertid krydses moden humant TNF-polypeptid ikke immunologisk med kaninplasma--TNF som vist nedenfor. Det anføres, at hele aminosy-resekvensen i modent humant TNF-polypeptid ikke altid er 25 nødvendig for at udtrykke aktiviteterne, og at et delvis modificeret humant TNF-polypeptid også har aktiviteterne, når blot det indeholder et aktivt sted i det modne TNF-polypeptid.

(3) Modifikation af DNA'et, der koder for humant 30 _TNF-polypeptid_ DNA'et, der koder for humant TNF-polypeptidet, kan modificeres ved i og for sig kendte metoder, så at der dannes DNA'er med eller indeholdende en basesekvens svarende til aminosyresekvensen med formlen I. Modifi-35 kation udføres f.eks. ved at spalte DNA'et med passende restriktionsendonuclase(r) og afskære en eller flere 0 28 DK 172013 B1 codoner med passende exonuclaser og/eller endonuclaser hver for sig eller kombineret efterfulgt af udskiftning mea degenerations- eller andre codoner, f.eks. sådanne, der kemisk er syntetiseret ved hjælp af phosphotriester-5 metoden [E. Ohtsuka et aL , Heterocycles 15, 395 (1981)] eller ved ligatering uden noget supplement af codoner til fremstilling af DNA, hvor en eller flere codoner er udeladt.

[II-l] 10 Som anført ovenfor angår den foreliggende op findelse også et polypeptid med eller indeholdende et human tumornekrose-faktorpolypeptid eller dets vigtiste del(e), et human tumornekrosefaktor-lignende stof, dets vigtigste del(e) og disses kemisk eller enzymatisk mo- 15 dificerede stoffer. Det er mere specifikt et polypeptid med den tidligere anførte formel <Y)p-(X)n-(B)m-A 1 20 eller et derivat eller et salt deraf, hvor A er et polypeptid med den tidligere anførte formel la, hvori en eller flere aminosyrer kan være udeladt eller erstattet med anden (andre) aminosyre(r)f 25 B er et peptid med den tidligere anførte for mel Ib, hvori 1-3 aminosyrer kan være udeladt eller erstattet med anden(re) aminosyre(r), X er et polypeptid, Y er Met, og 30 m, n og p er 1 eller 0.

Et foretrukket eksempel på polypeptidet, der er repræsenteret ved X i formlen I, er et polypeptid med den tidligere anførte formel Ic.

Det skal bemærkes, at polypeptiderne ifølge 35 opfindelsen omfatter følgende polypeptider: 0 29 DK 172013 B1 (1) Et polypeptid svarende til DNA'et ifølge opfindelsen som beskrevet i afsnit [I] ovenfor, som fremstilles ved hjælp af en vært, der er transformeret med en ekspressionsvektor, hvori det ovennævnte DNA er ind- 5 sat, (2) et humant TNF-polypeptid eller dets precursor-polypeptid, (3) et humant TNF-polypeptid, hvori en eller flere aminosyrer er udeladt eller erstattet med anden(re) ami- 10 nosyre(r), (4) et polypeptid bestående af en væsentlig del af humant TNF-polypeptidet, (5) et polypeptid, der afviger fra kanin-TNF-po-lypeptid, men indeholder eller har et peptid med høj ho- 15 mologi med en del(e) af kanin-TNF-polypeptid, (6) et degraderet produkt af humant TNF-polypeptidet, der er degraderet i en vært, (7) et polypeptid, der er resultatet af kemisk eller enzymatisk modifikation af humant TNF-polypepti- 20 det eller dets derivat, og (8) et polypeptid, der besidder eller potentielt besidder biologiske aktiviteter, der i det væsentlige svarer til humant TNF-polypeptidets.

Foretrukne polypeptider ifølge den foreliggen- 25 de opfindelse er følgende: (1) Et polypeptid med formlen I, hvor A har formlen la, B har formlen Ib, m er 1, n er 0, og Y og p er som for formlen I, (2) et polypeptid med formlen I, hvor A har form- 30 len la, m og n er 0, og Y og p er som angivet for formlen I, og (3) et polypeptid med formlen I, hvor A har formlen la, B har formlen Ib, X har formlen Ic, m og n er 1, og Y og p er som defineret for formlen I.

35 Et særligt foretrukket polypeptid er et poly peptid med formlen I, hvor A har formlen la, B har form-

O

DK 172013 B1 30 len Ib, m er 1 eller 0, og n og p er 0, eller fysiologisk acceptable salte heraf.

Polypeptidet med formlen la er et polypeptid med aminosyresekvensen fra 86. til 236. base i de ø-5 verste rækker i formel 6,

Polypeptider med formlen la, hvori en eller flere aminosyrer er udeladt eller erstattet, omfatter f.eks. følgende polypeptider: (4) Et polypeptid med formlen la, hvor Thr i 1.

10 stilling af N-endestillingen er udeladt, (5) et polypeptid med formlen la, hvori aminosyresekvensen fra Thr i 1. stilling til Pro i 6. stilling fra N-endestillingen er udeladt, (6) et polypeptid med formlen la, hvori aminosy-15 resekvensen fra Thr i 1. stilling til His i 9. stilling fra N-endestillingen er udeladt, (7) et polypeptid med formlen la, hvori aminosyresekvensen fra Thr i 1. stilling til Ala i 12. stilling fra N-endestillingen er udeladt, og 20 (8) et polypeptid med formlen la, hvori Thr og

His i 66. og 67. stilling fra N-endestillingen er erstattet med His, Thr eller Tyr.

Ifølge opfindelsen er mindst (9) én aminosyresekvens fra Trp i 193. stilling 25 til Leu i 236. stilling i de øverste rækker i formel 6/ og især (10) én aminosyresekvens fra Tyr i 220. stilling til Leu i 236. stilling i de øverste rækker i formel 6 30 vigtige aminosyresekvenser i et polypeptid med biologisk aktivitet.

Derivaterne af polypeptiderne med formlen I kan f.eks. være sådanne, der dannes ved at benytte de funktionelle grupper i sidekæden på kæden i polypepti-35 det med formlen I, aminogruppen ved N-endestillingen eller carboxylgruppen ved C-endestillingen, såsom en 0 31 DK 172013 B1 ester dannet mellem carboxylgruppen og en aliphatisk alkohol, et syreamid dannet mellem den primære eller sekundære amin med en syre eller et derivat deraf, eller et O-acyl-derivat af hydroxylgruppen.

5 Polypeptidernes [I] salte er salte dannet med carboxyl- eller aminogruppen i polypeptiderne [I], f.eks. salte dannet med natriumhydroxid, kaliumhydroxid, argi-nin, koffein, procain, saltsyre og gluconsyre.

Polypeptiderne [I] kan forekomme som aggrega-10 ter heraf, såsom en trimer, og sådanne aggregater omfattes naturligt af polypeptiderne ifølge opfindelsen.

[II-2] Fremgangsmåder til fremstilling af polypeptider- _ ne ifølge opfindelsen._

Et polypeptid med eller indeholdende et humant 15 TNF-polypeptid eller en vigtig del deraf kan produceres ved hjælp af følgende trin: (A) Indsætning af DNA'et med eller indeholdende en basesekvens, der koder for humant TNF-polypeptid ‘ eller dets vigtigste del, eller dets modifice- 20 rede basesekvens i en ekspressionsvektor, (B) indføring af rekombinantvektoren i en vært, (C) dyrkning af værten, der er transformeret med rekombinantvektoren, til fremstilling af polypeptide t, 25 (D) indsamling af de dyrkede celler og ekstraktion af polypeptidet fremstillet heraf, og (E) rensning af polypeptidet ved gængse rensningsmetoder for proteiner.

Om ønsket kan polypeptidet, der fremstilles 30 ved ovennævnte trin, modificeres (trin F) til fremstilling af andre polypeptider ifølge opfindelsen med formlen [I] eller derivater eller salte heraf.

(1) Fremstilling af humant TNF-polypeptid 35 Nedenfor følger en detaljeret beskrivelse af fremgangsmåder til fremstilling af humant TNF-polypepti- 0 32 DK 172013 B1 det ved hjælp af DNA'et ifølge opfindelsen.

Der kan fås en ekspressionsvektor til fremstilling af humant TNF-polypeptid ved at indsætte det klonede cDNA, der koder for humant TNF-polypeptid, i en passende S vektor. Alle vektorer, der formeres i mikroorganismer, der skal transformeres, kan anvendes. Eksempler omfatter plasmider (såsom E. coli-plasmid pBR322), fager (såsom fagderivater) og virusser (såsom SV40). De kan anvendes hver for sig eller kombineret, f.eks. som et 10 pBR322-SV40-hybridplasmid. Det er muligt at vælge det rigtige sted til indsætning af DNA'et. Med andre ord: et passende sted i en passende vektor kan spaltes med en passende restriktionsendonuclease på sædvanlig måde, og det klonede cDNA med passende længde kan indsættes 15 på det spaltede sted.

Mere specifikt konstrueres der en ekspressionsvektor til fremstilling af det ikke-sammensmeltede poly-peptid ved at tilføje et DNA-fragment, der indeholder basesekvensen, der koder for humant TNF-polypeptidet, hvori 20 initieringscodonen ATG tilføjes til 5'-endestillingen, og termineringscodonen (TAA, TAG eller TGA) foreligger i 3'-endestillingen, til et DNA-fragment med en passende promotor og Shine-Dalgarno-sekvensen og indsætte det i en vektor. Der kan konstrueres en ekspressionsvektor 25 til fremstilling af det sammensmeltede polypeptid ved at indsætte cDNA-fragmentet, hvori termineringscodonen er tilføjet til 3'-endestillingen, i vektoren, så at aflæsningsrammen falder sammen med aflæsningsrammen i det strukturgen, der skal sammensmeltes. Fremgangsmå-30 den til fremstilling af humant TNF-polypeptid som et sammensmeltet polypeptid har den fordel, at nedbrydningen af produktet i de transformerede værtsceller bliver mindst mulig. I dette tilfælde skal humant TNF-polypeptid udskæres fra det sammensmeltede produkt. Modent hu-35 mant TNF-polypeptid svarende til en aminosyresekvens fra Ser i 82. stilling til Leu i 236. stilling i de øverste 0 33 DK 172013 B1 rækker i tabel VI indeholder ikke noget methionin som komponent. Ved at anvende en ekspressionsvektor, der er konstrueret ved at indsætte human-TNF cDNA-fragmentet ligateret med 3'-endestillingen i basesekvensen i 5 et strukturgen, der skal sammensmeltes via et methio-nincodon (ATG), fås derfor humant TNF-polypeptidet let ud fra det sammensmeltede produkt ved spaltning af me-thionylpeptidbinding, f.eks. ved hjælp af behandling med cyanogenbromid [K. Itakura et al., Science 198, 10 1054 (1977)].

Eksempler på promotorerne er lac, trp, tac, phoS, phoA, PL og SV40 tidlige promotorer.

Transformanter fås ved at indføre ekspressionsvektoren i en vært såsom mikroorganisme, dyre-15 eller planteceller. F.eks. transformeres E. coli ved hjælp af Cohen m.fl.'s metode [Proc. Nat. Acad. Sci.

USA 69, 2110 (1972)]. Derpå produceres ved at dyrke en af transformanterne, et humant TNF-polypeptid eller polypeptidet med en methionin ved N-endestillingen.

20 Produktet kan akkumuleres enten i cytoplasmaen eller i værtscellernes periplasma afhængigt af, hvorledes ekspressionsvektoren er konstrueret. For at polypeptidet skal blive udskilt i periplasmaet kan der konstrueres en ekspressionsvektor ved at anvende et gen, der ko-25 der for et sekretorisk protein såsom et alkalisk phos-phatasegen (phoA) eller et phosphatbindendeproteingen (phoS) og tilføje DNA, der koder for humant TNF-polypeptidet i den korrekte translationsaflæsningsramme, til det ovennævnte gen på et passende sted efter en DNA-re-30 tion, der koder for signalpeptidet.

De herved fremkomne transformanter dyrkes under passende betingelser for transformanterne, indtil det ønskede polypeptid er helt produceret. Derpå eks-traheres polypeptidet fra kulturen. Når det producere-35 de polypeptid akkumuleres i cytoplasmaet, ødelægges værtscellerne ved lysozymfordøjelse og frysning og op- 0 34 DK 172013 B1 tøning eller ved lydbehandling eller ved hjælp af en fransk presse og centrifugeres eller filtreres derpå for at opsamle ekstrakten. Når det akkumuleres i peri-plasmaen, kan det ekstraheres, f.eks. ved hjælp af 5 Willsky et al.1 s metode [J. Bacteriol. 127, 595 (1976)].

Det således opnåede rå polypeptid kan renses ved hjælp af gængse rensningsmetoder for proteiner, f.eks. ved kombinationer af udsaltning, gelfiltrering elektro-phorese, affinitetschromatografi etc.

10 Ved hjælp af ovenstående fremgangsmåde kan humant TNF-polypeptidet ifølge opfindelsen og/eller poly-peptidet med en methionin ved N-endestillingen i polypep-tidet produceres.

Polypeptider ifølge den foreliggende opfindel-15 se ud over humant TNF-polypeptidet og polypeptidet med en methionin ved polypeptidets endestilling kan også fremstilles ved at anvende det ønskede DNA i det væsentlige som ved ovennævnte fremgangsmåde eller ved at anvende de rigtige kombinationer af kendte metoder.

20 (2) Modifikation af humant TNF-polypeptid

De modificerede humant TNF-polypeptider betyder polypeptider afledt af de allele mutanter af det DNA, der koder for humant TNF-polypeptid (allel mutant-polypeptid), idet der fremkommer et polypeptid ved 25 tilføjelsen af en aminosyre eller et peptid (bestående af to eller flere aminosyrer) til N- eller C-endestillin-gen i human-TNF-polypeptidet eller det allele mutantpo-lypeptid, idet der fremkommer et polypeptid ved udeladelse af en eller flere aminosyrer fra humant TNF-po-30 lypeptidet eller det allele mutantpolypeptid (f.eks.

udeladelse af 4 aminosyrer fra N-endestillingen i human--TNF-polypeptid som vist i afsnit III-l (6) nedenfor), deivater såsom estere, acylderivater eller syreamider dannet ved anvendelse af en funktionel gruppe i moleky-35 let, en aminorest fra N-endestillingen eller en carboxy-rest fra C-endestillingen og dets salt dannet ved anven- 0 35 DK 172013 B1 delse af aminorester eller carboxyrester med f.eks. natriumhydroxid, kaliumhydroxid, arginin, koffein, pro-cain, saltsyre, og gluconsyre.

Modifikation af humant TNF-polypeptidet eller 5 dets allele mutantpolypeptid sker på i og for sig kendt måde, f.eks. som i "Chemical Modification of Proteins", G.E. Means og R.E. Feeney, Holden-Day, Inc., Californien (1971), til fremstilling af det modificerede humant TNF-polypeptid som nævnt ovenfor.

10 [III] Kemiske og fysisk-kemiske egenskaber, biologisk aktivitet og immunologisk egenskab hos de typiske _polypeptider ifølge opfindelsen._

Renset humant TNF-polypeptid, som fremstillet i eksempel 4 (der vil blive kaldt rekombinant human-TNF 15 forkortet til rHu-TNF) anvendes til de analyser, der vil blive forklaret nedenfor.

[III-l] Kemiske og fysisk-kemiske egenskaber (1) Molekylvægt. rHu-TNF's molekylvægt måles ved gelfiltreringsanalyse med TSK-gel G3000 SW-kolonne 20 (7,5 x 600 cm, Toyo Soda) ved hjælp af højtydende væske-

chromatografi ved brug af 0,2 molær phosphatpuffer (pH

7) med eller uden 8 molær urinstof og 0,5%'s 2-mercapto-ethanol som opløsningsmiddel. Som molekylevægtmarkørpro-teiner anvendes følgende proteiner: okseserumalbumin 4 25 (molekylvægt (mv): 6,6 x 10 ), kanintriosephophatisome- 4 4 rase (mv: 5,3 x 10 ), ovalbumin (mv: 4,5 x 10 ), svine- 4 pepsin (mv: 3,27 x 10 ), sojabønnetrypsininhibltor (mv: 4 4 2,05 x 10 ), hestemyoglobin (mv: 1,78 x 10 ) og heste- 4 cytochrom c (mv: 1,24 x 10 ).

30 Som følge heraf har rHu-TNF en molekylvægt på 45,000 + 5.000 Daltons og 18.000 + 3.000 Daltons med eller uden hhv. Urinstof og 2-mercaptoethanol.

cDNA'et, der er indsat i ekspressionspias-mid pHTR91, koder for 155 aminosyrerester (og udelader en 35 methionin afledt ud fra.et initieringscodon ATG. Den teoretiske molekylvægt for rHu-TNF beregnes til 17.097 0 36 DK 172013 B1

Daltons ud fra den udledte aminosyresekvens. Den beregnede molekylevægt stemmer overens med den værdi, der bestemmes i nærvær af urinstof og 2-mercaptoethanol.

Denne konstatering viser, at rHu-TNF forekom-5 mer som monomer (underenhed) i nærvær af urinstof og 2-mercaptoethanol, men forekommer som aggregat, f.eks. en trimer, uden denatureringsmidler.

(2) Det isoelektriske punkt. Det isoelektriske punkt bestemmes ved isoelektrofokuserende gelelektropho- 10 rese ved 3 watt i 3 timer ved hjælp af en 5%'s polya-crylamin-plangel med en pH-gradient i intervallet fra pH 4,0 til pH 6,5 opnået med "Pharmalyte" (Pharmacia).

Protein farves med Coomassie-strålende blåt.

Separat skrælles gelen til en bredde på 3 mm og neddyp- 15 pes i 20 millimolær Tris-HCl-(pH 7,8)-puffer for at e- luere et protein. Der påvises klart cytotoksisk aktivitet i et eluat fra gelen afskrællet fra den stilling, der svarer til placeringen af et protein, der påvises ved farvningen.

20 rHu-TNF's isoelektriske punkt viser sig at være 5,9 + 0,3.

(3) Aminosyresammensætning. rHu-TNF's aminosyre-sammensætning bestemmes med en mikro-aminosyreanalysa-tor (Shimadzu Seisakusho) ved hjælp af en fluorometrisk 25 metode ved brug af orthophthalaldehyd, efter at prøven er hydrolyseret med saltsyre, 50 mikrogram rHu-TNF hydrolyseres i 6N HC1 ved 110°C. Indholdet af aminosyrer beregnes ved at korrigere på basis af de værdier, der bestemmes med hver 30 prøve, der er hydrolyseret i 24, 48 og 72 timer. Cy-stin (eller cystein) bestemmes som en cysteinsyre omdannet ved hjælp af permyresyreoxidation. Tryptophan bestemmes ved hjælp af en fluorometrisk metode ifølge Pajot, Eur. J. Biochem. 6_3, 263 (1976) .

35 Resultaterne findes i tabel I.

0 37 DK 172013 B1

Tabel i

Aminosyre Relative molmængder 5 Asp + Asn 12,1

Thr 5r5

Ser 12,4

Glu + Gin 20,3

Pro 10,3 10 Gly 10,6

Ala 13,0

Cys 1,5

Val 12,1

Met <0,1 15

Leu 17,7

Tyr 6,8

Phe 3,9

His 2,8 20 Lys 6,1

Arg 7,5

Trp 1,6 25 Aminosyresaimnensætningen stemmer godt overens med det, der udledes af basesekvensen, der koder for humant TNF-polypeptid.

_(4) Bestemmelse af den N-endestillede aminsyresekvens.

Den N-endestillede aminosyresekvens i rHu-TNF bestemmes 30 ved hjælp af Edman's nedbrydningsmetode (Arch. Biochem.

Biophys., 22, 475 (1942).

En phenylthiohydantoin-aminosyre afledt ud fra en N-endestillet aminosyre ved hjælp åf Edman's nedbrydningsmetode identificeres ved hjælp af højtydende væske- qc chromatografi ved anvendelse af en kolonne (4,6 x 250 mm) TSK-gel ODS-120A (Toyo Soda). Disse procedurer gentages 0 38 DK 172013 B1 serievis til bestemmelse af sekvensen i en nydannet N-endes tillet aminosyre.

Det viser sig derved, at den N-endestillede aminosyresekvens i rHu-TNF er som følger: 5 NI^-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp ---

Det er kendt,at nogle polypeptider, der er produceret i mikroorganismer ved anvendelse af rekombinant 10 DNA-teknologi, har en methioninrest afledt af en ini- tieringscodon (ATG) ved sin N-endestilling. Imidlertid kan i det i eksempel 5 fremstillede rHu-TNF ikke påvises en methioninrest ved N-endestillingen og derfor ikke fjernes fuldstændig.

15 (5) Bestemmelse af den N-endestillede aminosyresekvens.

Den C-endestillede aminosyresekvens i rHu-TNF bestemmes ved hjælp af den enzymatiske metode med carboxypeptidaser.

rHu-TNF fordøjes med carboxypeptidase-A og car-boxypeptidase-Y i molforhold mellem enzym og substrat på 20 hhv. 1:25 og 1:1000. De frie aminosyrer, der frigøres fra rHu-TNF's C-endestilling ved den dobbelte fordøjelse identificeres ved hjælp af en mikroaminosyreanalysa-tor (Shimadzu Seisakusho) ved passende intervaller fra 2 minutter til 180 minutter efter fordøjelsen.

25 Det viser sig herved, at rHu-TNF's C-endestil lede aminosyresekvens er som følger:

---Tyr-Phe-Gly-Ile-Ile-Ala-Leu-COOH

30 (6) Trypsinfordøjelse af rHu-TNF. 500 mikrogram rHu-TNF fordøjes med 20 mikrogram TPCK-behandlet trypsin (type XIII, Sigma Chemical Co.) i 5 millimol Tris-HCl-puffer (pH 7,8) ved stuetemperatur i 5 timer. Det fordøjede produkt underkastes præparativ isoelektrofo-35 kuserende gelelektrophorese som vist i eksempel 4-(2). Proteiner farves med Coomassie strålende blåt. Separat 0 39 DK 172013 B1 skrælles gelen til en bredde på 3 mm, og de afskrællede geler neddyppes i 20 mmol Tris-HCl-puffer (pH 7,8) for at eluere et protein.

Resultatet er, at det fordøgede produkt, der 5 elueres fra proteinskrællerne svarende til pH-zonen, der ligger ca. 0,3 lavere end rHu-TNF's isoeåektriske punkt, har cytotoksisk aktivitet.

Det fordøjede produkt med cytotoksisk aktivitet underkastes bestemmelse af den N-endestillede og 10 den C-endestillede aminosyresekvens ved de i hhv. afsnit (5) og (6) beskrevne metoder.

Herved er den delvise aminosyresekvens i det fordøjede produkt følgende: N-endestilling: NH2~Thr-Pro-Ser-Asp---

15 C-endestilling: ---Ile-Ala-Leu-COOH

At dømme ud fra aminosyresekvensen er det fordøjede produkt et polypeptid, der fremkommer ved fraspalt-ning af de fire N-endestillede aminosyrer (Ser-Ser-Ser-Arg) 20 fra rHu-TNF'et, og det har cytotoksisk aktivitet som nævnt ovenfor. Dette betyder, at mindst fire aminosyrer ved rHu-TNF's N-endestilling ikke har nogen betydning for dets biologiske aktivitet.

[III-2] Biologiske aktiviteter 25 (1) Cytotoksisk aktivitet mod muse-L-M-ceIle. Me toden til måling af den cytotoksiske aktivitet mod muse-L-M-celle (ATCC, CCL 1,2) er som følger:

En prøve på 0,1 ml fortyndes serievis med det nedenfor nævnte medium, og der sættes 0,1 ml af en 30 muse-L-M-cellesuspension (1 x 10^ celler/ml) til hver fordybning i en plade med 96 fordybninger (Flow Labs.).

Eagle's minimumsnødvendige medium (jf. f.eks. J. Paule "Cell and Tissue Culture", E.&S. Livingstone Ltd. (1970)] indeholdende 1% oksefosterserum anvendes. Pladen inku-35 beres ved 37°C i 48 timer i en fuldt humidificeret atmosfære indeholdende 5% carbondioxid. Efter inkubation 0 40 DK 172013 B1 tilsættes 20 mikroliter 25%'s glutaraldehyd for at fiksere levende celler. Efter fiksering vaskes pladen og tørres. Derpå tilsættes 0,1 ml 0,05%'s methylenblåtop-løsning for at farve de fikserede celler. Overskydende 5 methylenblåt vaskes af, og pladen tørres. Methylenblåt, der er associeret med de fikserede celler, elueres med 200 mikroliter 0,36N HC1, og absorbensen ved 665 run måles med en "Titertek Multiscan" (Flow Labs.). Absorbensen er proportional med antallet af levende celler.

10 Koncentrationen af biologisk aktivitet, der er nødvendig for at dræbe 50% af L-M-cellerne, defineres som 1 enhed/ ml. Den cytotoksiske aktivitet mod muse-L-M-celler bestemmes på de ovenfor nævnte betingelser og repræsenteres af "enheder (LM)" til forskel fra den cytotoksi-15 ske aktivitet mod muse-L-929-celler som målcelle.

Proteinindholdet bestemmes ved hjælp af O.H.

Lowry's et al.'s metode (J. Bio. Chem. 193, 265 (1951)].

Resultatet heraf er, at rHu-TNF'et har en specifik aktivitet på 2 x 10^ enheder (LM) eller mere pr.

20 mg protein.

(2) Antitumorvirkning på Meth-A-sarcom transplanter til mus. Antitumorvirkningen på mus med Meth-A-sarcom bedømmes ved hjælp af følgende metode: BALB/c-mus, der vejer ca. 23 g, transplanteres 25 intradermalt med 2 x 10^ Meth-A-sarcomceller i abdomen-huden, og 7 dage senere udvælges mus, hvis tumor er 6-7 mm i diameter. På 7. dagen efter tumortransplantationen indgives rHu-TNF i tumormassen eller intravenøst. Endo-toksinindholdet i rHu-TNF-tilberedningen er mindre end 30 0,01 ng pr. 1 x 10^ enheder (LM) cytotoksisk aktivitet.

Resultatet er, at der ved indgift i tumormassen iagttages en nekrotisk reaktion i tumortransplantatet hos alle mus, der injiceres med rHu-TNF i en dosis på 1 x 10 , 3 x 10 og 1 x 104 enheder (LM) pr. mus, in-35 den for 24 timer efter injektionen, og tumoren er fuldstændig regrederet ved forhold på hhv. 3:5, 5:5 og 5:5 for DK 172013 B1 0 41 hver dosis som vist. Ved intravenøs indgift iagttages en nekrotisk reaktion hos alle mus, der er injiceret med 3 4 rHu-TNF i en dosis på 3 x 10 og 1 x 10 enheder (LM) pr. mus, og forholdet for fuldstændig regression er hhv.

5 3 : 5 og 4:5.

(3) rHu-TNF1s inhiberende virkning på vakst af human- tumorce lier in vitro. rHu-TNF's inhiberende virkning på vækst af human-tumorceller og normale celler bedømmes in vitro under følgende betingelser. Hu- 4 10 man-tumorcelier eller normale celler udsås med 1 x 10 celler pr. fordybning i 1 ml Eagle's miniumsnødvendige medium indeholdende 10% oksefosterserum i en plade med 24 fordybninger. Der tilsættes rHu-TNF i en slutkoncen-tration på 100 enh. (LM)/ml og dyrkes derpå ved 37°C i 15 4 dage i fuldt humidificeret atmosfære indeholdende 5% carbondioxid. Fire timer før afslutningen af dyrknin- 3 gen tilsættes 1 mikrocurie H-thymidin til hver fordybning. Efter dyrkningen vaskes cellerne med phosphat-pufret saltvandsopløsning og lyses med 0,5%’s natrium- 3 20 dodecylsulfat. Mængden af H-thymidin inkorporeret i cellerne bestemmes ved at tælle radioaktiviteten i ly-satet.

Den inhiberende virkning anføres som et forhold for vækstinhiberingen beregnet ved hjælp af føl-25 gende ligning Vækstinhiberingsforhold (%) = (a-b)/a x 100 hvor a og b er de radioaktiviteter, der er inkorporeret i celler hhv. uden og med rHu-TNF.

Resultaterne, der er anført i tabel Ti, vi-30 ser, at rHu-TNF signifikant inhiberer væksten af human-tumorceller, men ikke påvirker normale celler. Denne konstatering viser, at rHu-TNF angriber tumorceller selektivt.

35 0 42 DK 172013 B1

Tabel II

Vækstinhi-

Human celle Oprindelse berings- _forhold 5 Normale celler: WI-38 (ATCC CCL 75) lungediploid ej inhib.

MRC-5 (AIICC CCL 171) lungediploid ej inhib.

IMR-90 (ATCC CCL 186) lungediploid ej inhib.

Tunorceller: 10 G-361 (ATCC CRL 1424) melanetn 75% HT-1376 (ATCC CRL 1472) blærecarcincm 49% ZR-75-1 (ATCC CRL 1500) brystcarcinon 97% HOS (ATCC CRL 1543) osteogen sarcan 47%

WiDr (ATCC CCL 218) colonadenocarcincm 37% 15 MCF7 (ATCC HTB 22) brystadenocarcincm 69% G-402 (ATCC CRL 1440) nyreleianyoblastem 98% PANC-1 (ATCC CRL 1469) epithelcarcincm 59%

HeLa (ATCC CCL 2) epithelcarcinom 31% 2o [III-3] Immunologisk egenskab rHu-TNF-opløsningen (100 enh. (LM)/ml] blandes med et lige så stort volumen 100-fold fortynding af det rensede antikaninplasma-TNF-antistof, der fremstilles i referenceeksempel 4. Efter inkubation ved 37°C i 2 ti-25 mer måles reaktionsblandingens cytotoksiske aktivitet ved hjælp af den metode, der er beskrevet ovenfor, og ved anvendelse af L-M-celler som målcelle.

Resultatet er, at rHu-TNF's cytotoksiske akti-vetet over hovedet ikke neutraliseres med antistoffet.

30 Det viser sig derfor, at humant TNF-polypeptid kan skelnes immunologisk fra kanin-TNF.

[IV]

Ved tilberedning af polypeptider ifølge opfindelsen kan disse foreligge i form af en opløsning eller 35 som et lyophiliseret produkt. Set ud fra et synspunkt vedrørende langvarig stabilitet er det ønskeligt.at de 0 43 DK 172013 B1 foreligger i form af lyophiliserede produkter. Det foretrækkes at tilsætte bærestoffer eller stabilisatorer til præparaterne. Eksempler på stabilisatorer omfatter albumin, globulin, gelatine, protamin, protaminsalte, gluco-5 se, galactose, xylose, mannitol', glucuronsyre, trehalose, dekstran, hydroxyethylstivelse og ikke-ioniske overfladeaktive midler (såsom polyoxyethylenfedtsyreestere, polyoxyethylenglycerolfedtsyreestere, polyoxyethylen-hær-det-ricinusolie, polyoxyethylenricinusolie, polyoxyethy1-10 enpolyoxypropylenalkylethere, polyoxyethylenpolyoxypropy-lenblokcopolymer, sorbitanfedtsyreestere, saccharosefedt-syreestere og glycerolfedtsyreestere).

[V]

Polypeptiderne ifølge opfindelsen er anvende-15 lige som antitumormidler, fordi de har selektiv cytotok-sisk virkning på tumorceller og regrederer tumorer hos tumorbærende dyr.

Sådanne polypeptidpræparater indgives fortrinsvis parenteralt eller topisk. De parenterale veje, såsom 20 intravenøst og intramuskulært, anvendes, når tumorceller strækker sig over et stort område eller metastaserer, eller når man tilsigter at hindre metastasering. Mod lokale tumorvæv foretrækkes direkte intratumor-indgift. Doseringen varierer afhængigt af typen og størrélsen af

25 tumorerne, af patientens tilstand og indgiftsvejen. I

2 7 reglen er den på 1 x 10 -1 x 10 enh. (LM)/kg, fortrinsvis 1 x 10^-1 x 10^ enh. (LM)/kg.

[VI]

De følgende eksempler og referenceeksempler 30 belyser opfindelsen mere specifikt.

I eksemplerne vil der blive henvist til tegningen, på hvilken fig. 1 viser restriktionsendunuclase-spalt-35 ningsstederne, der anvendes til fremstilling af DNA-frag menter, og retningerne og omfanget af sekvensinddelingen 0 44 DK 172013 B1 til bestemmelse af basesekvensen i det klonede cDNA, der koder for humant TNF-polypeptid [eksempel l-(9)], fig. 2 viser en fremgangsmåde til konstruktion af et ekspressionsplasmid pHTT26 [eksempel 2(1)], 5 fig. 3 viser en fremgangsmåde til konstruk tion af et ekspressionsplasmid pHTR91 [eksempel 2-(2)], fig. 4 viser en fremgangsmåde til konstruktion af et ekspressionsplasmid pHTS115 [eksempel 2-(3)], og 10 fig. 5 viser en fremgangsmåde til konstruktion af et ekspressionsplasmid pHTS37 [eksempel 2(4)].

Eksempel 1 (1) Fremstilling af TNF mRNA ud fra human-alveolære ma- 15 krofager _

Der indsamles human-alveolære makrofager ved broncho-alveolær skylning med phosphatpufret saltvands- 7 opløsning. De alveolære makrofager, 6,3 x 10 celler, suspenderes i RPMI-1640 medium indeholdende 10% oksefo-20 sterserum og udsås i petriskåle (8 cm i diameter) med g en celletæthed på 9 x 10 celler pr. skål. De fordyrkes ved 37°C i fuldt humidificeret atmosfære indeholdende 5% carbodioxid. Efter 1 times dyrkning tilsættes endotoxin (lipopolysaccharid afledt ud fra E. coli) , TPA 25 (phorbol-12-myristat-13-acetat) og cycloheximid (pro-teinsynteseinhibitor) til skålene, så at disses slut-koncentrationer bliver hhv. 10 mikrogram/ml, 10 ng/ml og 1 mikrogram/ml. Dyrkningen fortsættes yderligere i 4-4,5 timer (ialt 5-5,5 timer). Dyrkningsmediet fjer-30 nes ved sugning, og de makrofager, der klæber til skålene, lyses og homogeniseres i en 5 molær guanidylthiocy-anatopløsning indeholdende 0,6% natrium-N-lauroylsar-cosinat og 6 millimolær natriumcitrat. Homogenatet kommes i en 5,7 molær cæsiumchloridopløsning, der indehol-35 der 0,1 molær EDTA, og centrifugeres i 20 timer ved 26.500 omdr./min ved hjælp af en ultracentrifuge 0 45 DK 172013 B1 (RPS27-2-rotor, Hitachi Koki), hvorved der fås en total RNA-fraktion som pellets. Disse opløses i en lille smule 7 molær urinstofopløsning indeholdende 0,35 molær NaCl, 20 mmolær Tris-HCl (pH 7,4) og 20 mmolær EDTA og udvindes 5 ved fældning ud fra ethanol. Der fås ialt 159 mikrogram total RNA.

Den totale RNA-fraktion opløses i 1 ml 10 mmolær Tris-HCl-puffer (pH 7,4) indeholdende 1 mmolær EDTA (vil blive omtalt som TE-opløsning), og opløsningen op-10 varmes ved 65°C i 5 minutter. Der tilsættes en NaCl-op-løsning til en slutkoncentration på 0,5 molær, og opløsningen påføres en kolonne af oligo(dT)-cellulose, der i forvejen er bragt i ligevægt med TE-opløsningen indeholdende 0,5 molær NaCl. Der elueres poly(A)mRNA fra ko-15 lonnen med TE-opløsningen i et udbytte på 8 mikrogram.

Poly(A)mRNA'et opløses til en koncentration på 1,9 ng/nl i destilleret vand, og opløsningen injiceres i oocyter fra Xenopus laevis i en dosis på ca. 50 ni pr. oocyt ved hjælp af mikroinjiceringsmetode. 10 20 oocyter inkuberes i 100 mikroliter Barth's medium [J.B.

Gurdon, J. Embryol. Exp. Morphol. 2SLt 401 (1968)) ved 22°C i 24 timer. Oocyterne homogeniseres og centrifugeres ved 10.000 omdr./m i 10 minutter. Det ovenpå flydende lag analyseres for TNF-aktivitet ved at be-25 stemme den cytotoksiske aktivitet mod muse-L-929-celler.

Metoden til måling af den cytotoksiske aktivitet mod L-929-celler er som følger:

En prøve på 0,1 ml, der er fortyndet serievis med det nedenfor nævnte medium,og 0,1 ml af en suspen- 5 30 sion af L-929-celler (5 x 10 celler/ml) indeholdende actinomycin D (2 mikrogram/ml) tilsættes til hver fordybning i en plade med 96 fordybninger (Flow Labs.).

Der anvendes Eagle's minimumnødvendige medium indeholdende 1% oksefosterserum. Pladen inkuberes ved 38,5°C i 35 18 timer i en fuldt humidificeret atmosfære indeholden de 5% carbondioxid.

0 46 DK 172013 B1

Fremgangsmåderne til bestemmelse af antallet af levende L-929-celler og til bedømmelse af den biologiske aktivitet er de samme som ved analysen for cyto-toksisk aktivitet, idet der anvendes muse-L-M-celler 5 som målcelle som nævnte i afsnit [111-2-(1)].

Den cytotoksiske aktivitet mod L-929-celler, der bestemmes under de ovennævnte betingelser, anføres som enheder (L-929)" til forskel fra den cytotoksiske aktivitet mod muse-L-M-celler.

10 Det ovenpå flydende lag, der er fremstillet som anført ovenfor, har en cytotoksisk aktivitet på 6,6 enheder (L-929)/ml. Dette viser, at poly(A)mRNA-præpa-ratet indeholder TNF mRNA.

(2) cDNA-syntese 15 Komplementært DNA syntetiseres ifølge Gubier og Hoffman's metode [Gene 25, 263 (1983)] ved hjælp af det poly(A)mRNA, der fås i afsnit (l),som skabelon.

6 mikrogram af poly(A)mRNA'et opløses i 40 mikroliter 50 mmolær Tris-HCl-puffer (pH 8,3) indehol-20 dende 10 mmolær MgCl2, 10 mmolær dithiothreitol, 4 mmolær natriumpyrophosphat, 1,25 mmolær af hvert af de tre desoxyribonucleotidtriphosphater dGTP, dATP og dTTP, 0,5 32 mmolær dCTP, 167 nmolær a- -P-dCTP (specifik radioaktivitet 3.00 Ci/mmol), 4 mikrogram oligo(dT)^2-l8 °9 25 120 enheder omvendt transscriptase afledt ud fra avian- myeloblastosevirus (AMV) og inkuberet ved 43°C i 30 minutter. Derpå afbrydes reaktionen ved tilsætning af EDTA. Reaktionsblandingen ekstraheres med phenol/chlo-roform = 1:1, og der tilsættes ammoniumacetat til den 30 vandige fase til en slutkoncentration på 2,5 molær. Det fremkomne dDNA-mRNA-hybrid udvindes fra den vandige fase ved fældning ud fra ethanol. cDNA-mRNA-hybrid-bund-faldet opløses i 100 mikroliter 20 mmolær Tris-HCl-puf-fer, pH 7,5) indeholdende 5 mmolær MgCl2, 10 mmolær 35 (NH^)2SO^, 100 mmolær KC1, 0,15 mmolær β-nicotinamid- -adenindinucleotid, 5 mikrogram okseserumalbumin, 0,04 0 47 DK 172013 B1 mmolær af hver af fire desoxyribonucleotidtriphosphater dGTP, dATP, dTTP og dCTP, 0,9 enhed E. coli-ribonuclase H og 23 enheder E. coli-DNA-polymerase I og inkuberes ved 12°C i 60 minutter og videre ved 22°C i 60 minutter 5 for at syntetisere et dscDNA. Reaktionen afbrydes ved tilsætning af EDTA. dscDNA'et ekstraheres med phenol/ chloroform og udvindes ved fældning ud fra ethanol som ovenfor.

(3) Fremstilling af cDNA med oligo(dC)-hale Ί0 dscDNA'et, der fås ovenfor, opløses i 100 mi- kroliter 100 mmolær natriumcacodylatpuffer (pH 7,2) indeholdende 2 mmolær CoCl9, 0,2 mmolær dithiothreitol, 0,1 mmolær α P-dCTP (specifik radioaktivitet 3 Ci/mmol) og 10 enheder endestillet deoxynucleotidyltransferase, 15 hvilket inkuberes ved 37°C i 30 minutter, så at der kan tilføjes oligo(dC)-haler til dscDNA'ets 3»-endestilling.

Reaktionen afbrydes ved tilsætning af EDTA. det med oligo(dC)-hale forsynede dscDNA ekstraheres med phenol/chloroform og udvindes ved fældning ud fra ethan-20 ol. Det med oligo(dC)-hale forsynede dscDNA opløses i 10 mmolær Tris-HCl-puffer (pH 7,4) indeholdende 1 mmolær EDTA og 100 mmolær NaCl, så at det indeholder'2 mikrogram af det med oligo(dC)-hale forsynede dscDNA pr. ml.

(4) Fremstilling af med oligo(dG)-hale forsynet pBR322 25 DNA_ 10 mikrogram pBR322 DNA opløses i 100 mikro-liter 20 mmolær Tris-HCl-puffer (pH 7,4) indeholdende 10 mmolær MgC^, 50 mmolær (NH^^SO^ og 10 mikrogram okseserumalbumin, og 15 enheder restriktionsendonuclease 30 PstI tilsættes. Blandingen inkuberes ved 37°C i en time. Efter at reaktionen er afsluttet, ekstraheres reaktionsblandingen med phenol/chloroform, og det fremkomne DNA udvindes fra den vandige fase ved fældning ud fra ethanol. Det opnåede DNA opløses i 200 mikroliter af 35 samme reaktionspuffer, der anvendes til at forsyne dscDNA’et ovenfor med hale (med undtagelse af, at det 0 48 DK 172013 B1 indeholder 80 enheder endestillet desoxynucleotidyltrans- 3 32 ferase og H-dGTP i stedet for P-dCTP) og inkuberes ved 37°C i 20 minutter for at tilføje ca. 10-15 desoxy-guanylsyre-(dG)-rester til 3'-endestillingerne. Reak-5 tionsblandingen ekstraheres med phenol/chloroform, og det med oligo(dG)-hale forsynede pBR322 DNA udvindes fra den vandige fase ved ethanolfældning. Det fremkomne med hale forsynede pBR322 DNA opløses i samme puffer, der anvendtes til opløsning af det med oligo(dC)-hale forsyne-10 de dscDNA, så at det indeholder et med hale forsynede pBR322 DNA i en koncentration på 20 mikrogram pr. ml.

(5) Konstruktion af rekombinante plasmlder 120 mikroliter af opløsningen af det med oligo--(dC)-hale forsynede cDNA blandes med et lige så stort 15 volumen opløsning af det med oligo(dG)-hale forsynede pBR322 DNA, og blandingen inkuberes først ved 65°C i 5 minutter og ved 57°C i 120 minutter for at udføre lukning og for at konstruere rekombinante plasmider.

(6) Udvælgelse af transformanter 20 E. coli Xl776-stamme transformeres med de oven for opnåede rekombinante plasmider.

Specifikt dyrkes E. coli X1776 ved 37°C i 20 ml L-næringssuppe (sammensætning: 10 g trypton, 5 g gærekstrakt, 5 g NaCl og 1 g glucose pr. liter, pH 7,2) sup-25 pieret med 100 mikrogram/ml diaminopimelinsyre og 40 mikrogram/ml thymidin, indtil der nås uklarhed ved 600 nm på 0,5. Cellerne opsamles ved centrifugering ved 4°C og vaskes med 10 ml 10 mmolær Tris-HCl-puffer (pH 7,3) indeholdende 50 mmolær CaCl2· Cellerne gensuspen-30 deres i 2 ml af samme puffer, som anvendes ovenfor og henstår ved 0°C i 5 minutter. Til 0,2 ml af suspensionen tilsættes 0,1 ml af opløsningen af de rekombinante plasmider, der fremstilles ovenfor. Blandingen henstår ved 0°C i 15 minutter og holdes derpå på 42°C i 2 minut-35 ter. Derpå tilsættes 0,5 ml af den supplerede L-næringssuppe som anvendes ovenfor, og dyrkningen udføres under 0 49 DK 172013 B1 rystning i 1 time. En alikvot mængde af kulturen udtages, spredes på den supplerede L-næringssubstratagarplade, der indeholder 15 mikrogram/ml tetracyclin, og dyrkes ved 37°C i ca. 12 timer. Der fremstilles en cDNA-sam-5 ling ved at udvælge transformater, der er resistente mod tetracyclin.

(7) Kloning af human-TNF cDNA

Transformanter, der rummer de rekombinante plasmider indeholdende sDNA'er, der koder for humant TNF-10 -polypeptid, udvælges fra den cDNA-samling, der fås i afsnit (6) ved en kolonihybridiseringsanalyse ved hjælp af DNA-fragmenter fremstillet ud fra det klonede cdNA, der indkoder kanin-TNF, som sonder.

Specifik isoleres cDNA'et, der koder for kanin-15 -TNF, fra det rekombinante plasmid pRTNF802, som vist i referenceeksempel 1. Dets basesekvens er vist i tabel III. cDNA'et fordøjes med restriktionsendonuclasen Aval eller Haell. De fordøjede DNA-fragmenter udvindes ved fældning ud fra ethanol. De underkastes poly-20 acrylamidgelelektrophorese for at isolere ønskede DNA--fragmenter.

DNA-fragmentet (299 bp), der svarer til 285. til 583. base som vist i formel 3, fås ved fordøjelse med restriktionsendonucleasen Aval (vil blive omtalt 25 som Aval-fragment). Et andet DNA-fragment (88 bp) svarende til 33.-120. base vist i Vormel 3 fås ved fordøjelse med restriktionsendonuclase Haell (vil blive omtalt som Haell-fragment). Aval-fragmentet og Haell- 32 -fragmentet mærkes med P. Disse mærkede DNA-frag- 30 menter anvendes som sonde til screening af cDNA-samlin- gen for at udvælge transformanter med et plasmid, der indeholder cDNA , der koder for humant TNF-polypeptid, ved hjælp af kolonihybridiseringsanalysen ifølge Hana- han og Meselson's metode .12., 63,(1980).

35 Ud af ca. 20.000 kloner udvælges 43 kloner 32 ved 1. screening, hvor der anvendes det P-mærkede DK 172013 B1 50 o

Aval-fragment som sonde. Endvidere underkastes disse 43 udvalgte kloner en næste screening, hvor der anvendes 32 P-mærket HaeII-fragment som sonde.

Til sidst udvælges ved disse analyser 6 klo-5 ner, der rummer de rekombinante plasmider med cDNA'er, der hybridiserer stærkt med begge kanin-TNF cDNA-fragmen-terne.

(8) Ekspression

Rekombinante plasmid-DNA'er isoleres ved hjælp 10 af Wilkie et al.'s metode [Nucleic Acid Res. J, 859 (1979)] ud fra de seks transformater, der udvælges i afsnit (7) kaldet plasmid nr. pHTNPl, pHTNF4, pGTNF5, pHTNFl3, pHTNF22 og pHTNF26. Hvert at de rekombinante plasmider indføres i E. coli HB101 ifølge samme metode som beskrevet i 15 afsnit (6) til fremstilling af transformanter, der rummer de rekombinante plasmider.

Transformanterne dyrkes i 50 ml LB-næringssup-pe [sammensætning: 10 g trypton, 5 g gærekstrakt og 10 g NaCl pr. liter, pH 7,5], indtil uklarheden ved 600 niu 20 af kulturen når ca. 0,8. Derpå opsamles 3-5 x 1010 celler. Cellerne lyses ved hjælp af Nagata m.fl.'s metode [Nature 284, 316 (1980)] med små modifikationer. Cellerne gensuspenderes i 1 ml 50 mmolær Tris-HCl-puffer (pH 8,0) indeholdende 0,1% lysozym og 30 mmolær NaCl.

25 Efter henstand i 30 minutter i isvand lyses cellerne ved gentagen frysning-optøning 6 gange. Cellerestma teriale fjernes ved centrifugering, hvilket giver et klaret lysat. Lysatet, der fås fra hver transformant, underkastes analyse for cycotoksisk aktivitet mod L-929-30 -celler.

Det viser sig derved, at det opnåede lysat fra transformanten, der rummer plasmid pHTNF13, har cytotoksisk aktivitet på 186,1 enheder (L-929)/ml.

(9) Bestemmelse af basesekvensen i det klonede cDNA

35 Det rekombinante plasmid pHTNF13 isoleres som ovenfor. Plasmid-DNA'et spaltes med restriktionendo- 0 51 DK 172013 B1 nuclease PstI for at isolere et klonet cDNA, der er indsat i en vektor. Det klonede cDNA-fragment spaltes yderligere med forskellige restriktionsendonuclaser, og basesekvenserne i de fremkomne 16 fragmenter bestemmes ved 5 hjælp af Maxam-Gilert-metoden.

Fig. 1 viser restriktionsendonucleasespaltninqs-stederne, der anvendes til fremstilling af fragmenterne, og retningerne for sekvensinddelingen er vist ved pile.

Det rektangulære areal er en kodningsregion for human-10 -TNF-precursor-polypeptid. Formel 4 viser den bestemte basesekvens og aminosyresekvensen, der udledes ud fra basesekvensen. Regionen, der koder for humant TNF-poly-peptid, bestemmes på basis af homologi med den basesekvens, der koder for kanin-TNF.

15 Det DNA, der koder for humant TNF-polypeptid, koder for dets precursor-polypeptid, der består af 233 aminosyrerester. Det modne human-TNF-polypeptid er et polypeptid, der svarer til de 155 aminosyrerester fra dets Precursors carboxyendestilling, som er kodet i ba-20 sesekvensen fra base nr. 235 til base nr. 699 i formel 4 (regionen i parentes i formel 4). En terminerings-codon efterfulgt af den sidste codon, der koder for humant TNF-polypeptid, er en opalcodon TGA.

(10) Humant TNF-polypeptids immunologiske egenskab 25 Humant TNF-polypeptid immunologiske krydsreak tivitet i lysatet, der fås ovenfor, med anti-kanin--plasma-TNF-antistof afprøves på følgende måde:

Lysatet blandes med et lige så stort volumen af en 100 fold fortynding af det rensede anti-kaninplas-30 ma-TNF-antistof, der fås i referenceeksempel 4. Efter inkubation ved 37°C i 2 timer måles reaktionsblandingens cytotoksiske aktivitet ved hjælp af den ovenfor beskrevne metode, hvor der anvendes L-929-celler som målcelle. Kaninplasma-TNF, der fås i referenceeksempel 2, fortyn-35 des i forvejen med phosphatpufret saltvandsopløsning, og fortyndingen anvendes som et kontrol-TNF-præparat.

0 52 DK 172013 B1

Som resultatet nedenfor viser, neutraliseres humant TNF--polypeptids cytotoksiske aktivitet ikke med antistoffet.

5 Anti-kanin- Φ plasma-TNF- Cytotoksisk aktivitet

Prøve_-antistof_enheder (L-929)/ml

Lysat fra transfor- ej tilsat 186,1 manten, der rummer tilsat 191(0 10 plasmid pHTNF13

Kaninpiasma-TNF ej tilsat 572,3 tilsat «t.0,1 * Cytotoksisk aktivitet vises som aktiviteten i den 15 oprindelige prøveopløsning, der anvendes til prøven.

Eksempel 2

Fremstilling af humant TNF-polypeptid i Escherichia coli (1) Ekspression under tac-promotors styring 20 Det klonede cDNA isoleres ud fra det rekombi- nante plasmid pHTNFl3 som nævnt i eksempel 1. cDNA'et fordøjes yderligere med restriktionsendonucleasen EcoRI for at afskære en del af den ikke-kodende region længere fremme i TNF-kodningsregionen. Det fremkomne DNA-25 -fragment (ca. 1,1 kbp) indsættes i et større DNA-frag-ment fremstillet ud fra plasmid pBR322 ved fordøjelse med restriktionsendonucleaserne PstI og EcoRI for at konstruere et rekombinant plasmid, der omfatter TNF cDNA og et tetracyclin-resistent gen, som kaldes pHTH3.

30 Et ekspressionsplasmid pHTT26, der bærer et cDNA, der koder for det modne humant TNF-polypeptid, konstrueres ved hjælp af den i fig. 2 viste procedure.

cDNA'et, der er isoleret fra pHT113, fordøjes med restriktionsendocunleaserne Aval og Hindlll, og det 35 fremkomne DNA-fragment (578 bp), herunder det meste af kodningsregionen for det modne humant TNF-polypeptid 0 53 DK 172013 B1 (vil blive omtalt som HTNF-fragment), isoleres ved hjælp af polyacrylamidgelelektrophorese.

Et DNA-fragment, der omfatter en tac-promotor--region, isoleres på følgende måde: 300 mikrogram plas- 5 mid-DNA af pDR540 [P-L Biochemicals/ D.R. Russell et al..

Gene 20, 231 (1982)] opløses i 2 ml 10 mmolær Tris-HCl-puffer (pH 7,5) indeholdende 50 mmolær NaCl, 6 mmolær MgCl2 og 6 mmolær 2-mercaptoethanol og fordøjes med re-striktionsendonuclaserne EcoRI og BamHI ved inkubering 10 ved 37°C i 60 minutter. Efter tilsætning af NaCl, så at der fås en slutkoncentration på 0,3 molær, udvindes de fordøjede DNA-fragmenter ud fra ethanol. DNA-frag-mentet, der omfatter en tac-promotor-region, isoleres ved polyacrylamidgelektrophorese i et udbytte på 8,3 15 mikrogram.

tac-Promotofragmentet ligateres med et kemisk syntetiseret oligodesoxyribonucletid-mellemstykke med følgende formel:

5'-GATCCATGTCATCTTCTCGAACC 20 3'-GTACAGTAGAAGAGCTTGGGGCT

Dette mellemstykke omfatter en initieringscodon ATG og en basesekvens svarende til den 51-endestillede del af basesekvensen, der koder for det modne humant TNF-polypep-25 tid, og har BamHI- og Abal-klæbeender. Det fremkomne DNA-fragment omtales som tac-promotor-mellemstykkefrag-ment.

Separat afskæres et større DNA-fragment (ca.

4,3 kbp), der omfatter et ampicillin-resistent gen (der 30 vil blive omtalt som pBR322-Ampr-fragment), ud fra plasmid pBR322 ved fordøjelse med restriktionsendonuclaser-ne Hindlll og EcoRI og isoleres ved gelelektrophorese ved hjælp af en lavt smeltende agarose (0,7%).

1 mikrogram af HTNF-fragmentet og 6 mikrogram 35 af pBR322-Ampr-fragmentet opløses i 66 mmolær Tris-HCl--puffer (pH 7,6) indeholdende 6,6 mmolær MgCl2 og inku- 0 54 DK 172013 B1 beres ved 55°C i 10 minutter. Derpå tilsættes ATP og di-threitol indtil hhv. 1 og 10 mmolær, og der tilsættes 168 enheder T^-DNA-ligase, og blandingen inkuberes yderligere ved 22°C i 120 minutter. Det fremkomne DNA-5 -fragment udvindes ved ekstraktion med phenol i et udbytte på ca. 4 mikrogram. DNA-fragmentet (0,8 mikrogram) ligateres med tac-promotor-mellemstrykke-fragmentet (0,3 mikrogram) under samme betingelser som ovenfor med undtagelse af, at der anvendes 63 enheder T^-DNA-ligase.

10 Reaktionsblandingen fortyndes til 6 fold med destilleret vand og blandes med et lige så stort volumen af suspensionen af E. coli HM103-celler (P-L-Biochemiclas), der er behandles med calcium som vist nedenfor. Blandingen inkuberes først i isvand i 20 minutter, derpå 15 ved 42°C i 1 minut og ved stuetemperatur i 10 minutter, og der tilsættes LB-næringssuppe. Blandingen rystes ved 37°C i 60 minutter. En alikvot mængde af den fremkomne cellesuspension spredes på LB-agarplader indeholdende 25 mikrogram/ml ampicillin og dyrkes natten over 20 ved 37°C. De ampicillin-resistente kolonier udvælges.

En af transformanterne, der er i stand til at producere human-TNF-polypeptid, kaldes JMl03/pHTT26.

De calciumbehandlede E. Coli JMl03-celler fremstilles på følgende måde; E. coli JMl03-celler in-25 okkuleres i 5 ml L-næringssuppe og dyrkes natten over ved 37°C, indtil der nås uklarhed ved 650 nm i kulturen på 0,6. Efter henstand i 30 minutter i isvand opsamles cellerne ved centrifugering og suspenderes i 50 ml 50 mmolær CaCl2 efterfulgt af henstand ved 0°C i 60 minut- ΟΛ ter. Cellerne opsamles ved centrifugering og suspenderes atter i 10 ml 50 mmolær CaCl2 indeholdende 20% glycerol, og dette anvendes som de calciumbehandlede E. coli JM103-celler.

Transformanten JM103/pHRR26 dyrkes natten o-

35 O

ver i LB-næringssuppe ved 37 C. Kulturen (0,5 ml) in- okuleres i 5 ml frisk LB-næringssuppe og dyrkes yderli- 0 55 DK 172013 B1 gere ved 37°C i 1 time. Derpå tilsættes isopropyl-3-D--thiogalactosid til en slutkoncentration på 1 mmolær, og dyrkningen fortsættes i yderligere 4 timer. Cellerne opsamles og suspenderes i 1 ml 50 mmolær Tris-HCl-5 -puffer (pH 8,0) indeholdende 0,1% lysozym og 30 mmolær NaCl og henstår ved 0°C i 30 minutter. Derpå gentages frysning på et tøris/ethanol-bad og optøning ved 37°C 6 gange, og cellerester fjernes ved centrifugering, hvilket giver et klaret lysat.

10 Lysatet har en cyctotoksisk aktivitet på 9,9 4 x 10 enheder (L-929)/ml. Denne cytotoksiske aktivitet neutraliseres ikke med antistof mod kaninplasma-TNF som vist i referenceeksempel 4. Det bekræftes, at humant TNF--polypeptid ikke krydsreagerer immunologisk med kanin-15 plasma-TNF.

(2) Ekspression under kontrol af trp-promotor♦

Der konstrueres et ekspressionsplasmid pHTR91 ved hjælp af den i fig. 3 viste metode.

Det rekombinant plasmid pHTH3 fordøjes med 20 restriktionsendonuclaserne Aval og Sall, så det opskæres i 3 fragmenter (med en størrelse på ca. 0,8 kbp, 1,3 kbp og 2,6 kbp). DNA-fragmentet på 1,3 kbp, der omfatter det meste af kodningsregionen for det modne humant TNF-polypeptid og en del af det tetracyclinresistente 25 gen, isoleres (vil blive omtalt som Aval-Sall-fragment), Aval-Sall-fragmentet ligateres med følgende kemisk syntetiserede oligodesoxyribonucleotid-mellemstykke. Dette mellemstykket (adaptor) omtales som adaptor I.

30 5-CGATATGTCATCTTCTCGAACC

3'-TATACAGTAGAAGAGCTTGGGGCT

Det fremkomne DNA-fragment omtales som HTNF--adaptorfragment.

35 Separat udskæres DNA-fragmentet (35 bp) omfat tende en del af trp-promotor-regionen fra et plasmid 0 56 DK 172013 B1 pDR720 [P-L-Biochemicals, D.R. Russell et al., Gene 20, 231 (1982) ] ved fordøjelse med restrictionsendonuclaser-ne EcoRI og Hpal, og DNA-fragmentet ligateres med en kemisk syntetiseret adaptor med formlen: 5

5'-AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAAT

3' -TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTTTTCCCATTAGC

10 Det ligaterede DNA-fragment kaldes trp-promo- torfragment.

Plasmid pBR322 fordøjes med restrictionsendo-nucleaserne EcoRI og Sall, og der isoleres et større DNA--fragment (ca. 3,7 kbp). Ved ligatering efter hinanden 15 af disse fre DNA-fragmenter, HTNF-adaptorfragmentet, trp--promotorfragmentet og det større pBR322-fragment, konstrueres et ekspressionsplasmid pHTR91. Ekspressions-plasmidet indføres i E. coli HBlOl-celler ved hjælp af den i afsnit (1) beskrevne metode, og en af transforman-20 terne kaldes HB101/pHTR91.

Transformanten HB101/pHTR91 dyrkes natten over ved 37°C i det modificerede M-9-medium (sammensætning: 0,7% Na2HP04.12H20, 0,3% KH2PC>4, 0,05% NaCl, 0,1% NH4C1, 2 mg/liter vitamin B^, 0,45% casaminosyre, 1 mmolær 25 MgS04, 0,1 mmolær CaCl2 og 0,5% glucose). Kulturen (0,05 ml) inokuleres i 5 ml af det samme medium og dyrkes ved 37°C i en time. Derpå tilsættes 3-8-indolacrylsyre, så at der fås en slutkoncentration på 20 mikrogram/ml, og dyrkningen fortsættes i 4 timer. Cellerne opsamles og 30 behandles ved hjælp af samme metode som beskrevet i afsnit (1), så at der fås et klaret lysat.

Lysatet har en cytotoksisk aktivitet på 1,01 x 10^ enheder (L-929)/ml.

(3) Ekspression under kontrol af phoS-promotor.

35 Et ekspressionsplasmid pHTSHS, der kan pro ducere humant TNF-polypeptid, sammensmeltet med signal- 0 57 DK 172013 B1 peptidet og den N-endestillede del af et phosphatbin-dende protein, og det sammensmeltede protein udskilles i værtscellers periplasmaer, konstrueres ved hjælp af den i fig. 4 viste metode.

5 Aval-Sall-fragmentet, der fås i afsnit (2), ligateres med en kemisk syntetiseret oligodesoxyribo-nucleotidadaptor med følgende sekvens:

5’-GATCCATGTCATCTTCTCGAACC 10 31-GTACAGTAGAAGAGCTTGGGGCT

Det ligaterede DNA-fragment fordøjes med re-striktionsendonucleasen BamHI, så at der fås et DNA--fragment med BamHI-klæbrige endestillinger i begge 15 ender (vil blive kaldt HTNF-Tetr.BAMHI-fragment).

Separat fordøjes plasmid pSN5182 [T. Morita m. fl., Eur. J. Biochem., 130, 427 (1983)] indeholdende et phoS-gen, med restrictionsendonucleaserne Hpal og EcoRI til fremstilling af DNA-fragmentet (ca. 4 kbp), der om-20 fatter phoS-promotor-regionen og Shine-Dalgarno-sekven-, sen, DNA-sekvensen, der koder for signalpeptidet og den N-endestillede del af et phosphatbindende protein og det tetracyclinresistente gen. Dette DNA-fragment omtales som Hpal-EcoRI-fragment. Hpal-EcoRI-fragmentet ligate-25 res med et kemisk syntetiseret oliogdesoxyribonucleotid-forbindelsesstykke med følgende sekvens: 5'-CCCGGATCCGGG 3'-GGGCCTAGGCCC 30

Derpå fordøjes det ligaterede DNA-fragment med restriktionsendonucleasen BamHI. Det fremkomne DNA-fragment (ca. 3,6 kbp) med BamHI-klæbrige endestillinger i begge ender omtales som phoS-£romotor-BamHI.Tet -fragment.

35 HTNF-Tetr.BamHI-fragmentet ligateres med 4 phoS-promotor-BamHI.Tet -fragmentet, så at der konstrue- 0 58 DK 172013 B1 res et ekspressionsplasmid til produktion af humant TNF-“polypeptidet sammensmeltet med et phosphatbindende protein, der kaldes pHTS115. Ekspressionsplasmidet indføres i E.coli HB101 ifølge den ovenfor beskrevne metode.

5 En af transformanterne (HPl01/pHTS115) dyrkes i 5 ml TG-medium (sammensætning: 120 mmolær Tris-HCl--puffer (pH 7,4) indeholdende 0,2% glucose, 80 mmolær NaCl, 20 mmolær KC1, 20 mmolær NH^Cl, 3 mmolær Na2SO^, 1 mmolær MgCl2, 0,2 mmolær CaCl2, 200 nmolær FeCl^, 20 10 mg/liter leucin, 20 mg/liter prolin og 10 mg/liter vitamin B^) suppleret med 0,64 mmolær KH2PO^ ved 37°C i 20 timer under rystning. Cellerne opsamles ved centrifugering, gensuspenderes i 2 ml TG-medium suppleret med 0,064 mmolær KH2PO^ og dyrkes ved 37°C i 6 timer. Cel-15 lerne opsamles ved centrifugering og vaskes med 1 ml 10 mmolær Tris-HClpuffer (pH 7,2) indeholdende 30 mmolær NaCl. Derpå gensuspenderes de i 0,2 ml 33 mmolær Tris--HCl-puffer (pH 7,2) og blandes med et lige så stort volumen 33 molær Tris-HCl-puffer (pH 7,2) indeholdende 20 0,1 mmolær EDTA og 40% saccharose. Efter inkubering ved 37°C i 10 minutter opsamles cellerne og gensuspenderes i 0,4 ml afkølet 0,5 mmolær MgCl2 og henstår i isvand i 10 minutter under rystning af og til. Celleresterne fjernes ved centrifugering, så at der fås en kla-25 ret ekstrakt (der kaldes periplasmisk ekstrakt).

Den periplasmiske ekstrakt har en cytotoksisk aktivitet på 1,34 c 10^ enheder (L-929)/ml.

Molekylevægte af polypeptidet med cytotoksisk aktivitet bestemmes til 19.000 Daltons ved hjælp af na-triumdodecylsulfat-(SDS)-polyacrylamidgel-(12,5%)-elek-trophorese, der tyder på, at det fremstillede polypep-tid er et sammensmeltet (sammenbundet) protein.

(4) Ekspression under kontrol af phoS-promotor.

Der konstrueres et ekspressionsplasmid pHTS37, 35 der kan producere humant TNF-polypeptid sammenbundet med signalpeptidet og den N-endestillede del i et phosphat- 0 59 DK 172013 B1 bindende protein og det modne humant TNF-polypeptid med en del af dets precursordel og kan udskille det sam-menbundne protein i værtscellers periplasma, ved hjælp af den i fig. 5 viste metode.

5 Rekombinant plasmid-(pHTNF13)-DNA fordøjes med restriktionsendonuclease PstI, så at der udskæres et DNA-fragment (ca. 1,2 kbp), der omfatter human-TNF-cDNA. DNA-fragmentet fordøjes yderligere med restriktionsendonuclease Bbel, så at der fås et DNA-fragment 10 (ca. 0,9 kbp) vil blive omtalt som Bbel-Pstl-fragment.

6 mikrogram af Bbel-Pstl-fragmentet opløses i 80 mikro-liter 20 mmolær Tris-HCl-puffer (pH 8,0) indeholdende 12 mmolær CaCl2, 12 mmolær MgCl2, 0,2 mmolær NaCl, 1 mmolær EDTA og 0,02 enhed eksonuclease Bal31 og inkube-15 res ved 30°C i 30 minutter, så at der borttygges ca.

50-130 basepar fra begge ender af DNA-fragmentet. Derpå repareres fragmentet endestillinger ved inkubation ved 37°C i 60 minutter med 10 enheder E. coli-DNA-po-lymerase I (stort fragment) i nærvær af 0,1 mmolær af 20 hvert af fire desoxyribonucleotidtriphosphater, dCfP, dATP, dCTP og dTTP, samt 50 mikrogram/ml okseserumal-bumin. Det reparerede DNA-fragment fordøjes med re-striktionsendonucleasen EcoRI, og det fremkomne DNA--fragment (ca. 750 bp) med en stump ende og en EcoRI-25 -klæbrig ende isoleres i et udbytte på ca. 3 mikrogram (vil blive omtalt som Bal 31-EcoRI-fragment).

Bal 31-ExoRI-fragmentet ligateres med Hpal--EcoRI-fragmentet (ca. 4 kbp), der fås ud fra pSN5182 som beskrevet i afsnit (3), så at der konstrueres et ekspressionsplasmid, der indeholder phoS-promotorregi-onen, Shine-Dalgarno-sekvensen, DNA-sekvensen, der koder for signalpeptidet, og den N-endestillede del af et phosphatbindende protein samt DNA-sekvensen, der koder for det modne humant TNF-polypeptid og en del af 35 dets precursor-polypeptid.

o 60 DK 172013 B1

Ekspressionsplasmidet kaldes pHTS37, og det indføres i E.coli HB101, så at der fås en transformant, der kaldes HB101/pHTS37. Transformanten HRl01/pHTS37 dyrkes, og den periplasmiske ekstrakt fås under samme 5 betingelser som anført i afsnit (3).

Den periplasmiske ekstrakt, der fås, har en 5 cytotoksisk aktivitet på 4,93 x 10 ender (L-929)/ml.

Ekstrakten underkastes SDS-polyacrylamidgel--(12,5%)-elektrophorese. Elektrophoresen udføres ved 10 35 volt i 12 timer ved hjælp af Tris-glycinpuffer (pH

8,3) indeholdende 0,1% SDS. Protein farves med Coo-massie-strålende blåt. Der påvises to proteinbånd, som ikke iagttages i ekstrakten af E. coli HB101, i stillingerne der svarer til molekylevægte på ca. 22.000 15 og 16.500 Daltons. Separat rystes gelen, der er opskåret i 2 mm bredde, og hver gel rystes i 1 ml Eagle's minimumsnødvendige medium, der indeholder 1% oksefoster-serum, ved 4°C natten over for at eluere proteiner ud fra gelen. Hvert eluat anvendes til bestemmelse af den 20 cytotoksiske aktivitet mod muse-L-929-celler. Resultatet er, at der påvises en kraftig cytotoksisk aktivitet i eluatet fra gelen, der er afskåret fra den stilling der svarer til proteinet farvet med Coomassie-strå-lende blåt, og molekylvægten bestemmes til 16.500 25 Daltons.

Det antages ud fra opbygningen af ekspressionsplasmidet pHTS37, at humant TNF-polypeptid, der produceres i transformanten, skal være et protein sammenbundet af en del phosphatbindende protein og humant TNF-po-30 lypeptid og en dal af dets precursordel.

Den teoretiske molekylvægt for det sammen-bundne protein beregnes til ca. 23.000 Daltons. På den anden side er molekylvægten af det modne humant TNF-po-lypeptid 17.097 Daltons. Denne undersøgelse tyder på, 35 at det sammenbundne protein, der produceres, kan omdannes til det modne humant TNF-polypeptid i værtsceller o 61 DK 172013 B1 ved hjælp af begrænset hydrolyse, formodentlig på et særligt sted (Arg-Ser), der forbinder det modne humant TNF-polypeptid til dets precursordel.

Når den periplasmiske ekstrakt inkuberes med 5 5 mikrogram/ml trypsin (fra oksepancreas, Sigma Chemi cal Co.) ved 37°C i 1 time, og reaktionsblandingen underkastes SDS-polyacrylamid-gel-elektrophorese:under samme betingelser som ovenfor, påvises et proteinbånd i den stilling, der svarer til en molekylevægt på ca.

10 22.000 Daltons, hvilket kan være det sammenbundne pro tein, der er forsvundet ved trypsinfordøjelsen.

Eksempel 3

Fremstilling af modificeret humant TNF-polypeptid 15 Der konstrueres et ekspressionsplasmid pHTRD4, der bærer et DNA, der koder for et polypeptid, der fremkommer ved udeladelse af fire aminosyrer fra modent humant TNF-polypeptids N-endestilling, ved hjælp af samme procedure som ved ekspressionsplasmidet pHTR91, der er 20 beskrevet i eksempel 2(2), med undtagelse af, at der an-vedes følgende syntetiske adaptor i stedet for adaptor I:

5'-CGATATGACC

3'-TATACTGGGGCT 25

Ved anvendelse af ovennævnte syntetiske adaptor koder basesekvensen efterfulgt af en initieringsco-don (ATG) for en aminosyresekvens, der består af 151 a-minosyrerester, hvilket følger af udeladelse af 4 ami-30 nosyrer (Ser-Ser-Ser-Arg) fra modent human-TNF-polypep-tids N-endestilling.

Ekspressionsplasmidet pHTRD4, der er konstrueret ved ovennævnte metode, indfyres i E. coli HB101, og transformanten dyrkes natten over ved 37°C i det modi-35 ficerede M-9-medium. Kulturen (0,05 ml) inokuleres i 5 ml af samme medium og dyrkes ved 37°C i 1 time. Derpå 0 62 DK 172013 B1 tilsættes 3-3-indolacrylsyre, så at der fås en slutkon-centration på 20 mikrogram/ml, og dyrkningen fortsættes natten over. Cellerne opsamles ved centrifugering og behandles på samme måde som beskrevet i eksempel 2-(1), 5 så at der fås et klaret lysat.

Lysatet har en cytotoksisk aktivitet på 1,1 x 10^ enheder (L-929)/ml.

Eksempel 4 10 Fremstilling af humant TNF-precursor-polypeptid i Esche-richia coli._

Der konstrueres et ekspressionsplasmid pHTRP3, der bærer et cDNA, der koder for et humant TNF-precursor--polypeptid bestående af 233 aminosyrer, på følgende måde: 15 Det klonede cDNA isoleres ud fra det rekombinante plasmid pHT113 ved dobbelt fordøjelse med restriktionsendo-nucleaserne PstI og Hindlll, og cDNA-fragmentet fordøjes yderligere delvis med restriktionsendonucleasen HgiAI, så at der fås et DNA-fragment (ca. 820 bp), der omfatter 20 basesekvensen, der indkoder det meste af precursor-poly-peptidet. Det fremkomne DNA-fragment ligateres med et kemisk syntetiseret oligodesoxyribonucleotid-fragment med følgende formel:

25 5'-DVATATGAGCA

3 ' -TATAC

Det ligaterede DNA-fragment omtales som Pre--TNF-fragmentet.

30 Separat udskæres DNA-fragmentet, der indehol der en del af trp-promotor-regionen, ud fra plasmid pDR720 ved fordøjelse med restriktionsendonucleaserne EcoRI og Hpal, og DNA-fragmentet ligateres med følgende kemisk syntetiserede adaptor:

35 5'-AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAAT

3'-TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTTTTCCCATTAGC

0 63 DK 172013 B1

Det fremkomne DNA-fragment ligateres med Pre--TNF-fragmentet, og det ligaterede DNA-fragment kombineres med DNA-fragmentet (ca. 4,3 kbp), der har et ampicil-linresistent gen, isoleret ud fra plasmid pBR322 ved 5 fordøjelse med restriktionsendonucleaserne EcoRI og Hindlll.

Ekspressionsplasmidet pHTRP3, der konstrueres ved ovennævnte metode, indføres i E. coli HB101, og transformanten dyrkes natten over ved 37°C i det modificerede 10 M-9 medium. Kulturen (0,05 ml) inokuleres i 5 ml af sam me medium og dyrkes ved 37°C i 1 time. Derpå tilsættes 3-3-indolacrylsyre, så at der fås en slutkoncentration på 20 mikrogram/ml, og dyrkningen fortsætter natten over. Cellerne opsamles ved centrifugering og behandles på 15 samme måde som beskrevet i eksempel 2—(1), så at der fås et klaret lysat.

Lysatet har en cytotoksisk aktivitet på 1,8 x 104 enheder (L-929)/ml.

20 Eksempel 5

Produktion og rensning af humant TNF-polypeptid (1) Produktion i Escherichia coll. Transformanten HBl01/pHTR91, der fås i eksempel 2-(2), anvendes til fremstilling af humant TNF-polypeptid. Transforman-25 ten dyrkes natten over ved 37°C i LB-næringssuppe suppleret med 12,5 mikrogram/ml tetracyclin. Kulturen inokuleres i 10 volumendele af det modificerede M-9-medi-um, der anvendes i eksempel 2-(2), og dyrkes ved 37°C i 1 time. Efter tilsætning af 3-|3-indolacrylsyre, så 30 at der fås en slutkoncentration på 20 mikrogram/ml, fortsættes dyrkningen i 4 timer. Cellerne opsamles og behandles, så at der fås et klaret lysat ved hjælp af samme metode som i eksempel 2-(l). Lysatet anvendes til rensning af humant TNF-polypeptid.

35 (2) Rensning af humant TNF-polypeptid. Humant TNF- -polypeptid renses ud fra det lysat, der fås i afsnit 0 64 DK 172013 B1 (1) ved hjælp af følgende metode: Til en kolonne (5 x 20 cm) pakket med DEAE-"Sepharose" CL-6B (Pharmacia), der i forvejen er bragt i ligevægt med 20 mmolær Tris--HClpuffer (pH 7,8) tilføres 1030 ml af lysatet. Ko-5 lonnen vaskes med 3 liter af den samme puffer og elue-res derpå med en lineær gradient af NaCl fra 0 til 0,3 molær i samme puffer ved en strømningshastighed på 133 ml/time. Eluatet fraktioneres i 10 ml-fraktioner. De fraktioner, der har cytotoksisk aktivitet, opsamles og 10 slås sammen.

Udvinding af en cycotoksisk aktivitet er 53% i dette trin, og specifik aktivitet forøges op til ca.

9 gange.

De kombinerede aktive fraktioner afsaltes og 15 inddampes til 1/10 volumen ved ultrafiltrering med "Diaf lo" ved hjælp af en YM10-membran (Amicon).

Koncentratet underkastes præparativ isoelek-trofokuserende gelelektrophorese. En alikvot mængde koncentratet påføres en polyacrylamidgelplade (0,2 x 20 10 x 10 cm) med en pH-gradient fra pH 5,6 til pH 6,1, der fås med "Immobiline" (LKB). Elektrophoresen udføres ved 2.400 volt i 16 timer ved 15°C. Gelen opskæres i 10 mm's bredde, og proteinet elueres med 20 mmolær Tris-HClpuffer (pH 7,8). Ovennævnte procedure gen-25 tages. Eluaterne, der har cytotoksisk aktivitet, slås sammen og koncentreres ved ultrafiltrering som ovenfor.

Endelig påføres koncentratet en kolonne (0,7 x 25 cm) "Bio-Gel P-6" (BIO-RAD) og afsaltes.

Det afsaltede slutpræparat med cytotoksisk 30 aktivitet er homoget baseret på SDS-polyacrylamidgel-elektrophoretisk analyse, og det anvendes som renset humant TNF-polypeptid til analyser som nævnt i afsnit [III] · 35 0 65 DK 172013 B1

Eksempel 6

Fremgangsmåde til fremstilling af lyophiliseret humant TNF-polypeptid_

Den rensede humant TNF-polypeptidopløsning, 5 der fås ved den i eksempel 5 beskrevne metode# anvendes til fremstilling af et lyophiliseret, humant TNF-po-lypeptid.

10 ml af den rensede humant TNF-polypeptidop- 7 løsning, der har en cytotoksisk aktivitet på 2,2 x 10 10 enheder (LM) blandes med 1/10 volumen 8% NaCl indeholdende 10% humanserumalbumin og 20% D-mannitol. Efter at opløsningens pH er justeret til 6,8, steriliseres den fremkomne opløsning ved filtrering gennem "Micro-flow"-membran (Flow Labs., porestørrelse 0,2^u). 5 ml 15 af den sterile opløsning kommes i hætteglas og lyophi-liseres derpå. Hvert hætteglas indeholder 10^ enheder (LM) renset humant TNF-polypeptid.

Referenceeksempel 1 20 Fremstilling kanin-TNF cDNA

(1) Fremstilling af TNF mRNA ud fra makrofager af kaninalveole. Kaniner (der vejer ca. 2,5 kg) injiceres intravenøst med dræbte tørrede celler af Propionibacterium aenes i en dosis på 100 mg pr. kanin 25 og aflives 8 dage senere. Lungerne vaskes gentagne gange med phosphatpufret saltvandsopløsning gennem et rør indsat i dyrenes trachea, og der opsamles alveolæ- 9 re makrophager. Der fås ca. 3 x 10 alveolære makro-phager fra 12 kaniner.

30 De alveolære makrophager suspenderes i RPMI- -1640-medium indeholdende 10% oksefosterserum og udsås 1 Petriskåle (8 cm i diameter) med en celletæthed på π 2 x 10 celler pr. skål. De fordyrkes ved 37°C i fuldt humidificeret atmosfære indeholdende 5% carbondioxid.

35 Efter fordyrkning i en time, tilsættes endotoksin (li-popolysaccharid afledt ud fra E. coli), TPA (phorbol- o 66 DK 172013 B1 -12-myristat-13-acetat) og cycloheximid (proteinsynte-se-inhibitor), så at slutkoncentrationerne bliver hhv.

10 mikrogram/ml, 10 ng/ml og 1 mikrogram/ml. Dyrkningen fortsættes i yderligere 4-4,5 timer (ialt 5-5,5 timer), 5 dyrkningsmediet fjernes ved sugning, og de makrofager, der klæber til skiverne, lyses og homogeniseres i en 5 molær guanidylthiocyanatopløsning indeholdende 0,6% natrium-N-lauroylsarcosinat og 6 mmolær natriumcitrat. Homogenatet tilsættes en 5,7 molær cæsiumchloridopløs-10 ning indeholdende 0,1 molær EDTA og centrifugeres i 20 timer ved 26.500 omdr./min. i en ultracentrifuge ("RPS27-2 rotor", Hitachi Koki), så at der fås en samlet RNA-fraktion som pellets. Disse opløses i en lille smule 7 molær urinstofopløsning indeholdende 0,35 molær 15 NaCl, 20 mmolær Tris-HCl (pH 7,4) og 20 mmolær EDTA og udvindes ved fældning ud fra ethanol. Af 12 kaniner fås 5,2 mg total RNA.

Den totale RNA-fraktion opløses i 2 ml TE-op-løsning, der anvendes i eksempel 1-(1), og opløsningen 20 opvarmes ved 65°C i 5 minutter. Der tilsættes en NaCl-opløsning indtil en slutkoncentration på 0,5 molær, og opløsningen påføres på en kolonne af oligo(dT)-cellulose, der i forvejen er bragt i ligevægt med TE-opløsningen indeholdende 0,5 molær NaCl. Der elueres poly(A)-25 mRNA fra kolonnen med TE-opløsningen i et udbytte på 314 mikrogram. 200 mikrogram af det fremkomne poly(A)mRNA underkastes agarose-gel-elektrophorese (gelkoncentration 1% i nærvær af 6 molær urinstof, pH 4) og fraktioneres i 7 fraktioner ifølge molekylstørrelser. Poly(A)-30 mRNA isoleres fra hver gel fraktioneret ved smeltning ved 70°C i 10 minutter efterfulgt af ekstraktion først med phenol og derpå med chloroform og af fældning ud fra ethanol. Indholdet af kanin-TNF mrNA i poly(A)mRNA udvundet fra hver fraktion bestemmes ved en mRNA-trans-35 lationsprøve ved hjælp af oocyter af Xenopus laevis.

0 67 DK 172013 B1

Kanin-TNF mRNA udvindes i en højere koncentration ud fra en fraktion svarende til en molekylestørrel-se på 1,6-2,7 kb (forkortes til beriget kanin-TNF mRNA).

Den berigede kanin-TNF mRNA-fraktion, der fås 5 her, anvendes til følgende eksperiment: (2) Syntese af cDNA. cDNA syntetiseres under følgende betingelser. 4 mikrogram af den berigede TNF-mRNA-fraktion opløses i 100 mikroliter 50 mmolær Tris-HCl-puf-fer (pH 8,3) indholdende 10 mmolær MgC^/ 70 mmolær KC1, 10 1 mmolær dithiothreitol, 0,5 mmolær af hver af de fire desoxyribonucleotidtriphosphater dTTP, dCTP, dATP og dGTP (dCTP er mæret med P, specifik aktivitet 4,4 x 10 cpm/nmol), 3 mikrogram oligo(dT)^2-18 °9 enheder omvendt transcriptase afledt ud fra fugle-myeloblastose-15 virus og inkuberet ved 43°C i 90 minutter. Derpå afbrydes reaktionen ved tilsætning af EDTA. Det fremkomne cDNA-mRNA-hybrid ekstraheres med phenol/chloroform = 1:1 og udvindes ud fra den vandige fase ved fældning ud fra ethanol. mRNA-skabelonen fjernes ved behandling med al-20 kali ved 65-70°C. Det syntetiserede sscDNA udvindes ved fældning ud fra ethanol.

sscDNA-bundfaldet opløses i 40 mikroliter 0,1 molær "Hepes"-puffer (pH 6,9) indeholdende 0,5 mmolær af hver af de fire desoxyribonucleotidtriphosphater dATP, 25 dTTP, dGTP og dCTP, 5 mmolær MgC^, 70 mmolær KC1, 1,5 mmolær 2-mercaptoethanol og 8 enheder E. coli-DNA-poly-merase I (stort fragment) og inkuberes ved 15°C i 20 timer til syntetisering af dscDNA. Reaktionen afbrydes ved tilsætning af natriumdodecylsulfat. dscDNA'et eks-30 traheres med phenol/chloroform og udvindes ved fældning ud fra ethanol.

Det fremkomne dscDNA opløses i 100 mikrogram 50 mmolær natriumacetat (pH 4,5) indeholdende 1 mmolær ZnSO^, 200 mmolær NaCl, 0,5% glycerol og 0,5 enhed Sl-35 nuclease og inkuberes ved 37°C i 20 minutter for at spalte hårnålestrukturen. Reaktionen afbrydes ved tilsætning o 68 DK 172013 B1 af EDTA. Reaktionsblandingen ekstraheres med phenol/chlo-roform og derpå med diethylether. dscDNA udvindes ved fældning ud fra ethanol.

(3) Fældning af cDNA med oligo(dC)-hale. Det o-5 venfor fremstillede dscDNA opløses i 100 mikroliter 130

mmolær natriumcacodylat-30 mmolær Tris-HCl-puffer (pH

6,8) indeholdende 1 mmolær CoCl-, 0,1 mmolær dithiothrei- ^ 3 tol, 0,2 mikrogram poly(A), 0,1 mmolær H-dCTP (specifik aktivitet 5400 cpm/pmol) og 10 enheder endestillet des-10 oxynucleotidyltransferase og inkuberes ved 37°C i 20 minutter, så at der kan tilføjes oligo(dC)-haler på dscDNA's 3'-endestillinger.

Reaktionen afbrydes ved tilsætning af EDTA. Reaktionsblandingen ekstraheres med phenol/chloroform 15 og derpå med diethylether, og det med oligo(dC)-hale forsynede dscDNA udvindes ved fældning ud fra ethanol. Det med oligo(dC)-hale forsynede dscDNA opløses i 10 mmolær Tris-HClpuffer (pH 7,4) indeholdende 1 mmolær EDTA og 100 mmolær NaCl, så at det indeholder 0,2 mikrogran af 20 det med oligo(dC)-hale forsynede dscDNA pr. ml.

(4) Fremstilling af med oligo(dG)-hale forsynet plasmid pBR322 DNA. 10 mikrogram pBR322 opløses i 100 mikroliter 20 mmolær Tris-HCl-puffer (pH 7,4) indeholdende 10 mmolær MgC^» 50 mmolær (NH^) og 10 25 mikrogram okseserumalbumin, og 15 enheder restriktions-endonuclease PstI tilsættes. Blandingen inkuberes ved 37°C i en time. Efter at reaktionen er afsluttet ekstraheres reaktionsblandingen med phenol/chloroform, og det fremkomne DNA udvindes ud fra den vandige fase ved 30 fældning ud fra ethanol. Det opnåede DNA opløses i 200 mikroliter af samme reaktionspuffer, der anvendes til at forsyne dscDNA ovenfor med hale (med undtagelse af, at den indeholder 80 enheder endestillet desoxynu- 3 3 cleotidyltransferase og H-dGTP i stedet for H-dCTP) 35 og inkuberes ved 37°C i 20 minutter, så at der tilføjes ca. 10-15 dG-rester pr. ende. Reaktionsblandingen eks- 0 69 DK 172013 B1 traheres med phenol/chloroform, og det med oligo(dG)-hale forsynede plasmid pBR322-DNA udvindes ud fra den vandige fase ved fældning med ethanol. Det fremkomne med hale forsynede plasmid-DNA opløses i samme puffer, som 5 anvendes til opløsning af et med oligo(dC)-hale forsynede dscDNA, så at det indeholder det med hale forsynede plasmid-DNA i en koncentration på 2 mikrogram pr. ml.

(5) Konstruktion af et rekombinant plasmid. 50 mikroliter opløsning af det med oligo(dC)-hale forsyne- 10 de cDNA blandes med 50 mikroliter opløsning af det med oligo(dG)-hale forsynede pBR322-DNA, og blandingen inkuberes først ved 65°C i 10 minutter, så ved 57°C i 120 minutter, ved 45°C i 60 minutter, ved 35°C i 60 minutter og ved stuetemperatur i 60 minutter, så at der sker sam-15 menlukning og for at konstruere rekomninante plasmider.

(6) Udvælgelse af transformanter. E. coli X1776--samme transformeres med de ovenfor opnåede rekombinante plasmider.

Specifikt dyres E. Coli X1776 ved 37°C i 20 ml 20 L-næringssuppe suppleret med 100 mikrogram/ml diamino- pimelinsyre og 40 mikrogram/ml thymidin, indtil uklarheden ved 600 nm når 0,5. Cellerne opsamles ved centrifu- o gering ved 0 C og vaskes med 10 mmolær Tris-HCl-puffer (pH 7,3) indeholdende 50 mmolær CaC^· Cellerne gensus-25 penderes i 2 ml af den samme puffer som anvendes ovenfor og henstår ved 0°C i 5 minutter. Til 0,2 ml af suspensionen tilsættes 0,1 ml af den ovenfor fremstillede opløsning af rekombinant plasmid. Blandingen henstår ved 0°C i 15 minutter og holdes derpå ved 42°C i 2 mi-30 nutter. Derpå tilsættes 0,5 ml af den ovenfor anvendte supplerede L-næringssuppe, og dyrkningen udføres under rystning i 1 time. En alikvot mængde af kulturen tages fra, udstryges på en suppleret L-næringssubstratagarplade, der indeholder 15 mikrogram/ml tetracyclin og dyrkes 35 ved 37°C i ca. 12 timer. De transformanter, der er resistente mod tetracyclin, udvælges og anvendes som cDNA-samling.

0 70 DK 172013 B1 (7) Hybridiseringsprøve. Kolonihybridiserings- 32 prøve sker ved anvendelse af P-mærket cDNA-sonde ved hjælp af Hanahan og Meselson's metode for at screene cDNA-samlingen for transformanter, der har et plasmid 5 indeholdende cDNA, der koder for kanin-TNF. Induktion- 32 plus- og induktion-minus- P-mærkede sonder syntetiseres ved den i afsnit (2) ovenfor beskrevne metode med mRNA'er, der fås ud fra induktion-plus- og -minus-alveolære makrofager ved den i afsnit (1) beskrevne metode 10 med undtagelse af, at der anvendes P-dCTP med høj specifik radioaktivitet. Ved denne prøve udvælges kolonier af transformanter der rummer de rekombinante plasmi-der, der hybridiserer stærkt med induktions-plus-son-den, men ikke hybridiserer med induktion-minus-sonden.

15 Der udvælges 50 kolonier ud af ca. 20.000 kolonier.

20 ud af de udvalgte 50 kolonier underkastes derpå en mRNA-hybridiserings-translationsprøve ved hjælp af den af T. Maniatis et al. udgivne "Molecular Cloning", 329 (1980) , Cold Spring Harbor Lab. Plasmid-DNA'et eks-20 traheres fra hver af transformanterne og fikseres på nitrocellulosefiltre efter varmedenaturering. Poly(a)-mRNA-fraktionen, der indeholder kanin-TNF mRNA, der fås i afnsit (1) ovenfor, sættes til filtreret og inkuberes ved 50°C i 3 timer for at få hybridisering. Det 25 hybridiserede mRNA udvindes og injiceres i oocyterne for at kunne bestemme, om det udvundne mRNA er kanin-TNF mRNA.

Som resultat af denne prøve findes tre kolonier, der har plasmider indeholdende cDNA'er, som stærkt hybridiserer med kanin-TNF mRNA. cDNA-fragmenter fås ud fra plas-30 midet med cDNA med den største størrelse (ca. 750 bp) ved fordøjelse med restriltionsendonucleasen Ddel og an- vedes som sonde ved yderligere screening. Disse DNA- 32 -fragmenter mærkes med P. Ved hjælp af disse sonder screenes den cDNA-samling, der fås i afsnit (6) ovenfor 35 ved en kolonihybridiseringsprøve, og der udvælges kolonier af transformanter med plasmider indeholdende cDNA'er, 0 71 DK 172013 B1 der hybridiserer stærkt med de mærkede sonder. 98 kolonier ud af ca. 60.000 kolonier i cDNA-samlingen viser sig at være positive ved prøven. Det rekombinante plas-mid-DNA isoleres, og de indsatte cDNA'er udskæres fra 5 disse rekombinante plasmider ved fordøjelse med restrik-tionsendonucleasen Pdtl, og deres størrelser måles ved hjælp af polyacrylamidgel-elektrophorese. 17 kloner af transformanter med indsatte cDNA'er på mindst 1 kbp udvælges. Ud fra en transformant indeholdende cDNA med 10 den største størrelse (transformant nr.: X1776/pRTNF802, plasmid nr. pRTNF802) isoleres det klonede cDNA, og dets basesekvens bestemmes ved hjælp af følgende metode: (8) Bestemmelse af basesekvensen i det klonede cDNA. Transformanten X1776/pRTNF802, der udvælges i afsnit (7) 15 ovenfor, dyrkes i L-næringssuppe suppleret med diamino-pimelinsyre og thymidin. Cellerne behandles ifølge Wilkie m.fl.'s metode, så at der fås et plasmid-DNA. Plas-mid-DNA'et fordøjes med restriktionsendonucleasen PstI og renses, så at der fås et klonet cDNA. Det klonede 20 cDNA-fragment fordøjes yderligere med forskellige restrik-tionsendonucleaser, og basesekvenserne i passende med re-striktionsendonuclase spaltede fragmenter bestemmes ved hjælp af Maxam-Gilbert-metoden.

Basesekvensen, der bestemmes, er vist i formel 25 7 nedenfor: 30 35 DK 172013 B1 72

Formel 7.

10 20 30

GGGGGGGGGGGGGGGCCCTCTGGAGAGAGC

40 50 60

GCCATGAGCACTGAGAGTATGATCCGGGAC

MetSerThrGluSerMetlleArgAsp 70 80 90

GTCGAGCTGGCGGAGGGGCCGCTCCCCAAG

ValGluLeuAlaGluGlyProLeuProLys 100 110 120

AAGGCAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAAGCGC

LysAlaGlyGlyProGlnGlySerLysArg 130 140 150

TGCCTCTGCCTCAGCCTCTTCTCTTTCCTG

CysLeuCysLeuSerLeuPheSerPheLeu 160 170 180

CTCGTGGCTGGAGCCACCACGCTCTTCTGC

LeuValAlaGlyAlaThrThrLeuPheCys 190 200 210

CTGCTGCACTTCAGGGTGATCGGCCCTCAG

LeuLeuHisPheArgVallleGlyProGln 220 230 240

GAGGAAGAGCAGTCCCCAAACAACCTCCAT

GluGluGluGlnSerProAsnAsnLeuHis 250 260 270 CTAGTCAACCCTGTGGCCCAGATGGTCACC LeuValAsηProVa1AlaG1nMetVa1Thr 280 290 300

CTCAGATCAGCTTCTCGGGCCCTGAGTGAC

LeuArgSerAlaSerArgAlaLeuSerAsp 310 320 330

AAGCCTCTAGCCCACGTAGTAGCAAACCCG

LysProLeuAlaHisValValAlaAsnPro 340 350 360

CAAGTGGAGGGCCAGCTCCAGTGGCTGAGC

GlnValGluGlyGlnLeuGlnTrpLeuSer 370 380 390

CAGCGTGCGAACGCCCTGCTGGCCAACGGC

GlnArgAlaAsnAlaLeuLeuAlaAsnGly ... fortsættes DK 172013 B1 73 rormp 1 „7. (forts) , 400 410 420

ATGAAGCTCACGGACAACCAGCTGGTGGTG

MetLysLeuThrAspAsnGlnLeuValVal 430 440 450

CCGGCCGACGGGCTGTACCTCATCTACTCC

ProAlaAspGlyLeuTyrLeuIleTyrSer 460 470 480

CAGGTTCTCTTCAGCGGTCAAGGCTGCCGC

GlnValLeuPheSerGlyGlnGlyCysArg 490 500 510

TCCTACGTGCTCCTCACTCACACTGTCAGC

SerTyrValLeuLeuThrHisThrValSer 520 530 540

CGCTTCGCCGTCTCCTACCCGAACAAGGTC

ArgPheAlaValSerTyrProAsnLysVal 550 560 570

AACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGC

AsnLeuLeuSerAlalleLysSerProCys 580 590 600

CACCGGGAGACCCCCGAGGAGGCTGAGCCC

HisArgGluThrProGluGluAlaGluPro 610 620 630

ATGGCCTGGTACGAGCCCATCTACCTGGGC

MetAlaTrpTyrGluProIleTyrLeuGly 640 650 660

GGCGTCTTCCAGTTGGAGAAGGGTGACCGG

GlyValPheGlnLeuGluLysGlyAspArg 670 680 690

CTCAGCACCGAGGTCAACCAGCCTGAGTAC

LeuSerThrGluValAsnGlnProGluTyr 700 710 720

CTGGACCTTGCCGAGTCCGGGCAGGTCTAC

LeuAspLeuAlaGluSerGlyGlnValTyr 730 740 750

TTTGGGATCATTGCCCTGTGAGGGGACTGA

PheGlyllelleAlaLeu 760 770 780

CCACCACTCCTCCCCCTCTCCCACCCCAGC

790 800

CCCCTCACTCTGGGCGCCCTCAG

0 74 DK 172013 B1

Basesekvensen fra 277. til 738. base tilskrives kodningsregionen for modent kanin-TNF i overensstemmelse med den N-endestillede og den C-endestillede ami-nosyresekvens i TNF renset ud fra kaninplasma, som det 5 er beskrevet i referenceeksempel 2. 34. til 276. base udgør en basesekvens, der formodes at koe for et poly-peptid, der er nødvendigt som precursor for kanin-TNF.

Referenceeksempel 2

10 Isolering og rensning af kaninplasma-TNF

Kaniner (legemsvægt 2,5 til 3,0 kg) injiceres intravenøst med 50 m dræbte tørrede celler af Propioni-bacterium aenes. 8 dage senere injiceres kaninerne intravenøst med 100 mikrogram endotoxin (lipopolysaccharid 15 afledt ud fra E. coli). 2 timer senere udtages der blod fra hver kanin ved hjertepunktur. Blodet blandes med 100 enheder natriumheparin pr. 100 ml og centrifugeres derpå ved 5000 omdr/min. i 30 minutter under afkøling for at fjerne blodceller og uopløseligt stof. Af 400 20 kaniner fås 24 liter plasma.

24 g EDTA og 240 g "Celite" tilsættes til de 24 liter plasma, og blandingen omrøres i 1 time og filtreres der på gennem filtre, først med en porestørrelse på 3^,u, derpå med l^u og endelig 0,2yU.

25 Til 24 liter filtrat tilsættes 12 liter 0,04 molær Tris-HCl-puffer (pH 7,8), og blandingen påføres en kolonne (27 x 45 cm) DEAE-"Sepharose" C1-6B (Pharmacia) bragt i ligevægt med 0,04 molær Tris-HCl--puffer (pH 7,8) indeholdende 0,1 molær NaCl. Kolonnen ΟΛ vaskes derpå med 75 liter 0,04 molæt Tris-HCl-puffer (pH 7,8) indeholdende 0,1 molær NaCl og derpå med 50 liter 0,04 molær Tris-HCl-puffer (pH 7,8) indeholdende 0,15 molær NaCl og elueres derpå med 0,04 molær Tris-· -HCl-puffer (pH 7,2) indeholdende 0,18 molær NaCl. E-35 luatet fraktioneres i 8-liter-fraktioner, og aktive fraktioner med cytotoksisk aktivitet opsamles. De ak- 0 75 DK 172013 B1 tive fraktioner slås sammen og fortyndes med et lige så stort folumen 0,04 molær Tris-HCl-puffer (pH 7,8). Den fortyndede opløsning påføres en kolonne (10 x 13 cm) DEAE-"Sepharose" C1-6B. Kolonnen vaskes med 1 liter 5 0,04 molær Tris-HCl-puffer (pH 7,8) indeholdende 0,1 mo lær NaCl og elueres derpå med 5 liter 0,04 molær Tris--HCl-puffer (pH 7,2) indeholdende 0,18 molær NaCl. E-luatet fraktioneres i 250 ml-fraktioner, og fraktioner med cytotoksisk aktivitet opsamles og slås sammen.

10 Den aktive fraktion opvarmes ved 60°C i 30 minutter og afkøles hurtigt til 4°C. Den afkølede opløsning koncentreres ved ultrafiltrering.

Det fremomne koncentrat påføres på en kolonne (5 x 80 cm) af "Sephacryl" S-200 (Pharmacia), der 15 er bragt i ligevægt med 0,005 molær phosphatpuffer (pH 7,4) indeholdende 0,1 molær NaCl, og elueres med samme puffer. Eluatet fraktioneres i 40 ml-fraktioner, og aktive fraktioner opsamles, slås sammen og koncentreres ved hjælp af ultrafiltrering.

20 Koncentratet af aktive fraktioner, der fås 2+ ved gelfiltrering, påføres en kolonne af Zn -chelat "Sepharose" som vist nedenfor. En kolonne (1,6 x 20 cm) fyldt med chelat~"Sepharose" (iminoeddikesyrefik-seret harpiks) fremstillet ved hjælp af J. Porath m.

25 fl.'s metode [Nature 258, 598 (1975)] vaskes med 120 ml zinkchloridopløsning (1 mg/ml) og bringes i ligevægt med 0,05 molær phosphatpuffer (pH 7,4) indeholdende 0,1 molær NaCl. Derpå påføres det i det tidligere trin opnåede koncentrat på kolonnen og elueres med samme puffer.

30 Fraktioner, der ikke adsorberes på kolonnen, opsamles. Cytotoksisk aktivitet udvindes næsten fuldstændig i disse fraktioner.

De aktive fraktioner, der fås i ovenstående trin, koncentreres og påføres på en kolonne (1,5 x 90 35 cm) af "Toyopearl" HW-55 (Toyo Soda Co., Ltd.) og bringes helt i ligevægt med 0,005 molær phosphatpuffer (pH

0 76 DK 172013 B1 7,4) indeholdende 0,15 molær NaCl. Kolonnen elueres med samme puffer, og aktive fraktioner slås sammen. Dette præparat er renset kaninplasma-TNF.

Dette rensede kaninplasma-TNF, der fås her, 5 anvendes i referenceeksemplerne 3 og 4.

Referenceeksempel 3

Bestemmelse af N-endestillede og C-endestillede aminosy-resekvenser i kaninplasma-TNF.

10 Det rensede kaninplasma-TNF, der fås i referenceeksempel 2, anvendes til bestemmelse af den N-endestil lede og den C-endestillede aminosyresekvens.

Den N-endestillede aminosyresekvens bestemmes ved hjælp af Edman's nedbrydningsmetode. De fremkomne 15 phenylthiohydantoin-aminosyrer identificeres ved hjælp af højtydende væskechromatografi ved anvendelse af en "Zorbax" ODS-kolonne (duPont).

Den C-endestillede aminosyresekvens bestemmes ved hjælp af den enzymatiske metode ved brug af carboxy-20 peptidaser. Det rensede kaninplasma-TNF fordøjet med carboxypeptidaserne A og Y i et molforhold mellem enzym og substrat på hhv. 1:25 og 1:1000. De frie aminosyrer, der frigøres fra C-endestillingen i kaninplasma-TNF ved den dobbelte fordøjelse, identificeres ved hjælp af en 25 mikro-aminosyreanalysator (Shimadzu Seisakusho) med passende mellemrum fra 2 minutter til 180 minutter efter fordøjelsen.

Det viser sig herved, at den N-endestillede og den C-endestillede aminosyresekvens i kaninplasma-30 -TNF er som følger: N-endestilling: Ser-Ala-Ser-Arg-Ala-...

C-endestilling: ... Val-Tyr-Phe-Gly-Ile-Ile-Ala-Leu 35 0 77 DK 172013 B1

Referenceeksempel 4

Fremstilling af et anti-kaninplasma-TNF-antistof 5 TNF-opløsning indeholdende 1,9 x 10 enheder (L-929) af det rensede kaninplasma-TNF, der fås i refe-5 renceeksempel 2, emulgeres med et lige så stort volumen Freund's komplette adjuvans, og emulsionen injiceres sub-cutant i ryggen på marsvin i flere dele. Derpå immuniseres dyrene ved hjælp af samme metode 1, 3 og 6 uger senere. Endvidere injiceres intraperitonealt 8 uger 10 senere samme mængde renset kaninplasma-TNF sammen med aluminiumhydroxidgel. Helblod udtages ved hjertepunktur 9 uger efter den første immunisering og centrifugeres, så at der fås et antiserum indeholdende et anti-kaninplasma-TNF-antistof .

15 Antiserummet ledes gennem en kolonne af "Sepha- rose" 4B koblet med serumproteinkomponenter fra normale kaniner. Ved at gentage dette 3 gange fås et renset antistof, specifikt for kaninplasma-TNF. Det bekræftes ved immunelektrophorese og gel-dobbelt diffusionsme-20 tode, at dette antistof danner en enkelt fældningslinie udelukkende med det rensede kaninplasma-TNF.

En ca. 60.000 ganges fortynding af dette rensede antistof kan neutralisere 50% af 500 enheder (L-929) cytotoksisk aktivitet i kaninplasma-TNF, og en ca. 1000 25 ganges fortynding af antistoffet kan fuldstændig neutralisere 50 enheder (LM) cytotoksisk aktivitet i kaninplasma-TNF .

30 35

Claims

1. DNA, kendetegnet ved, at det har eller indeholder en basesekvens svarende til en aminosyresekvens med formlen 5 (Y)p-(X)n-{B)m-A I eller en basesekvens med et termineringscodon i 3'-endestillingen i basesekvensen, 10 hvor A er et polypeptid med formlen The Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu

2. DNA ifølge krav 1, kendetegnet ved, at A, B, Y, m, n og p er som defineret i krav 1, og X er et polypeptid med formlen Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu 10 Leu Ala Glu Glu Ala Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gin Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gin Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gin Ala Val Arg

3. DNA ifølge krav l, kendetegnet ved, at A, B, Y og p er som defineret i krav 1, X er et polypeptid 20 med formlen Ic ifølge krav 2, og m og n er l.

4. DNA ifølge krav 1, kendetegnet ved, at A, B, Y og p er som defineret i krav 1, m er 1 og n er 0.

5 X' er en basesekvens med formlen (5')-AGC ACT GAA AGO ATG ATC CGG GAC GTG GAG CTG GCC GAG GAG GCG CTC CCC AAG AAG ACA GGG GGG CCC CAG GGC TCC AGG CGG

5 Thr eller Tyr, m og n er 0, og Y og p er som defineret i krav 3.

5. DNA ifølge krav 1, kendetegnet ved, at A, y og p er som defineret i krav 1, og n og m er 0.

6. DNA ifølge krav 1, kendetegnet ved, at A hår formlen la, hvor en eller flere aminosyrer er udeladt eller erstattet med anden(re) aminosyre(r), m og n er 0, og Y og p er som defineret i krav 2.

7. DNA ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 30 det har eller indeholder en basesekvens svarende til en aminosyresekvens med formlen I, hvor A er et polypeptid med formlen la, hvori Thr i den første stilling fra N-endestil-lingen, aminosyrer fra nævnte Thr i første stilling til Pro i 6. stilling, aminosyrer fra nævnte Thr i første stilling 35 til His i 9. stilling eller aminosyrer fra ovennævnte Thr i første stilling til Ala i 12. stilling er udeladt, m og n DK 172013 B1 er 0, og Y og p er som defineret i krav 1.

8. DNA ifølge krav 1, kendetegnet ved, at A er et polypeptid med formlen la, hvori Thr og His i 66. og 67. stilling fra N-endestillingen er erstattet med His,

9. DNA ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har eller indeholder en basesekvens med formlen 10 (Y')p- (X')n-(B' >nTA' II eller en basesekvens med en termineringscodon ved nævnte basesekvens' 3'-endestilling, hvor A' er en basesekvens med formlen 15 C 5 *)-ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT G TT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGQ CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA 2Q GAT AAC CAG CTG G TG G TG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC Ila

25 TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT 3Q GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTG-(3') hvori en eller flere codoner kan være udeladt eller erstattet med anden(re) codon(er),

35 B' er en basesekvens med formlen DK 172013 B1 (5')-TCA-TCT-TCT-CGA-(3')... IIb hvori 1-3 codoner kan være udeladt eller erstattet med andentre) codoner(er),

10. DNA ifølge krav 9, kendetegnet ved, at A', B', Y' og p er som defineret i krav 9, m er 1 og n 20 er 0.

10 TGC TTG TTC CTC AGC CTC TTC TCC TTC CTG ATC GTG GCA GGC GCC ACC ACG CTC TTC TGC Ile CTG CTG CAC TTT GGA GTG ATC GGC CCC CAG AGG G AA GAG TTC CCC AGG GAC CTC TCT CTA ATC AGC CCT CTG GCC CAG GCA GTC AGA-(3') 15 Y' er ATG, og m, n og p er 1 eller 0.

11. Vektor, kendetegnet ved, at den har et DNA ifølge et hvilket som helst af kravene 1-8 eller 9-10 indsat.

12. Vektor ifølge krav 11, kendetegnet 25 ved, at den er en ekspressionsvektor.

13. Vært, kendetegnet ved, at den er transformeret med en vektor ifølge krav 11-12.

14. Polypeptid, kendetegnet ved, at det har formlen I med de i krav 1 anførte symboldefinitioner.

15. Polypeptid ifølge krav 14, kendetegnet ved, at X er et polypeptid med formlen Ic i krav 2.

15 Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser la

16. Polypeptid ifølge krav 14, kendetegnet ved, at symbol forklaringerne er som i krav 3, 4 eller 5.

17. Polypeptid ifølge krav 14, kendetegnet 35 ved, at A er et polypeptid med formlen la, B er et peptid med formlen Ib, m er 1, og n og p er 0. DK 172013 B1

18. Polypeptid ifølge krav 14, kendetegnet ved, at A er et polypeptid med formlen la, m, n og p er 0.

19. Polypeptid ifølge krav 14, kendetegnet ved, at det har formlen I eller er et derivat eller salt 5 heraf, hvor A er et polypeptid med formlen la, hvori en eller flere aminosyrer er udeladt eller erstattet med andentre) aminosyre(r), m og n er 0, og Y og p er som defineret i krav 1.

20. Polypeptid ifølge krav 19, kendetegnet 10 ved, at Thr i den første stilling fra N-endestillingen, aminosyrer fra det ovennævnte Thr i den første stilling til Pro i den 6. stilling, aminosyrer fra ovennævnte Thr i den første stilling til His i den 9. stilling eller aminosyrer fra det ovennævnte Thr i den første stilling til Ala i den 15 12. stilling er udeladt, m er 0, og Y og p er som defineret i krav 1.

20 Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile

25 Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu hvori en eller flere aminosyrer kan være udeladt eller er-30 stattet med anden(re) aminosyre(r), B er et peptid med formlen Ser-Ser-Ser-Arg Ib 35 hvori 1-3 aminosyrer kan være udeladt eller erstattet med anden(re) aminosyre(r), DK 172013 B1 X er et polypeptid, Y er Met, og m, n og p er l eller 0, og hvor polypeptidet A har i det væsentlige samme aktivitet 5 som human tumornekrosefaktor.

21. Polypeptid ifølge krav 19, kendetegnet ved, at symbolforklaringen er som defineret i krav 8.

22. Pharmaceutisk acceptabelt salt, kendeteg-20 net ved, at det er et salt af et polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 16-21.

23. Aggregat, kendetegnet ved, at det som underenhed har et polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 16-21 eller 22.

24. Pharmaceutisk sammensætning, kendeteg net ved, at den som aktivt stof omfatter et stof ifølge et hvilket som helst af kravene 14-21 eller 22-23. 30 35